KR102453717B1

KR102453717B1 - 원시 장 내배엽 세포 및 그 제작 방법

Info

Publication number: KR102453717B1
Application number: KR1020177018234A
Authority: KR
Inventors: 다카노리 다케베; 히데키 다니구치; 란 란 장
Original assignee: 고리츠다이가쿠호진 요코하마시리츠다이가쿠
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2015-12-08
Publication date: 2022-10-11
Also published as: CN107208056A; EP3239294A1; WO2016093222A1; CA2969194A1; US10370638B2; SG11201704424PA; CA2969194C; US20170335277A1; EP3239294A4; KR20170092637A; JP5777127B1; JP2016106591A; CN107208056B

Abstract

인간 장기 세포를 저렴하게 안정적으로 또한 대량으로 유도하기 위한 기반 기술을 제공한다. 다능성 줄기 세포를 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시한 후에 유도되는 세포로서, 미분화 (다능성) 세포 마커인, NANOG, OCT4, MYC, LIN28A 가 음성이고, 내배엽 세포 마커인, CXCR4, CER1, HHEX, GATA4 가 음성이고, 장 내배엽 세포 마커인, CDX2, HOXB9 가 양성이고, 또한, 간엽계 세포 마커인 브라큐리 (T) 가 음성이고, 췌장세포 마커인, PDX1 이 음성이고, 적어도 간세포, 췌장세포 및 장세포로 분화할 수 있는 세포.
상기 세포의 제작 방법 및 증폭 방법, 상기 세포를 사용하여 장기 세포를 제작하는 방법, 상기 세포를 동결·보존하여, 장기 세포를 제조하기 위한 워킹 셀 뱅크를 구축하는 방법도 제공한다.

Description

원시 장 내배엽 세포 및 그 제작 방법{PRIMITIVE GUT ENDODERM CELLS AND METHOD FOR PRODUCING SAME}

본 발명은 원시 장 (腸) 내배엽 세포 및 그 제작 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 간세포, 췌장세포 및 장세포로 분화 가능한 내배엽 세포 및 그 제작 방법에 관한 것이다.

최근, iPS/ES 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 유도한 조직·장기를 이용하여, 새로운 의약품을 개발하기 위한 창약 (創藥) 스크리닝이나, 상실된 장기의 기능을 보충하는 재생 의료를 실현화하는 것이 주목받고 있다 (Takebe, et al. Nature, 499 : 481-484, 2013 (비특허문헌 1), WO2013/047639 : 조직 및 장기의 제작 방법 (특허문헌 1)).

인간 iPS 세포를 사용한 간 질환에 대한 재생 치료를 실현화하기 위해서는, 「초대량」의 인간 간세포의 GMP 등급의 제조 기술이 필요하게 된다. 예를 들어, 인간 성체 간장의 약 30 ％ 의 기능 대체를 가능하게 하기 위해서는, 환자 1 명에 대하여 간세포수로서 6×10¹⁰ 세포를 이식하여 생착시키는 것이 필수 조건이다. 한편, 이들 초대량의 인간 간세포 제조에 대해서는, 기존의 선행 기술에 의한 분화 유도 프로토콜에 의해서 세포 조제를 시도하는 경우, 이식 효율까지 가미하면, 1 명의 간 이식 대기 환자의 치료에 약 95 억엔이라는 막대한 비용을 필요로 함이, 우리들의 대략적인 비용 계산에 의해 판명되어 있다.

[비특허문헌]

(비특허문헌 1) Takebe, et al. Nature, 499 : 481-484, 2013

[특허문헌]

(특허문헌 1) WO2013/047639 A1

간 질환에 대한 재생 치료 비용의 대부분은, 인간 iPS 세포로부터의 분화 유도에 필요한 사이토카인 등의 분화 유도 인자인 점에서, 대폭적인 비용 삭감을 목표로 함에 있어서는, 인간 iPS 세포로부터 장기 세포로의 분화 과정에 있어서의 매우 중요한 중간 단계로서 「원시 장 내배엽 세포 (Primitive Gut Endoderm Cells : PGECs)」를 설정하는 것이 매우 유리한 전략으로 생각된다. 요컨대, 분화 유도 기간이 대폭 단축되는 것, 분화 유도별 편차의 발생이 최소화되는 것 등에 의해서, 인간 장기 세포를 저렴하게 안정적으로 또한 대량으로 유도하기 위한 기술 기반이 된다.

이러한 기술적 장벽을 해결하는 어프로치로는, 최근, 다음 3 가지 어프로치가 시도되고 있다. (1) iPS 세포로부터 유도한 내배엽 전구 세포 (Cell Stem Cell. 2012 Apr 6 ; 10(4) : 371-84., WO2012178215 A1), (2) 전장 내배엽 세포 (Stem Cell Report, Vol1, 293-306, 2013), (3) 디렉터리 프로그래밍에 의해 얻은 다능성 내배엽 세포 (Nature 508, 93-97, 2014). 각각 (1) ∼ (3) 의 방법에 의해서 제작한 중간 단계의 세포를 증폭하여, 기능 세포의 분화 유도에 사용하는 방법이다. 그러나, (1) 에 있어서는, 마우스 세포를 피더로서 사용하기 때문에 임상 응용하는 것이 어렵다. (2) 에 있어서는, 증폭시킨 세포로부터 유도한 세포의 분화 기능이 현저히 낮은 것, (3) 의 방법에 있어서는, 증폭시키는 세포의 안전성에 과제가 있는 것, 즉, CXCR4 등의 전이 등의 암의 악성도에 관계된 마커 발현이 인정되는 등의 문제로부터 각각의 세포에 있어서, 의료·산업 응용에 사용하기가 어려운 것이 현 상황이었다.

본 발명은 이들 선행 기술의 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 예의 노력한 결과, 상기 (1), (3) 의 세포와 (2) 의 세포의 중간 단계에 있는 「원시 장 내배엽 세포 (Primitive Gut Endoderm Cells : PGECs)」의 유도를 확립하였다. 그리고, 그 세포들을 증폭시킨 후에, 기능 세포로의 분화 유도에도 성공하였다. 본 발명의 원시 장 내배엽 세포 (PGECs) 는, 간세포, 췌장세포 및 장세포로의 분화가 가능하고 (분화 기능이 높다) (상기 (2) 의 세포에 대한 우위성), CXCR4 등의 암의 악성도에 관계된 마커를 발현하지 않으며 (안전성이 높다) (상기 (3) 의 세포에 대한 우위성), 또한, 피더 세포를 사용하지 않고 조제할 수 있기 때문에, 임상 응용이 용이하다 (상기 (1) 의 세포에 대한 우위성) 는 우위성을 갖는다.

본 발명의 요지는 다음과 같다.

(1) 다능성 줄기 세포를 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시한 후에 유도되는 세포로서, 미분화 (다능성) 세포 마커인, NANOG, OCT4, MYC, LIN28A 가 음성이고, 내배엽 세포 마커인, CXCR4, CER1, HHEX, GATA4 가 음성이고, 장 내배엽 세포 마커인, CDX2, HOXB9 가 양성이고, 또한, 간엽계 세포 마커인 브라큐리 (brachyury) (T) 가 음성이고, 췌장세포 마커인, PDX1 이 음성이고, 적어도 간세포, 췌장세포 및 장세포로 분화할 수 있는 세포.

(2) 제 1 단계에서, Rock 저해제 (Rock Inhibitor) 의 존재하에, 제 2 단계에서, Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 3 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재하에 배양하여 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시하는 것을 포함하는, (1) 에 기재된 세포의 제작 방법.

(3) 계대 후의 제 1 단계 또는 계대 첫날에, Rock 저해제의 존재하에, 그 후에는, SFD, FGF2, VEGF, EGF, A83-01 및 Chir99021 의 존재하에 배양하는 것을 포함하는, (1) 에 기재된 세포의 증폭 방법.

(4) (1) 에 기재된 세포를 장기 세포로 분화 유도하는 것을 포함하는, 장기 세포의 제작 방법.

(5) (1) 에 기재된 세포를 임의의 단계에서 동결·보존하여, 장기 세포를 제조하기 위한 워킹 셀 뱅크를 구축하는 방법.

인간 iPS 세포로부터 분화 중도 단계에 상당하는 PGECs 를 비(非)피더 환경하에서 분화 유도하는 것이 가능해졌다. 이 PGECs 는 대량 조제가 가능하고, 이 세포를 사용하여, 기관 원기 (Takebe, et al. Nature, 499 : 481-484, 2013) 를 제조할 수 있다.

유도된 PGECs 는, 종래법에서 필수였던 피더 세포의 비존재하에 있어서도 20 회 이상에 걸쳐 계대 배양을 실시함으로써 10¹⁰ 배로 세포를 증폭시키는 것이 가능하였다. 그리고, 증폭된 세포는 동결 보존에 의한 스톡이 가능하였다.

또한, 간세포, 췌장세포, 장관 세포 등의 여러 가지 기능 세포로의 분화 능력을 갖고 있는 PGECs 는, 종래법에서 과제였던 계대를 반복한 후에도, 높은 기능을 갖는 기능 세포로 분화 유도되었다.

본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원, 특원 제2014-248694호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1 은 인간 iPS 세포 유래 원시 장 내배엽 세포 (Primitive Gut Endoderm Cells, PGECs) 의 유도·증폭·분화법의 개요를 나타낸다. 본 발명에 의해 증폭되는 세포는, 완성 내배엽 (Definitive Endoderm) 이나 내배엽 전구세포 (Endodermal Progenitor) 라고 불리는 세포보다도 (장관계로) 분화된 보다 하류의 세포인 원시 장 내배엽 세포 (Primitive Gut Endoderm Cell, PGEC) 이라는 세포이다. 본 세포는, 내배엽에서 유래하는 모든 세포로 분화 가능한 세포이다. 세포명 (인간 iPSC/ESC, 내배엽 전구세포 (Endoderm progenitor, EP)/완성 내배엽 (Definitive Endoderm, DE), PGECs) 의 아래 또는 우측에는, 그 세포가 발현하는 마커의 종류를 기재하였다.
도 2 는 인간 iPS 세포로부터 계대를 거치지 않은 PGEC 의 초기 분화 유도 프로세스와 세포의 형태학적 관찰을 나타낸다.
도 3 은 Rock 저해제의 첨가에 의해, 계대를 했을 때의 세포의 접착·생착이 대폭 개선되는 것을 나타낸다.
도 4 는 PGEC 계대 후의 유지 및 증식에 유효한 사이토카인·첨가 인자 조합의 검토. M1 ∼ 8 은, 조건의 차이를 나타낸다. 도 5 의 결과와 함께, M2 의 조건이 유효한 것을 나타낸다.
도 5 의 좌측도는, M1 ∼ 8 에 있어서의 유전자 발현량의 비교를, 우측도는, 세포 증식수의 정량 결과를 나타낸다. 세포가 양호하게 증식하는 M2, M4, M6 ∼ 8 의 조건 중, PGEC 마커인 CDX2 가 발현 증강하고, CXCR4, CER1 의 발현이 저하되는 조건은, M2 임이 나타났다.
도 6 은 계대 1 ∼ 20 회째, 및, 계대 5 회째에 있어서의 세포의 형태학적 변화를 현미경 관찰한 결과, 장기적으로 계대를 계속한 후에도 세포의 형태가 유지되는 것을 나타낸다.
도 7 은 계대 10 회째에 있어서 장기 동결 보존을 실시하고, 해동하여 세포 배양을 계속한 후의 형태 관찰의 결과. 해동 후, 계대 20 회 반복한 후에도 세포의 형태가 유지되는 것을 나타낸다.
도 8 은 인간 iPS 세포 유래 PGECs 의 증식 곡선 (도 8, 좌측) 과 세포 배가 시간 (도 8, 우측) 을 나타낸다.
도 9 는 계대 전 (P0) 및 계대 후 (P5, 10, 15, 20) 에 있어서의 인간 iPS 세포 유래 PGEC 마커의 유전자 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 10 은 계대 전 (P0) 및 계대 후 (P5, 15) 에 있어서의 인간 iPS 세포 유래 PGECs 의 FACS 시간 경과적 해석의 결과를 나타낸다.
도 11 은 계대 전 (P0) 및 계대 후 (P1, 10, 15) 에 있어서의 인간 iPS 세포 유래 PGECs 의 면역학적 해석의 결과를 나타낸다.
도 12 는 계대 후 (P5, 10, 15) 에 있어서의 인간 iPS 세포 유래 PGECs 의 면역학적 해석의 결과를 나타낸다.
도 13 은 인간 iPS 세포 유래 PGECs 의 주성분 해석의 결과를 나타낸다.
도 14 는 인간 iPS 세포 유래 PGECs 의 계층적 클러스터링 해석의 결과를 나타낸다.
도 15-1 은 증폭시킨 인간 iPS 세포 유래 PGEC (P6) 를 단계적으로 분화 유도한 간세포의 형태 변화 (도 15-1, 상단) 와 간세포 분화 마커의 유전자 발현 해석의 결과 (도 15-1, 하단) 를 나타낸다.
도 15-2 는 증폭시킨 인간 iPS 세포 유래 PGEC (P6) 를 분화 유도한 간세포의 약(弱)확대 이미지. 광역에 걸쳐 균일한 형태를 나타내는 성숙 간세포가 유도되어 있음을 나타낸다.
도 16 는 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 분화 유도한 간세포 (PGEC-MH) 의 면역학적 해석의 결과 (상단, 좌측), ICG 시험, PAS 염색의 결과 (상단, 우측), 간세포 분화 마커의 발현 (qPCR) 을 나타낸다.
도 17-1 은 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 분화 유도한 간세포 (PGEC-MH) 의 계대 후 (P2, 4, 6, 9) 의 형태학적 관찰을 나타낸다.
도 17-2 는 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 분화 유도한 간세포 (PGEC-MH) 의 계대 후 (P3, 5) 의 마이크로어레이 해석의 결과 (좌측) 및 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 분화 유도한 간세포 (PGEC-MH) 의 계대 전 (P0) 및 계대 후 (P5, 10) 의 ALB 분비능을 나타낸다.
도 18 은 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 단계적으로 유도한 췌장세포의 형태학적 해석의 결과를 나타낸다.
도 19 는 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 분화 유도한 췌장세포의 면역 염색의 결과를 나타낸다.
도 20 은 인간 iPS 세포 유래 PGECs 로부터 분화 유도한 췌장세포의 유전자 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 21 은 PGEC 를 사용한 장 조직의 단계적 유도의 방법의 개요를 나타낸다.
도 22 는 PGEC 로부터 유도한 장 조직의 사진을 나타낸다.
도 23 은 PGEC (P1 이후) 에 특이적인 양성·음성 마커 유전자의 추출. 인간 iPS 세포 유래 PGECs 1 회째의 계대 이후의 특이적 마커의 발현량을 상대 정량한 것을 나타낸다. 양성인 것은 빨강, 음성이 되는 것은 파랑으로 나타낸다.
도 24 는 다양한 iPS 클론으로부터의 원시 장 내배엽 세포 (PGEC) 의 수립. A : 유도된 원시 장 내배엽 세포 (Passage 0 의 제 5 일) 의 현미경 관찰 이미지. 유도에 사용한 iPS 세포로는, 1231A3-, 1383D2-, 1383D6-, Ff-01-, Ff-06- 의 5 종의 상이한 클론을 사용하였다. B : iPS 클론마다의 증식 곡선. 모든 클론에서 유래하는 PGEC 는 적어도 20 회 이상에 걸쳐 계대·증폭을 실시하는 것이 가능하였다.
도 25 는 이식을 실시한 PGEC 의 내배엽 조직 재구축능. A : 이식 1 개월 후의 조직을 적출한 결과, 분명한 기형 종 (腫) 이나 암 등과 같은 종양의 형성을 인정하지 않았다. 흑색 점선 : PGEC 유래의 조직. B : 면역 조직 화학 염색의 결과, PGEC 유래의 조직은, 다양한 인간 내배엽 유래 조직을 형성하였다. 즉, 간장·췌장·장관의 마커에 염색되는 조직을 형성하는 것이 나타났다. 스케일 바 = 50 ㎛.
도 26 은 PGEC 유래의 간싹 (liver bud) 의 장기 배양 후 기능 발현의 검토. A : in vitro 에서 작성한 PGEC 유래 간싹의 현미경 관찰. 스케일 바 = 50 ㎛. B : PGEC 유래 간싹의 알부민 분비능. 인간 알부민은, HCM/EGM 에 의한 분화 유도 4 일째의 단계에서 검출되었다. 그리고, PGEC 단독으로 스페어 배양 (PGEC 만을 회수하여, 바닥에 세포가 모이는 형상을 한 저접착성의 배양 접시에 5×10⁵ 세포/웰/24 웰 플레이트의 밀도로 세포를 파종한 후에, 수일간 배양함으로써 얻은 조직) 을 실시한 조직과 비교하여, 유의하게 높은 알부민 분비능을 나타내는 것이 분명해졌다. 또, 배지 조건을 HCM/EGM 이 아니라, KO-DMEM/EGM 을 사용한 경우에는 알부민 분비가 확인되지 않았다.
도 27 은 분화 유도를 실시한 PGEC 유래 간싹의 암모니아 대사 기능. 분화 유도를 실시한 PGEC 유래 간싹은, 뚜렷한 암모니아 대사 기능을 갖는 것이 분명해졌다.
도 28 은 극증 간부전 모델에 대한 PGEC 유래 간싹 이식에 의한 치료 효과. PGEC 유래 스페어 또는, 간싹을 이식한 군에서는, 비이식군과 비교하여 생존율이 개선되는 것이 판명되었다.
도 29 는 면역 조직 화학 염색에 의한 간세포·담관 상피 세포로의 분화 유도의 확인. A : 이식 1 개월 시점에서 형성된 PGEC 유래 간싹 이식 조직은, 혈관화된 조직이었다. 또한, 기형 종이나 악성 종양을 의심하는 소견은 인정되지 않았다. B : 면역 조직 화학 염색의 결과로부터, 인간 핵 특이적 항원, 인간 알부민 (간세포), 인간 CK7 (담관 상피 세포), 인간 CD31 (혈관) 에 염색성을 나타내는 간 조직이 형성된 것이 판명되었다. 스케일 바 = 50 ㎛.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 다능성 줄기 세포를 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시한 후에 유도되는 세포로서, 미분화 (다능성) 세포 마커인, NANOG, OCT4, MYC, LIN28A 가 음성이고, 내배엽 세포 마커인, CXCR4, CER1, HHEX, GATA4 가 음성이고, 장 내배엽 세포 마커인, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, CDX2, HOXA9, HOXB9, HOXC9 가 양성이고, 또한, 간엽계 세포 마커인 브라큐리 (T) 가 음성이고, 췌장세포 마커인, PDX1 이 음성이고, 적어도 간세포, 췌장세포 및 장세포로 분화할 수 있는 세포 (이하, 본 명세서에 있어서, 원시 장 내배엽 세포, Primitive Gut Endoderm Cells, PGE 또는 PGECs 로 기재하는 경우도 있다) 를 제공한다.

본 발명의 세포 (PGECs) 는 다능성 줄기 세포를 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시한 후에 유도된다. 다능성 줄기 세포란, 생체의 여러가지 조직으로 분화되는 능력 (분화 만능성) 을 잠재적으로 가진 세포로서, 구체적으로는, 내배엽, 중배엽, 외배엽의 모두로 분화 가능한 세포를 가리키며, 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포), 배성 (胚性) 줄기 세포 (ES 세포) 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다능성 줄기 세포는 인간 유래의 것이면 좋지만, 인간 이외의 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 개, 돼지, 원숭이, 양, 소, 새 등의 동물 유래여도 된다.

다능성 줄기 세포를 분화시키기 위해서는, 제 1 단계에서, Rock 저해제의 존재하에, 제 2 단계에서, Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 3 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재하에 배양하면 되고, 예를 들어, 배양 첫날을 제 0 일로 하여, 제 0 일은, Rock 저해제의 존재하에, 제 1 일은 Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 2 일 - 제 3 일은, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 일 - 제 5 일은, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 피더 세포 비존재하에 다능성 줄기 세포를 배양하면 되지만, 분화의 방법은 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지로는, SFD 배지, RPMI 배지, 그 조합 등을 사용하면 된다.

계대는 적어도 1 회 이상 실시한다. 계대 횟수 (Passage Number) 는, 본 발명의 세포 (PGECs) 가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1 ∼ 30 회이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 20 회이다. 다능성 줄기 세포를 분화시킨 후, 계대를 시작하는 타이밍은, 세포가 배양 접시를 차지하는 비율 (컨플루언시) 이 80 ∼ 90 ％ 정도의 상태가 되었을 때가 좋다. 이 상태는, FACS 로 해석을 하면, 도 10 과 같이, c-kit, CXCR4 와 같은 항원이 대략 (80 ％ 이상) 양성인 세포 집단이다. 그러나, 본 발명자들은, c-kit, CXCR4 가 음성인 것도 일괄하여 계대하는 방법을 채택하고 있어 (프로세스가 단순·간편), 분리를 할 필요성이 없다는 점도 본 방법의 유리한 점이라고 말할 수 있다.

계대는, SFD 에, A83-01, CHIR, VEGF, EGF, FGF2 를 첨가한 배지에서 실시하면 되지만, 이 배지에 한정되는 것은 아니다.

계대 후, CDX2, HOXB9 등의 HOX 유전자군이 유도되는 것이 관찰되었다.

세포의 배양은, 37 ℃, 5％ CO₂ 의 배양용 인큐베이터에서 실시하면 된다.

본 발명의 실시 양태로서, 예를 들어, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Rock 저해제 (1-20 μM, 바람직하게는 10 μM) 를 첨가한 배지에 다능성 줄기 세포 (2 ∼ 6×10⁵ 개) 를 파종하고 (제 0 일), 1 일간 배양한 후, SFD 배지 (1.5-4 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Wnt3a (1-100 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여 (제 1 일), 다시 1 일간 배양한다. 이어서, SFD 배지와 RPMI1640 배지를 1 : 1 ∼ 1 : 10 (바람직하게는 1 : 9) 의 비율로 혼합하고, 그 배지에 BMP4 (0.5-4 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (5-50 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 2 일 - 제 3 일). 그 후 다시 SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 BMP4 (0.5-5 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 4 일 - 제 5 일). 배양 후의 세포를 P0 세포 (계대 (passage) 0) 로 하여, 계대를 실시한다. 예를 들어, P0 세포 (500 ∼ 4×10⁵ 개, 바람직하게는 1×10⁵ 개) 를 PGE 유지 배지에 파종하고, 그 후, 배지 교환을 3 ∼ 4 일에 1 회 실시한다. PGE 유지 배지는, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 FGF2 (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖), EGF (10-40 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖), A83-01 (0.1-1 μM, 바람직하게는 0.5 μM), Chir99021 (1-5 μM, 바람직하게는 3 μM) 을 첨가한 것이다.

본 발명의 별도의 실시 양태로서, 예를 들어, B27 (2 ％) 첨가 RPMI/1640 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Rock 저해제 (1-20 μM, 바람직하게는 10 μM) 를 첨가한 배지에 다능성 줄기 세포 (2 ∼ 6×10⁵ 개) 를 파종하고 (제 0 일), 1 일간 배양한 후, B27 (2 ％) 첨가 RPMI/1640 배지 (1.5-4 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Wnt3a (1-100 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여 (제 1 일), 다시 1 일간 배양한다. 이어서, B27 (2 ％) 첨가 RPMI/1640 배지 (1.5-4 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 BMP4 (0.5-4 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (5-50 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 2 일 - 제 3 일). 그 후 다시 SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 BMP4 (0.5-5 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 4 일 - 제 5 일 또는 제 4 일). 배양 후의 세포를 P0 세포 (passage 0) 로 하여, 계대를 실시한다. 예를 들어, P0 세포 (500 ∼ 4×10⁵ 개, 바람직하게는 1×10⁵ 개) 를 PGE 유지 배지에 파종하고, 그 후, 배지 교환을 3 ∼ 4 일에 1 회 실시한다. PGE 유지 배지는, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 FGF2 (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖), EGF (10-40 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖), A83-01 (0.1-1 μM, 바람직하게는 0.5 μM), Chir99021 (1-5 μM, 바람직하게는 3 μM) 을 첨가한 것이다.

본 발명의 세포 (PGECs) 는, 미분화 (다능성) 세포 마커인, NANOG, OCT4, MYC, LIN28A 가 음성이고, 내배엽 세포 마커인, CXCR4, CER1, HHEX, GATA4 가 음성이고, 장 내배엽 세포 마커인, CDX2, HOXB9 가 양성이고, 또한, 간엽계 세포 마커인 브라큐리 (T) 가 음성이고, 췌장세포 마커인, PDX1 이 음성이다. 이 밖에, 장 내배엽 세포 마커인, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXA9 및 HOXC9 가 양성이고, 간엽계 세포 마커인, PDGFRA 가 음성이고, 간세포 마커인, ALB 가 음성인 것이 바람직하다.

본 발명의 세포 (PGECs) 는, 간세포, 췌장세포, 장세포 등의 장기 세포로 분화할 수 있다. 간세포, 췌장세포 또는 장세포로의 분화 유도는, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 장기 세포가 간세포인 경우, 예를 들어, FBS, HGF, OSM 및 DEX 의 존재하에, 본 발명의 PGECs 를 배양함으로써, 간세포로 분화 유도할 수 있다 (후술하는 실시예 참조). 장기 세포가 췌장세포인 경우, 예를 들어, L-글루타민, 글루코오스, 아스코르브산, SB431542, 2-M 인슐린 및 니코틴아마이드의 존재하에, 본 발명의 PGECs 를 배양함으로써, 췌장세포로 분화 유도할 수 있다 (후술하는 실시예 참조). 장기 세포가 장세포인 경우, 예를 들어, B27, R-Spondin1, 노긴 (Noggin) 및 EGF 의 존재하에, 본 발명의 PGECs 를 배양하여, 장세포로 분화 유도할 수 있다 (후술하는 실시예 참조).

본 발명의 세포 (PGECs) 는, 동결 보존이 가능하다. 동결 보존의 타이밍은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 계대 횟수 1 ∼ 20 회 후이고, 보다 바람직하게는 계대 횟수 2 ∼ 10 회 후이다.

일반적인 세포 동결·해동의 방법에 준하면 되는 것이 본 세포의 이점이지만, 특히, 보존용 용매에 혼합한 후에 동결하기까지의 작업 및 보존 후의 동결 세포를 융해할 때의 조작을 신속하게 실시하는 것이 중요하다.

본 발명의 세포 (PGECs) 는 동결 보존이 가능하기 때문에, 임상·창약 응용에 사용되는 내배엽에서 유래하는 세포·조직·장기를 제조할 때에, 워킹 셀 뱅크로서의 이용이 가능하다. 따라서, 본 발명은, PGECs 세포를 임의의 단계에서 동결·보존하여, 장기 세포를 제조하기 위한 워킹 셀 뱅크를 구축하는 방법도 제공한다.

본 발명의 세포 (PGECs) 를 제작하기 위해서는, 제 1 단계에서, Rock 저해제의 존재하에, 제 2 단계에서, Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 3 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재하에 배양하여 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시하면 되고, 예를 들어, 배양 첫날을 제 0 일로 하여, 제 0 일은 Rock 저해제의 존재하에, 제 1 일은 Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 2 일 - 제 3 일은 BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 일 - 제 5 일은 BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 피더 세포 비존재하에 다능성 줄기 세포를 배양하여 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시하면 되지만, 본 발명의 세포 (PGECs) 의 제작 방법은 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지로는, SFD 배지, RPMI 배지, 그 조합 등을 사용하면 된다.

계대에 대해서는, 전술한 바와 같다.

세포의 배양은, 37 ℃ , 5％ CO₂ 의 배양용 인큐베이터애서 실시하면 된다.

본 발명의 실시 양태로서, 예를 들어, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Rock 저해제 (1-20 μM, 바람직하게는 10 μM) 를 첨가한 배지에 다능성 줄기 세포 (2 ∼ 6×10⁵ 개) 를 파종하고 (제 0 일), 1 일간 배양한 후, SFD 배지 (1.5-4 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Wnt3a (1-100 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여 (제 1 일), 다시 1 일간 배양한다. 이어서, SFD 배지와 RPMI1640 배지를 1 : 1 ∼ 1 : 10 (바람직하게는 1 : 9) 의 비율로 혼합하고, 그 배지에 BMP4 (0.5-4 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (5-50 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 2 일 - 제 3 일). 그 후 다시 SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 BMP4 (0.5-5 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 4 일 - 제 5 일). 배양 후의 세포를 P0 세포 (passage 0) 로 하여, 계대를 실시한다. 예를 들어, P0 세포 (500 ∼ 4×10⁵ 개, 바람직하게는 1×10⁵ 개) 를 PGE 유지 배지에 파종하고, 그 후, 배지 교환을 3 ∼ 4 일에 1 회 실시한다. PGE 유지 배지는, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 FGF2 (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖), EGF (10-40 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖), A83-01 (0.1-1 μM, 바람직하게는 0.5 μM), Chir99021 (1-5 μM, 바람직하게는 3 μM) 을 첨가한 것이다.

본 발명의 별도의 실시 양태로서, 예를 들어, B27 (2 ％) 첨가 RPMI/1640 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Rock 저해제 (1-20 μM, 바람직하게는 10 μM) 를 첨가한 배지에 다능성 줄기 세포 (2 ∼ 6×10⁵ 개) 를 파종하고 (제 0 일), 1 일간 배양한 후, B27 (2 ％) 첨가 RPMI/1640 배지 (1.5-4 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 Wnt3a (1-100 ng/㎖, 바람직하게는 50 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여 (제 1 일), 다시 1 일간 배양한다. 이어서, B27 (2 ％) 첨가 RPMI/1640 배지 (1.5-4 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 BMP4 (0.5-4 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (5-50 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 2 일 - 제 3 일). 그 후 다시 SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 BMP4 (0.5-5 ng/㎖, 바람직하게는 2 ng/㎖), bFGF (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖) 및 Activin A (50-150 ng/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양한다 (제 4 일 - 제 5 일 또는 제 4 일). 배양 후의 세포를 P0 세포 (계대 (passage) 0) 로 하여, 계대를 실시한다. 예를 들어, P0 세포 (500 ∼ 4×10⁵ 개, 바람직하게는 1×10⁵ 개) 를 PGE 유지 배지에 파종하고, 그 후, 배지 교환을 3 ∼ 4 일에 1 회 실시한다. PGE 유지 배지는, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 FGF2 (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖), EGF (10-40 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖), A83-01 (0.1-1 μM, 바람직하게는 0.5 μM), Chir99021 (1-5 μM, 바람직하게는 3 μM) 을 첨가한 것이다.

또한, 본 발명의 세포 (PGECs) 를 증폭시키기 위해서는, 계대 후의 제 1 단계 또는 계대 첫날에, Rock 저해제의 존재하에, 그 후에는, SFD, FGF2, VEGF, EGF, A83-01 및 Chir99021 의 존재하에 배양하면 되고, 예를 들어, 계대 후의 배양 첫날을 제 0 일로 하여, 제 0 일은 Rock 저해제의 존재하에, 그 후에는, SFD, FGF2, VEGF, EGF, A83-01 및 Chir99021 의 존재하에 배양함으로써 증폭시키면 되지만, 본 발명의 세포 (PGECs) 의 증폭 방법은, 이 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시 양태로서, 예를 들어, 계대 후의 배양 첫날 또는 계대 첫날을 제 0 일로 하여, PGEC 세포 (500 ∼ 4×10⁵ 개, 바람직하게는 1×10⁵ 개) 를 Rock 저해제 첨가 (1-100 μM, 바람직하게는 10 μM) PGE 유지 배지에 파종하고 (제 0 일), 다음날 PGE 유지 배지로 배지 교환을 한다. 배지 교환을 3 ∼ 4 일에 1 회 실시한다. PGE 유지 배지는, SFD 배지 (1.5-2 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖) 에 FGF2 (5-10 ng/㎖, 바람직하게는 5 ng/㎖), VEGF (8-20 ng/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖), EGF (10-40 ng/㎖, 바람직하게는 20 ng/㎖), A83-01 (0.1-1 μM, 바람직하게는 0.5 μM), Chir99021 (1-5 μM, 바람직하게는 3 μM) 을 첨가한 것이다.

본 발명의 세포 (PGECs) 를 제작 및/또는 증폭시키기 위해서는, 겔 등의 지지체 상에서 배양하면 된다. 지지체로는, 30 배 희석 마트리겔을 사용하는 것이 바람직하지만, 그것에 한정되지는 않는다. 다른 지지체로는, 예를 들어, 라미닌 및 그 유도체, 비트로넥틴, 아가로오스겔, 아크릴아미드겔, 하이드로겔, 콜라겐겔, 우레탄겔 등을 예시할 수 있다.

또, 본 발명은 본 발명의 세포 (PGECs) 를 사용하여, 간세포, 췌장세포, 장세포 등의 장기 세포를 제작하는 방법도 제공한다. 간세포, 췌장세포 또는 장세포로의 분화 유도는, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 장기 세포가 간세포인 경우, 예를 들어, FBS, HGF, OSM및 DEX 의 존재하에, 본 발명의 PGECs 를 배양함으로써, 간세포로 분화 유도할 수 있다 (후술하는 실시예 참조). 장기 세포가 췌장세포인 경우, 예를 들어, L-글루타민, 글루코오스, 아스코르브산, SB431542, 2-M 인슐린 및 니코틴아마이드의 존재하에, 본 발명의 PGECs 를 배양함으로써, 췌장세포로 분화 유도할 수 있다 (후술하는 실시예 참조). 장기 세포가 장세포인 경우, 예를 들어, B27, R-Spondin1, 노긴 및 EGF 의 존재하에, 본 발명의 PGECs 를 배양하여, 장세포로 분화 유도할 수 있다 (후술하는 실시예 참조). 본 발명의 세포 (PGECs) 는 간세포, 췌장세포 및 장세포 이외의 장기 세포, 예를 들어, 폐 세포, 갑상선 세포, 소화관 분비선 세포, 복막 세포, 흉막 세포, 후두 세포, 이관·기관·기관지 세포, 요로 세포로도 분화될 수 있다. 본 발명의 세포로부터 장기 세포를 분화 유도하기 위해서는, 본 발명의 세포를 겔 등의 지지체 상에서 배양하면 된다. 지지체로는, 평면에서의 분화 유도를 시도하는 경우에는 30 배 희석 마트리겔을 사용하는 것이 바람직하고, 입체로 기관 원기 제작에 의한 분화 유도를 시도하는 경우에는, 겔 (예를 들어, 원액 ∼ 4 배 희석 마트리겔 (등록 상표), 아가로오스겔, 아크릴아미드겔, 하이드로겔, 콜라겐겔, 우레탄겔 등) 을 사용하는 것이 바람직하지만, 그것에 한정되지는 않는다. 본 발명의 세포로부터 분화 유도된 장기 세포는, 기능성이 높을 뿐 아니라, 종래의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도한 것에 비교하여 균질성이 매우 높다 (후술하는 실시예 참조).

본 발명의 세포 (PGECs) 부터 제작한 장기 세포를 사용하여, 조직이나 장기를 제작할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 (PGECs) 부터 제작한 장기 세포를 혈관 내피 세포 및 간엽계 세포와 공배양하여 기관싹을 제작하고, 이것을 생체 내에 이식함으로써, 조직이나 장기를 제작할 수 있다 (Takebe, et al. Nature, 499 : 481-484, 2013 (비특허문헌 1), WO2013/047639 : 조직 및 장기의 제작 방법 (특허문헌 1)).

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1] iPS 세포로부터 PGEC 의 증폭법

[실험 방법]

마트리겔 코팅 상에서 배양한 iPS 세포 (제대 (臍帶) 로부터 독자적으로 수립한 iPS 세포, 및, TkDA3 (도쿄 대학에서 제공)) 를 아큐타제 (Accutase) 에 의해 박리하여 회수하였다. SFD 배지에 Rock 저해제 (10 uM) 를 첨가한 배지를 사용하여 마트리겔 코팅한 6 웰 플레이트에 2 ∼ 6×10⁵ 세포/웰로 파종하여, 1 일간 배양하였다. 배양 후, SFD 배지에 Wnt3a (50 ng/㎖) 및 Activin A (100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 다시 1 일간 배양하였다. 이어서, SFD 배지와 RPMI1640 배지를 1 : 9 의 비율로 혼합하고, 그 배지에 BMP4 (0.5 ng/㎖), bFGF (5 g/㎖), VEGF (10 ng/㎖) 및 Activin A (100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양하였다. 그 후 다시 SFD 배지에 BMP4 (0.5 ng/㎖), bFGF (5 ng/㎖), VEGF (10 ng/㎖) 및 Activin A (100 ng/㎖) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 2 일간 배양하였다. 배양 후의 세포를 PGE P0 으로 하여, PGE 유지 배지에서 계대를 실시하였다.

아큐타제 (Accutase) 에 의해 PGE P0 의 세포를 박리하여, P0 세포를 회수하였다. 회수한 세포의 2/3 양의 세포를 Rock 저해제 (10μM) 를 첨가한 PGE 유지 배지를 사용하여 마트리겔 코팅한 6 웰 프레이트에 파종하였다. 다음날, 세포를 다시 회수하고, Rock 저해제 (10μM) 를 첨가한 PGE 유지 배지를 사용하여 60 ㎜ 디시 (dish) 에 전량 파종하였다. 다음날 세포를 관찰하여, 세포가 80 ％ 컨플루언스 이하인 경우에는 PGE 유지 배지로 배지 교환을 실시하고, 세포가 80 ％ 컨플루언스 이상인 경우에는 계대를 실시하였다. 계대는 P5 까지는 1/3 ∼ 1/2 의 비율로 계대를 실시하는 것이 바람직하다. 증식이 빠른 경우에는 그 이하여도 된다. 계대할 때에는 마트리겔 코팅한 디시에 Rock 저해제 (10 nM) 를 첨가한 PGE 유지 배지를 사용하여 세포를 파종하고, 다음날 PGE 유지 배지로 배지 교환을 하였다. 배지 교환은 3 ∼ 4 일에 1 회 실시하였다. 100 ㎜ 디시에 3×10⁵ 세포/디시로 파종하면 3 ∼ 4 일에 컨플루언스가 되었다. 단, 계대의 타이밍은, 그 때의 세포의 상태를 확인하면서 타이밍을 지적화 (至適化) 한다.

※ 또, 상기 PGE 분화 유도 및 간장 분화 유도에 사용하는 시약을, 다음 표 1 ∼ 3 에 나타낸다.

2. PGE 분화 유도 및 유지에 필요한 배지의 조제

PGE 분화 유도 및 PGE 유지에 필요한 기초 배지 (이하 SFD 배지) 및 PGE 유지 배지를 조제한다. 표 2 및 표 3 에 SFD 배지, PGE 유지 배지의 조성을 나타낸다.

3. 마트리겔 코팅

마트리겔 그로우스 팩터 리듀스를 RPMI 에 의해 1/30 로 희석하였다. 희석한 용액을 하기 표 4 에 따라서 필요량을 배양 접시에 첨가하고, 전체면에 고르게 퍼지게 하였다. 실온에서 약 2 시간 방치하였다. 희석 용액을 튜브에 회수하고, RPMI 를 희석 용액과 등량 첨가하였다 (이 코팅 작업을 이하 마트리겔 코팅이라고 한다). 희석액은 3 회째까지 사용 가능하였다. 세포를 파종할 때에는 마트리겔 코팅을 실시하였다.

4. PGEC 세포의 동결 보존과 해동법

동결 보존

PGEC 가 90 ％ 컨플루언스가 된 상태로 (100 ㎜ 디시 (dish) 당 3 ∼ 4×10⁶ 세포 정도), 100-㎜ 디시 당, 3 ㎖ 무균 (sterile) Ca+/Mg+-프리 PBS 로 세정하였다. 그 후, 1.5 ㎖ 아큐타제를 첨가하여, 37 ℃, 5％ CO₂ 인큐베이터 안에서 2 ∼ 5 분 처리를 실시하였다. 그 후, 즉시 9 ㎖ 의 DMEM-F12 로 중화한 후 50 ㎖ 코니컬 튜브에 회수하였다. 세포를 카운트한 후 80 ∼ 90 g, 5 분으로 원심분리를 실시하였다. 상청을 폐기한 후, 5×10⁵ 세포 당 1 ㎖ 가 되도록 조제한 셀 뱅커 (cell banker-1) 로 부드럽게 현탁하여, 1 ㎖ 씩의 세포 현탁액을 동결 보존용 튜브로 옮겼다. 이소프로판올로 채워진 1 ℃ 의 동결용 컨테이너에 튜브를 탑재하여 (뚜껑이 꼭 닫혀 있는 것을 확인), -80 ℃ 의 냉동고에서 1 일 가만히 정지시켜 두었다. 다음날, 액체 질소 탱크로 이동시켜, 보존하였다. 본 법에 있어서는 장기적인 보존이 가능한데, 2 년 이상의 보존이 가능할 것으로 생각된다.

해동

액체 질소 탱크로부터 꺼낸 PGEC 함유 동결 튜브를 꺼내어, 미리 37 ℃ 로 설정한 워터 배스에서 급속 융해하였다. 동결 세포가 완전히 해동되기 직전이 되면 (< 1 분 이내) 워터 배스로부터 꺼내어, 즉시 안전 캐비넷 안에서 70 ％ 에탄올로 주위를 닦은 후, 세포를 미리 데워둔 9 ㎖ 의 DMEM-F12 와 함께 원심용 코니컬 튜브로 옮겼다. 80 ∼ 90 g, 5 분간의 원심에 의해 세정을 실시하여, 2×10⁴ 세포 당 1 ㎖ 가 되도록 조제한 10μM Rock 저해제가 함유된 PGE 유지 배지에서 현탁, 매트리젤 (Matrigel) (성장-인자 감소 (growth-factor reduced)) (1 : 30 의 희석) - 코팅 완료된 100 ㎜ 디시에 전체량이 10 ㎖ 가 되도록 파종을 실시하였다 (= 2×10⁵ 세포/100 ㎜ 디시). 37 ℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 배양을 실시하고, 다음날로부터는 PGE 유지 배지 (Rock 저해제 없음) 에서 2 일마다 배지 교환을 실시하여 증식시켰다.

[실험 결과]

(1) 본 실시예에 있어서의 개요를 나타낸다 (도 1). 본 발명에 의해 증폭되는 세포는, Definitive Endoderm (D'Amour, K.A. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature biotechnology 23, 1534-1541 (2005)., Iwashita, H. et al. Secreted Cerberus1 as a Marker for Quantification of Definitive Endoderm Differentiation of the Pluripotent Stem Cells. PloS one 8, e64291 (2013)., Si-Tayeb, K. et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305 (2010).) 나 Endodermal Progenitor (Cheng, X. et al. Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell stem cell 10, 371-384 (2012).) 라고 불리는 세포보다도 (장관계로) 분화된 보다 하류의 세포인 Primitive Gut Endoderm Cell (PGEC) 이라는 세포이다. 본 세포는, 내배엽에서 유래하는 모든 세포로 분화 가능한 세포이다.

(2) 인간 iPS 세포로부터 계대를 거치지 않은 PGEC 의 초기 분화 유도 프로세스의 세포의 형태학적 관찰 (도 2). 인간 iPS 세포의 미분화성이 충분히 유지되고 있음을 콜로니의 형태·OCT4, SOX2 의 면역 염색에 의해 확인하였다(제 0 일). 다음으로, 미분화 상태가 유지된 iPS 세포를 Activin A 및 기재된 분화 인자에 순차적으로 노출시켜, 완성 내배엽 (Definitive Endoderm) 으로의 유도를 실시하였다. 6일째에는, 많은 세포가 비대화된 핵을 가진 포석 (鋪石) 형상의 완성 내배엽 (Definitive Endoderm) 세포로 분화 유도되었다.

(3) PGEC 의 계대 직후에 있어서의 ROCK 저해제의 유용성의 검토 (도 3). 사진 (도 3 상측) 은, 형광 표지한 PGEC 세포를 계대하여, 제 3 일 시점에서의 배양 접시의 전체 이미지를 촬영한 것. AAVS1 : : EGFP-iPS 세포 (TkDA) 를 사용하여 유도한 PGEC 를 계대 후, EGFP 의 형광에 의해서 생존·접착·증식을 평가하였다. 플레이팅 첫날에 Rock 저해제를 첨가함으로써 세포의 생존·접착이 항진되었다. 한편, Rock 저해제 비존재하에는, 많은 세포는 생존할 수 없었다 (도 3, 상측). 플레이팅 후 3 일째에 세포수를 계수한 결과, Rock 저해제 노출군에서는 세포수가 뚜렷하게 많아, 증식이 항진되어 있는 것으로 생각되었다(도 3, 하측). 가로축은, 웰마다의 데이터 (n) 를 나타낸다.

(4) 계대 후의 PGEC 의 증폭에 유용한 액성 인자의 검토 (도 4, 5). 유도한 완성 내배엽 (definitive endoderm) 세포를, 상이한 사이토카인·저분자 화합물을 조합한 배지 조건으로 배양을 실시하여, 최적의 조건을 탐색하였다. 3 일째에 얻어진 세포의 형태를 도 4 에, 유전자 발현 해석의 결과를 도 5 좌측에, 세포수를 도 5 우측에 나타내었다. 그 결과, 세포가 양호하게 증식하기 위해서는 CHIR99021 이, 또한, 원시 장 내배엽 (PGEC) 마커 (CDX2) 양성·완성 내배엽 마커 (definitive endoderm marker) (CXCR4 ·CER1) 음성의 세포를 유도하기 위해서는, FGF2, BMP4, VEGF, CHIR99021 및 A83-01 이 필요하였다. 따라서, PGEC 의 유도에는, FGF2, BMP4, VEGF, CHIR99021 및 A83-01 이 필수적임이 판명되었다.

* P1 : 계대 1 (passage 1), M1-M8 : 배지 조성의 차이 (#1 - #8) 를 나타낸다. 각 배지 조성은 사진의 바로 아래에 기재된 바와 같다.

(5) 계대 배양을 반복한 PGEC 의 형태학적 관찰 (도 6). 도 6 상단은, PGEC-P1, P10, P20 의 시점에 있어서 계대 후 5 일째의 배양 세포의 관찰 결과를 나타낸다. FGF2, BMP4, VEGF, CHIR99021 및 A83-01 의 존재하에 증폭을 실시한 결과, 20 회 이상에 걸쳐 계대를 거듭한 상태라도, 증식이 계속됨과 함께, PGEC 에 특징적인 상피 형상의 구조가 유지되고 있는 것을 확인하였다. 도 6 하단은, P5 의 단계에 있어서, 계대 후 1 일에서 5 일째까지의 사이에 증식하는 과정을 나타낸다.

또한 본 세포는, 방법에 기재된 순서로, 임의의 타이밍에 동결 보존이 가능하고, P10 시점에서 3 개월간 보존한 세포를 해동 후, 재차 20 계대 정도의 증폭이 가능하다는 것이 밝혀져 있다 (도 7). 도 7 상단은, P10 시점에서 동결 보존·해동한 PGEC 를 추가로, 1 계대 (P1), 10 계대 (P10), 20 계대 (P20) 한 것을 제 0 일에서 증폭시킨 후의 형태를 나타낸다. 어느 것에 있어서도, 동결 보존을 거치지 않은 PGEC 과 동일한 상피 형상의 세포 증식을 확인할 수 있었다. 도 7 하단은, P10 시점에서 동결 보존·해동한 PGEC 를 5 계대 (P5) 한 것을 제 1 일, 제 3 일 , 제 5 일에서 증폭시킨 후의 형태를 나타낸다. 증식능에 대해서도, 양호하게 유지되고 있음이 판명되었다.

(6) 인간 iPS 세포 유래 PGEC 의 증식 곡선 (도 8, 좌측) 과 세포 배가 시간 (도 8, 우측). 본 결과로부터, 적어도 20 회 이상의 계대가 가능하고, 동결 (stock) 후에도 이들이 20 회 이상 계대하는 것이 가능하였다.

(7) 계대 전 (P0) 및 계대 후 (P5, 10, 15, 20) 에 있어서의 PGEC 마커의 유전자 발현 해석. 계대 후 (P5, 10, 15, 20) 의 세포는, CDX2+/CER1-/CXCR- 였다 (도 9). 내배엽 마커인 SOX17, FOXA2 는 유지되어 있었다. 내배엽 마커인 GATA4 는 유지되어 있지 않았다.

(8) 계대 전 (P0) 및 계대 후 (P1, 10, 15, 20) 에 있어서의 세포의 특성 해석. FACS (Flow cytometry) 해석의 결과, 계대 전 (P0, 제 5 일) 의 세포는 대부분이 내배엽 전구세포 (Endoderm Progenitor) 또는, 완성 내배엽 마커 (Definitive Endoderm Marker) 인 C-KIT, CXCR4 공(共)양성인데 반하여, 계대 후 (P5, 15) 의 세포는 음성이었다 (도 10). PGEC 마커인 CDX2 의 면역 염색의 결과, 계대 전 (P0) 에서는 발현을 인정하지 않았던 것에 반하여, 계대 후 (P1, 10, 15) 에는 양성으로 유지되어 있었다 (도 11). 한편, 내배엽 마커인 FOXA2, SOX17, HNF4A 는 양성이었다. 그리고, 다능성 줄기 세포 마커인 NANOG, OCT4 는 음성이었다 (도 12).

(9) 공배양시 (HUVECs (Lonza, cat. no.191027), hMSCs (Lonza, cat. no. PT-2501)), 배양액으로서 내피 세포 배지가 아니라, Hepatocyte Medium (XenoTech), 또는 BMP4 및 FGF2 를 첨가한 간세포 유도 배지 (Hepatology, 51(1), 297-305,2010) 를 사용한 경우에는, 간싹에 특징적인 유전자 발현의 증강 (Alb, TTR 등) 은 인정되지 않았다.

[실시예 2] 마이크로어레이 해석에 의한 분화 단계의 상세 해석

[실험 방법]

전 RNA 는, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) 를 사용하여, 인간 iPSC-PGEC 유래 세포 (PGEC (P0), PGEC (P1 ∼ P16 의 각종 세포) 및 PGEC 로부터 분화 유도한 간세포 (PGEC-MH) (후술하는 실시예 3 에서 분화 유도한 세포)) 로부터 조제하였다. 대조군으로서, 인간 iPSC 유래 세포 (hiPSC, iPSC-DE (완성 내배엽 (Definitive Endoderm)), iPSC-HE (간 내배엽 (Hepatic Endoderm)) iPSC-IH (미성숙 간세포 (Immature Hepatocyte)), iPSC-MH (성숙 간세포 (Mature Hepatocyte)), iPSC-LB (간 싹 (Liver Bud)) (각 세포의 정의는 이하의 2 개의 논문에 기재 : Si-Tayeb, K. et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305 (2010)., Takebe, T. et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013)., Takebe, T. et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature protocols 9, 396-409 (2014)) 및, 인간 성체 간장 (Lot No. : B308121, Biochain Institute, Hayward, CA, USA) 에서 얻은 RNA 를 해석하였다. cRNA 를 증폭시켜, Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) 를 사용하여 표지하고, 44 K 의 60 량체 올리고 마이크로어레이 (Human Gene E×pression 4×44 K v2 Microarray Kit ; Agilent Technologies) 에 제조자의 지시에 따라 하이브리다이즈시켰다. 하이브리다이즈시킨 마이크로어레이 슬라이드를, Agilent High-Resolution Microarray Scanner 를 사용하여 스캔하였다. Feature E×traction Software 버전 10.7.3.1 (Agilent Technologies) 을 사용하여, 상대 하이브리다이제이션 강도 및 백그라운드 하이브리다이제이션값을 계산하였다. Agilent Technologies 가 권장하는 순서에 따라서 GeneSpring 11.5.1 Software 중의 플래그 기준을 사용하여, 라이브 시그널 강도 및 각 프로브의 플래그를 하이브리다이제이션 강도 및 스폿 정보로부터 계산하였다. 그리고, 샘플의 라이브 시그널 강도를 log2 변환하여, 변위값 알고리즘에 의해서 정규화하였다. 우리들은 모든 샘플에, 「타협한」 (compromised) 플래그를 제외하고 프로브를 선택하여, 검출된 유전자로서 34,183 개의 프로브를 얻었다. 얻어진 발현 데이터로부터, 75 ％ shiftile & median 보정한 데이터를 사용하여, 주성분 해석, 계층적 클러스터링법에 의해서 샘플의 분화 단계를 분류하였다.

[실험 결과]

주성분 해석의 결과 (도 13) 및, 계층적 클러스터링의 결과 (도 14) 를 나타낸다. 계대 전의 PGEC (P0) 는, iPSC-DE (완성 내배엽 (Definitive Endoderm) 이나 내배엽 전구세포 (Endodermal Progenitor)) 에 상당하는 세포임이 판명되었다. 한편, 계대 후 (P1 ∼ P15) 의 세포는, iPSC-HE 에 가까운 분화 단계의 세포이고, 이들은 다시 분화된 iPSC-MH 나, PGEC-MH 이전의 분화 상태에 있는 것이 나타났다. 이상으로부터, 한번이라도 계대를 거침으로써 증폭되는 세포는, iPSC-DE 와 iPSC-HE 의 중간에 위치하는 분화 단계의 세포인 것이 분명해졌다.

[실시예 3] PGEC 로부터 간세포로의 분화

[실험 방법]

PGEC (P6) 를 다음날 60 ∼ 100 ％ 컨플루언스가 되도록 Rock 저해제 (10μM) 를 첨가한 PGE 유지 배지를 사용하여 마트리겔 코팅한 디시에 파종하였다. 다음날, 세포가 60 ∼ 100 ％ 컨플루언스인 것을 확인하고, PGE 유지 배지에 Activin (100 ng/㎖) 을 첨가한 배지로 배지 교환하여, 2 일간 배양하였다 (PGEC-2d). (60 ％ 컨플루언스 이하인 경우에는 PGE 유지 배지로 배지 교환을 실시하여, 60 ％ 컨플루언스 이상이 될 때까지 배양한다) 배양 후, SFD 배지에 DM31898 (250 nM), IWP2 (4 μM), PD0325901 (500 nM) 및 RA (2 μM) 를 첨가한 배지로 배지 교환하여 1 일간 배양하였다. 다시, SFD 배지에 A-83-01 (1 μM), BMP4 (10 ng/㎖), IWP2 (4 μM), 및 RA (2 μM) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 3 일간 배양하였다 (PGEC-HE). 그 후, 녹아웃 D-MEM 배지에 20％ KSR, 1％ DMSO, 1％ NEAA, 2-ME (0.1 mM) 및 L-글루타민 (1 mM) 을 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여 3 일간 배양하였다. 이어서, EGF 를 제거한 HCM 를 조제하고, 그 배지에 5％ FBS, HGF (20 ng/㎖), OSM (20 ng/㎖) 및 DEX (100 nM) 를 첨가한 배지에서 8 일간 배양하여, 간세포 (PGEC-MH) 로의 종말 분화 유도를 실시하였다.

[실험 결과]

(1) 증폭시킨 PGEC (P6) 를 단계적으로 분화 유도한 간세포의 형태 변화 (도 15-1, 상단) 와 유전자 발현 해석 (도 15-1, 하단). 종말 분화를 실시한 PGEC-MH 는, 간세포와 유사한 형태를 나타내고 있어, 간세포 마커 유전자의 발현이 증강되는 것이 확인되었다. PGEC-MH 는, 면역 염색의 결과 간세포 마커의 발현을 인정하였다. 그리고, ICG 시험, PAS 염색의 결과로부터도 대사 기능을 가진 줄기 세포인 것이 판명되었다 (도 16, 상단).

(2) 통상, iPSC 로부터 유도한 간세포는 균질하게 분화 유도하는 것이 곤란하지만, PGEC 로부터 분화된 세포는 균질한 형태학적 특징을 갖는 간세포로 분화 유도하는 것이 가능하였다 (도 15-2). 따라서 유전자 발현 해석의 결과, iPSC 로부터 유도한 MH (iPSC-MH) 와 비교하여, PGEC-MH 에 있어서 간세포 마커가 우위에서 고발현되는 것이 분명해졌다 (도 16, 하단).

(3) 계대 후의 PGEC 의 간세포 분화 유도능의 검토 (도 17). 형태학적 해석의 결과, 계대를 반복한 후에도 양호한 재현성으로, 간세포를 유도할 수 있는 것이 분명해졌다 (도 17-1). 그리고, 유전자 발현 해석 및, ELISA 에 의한 단백질 분비 기능 해석의 결과, 계대를 반복한 후에도 높은 간세포 기능이 발휘되는 것이 판명되어, 그것들은 iPSC-MH 와 비교하더라도 유의하게 높은 것이 분명해졌다 (도 17-2). 흥미롭게도, PGEC (P0) 와 비교하여 PGEC (P5, 10) 쪽이, ALB 분비능이 높고, 간세포로의 분화능이 높은 것으로 생각되었다 (도 17-2, 우측).

[실시예 4] PGEC 로부터 췌장세포로의 분화

[실험 방법] PGEC을 사용한 췌장세포의 단계적 유도의 방법 (도 18).

증폭을 실시한 PGEC 를 Rock 저해제 (10 nM) 을 첨가한 PGEC 유지 배지를 사용하여, 파종 밀도가 다음날에 60 ∼ 100 ％ 정도가 되도록 마트리겔 코팅한 디시 (dish) 에 파종한다. 다음날, 세포가 60 ∼ 100 ％ 컨플루언스인 것을 확인하고, PGEC 유지 배지에 Activin (100 ng/㎖) 을 첨가한 배지로 배지 교환하여, 2 일간 배양하였다. (60 ％ 컨플루언스 이하인 경우에는 PGE 유지 배지로 배지 교환을 실시하여, 60 ％ 컨플루언스 이상이 될 때까지 배양한다) 배양 후, DMEM (고 글루코오스 (high glucose)) 배지에 L-글루타민 (2 mM), B27 (1 ％), 아스코르브산 (50 ㎍/㎖), 노긴 (Noggin) (25 ng/㎖), A83-01 (1 μM), RA (2 μM), cyclopamine (0.25 μM) 를 첨가한 배지로 배지 교환하여, 3 일간 배양하였다. 또한, DMEM (고 글루코오스) 배지에 L-글루타민 (2 mM), B27 (1 ％), 아스코르브산 (50 ㎍/㎖), 노긴 (Noggin) (25 ng/㎖), SB431542 (6μM), 인슐린 (800 pM) 및 니코틴아마이드 (10 mM) 를 첨가한 배지로 배지 교환을 실시하여, 1 일간 배양하였다. 그 후, DMEM (high glucose) 배지에 L-글루타민 (2 mM), 글루코오스 (20 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/㎖), SB431542 (6μM), 2-M 인슐린 (800 pM) 및 니코틴아마이드 (10 mM) 를 첨가한 배지에서 12 일간 배양하여, 췌장세포로 종말 분화 유도를 실시하였다.

[실험 결과]

(1) PGEC 로부터 단계적으로 유도한 췌장세포의 형태학적 해석 (도 18). PGEC 로부터 췌장세포, 특히, 인슐린 분비 세포로의 분화 유도 프로토콜을 기재하였다 (도 18). PGE-2d 를 노긴 (Noggin), KAAD-사이클로파민 (KAAD-cyclopamine), 레티노산 (retinoic acid) (NCR) 존재하에 3 일간 배양함으로써 PDX1 양성의 췌전구 세포를 유도하였다. 또한 6 일에서 12 일째까지는, B27 등 기재된 인자를 포함하는 H21 (고 글루코오스 (high glucose)) 배지에서 배양을 실시하여, 12 일의 단계에 있어서 췌장세포가 유도되는 것을 확인하였다.

(2) 면역 염색의 결과, PGEC 유래 췌장세포는, 췌장 전구 세포 마커인 PDX1, 내분비 세포 마커인 INSULIN, GLUCAGON, SOMATOSTATIN, 외분비 세포 마커인 AMYLASE 에 양성의 세포로 분화 유도되었다 (도 19).

(3) 유전자 발현 해석의 결과, INSULIN, PDX1 의 발현이 증강되어, β 세포로의 분화 유도가 확인되었다 (도 20).

[실시예 5] PGEC 로부터 장 조직으로의 분화

[실험 방법] PGEC 를 사용한 장 조직의 단계적 유도의 방법 (도 21).

증폭을 실시한 PGEC 를 Rock 저해제 (10 nM) 을 첨가한 PGEC 유지 배지를 사용하여, 도 21 에 기재된 바와 같이, 미리 B27 1 ％, R-Spondin1 (500 ng/㎖), 노긴 (Noggin) (100 ng/㎖), EGF (50 ng/㎖) 를 포함하는 마트리겔을 코팅한 디시에 파종하였다. 그 후, 세포 파종한 후에도, B27 1 ％, R-Spondin1 (500 ng/㎖), 노긴 (Noggin) (100 ng/㎖), EGF (50 ng/㎖) 를 포함하는 마트리겔을 재차 첨가하여, 포매 (包埋) 한 다음에, 1 ∼ 22 일째까지는, Pen/strep, L-글루타민, B27 2 ㎖/50 ㎖, HEPES (15 mM), R-Spondin1 (500 ng/㎖), 노긴 (100 ng/㎖), EGF (100 ng/㎖) 를 각각 함유하는 DMEM/F12 advanced 배지에서 배양하였다. 22 일째에는, 재차 B27 1 ％, R-Spondin1 (500 ng/㎖), 노긴 (100 ng/㎖), EGF (50 ng/㎖) 를 포함하는 마트리겔을 위에서부터 첨가·포매하여, 같은 배지에서 배양함으로써 장 조직을 유도하였다. 배지 교환은, 2 일에 1 회 실시하였다. 얻어진 조직은 임의의 타이밍에서 분산하여, 동일한 순서로 재파종함으로써 장 조직을 얻을 수 있다. 또, 장 조직을 유도하기 위해서 필요한 PGEC 의 세포수는, 단일 내지 복수 개 중 어느 것으로부터도 제작이 가능하였다.

[실험 결과]

(1) PGEC 로부터의 장 조직 유도 프로토콜 (도 21)

(2) 단일 세포로부터 배양한 PGEC 는, 현미경 관찰의 결과, 적층화한 상피가 깔려 채워진 입체적인 루프상 구조가 복수 인정되는 장 조직으로 분화 유도되는 것이 분명해졌다 (도 22).

실시예 1 ∼ 4 에서 사용한 각종의 측정 방법.

·형태학적 관찰 방법 : 도 2, 4, 6, 15-1 상측, 15-2, 17-1, 18

위상차 현미경 (Olympus) 에 의해 관찰을 실시하였다.

·마커의 유전자 발현 해석 : 도 5, 9, 15-1 하측, 16-1, 20

Quantitative real-time reverse transcription PCR (QRT-PCR) 은, LightCyclera 480 System (Roche) ·LightCyclera 480 SYBR Green I Master mi× (Roche) 을 사용하여 실험을 실시하였다.

· 세포의 증식 곡선 : 도 8 좌측

증식 곡선은, 계대·파종 직후에 10⁵ 세포/웰 (6 웰 플레이트) (D0) 이 되도록 파종하고, 3 일 후에 세포를 박리하여 세포수를 카운트하는 조작을 반복함으로써 작성하였다.

·세포 배가 시간 : 도 8 우측 :

증식 곡선으로부터 1 차 근사에 의해 얻어진 근사 곡선에 있어서의 기울기로부터, 임의의 두 개의 타이밍에서의 세포수를 구하여, 이하의 계산식에 대입함으로써 구했다. ((t2 - t1)/3.32×(log n₂ - log n₁) 여기서 t 는 시간과 n 개의 새포수 이다.)

·FACS 해석 : 도 10

FACS 해석은, Takebe, T. et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013) 에 기재된 방법으로 실시하였다. 박리한 세포 (definitive endoderm/PGEC) 를 형광 콘쥬게이트 모노클로날 항체 (mAbs) 에 의해 4 ℃, 30 분, 암실에서 인큐베이트한 후, 2 ％ FBS 를 포함하는 PBS 로 세정한 후, MoFlo (DakoCytomation) 에 의해서 해석하였다. 사용한 항체는 다음과 같다 : 알로피코시아닌 (allophycocyanin, APC) - 콘주게이트된 hCD117 (hC-KITAPC) ; 피코에리트린 (phycoerythrin, PE) - 콘주게이트된 hCD184 (hCXCR4PE).

·마커의 면역 염색 : 도 11, 12, 16, 19

배양한 세포를 메탄올·30 분·빙상 고정을 실시하여, 10 ％ 정상 염소 혈청 (nomal goat serum, NGS) 으로 60 분간 블로킹을 실시하였다. 다음으로, 1 차 항체 (1 : 200) 를 첨가한 후, 4 ℃ overnight 를 실시하였다. PBS 에 의한 세정 조작 후, 적절한 이차 항체 (Alexa-488, -555, or -647-콘주게이트된 2차 항체 (1 : 500 ; Invitrogen)) 를 조제·첨가하여, 실온에서 60 분간 반응시켰다. 염색을 실시한 세포는, 핵 염색 (DAPI) 을 실시한 다음, FA mounting fluid 로 봉입을 실시하였다. 사진은, Zeiss A×ioImager and microscope 로 촬상하였다.

·PAS 염색 : 도 16 우측 상단

Giemsa and Periodic acid Schiff (Wako) 염색을, 부속 설명서의 방법에 따라서 염색하였다.

·ICG 흡수 : 도 16 우측 하단

DMSO 에서, 25 ㎎/㎖ 가 되도록 스톡되어 있던 Cardiogreen reagent (Sigma Cat# I2633) 를, 1 ㎎/㎖ (워킹 농도) 이 되도록 세포 배양용 배지 (DMEM) 에 희석하였다. 배양 중의 PGEC-MH 를, 먼저 조제한 DMEM 배지 (1 ㎎/㎖ cardiogreen (500 ㎕/24 웰) 에 37 ℃, 3 ∼ 6 시간 인큐베이트하였다. 그 후, 통상적인 세포 배양용 배지로 교환한 다음에, 현미경 관찰에 의해 ICG 의 혼입을 확인하였다.

·ALB 분비능의 측정 : 도 17 우측

ALB 분비의 측정은, Takebe, T. et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013) 에 기재된 방법으로 실시하였다. 배지 교환 후, 1 일째의 배지를 회수하여, Human Albumin ELISA Quantitation Kit (Bethyl Laboratories) 를 사용해서, 부속 설명서의 방법에 따라서 계측하였다.

[실시예 6] 1 회째의 계대 이후의 특이적 마커

실시예 2 에 기재된 방법에 의해서, 취득한 전체 유전자의 망라적 발현 해석의 결과로부터, iPSC, DE, PGEC (P0) 의 3 개에 대해, PGEC (P1 이후) 에서 특이적으로, 가장 크게 발현 증가 또는 감소한 유전자를 추출하였다 (표 5 및 도 23). 즉, PGEC (P1 이후) 의 전체 샘플에서 공통적으로 고발현 내지, 저발현을 나타내는 마커 유전자의 리스트를 나타낸다.

[실시예 7] 다양한 iPS 클론으로부터의 원시 장 내배엽 세포 (PGEC) 의 수립 (도 24)

(방법)

TkDA3-4 (실시예 1 의 TkDA3 (도쿄 대학에서 공급) 의 4 번째 클론) 에 추가하여, 1231A3-, 1383D2-, 1383D6-, Ff-01-, Ff-06- (iMatri×(라미닌 ; 주식회사 닛피로부터 구입) 상에서 배양한 iPS 세포 (말초혈로부터 쿄토 대학에서 수립한 iPS 세포)) 등의 iPS 세포 클론으로부터 PGEC 를 제작하였다. PGEC 의 제작에는, 클론마다 분화 유도 기간을 최적화할 필요가 있다. 유도법에 대해서는, 표6 을 참조한 바와 같이 하였다.

(결과)

유도된 원시 장 내배엽 세포 (Passage 0 의 제 5 일) 의 현미경 관찰 이미지를 도 24A 에 나타낸다. 유도에 사용한 iPS 세포로는, 1231A3-, 1383D2-, 1383D6-, Ff-01-, Ff-06- 의 5 종류의 상이한 클론을 사용하였다.

iPS 클론마다의 증식 곡선을 도 24B 에 나타낸다. 모든 클론에서 유래하는 PGEC 는 적어도 20 회 이상에 걸쳐 계대·증폭을 실시하는 것이 가능하였다.

[실시예 8] 이식을 실시한 PGEC 의 내배엽 조직 재구축능 (도 25)

(방법)

TkDA3-4 iPS 세포 클론으로부터 제작한 100 만개의 PGECs 를, 면역 부전 마우스 (간 장애는 유도하지 않은 상태의 TkNOG 마우스, 실험 동물 중앙 연구소 (Central Institute for Experimental Animals)) 신피막 (腎被膜) 하에 이식하였다. 이식한 조직은 1 개월 후에 적출하여, 육안 관찰 후에 조직학적 해석을 실시하였다.

(결과)

이식 1 개월 후의 조직을 적출한 결과, 분명한 기형 종이나 암 등과 같은 종양의 형성이 인정되지 않았다 (도 25A). 흑색 점선 : PGEC 유래의 조직.

면역 조직 화학 염색의 결과, PGEC 유래의 조직은, 다양한 인간 내배엽 유래 조직을 형성하였다 (도 25B). 즉, 간장·췌장·장관의 마커에 염색되는 조직을 형성하는 것이 나타났다. 스케일 바 = 50 ㎛.

[실시예 9] PGEC 유래의 간싹의 장기 배양 후 기능 발현의 검토 (도 26)

(방법)

저접착성의 배양 플레이트를 사용하여, PGEC (Passage 5 의 제 5 일) 로부터 간싹을 제작하였다. 간싹 제작에는, PGEC 유래 세포 : 제대 유래 정맥 내피 세포 (HUVEC) : 간엽계 줄기 세포 (MSC) 를 10 : 7 : 1 의 비율로 혼합한 후, LONZA 사의 HCM 배지, EGM 배지를 1 : 1 로 혼합한 배지 중에서 분화 유도를 실시하였다. 분화 유도 후의 PGEC 유래 간싹 배양 상청 중에 있어서의 알부민 농도는, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 정량 키트 (Bethyl Laboratories Inc.) 를 사용하여 평가하였다.

(결과)

in vitro 에서 작성한 PGEC 유래 간싹의 현미경 관찰을 도 26A 에 나타낸다. 스케일 바 = 50 ㎛.

PGEC 유래 간싹의 알부민 분비능을 도 26B 에 나타낸다. 인간 알부민은, HCM/EGM 에 의한 분화 유도 4 일째의 단계에서 검출되었다. 그리고, PGEC 단독으로 스페어 배양 (PGEC 만을 회수하여, 바닥에 세포가 모이는 형상을 한 저접착성의 배양 접시에 5×10⁵ 세포/웰/24 웰 플레이트의 밀도로 세포를 파종한 후에, 수일간 배양함으로써 얻은 조직) 을 실시한 조직과 비교하여, 유의하게 높은 알부민 분비능을 나타내는 것이 분명해졌다. 또, 배지 조건을 HCM/EGM 이 아니라, KO-DMEM/EGM 을 사용한 경우에는 알부민 분비가 확인되지 않았다.

[실시예 10] 분화 유도를 실시한 PGEC 유래 간싹의 암모니아 대사 기능 (도 27)

(방법)

15 계대 배양을 실시한 PGEC 에서 유래하는 간싹의 분화 유도를 실시한 후, 2 mM 의 NH₄Cl 을 배양 상청에 첨가하였다. 그 후, 0 hr, 3 hr, 6 hr, 24 hr 의 각 시점에 있어서 배양 상청을 샘플링하여, 암모니아 농도를 암모니아 테스트 (WAKO) 에 의해 측정하였다.

(결과)

분화 유도를 실시한 PGEC 유래 간싹은, 뚜렷한 암모니아 대사 기능을 갖는 것이 분명해졌다 (도 27).

[실시예 11] 극증 간부전 모델에 대한 PGEC 유래 간싹 이식에 의한 치료 효과 (도 28)

(방법)

8 주령의 Alb-TRECK/SCID 마우스 (도쿄도 의학 종합 연구소 : Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science 에서 제공) 복강 내에, 디프테리아 독소 (DT : Sigma, St.Louis, MO, USA ; D0564-1MG) 를 투여 (DT dose : 1.5 ㎍/kg) 한 후, 극증 간부전이 발증되어 있는 것을 48 시간 후의 AST 값이 8000 IU/L 이상인 것으로써 확인하였다. 이 조건을 만족한 극증 간부전의 마우스 개체에 관해서, 마취하에 PGEC 스페어 (n = 9) 및, PGEC 에서 유래하는 간싹 (n = 8) 을 신피막하에 이식하였다. 이식군은, 비이식군인 대조군 (Sham (n = 13)) 과 비교하여 그 생존율의 개선 효과를 비교하였다.

(결과)

PGEC 유래 스페어 또는, 간싹을 이식한 군에서는, 비이식군과 비교하여 생존율이 개선되는 것이 판명되었다 (도 28).

[실시예 12] 면역 조직 화학 염색에 의한 간세포·담관 상피 세포로의 분화 유도의 확인 (도 29)

(방법)

Alb-TRECK/SCID 마우스 (도 28 의 실험 마우스) 의 신피막하에 PGEC 유래 간싹을 이식한 후, 형성된 조직을 회수하여, 육안 소견 및 조직학적 소견을 해석하였다.

(결과)

이식 1 개월 시점에 있어서 형성된 PGEC 유래 간싹 이식 조직은, 혈관화된 조직이었다. 또한, 기형 종이나 악성 종양을 의심하는 소견은 인정되지 않았다 (도 29A).

면역 조직 화학 염색의 결과로부터, 인간 핵 특이적 항원, 인간 알부민 (간세포), 인간 CK7 (담관 상피 세포), 인간 CD31 (혈관) 에 염색성을 나타내는 간 조직이 형성되었음이 판명되었다 (도 29B). 스케일 바 = 50 ㎛.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.

본 발명에 의해, 조직·장기를 제작하기 위한 재료가 되는 장기 세포를, 고품질이면서 또한 안정적으로 조제하는 것이 가능해졌다. 본 발명의 기술은, 창약 스크리닝이나 재생 의료에 응용할 수 있다.

Claims

제 1 단계에서, Rock 저해제의 존재하에, 제 2 단계에서, Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 3 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재하에 배양하여 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시하는 것을 포함하는 제작 방법에 의해 유도되는 세포로서, 미분화 (다능성) 세포 마커인, NANOG, OCT4, MYC, LIN28A 가 음성이고, 내배엽 세포 마커인, CXCR4, CER1, HHEX, GATA4 가 음성이고, 장 내배엽 세포 마커인, CDX2, HOXB9 가 양성이고, 또한, 간엽계 세포 마커인 브라큐리 (T) 가 음성이고, 췌장세포 마커인, PDX1 이 음성이고, 적어도 간세포, 췌장세포 및 장세포로 분화할 수 있는 세포.
제 1 단계에서, Rock 저해제의 존재하에, 제 2 단계에서, Activin A 및 Wnt3a 의 존재하에, 제 3 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 제 4 단계에서, BMP4, bFGF, VEGF 및 Activin A 의 존재하에, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재하에 배양하여 분화시킨 후, 계대를 적어도 1 회 이상 실시하는 것을 포함하는, 제 1 항에 기재된 세포의 제작 방법.
계대 후의 제 1 단계 또는 계대 첫날에, Rock 저해제의 존재하에, 그 후에는, SFD, FGF2, VEGF, EGF, A83-01 및 Chir99021 의 존재하에 배양하는 것을 포함하는, 제 1 항에 기재된 세포의 증폭 방법.
제 1 항에 기재된 세포를 장기 세포로 분화 유도하는 것을 포함하는, 장기 세포의 제작 방법.
제 1 항에 기재된 세포를 임의의 단계에서 동결·보존하여, 장기 세포를 제조하기 위한 워킹 셀 뱅크를 구축하는 방법.