JP5777127B1 - 原始腸内胚葉細胞及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも1回以上実施した後に誘導される細胞であって、未分化(多能性)細胞マーカーである、NANOG, OCT4, MYC, LIN28Aが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、CXCR4, CER1, HHEX, GATA4が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、CDX2, HOXB9が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ(T)が陰性であり、膵細胞マーカーである、PDX1が陰性であり、少なくとも肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化しうる細胞。
(2)第1の段階で、SFD及びRock Inhibitorの存在下で、第2の段階で、SFD、Activin A及びWnt3aの存在下で、第3の段階で、RPMI、SFD、BMP4、bFGF、VEGF及びActivin Aの存在下で、第4の段階で、SFD、BMP4、bFGF、VEGF及びActivin Aの存在下で、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養して分化させた後、継代を少なくとも1回以上実施することを含む、(1)記載の細胞の作製方法。
(3)継代後の第1の段階で、Rock Inhibitorの存在下で、その後は、SFD、FGF2、VEGF、EGF、A83-01及びChir99021の存在下で培養することを含む、(1)記載の細胞の増幅方法。
(4)(1)記載の細胞を臓器細胞へ分化誘導することを含む、臓器細胞の作製方法。
(5)(1)に記載の細胞を任意の段階で凍結・保存し、臓器細胞を製造するためのワーキングセルバンクを構築する方法。
また、本発明は、本発明の細胞(PGECs)を用いて、肝細胞、膵細胞、腸細胞などの臓器細胞を作製する方法も提供する。肝細胞、膵細胞又は腸細胞への分化誘導は、後述の実施例に記載の方法で実施することができる。臓器細胞が肝細胞である場合、例えば、FBS、HGF、OSM及びDEXの存在下で、本発明のPGECsを培養することで、肝細胞へ分化誘導することができる(後述の実施例参照)。臓器細胞が膵細胞である場合、例えば、L-glutamine、glucose、ascorbic acid、SB431542、2-M Insulin及びNicotanamideの存在下で、本発明のPGECsを培養することで、膵細胞へ分化誘導することができる(後述の実施例参照)。臓器細胞が腸細胞である場合、例えば、B27、R-Spondin1、Noggin及びEGFの存在下で、本発明のPGECsを培養して、腸細胞へ分化誘導することができる(後述の実施例参照)。本発明の細胞(PGECs)は、肝細胞、膵細胞及び腸細胞以外の臓器細胞、例えば、肺細胞、甲状腺細胞、消化管分泌腺細胞、腹膜細胞、胸膜細胞、喉頭細胞、耳管・気管・気管支細胞、尿路細胞へも分化しうる。本発明の細胞から臓器細胞を分化誘導するには、本発明の細胞をゲルなどの支持体上で培養するとよい。支持体としては、平面での分化誘導を試みる場合には、30倍希釈マトリゲルを用いることが好ましく、立体で器官原基作製による分化誘導を試みる場合には、ゲル(例えば、原液〜4倍希釈マトリゲル(登録商標)、アガロースゲル、アクリルアミドゲル、ハイドロゲル、コラーゲンゲル、ウレタンゲルなど)を用いることが好ましい、それに限定されることはない。本発明の細胞から分化誘導された臓器細胞は、機能性が高いことに加え、従来の多能性幹細胞から分化誘導したものに加えて均質性が極めて高い(後述の実施例参照)。
〔実施例1〕 iPS細胞からPGECの増幅法
〔実験方法〕
マトリゲルコーティング上で培養したiPS細胞(臍帯より独自に樹立したiPS細胞、および、TkDA3(東京大学より提供))をAccutaseにより剥離し回収した。SFD培地にRock Inhibitor(10uM)を添加した培地を用いてマトリゲルコーティングした6wellplateに2〜6×105cells/wellで播種し、1日間培養した。培養後、SFD培地にWnt3a(50ng/ml)及びActivin A(100ng/ml)を添加した培地で培地交換を行い、更に1日間培養した。次いで、SFD培地とRPMI1640培地を1:9の割合で混合し、その培地にBMP4(0.5ng/ml)、bFGF(5g/ml)、VEGF(10ng/ml)及びActivin A(100ng/ml)を添加した培地で培地交換を行い、2日間培養した。その後更にSFD培地にBMP4(0.5ng/ml)、bFGF(5ng/ml)、VEGF(10ng/ml)及びActivin A(100ng/ml)を添加した培地で培地交換を行い、2日間培養した。培養後の細胞をPGE P0とし、PGE維持培地にて継代を行った。
※なお、上記PGE分化誘導及び肝臓分化誘導に使用する試薬を、次の表1〜3に示す。
PGE分化誘導及びPGE維持に必要な基礎培地(以下SFD培地)及びPGE維持培地を調製する。表2及び表3にSFD培地、PGE維持培地の組成を示す。
マトリゲル グロースファクターリデュースをRPMIで1/30に希釈した。希釈した溶液を下記表4に従い必要量を培養皿に加え、全面にゆきわたらせた。室温で約2時間放置した。希釈溶液をチューブに回収し、RPMIを希釈溶液と等量加えた(このコーティング作業を以下マトリゲルコーティングとする)。希釈液は、3回目まで使用可能であった。細胞を播種する際はマトリゲルコーティングを行った。
凍結保存
PGECが90%コンフルエンスになった状態で(100mm dish あたり 3〜4 x106 cell程度)、100-mm dishあたり、3 ml sterile Ca+/Mg+-free PBSで洗浄した。その後、1.5 ml Accutase を加え、37°C 、5% CO2 インキュベーターの中で2〜5分処理を行った。そののち、ただちに9 ml の DMEM-F12で中和した後50mlコニカルチューブに回収した。細胞をカウントののち 80〜90g, 5minで遠心分離を行った。上清を廃棄の後、5 x 105 cellsあたり1mlになるように調製したセルバンカー (cellblanker-1)で優しく懸濁し、1 mlずつの細胞懸濁液を凍結保存用チューブに移した。イソプロパノールで満たされた1°Cの凍結用コンテナーにチューブを搭載し(蓋がきちんと閉まっていることを確認)、-80°Cの冷凍庫で1日静置した。翌日、液体窒素タンクに移動し、保存を行った。本法においては長期的な保存が可能であるが、2年以上の保存が可能であると考えられる。
液体窒素タンクより取り出したPGEC入り凍結チューブを取り出し、予め37°Cに設定したウォーターバスにて急速融解した。凍結細胞が完全に解凍する直前になったら(< 1 分以内) ウォーターバスから取り出し、直ちに安全キャビネットの中で70%エタノールで周囲を拭ったのち、細胞を予め温めたおいた9mlのDMEM-F12とともに遠心用コニカルチューブに移した。80〜90g、5分間の遠心により洗浄を行い、2 x104 cellsあたり1mlになるように調製した 10μM Rock Inhibitor 入りのPGE維持培地にて懸濁、Matrigel (growth-factor reduced) (1:30の稀釈)-コート済みの100mm dishへ全量が 10 ml になるように播種を行った (=2 x105 cells/100mm dish) 。37°C 、5% CO2 インキュベーターにて培養を行い、翌日からはPGE維持培地(Rock Inhibitorなし)にて2日おきに培地交換を行い増殖させた。
(1)本実施例における概要を示す(図1)。本発明により増幅される細胞は、Definitive Endoderm(D'Amour, K.A. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature biotechnology 23, 1534-1541 (2005).、Iwashita, H. et al. Secreted Cerberus1 as a Marker for Quantification of Definitive Endoderm Differentiation of the Pluripotent Stem Cells. PloS one 8, e64291 (2013).、Si‐Tayeb, K. et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305 (2010).)やEndodermal Progenitor(Cheng, X. et al. Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell stem cell 10, 371-384 (2012).)と呼ばれる細胞よりも(腸管系に)分化したより下流の細胞であるPrimitive Gut Endoderm Cell (PGEC)という細胞である。本細胞は、内胚葉に由来するすべての細胞に分化可能な細胞である。
(2)ヒトiPS細胞から継代を挟まないPGECの初期分化誘導プロセスの細胞の形態学的観察(図2)。ヒトiPS細胞の未分化性が十分に保たれていることをコロニーの形態・OCT4, SOX2の免疫染色により確認した(Day0)。次に、未分化状態の保たれたiPS細胞をActivin A および記載の分化因子に順次曝露し、Definitive Endodermへの誘導を行った。6日目には、多くの細胞が肥大化した核を有した敷石状のDefinitive Endoderm細胞へと分化誘導された。
(3)PGECの継代直後におけるROCK inhibitorの有用性の検討(図3)。写真(図3上)は、蛍光標識したPGEC細胞を継代し、Day3時点における培養皿の全体像を撮影したもの。AAVS1::EGFP-iPS細胞(TkDA)を用いて誘導したPGECを継代ののち、EGFPの蛍光によって生存・接着・増殖の評価を実施した。プレーティングの初日にRock Inhibitorを添加することで細胞の生存・接着が亢進した。一方、Rock Inhibitor 非存在下では、多くの細胞は生存することが出来なかった (図3, 上)。プレーティング後3日目に細胞数を計数した結果、Rock Inhibitor曝露群では細胞数が著名に多く、増殖が亢進しているものと考えられた(図3, 下)。横軸は、ウェル毎のデータ(n)を示す。
(4)継代後のPGECの増幅に有用な液性因子の検討(図4,5)。誘導したdefinitive endoderm 細胞を、異なるサイトカイン・低分子化合物を組み合わせた培地条件で培養を行い、最適な条件を探索した。3日目に得られた細胞の形態を図4に、遺伝子発現解析の結果を図5左、細胞数を図5右に示した。その結果、細胞が良好に増殖するためにはCHIR99021が、かつ、原始腸内胚葉(PGEC)マーカー(CDX2)陽性・definitive endoderm marker(CXCR4 ・CER1)陰性の細胞を誘導するためには、FGF2, BMP4, VEGF, CHIR99021 および A83-01 が必要であった。したがって、PGECの誘導には、FGF2, BMP4, VEGF, CHIR99021 および A83-01が必須であることが判明した。
*P1: passage 1、 M1-M8: 培地組成の違い(#1-#8)を示す。各培地組成は写真の直下に記載の通り。
(7)継代前(P0)および継代後(P5, 10, 15, 20)におけるPGECマーカーの遺伝子発現解析。継代後(P5, 10, 15, 20)の細胞は、CDX2+/CER1-/CXCR-であった(図9)。内胚葉マーカーであるSOX17, FOXA2は維持されていた。内胚葉マーカーであるGATA4は維持されていなかった。
(8)継代前(P0)および継代後(P1, 10, 15, 20)における細胞の特性解析。FACS(Flow cytometry)解析の結果、継代前(P0, Day5)の細胞は大部分がEndoderm Progenitorまたは、Definitive Endoderm MarkerであるC-KIT、CXCR4共陽性であったのに対し、継代後(P5, 15)の細胞は陰性であった(図10)。PGECマーカーであるCDX2の免疫染色の結果、継代前(P0)では発現を認めなかったのに対し、継代後(P1, 10, 15)は陽性で維持されていた(図11)。一方、内胚葉マーカーであるFOXA2,SOX17, HNF4Aは陽性であった。さらに、多能性幹細胞マーカーであるNANOG、OCT4 は陰性であった(図12)。
(9)共培養の際(HUVECs (Lonza, cat. no. 191027), hMSCs (Lonza, cat. no. PT-2501))、培養液として内皮細胞培地ではなく、Hepatocyte Medium (XenoTech)、あるいはBMP4及びFGF2を添加した肝細胞誘導培地(Hepatology, 51(1), 297-305,2010)を用いた場合には、肝芽に特徴的な遺伝子発現の増強(Alb、TTRなど)は認められなかった。
〔実験方法〕
全RNAは、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて、ヒトiPSC-PGEC由来細胞(PGEC(P0), PGEC(P1〜P16の各種細胞)およびPGECより分化誘導した肝細胞(PGEC-MH)(後述の実施例3で分化誘導した細胞。))から調製した。対照群として、ヒトiPSC由来細胞 (hiPSC, iPSC-DE(Definitive Endoderm), iPSC-HE(Hepatic Endoderm) iPSC-IH(Immature Hepatocyte)、 iPSC-MH(Mature Hepatocyte), iPSC-LB(Liver Bud)(各細胞の定義は以下の2つの論文に記載:Si‐Tayeb, K. et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305 (2010).、Takebe, T. et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013).、Takebe, T. et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature protocols 9, 396-409 (2014).)および、ヒト成体肝臓 (Lot No.: B308121、Biochain Institute 、Hayward, CA, USA)から得たRNAを解析した。cRNAを増幅し、Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて標識し、44Kの60量体オリゴマイクロアレイ(Human Gene Expression 4x44K v2 Microarray Kit; Agilent Technologies)に製造者の指示に従ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたマイクロアレイスライドを、Agilent High-Resolution Microarray Scannerを用いてスキャンした。Feature Extraction Software バージョン 10.7.3.1 (Agilent Technologies)を用いて、相対ハイブリダイゼーション強度およびバックグラウンドハイブリダイゼーション値を計算した。Agilent Technologiesが推奨する手順に従ってGeneSpring 11.5.1 Software中のフラグ基準を用いて、生のシグナル強度および各プローブのフラグをハイブリダイゼーション強度およびスポット情報から計算した。さらに、サンプルの生シグナル強度をlog2変換し、変位値アルゴリズムによって正規化した。我々は全てのサンプルに、「妥協した」(compromised)フラグを除きプローブを選択し、検出された遺伝子として34,183個のプローブを得た。得られた発現データから、75% shiftile & median補正したデータを用いて、主成分解析、階層的クラスタリング法によってサンプルの分化段階を分類した。
主成分解析の結果(図13)および、階層的クラスタリングの結果(図14)を示す。継代前のPGEC(P0)は、iPSC-DE(Definitive EndodermやEndodermal Progenitor)に相当する細胞であることが判明した。一方、継代後(P1〜P15)の細胞は、iPSC-HEに近い分化段階の細胞であり、それらはさらに分化したiPSC-MHや、PGEC-MH以前の分化状態にあることが示された。以上から、一度でも継代を挟むことで増幅される細胞は、iPSC-DEとiPSC-HEの中間に位置する分化段階の細胞であることが明らかとなった。
〔実験方法〕
PGEC(P6)を翌日60〜100%コンフルになるようにRock Inhibitor(10μM)を添加したPGE維持培地を用いてマトリゲルコーティングしたdishに播種した。翌日、細胞が60〜100%コンフルであることを確認し、PGE維持培地にActivin(100ng/ml)を添加した培地で培地交換し、2日間培養した(PGEC-2d)。(60%コンフル以下の場合はPGE維持培地で培地交換を行い、60%コンフル以上になるまで培養する。) 培養後、SFD培地にDM31898(250nM)、IWP2(4μM)、PD0325901(500nM)及びRA(2μM)を添加した培地で培地交換して1日間培養した。更に、SFD培地にA-83-01(1μM)、BMP4(10ng/ml)、IWP2(4μM)、及びRA(2μM)を添加した培地で培地交換を行い、3日間培養した(PGEC-HE)。その後、ノックアウトD-MEM培地に20%KSR、1%DMSO、1%NEAA、2-ME(0.1mM)及びL-Glutamine(1mM)を添加した培地で培地交換を行い3日間培養した。次いで、EGFを除いたHCMを調製し、その培地に5%FBS、HGF(20ng/ml)、OSM(20ng/ml)及びDEX(100nM)を添加した培地で8日間培養し、肝細胞(PGEC-MH)へと終末分化誘導を行った。
(1)増幅したPGEC(P6)を段階的に分化誘導した肝細胞の形態変化(図15-1、上段)と遺伝子発現解析(図15-1、下段)。終末分化をしたPGEC-MHは、肝細胞様の形態を示しており、肝細胞マーカー遺伝子の発現が増強することが確認された。PGEC-MHは、免疫染色の結果肝細胞マーカーの発現を認めた。さらに、ICG試験、PAS染色の結果からも代謝機能を持つ幹細胞であることが判明した(図16,上段)。
(2)通常、iPSCより誘導した肝細胞は均質に分化誘導することが困難であるが、PGECより分化した細胞は均質な形態学的特徴を有する肝細胞へと分化誘導することが可能であった(図15-2)。したがって遺伝子発現解析の結果、iPSCより誘導したMH(iPSC-MH)と比較して、PGEC-MHにおいて肝細胞マーカーが優位に高発現することが明らかとなった(図16、下段)。
(3)継代後のPGECの肝細胞分化誘導能の検討(図17)。形態学的解析の結果、継代を繰り返した後も再現性良く、肝細胞を誘導できることが明らかとなった(図17-1)。さらに、遺伝子発現解析および、ELISAによるタンパク質分泌機能解析の結果、継代を繰り返したのちも高い肝細胞機能が発揮されることが判明し、それらは、iPSC-MHと比較しても有意に高いことが明らかとなった(図17-2)。興味深いことに、PGEC(P0)と比較して、PGEC(P5, 10)の方が、ALB分泌能が高く、肝細胞への分化能が高いものと考えられた(図17-2、右)。
〔実験方法〕 PGECを用いた膵細胞の段階的誘導の方法(図18)。
増幅を行ったPGECをRock Inhibitor(10nM)を添加したPGEC維持培地を用いて、播種密度が翌日に60〜100%程度になるようマトリゲルコーティングしたdishに播種する。翌日、細胞が60〜100%コンフルであることを確認し、PGEC維持培地にActivin(100ng/ml)を添加した培地で培地交換し、2日間培養した。(60%コンフル以下の場合はPGE維持培地で培地交換を行い、60%コンフル以上になるまで培養する。) 培養後、DMEM(high glucose)培地にL-glutamine (2mM)、B27 (1%)、ascorbic acid (50μg/ml)、Noggin (25ng/ml)、A83-01 (1μM)、RA (2μM)、cyclopamine (0.25μM)を添加した培地で培地交換し、3日間培養した。更に、DMEM(high glucose)培地にL-glutamine (2mM)、B27 (1%)、ascorbic acid (50μg/ml)、Noggin (25ng/ml)、SB431542 (6μM)、Insulin(800pM) 及び Nicotanamide (10mM)を添加した培地で培地交換を行い、1日間培養した。その後、DMEM(high glucose)培地にL-glutamine (2mM)、glucose (20mM)、ascorbic acid (50μg/ml)、SB431542 (6μM)、2-M Insulin(800pM) 及び Nicotanamide (10mM)を添加した培地で12日間培養し、膵細胞へと終末分化誘導を行った。
(1)PGECから段階的に誘導した膵細胞の形態学的解析(図18)。PGEC から膵細胞、特に、インスリン分泌細胞への分化誘導プロトコルを記載した (図18) 。PGE-2dを Noggin、 KAAD-cyclopamine、retinoic acid (NCR)存在下で三日間培養することでPDX1陽性の膵前駆細胞を誘導した。さらに6日目から12日目までは、B27 など記載の因子を含むH21 (high glucose) 培地にて培養を行い、12日の段階において膵細胞を誘導されることを確認した。
(2)免疫染色の結果、PGEC由膵細胞は、膵臓前駆細胞マーカーであるPDX1、内分泌細胞マーカーであるINSULIN, GLUCAGON, SOMATOSTATIN、外分泌細胞マーカーであるAMYLASEに陽性の細胞へと分化誘導された(図19)。
(3)遺伝子発現解析の結果、INSULIN、PDX1の発現が増強し、β細胞への分化誘導が確認された(図20)。
〔実験方法〕 PGECを用いた腸組織の段階的誘導の方法(図21)。
増幅を行ったPGECをRock Inhibitor(10nM)を添加したPGEC維持培地を用いて、図21に記載のとおり、予めB27 1%、R-Spondin1(500ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、EGF(50ng/ml)を含むマトリゲルをコーティングしたdishに播種を行った。そののち、細胞播種したあとにも、B27 1%、R-Spondin1(500ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、EGF(50ng/ml)を含むマトリゲルを再度添加し、包埋した上で、1〜22日目までは、Pen/strep、L-glutamine、 B27 2ml/50ml、HEPES(15mM)、R-Spondin1(500ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)、を各々含有するDMEM/F12 advanced培地で培養した。22日目には、再度、B27 1%、R-Spondin1(500ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、EGF(50ng/ml)を含むマトリゲルを上から添加・包埋し、同様の培地で培養することにより腸組織の誘導を行った。培地交換は、2日に1回行った。得られた組織は、任意のタイミングで分散し、同様の手順で再播種することで腸組織を得ることが出来る。なお、腸組織を誘導するために必要なPGECの細胞数は、単一ないし複数個のいずれからでも作製することが可能であった。
(1)PGECからの腸組織誘導プロトコル(図21)
(2)単一細胞より培養したPGECは、顕微鏡観察の結果、積層化した上皮が敷き詰められた立体的なループ状構造を複数認める腸組織へと分化誘導されることが明らかとなった(図22)。
・形態学的観察方法:図2、4、6、15−1上、15−2、17−1、18
位相差顕微鏡 (Olympus)により観察を行った。
・マーカーの遺伝子発現解析:図5、9、15−1下、16−1、20
Quantitative real-time reverse transcription PCR (QRT-PCR) は、 LightCyclera 480 System (Roche) ・LightCyclera 480 SYBR Green I Master mix (Roche)を用いて実験を行った。
・細胞の増殖曲線:図8左
増殖曲線は、継代・播種直後に105cells/well (6 well plate) (D0)になるように播種を行い、3日後に細胞を剥離し細胞数をカウントする操作を繰り返すことにより作成した。
・細胞倍化時間:図8右:
増殖曲線より1次近似により得られた近似曲線における傾きから、任意の二つのタイミングでの細胞数をもとめ、以下の計算式に代入することにより求めた。( (t2 - t1)/3.32 x (log n2 - log n1) where t is time and n number of cells.)
・FACS解析:図10
FACS解析は、Takebe, T. et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013)に記載の方法で実施した。剥離した細胞 (definitive endoderm/PGEC)を蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体(mAbs) で4℃、30分、暗室でインキュベートしたのち、2% FBS を含むPBS で洗浄したのち、MoFlo (DakoCytomation)によって解析を行った。使用した抗体は次のとおりである:allophycocyanin (APC)-conjugated hCD117 (hC-KITAPC); phycoerythrin (PE)-conjugated hCD184 (hCXCR4PE)。
・マーカーの免疫染色:図11、12、16、19
培養した細胞をメタノール・30 分・氷上固定を行い、10% normal goat serum (NGS)にて60分間ブロッキングを行った。次に、1次抗体 (1:200) を添加の後、4°C overnightを行った。PBSによる洗浄操作ののち、適切な二次抗体(Alexa-488, -555, or -647-conjugated secondary antibodies (1:500; Invitrogen))を調製・添加し、室温で60分間反応させた。染色を行った細胞は、核染色 (DAPI) をおこなったのち、 FA mounting fluidにて封入を行った。写真は、Zeiss AxioImager and microscopeにて撮像した。
Giemsa and Periodic acid Schiff (Wako) 染色を、付属の説明書の方法にしたがって染色した。
・ICG uptake:図16右下
DMSOにて、25mg/mlになるようにストックされていたCardiogreen reagent (Sigma Cat# I2633) を、1mg/ml (working concentration) になるように細胞培養用培地(DMEM)に希釈した。培養中のPGEC-MHを、先に調製したDMEM培地(1mg/ml cardiogreen (500μl/24well))に37℃、3〜6時間インキュベートした。そののち、通常の細胞培養用培地に交換した上で、顕微鏡観察によりICGの取り込みを確認した。
・ALB分泌能の測定:図17右
ALB分泌の測定は、Takebe, T. et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013)に記載の方法で実施した。培地交換後、1日目の培地を回収し、Human Albumin ELISA Quantitation Kit (Bethyl Laboratories) を用い、付属の説明書の方法にしたがって計測を行った。
実施例2に記載の方法によって、取得した全遺伝子の網羅的発現解析の結果から、iPSC, DE, PGEC(P0)の3つに対して、PGEC(P1以降)で特異的に、最も大きく発現増加または、減少した遺伝子を抽出した(表5および、図23)。すなわち、PGEC(P1以降)の全サンプルで共通して高発現ないし、低発現を示すマーカー遺伝子のリストを示す。
Claims (5)
- 多能性幹細胞を分化させた後、継代を少なくとも1回以上実施した後に誘導される細胞であって、未分化(多能性)細胞マーカーである、NANOG, OCT4, MYC, LIN28Aが陰性であり、内胚葉細胞マーカーである、CXCR4, CER1, HHEX, GATA4が陰性であり、腸内胚葉細胞マーカーである、CDX2, HOXB9が陽性であり、さらに、間葉系細胞マーカーであるブラキュリ(T)が陰性であり、膵細胞マーカーである、PDX1が陰性であり、継代培養が可能で、かつ、少なくとも肝細胞、膵細胞及び腸細胞に分化しうる細胞。
- 第1の段階で、SFD及びRock Inhibitorの存在下で、第2の段階で、SFD、Activin A及びWnt3aの存在下で、第3の段階で、RPMI、SFD、BMP4、bFGF、VEGF及びActivin Aの存在下で、第4の段階で、SFD、BMP4、bFGF、VEGF及びActivin Aの存在下で、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養して分化させた後、継代を少なくとも1回以上実施することを含む、請求項1記載の細胞の作製方法。
- 継代後の第1の段階で、Rock Inhibitorの存在下で、その後は、SFD、FGF2、VEGF、EGF、A83-01及びChir99021の存在下で培養することを含む、請求項1記載の細胞の増幅方法。
- 請求項1に記載の細胞を臓器細胞へ分化誘導することを含む、臓器細胞の作製方法。
- 請求項1に記載の細胞を任意の段階で凍結・保存し、臓器細胞を製造するためのワーキングセルバンクを構築する方法。
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