WO2022009969A1 - 網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、黄斑変性症や網膜色素変性症(RP:retinitis pigmentosa)等の網膜変性疾患の治療のために移植されたRPE細胞の生着を促進させる方法、および該移植された他家RPE細胞がレシピエント側のリンパ球によって拒絶されないようにする方法を提供する。
Description
本発明は、網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤、移植用免疫抑制剤、および網膜色素上皮細胞の移植用医薬組成物に関する。
網膜色素上皮(RPE)細胞は網膜の最外層に、色素を伴う一層の上皮細胞組織として存在しており、視覚を司る眼球網膜の機能維持に極めて重要な役割を担っている。その代表的な機能として、貪食機能による網膜視細胞外節の新生、視細胞外節に特異的に存在する光感受性タンパクである視物質のリサイクル及び種々のサイトカインの分泌によるRPE隣接組織である視細胞および脈絡膜の保護効果等が挙げられる。従って、RPE細胞が加齢又はその遺伝子異常等により機能不全またはそれに伴う変性ひいては細胞死を来すことで、加齢黄斑変性症(AMD)及びシュタルガルト病等の黄斑変性症または網膜色素変性症(RP)等の重篤な網膜変性を引き起こすことが知られている。特に、AMDは高齢者の中心視力の低下や失明を引き起こす眼疾患であり、今後未曽有の高齢化社会を迎える日本を含む先進国において重要な社会問題となっている。現在、AMDに対する治療法は対症療法である抗体医薬の眼内投与が一般的であり、未だに有効な治療法が確立されていないことから、その代わりとなる根治療法の開発が望まれている。さらに、シュタルガルト病およびRPに対しては現在まで有効な治療法は一切確立されていない。
近年、AMDやRPに対する新たな治療法として、多能性幹細胞から分化誘導したRPE細胞を補充または置換する細胞移植治療が脚光を浴びていることから、細胞治療用移植材料としてのRPE細胞の活用が期待されている。例えば、Ocata Therapeutics社(旧Advanced Cell Technology(ACT)社)はヒト胚性幹細胞(ES細胞)由来のRPE細胞を用いた加齢黄斑変性症(AMD)及びシュタルガルト病の臨床研究を進めている。我が国でも、2014年に、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来のRPE細胞シートを滲出型AMD患者に移植する手術が実施され、世界初のiPS細胞移植治療として大いに注目を集め、現在も治療経過が順調であることが報告されている。
近年、AMDやRPに対する新たな治療法として、多能性幹細胞から分化誘導したRPE細胞を補充または置換する細胞移植治療が脚光を浴びていることから、細胞治療用移植材料としてのRPE細胞の活用が期待されている。例えば、Ocata Therapeutics社(旧Advanced Cell Technology(ACT)社)はヒト胚性幹細胞(ES細胞)由来のRPE細胞を用いた加齢黄斑変性症(AMD)及びシュタルガルト病の臨床研究を進めている。我が国でも、2014年に、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来のRPE細胞シートを滲出型AMD患者に移植する手術が実施され、世界初のiPS細胞移植治療として大いに注目を集め、現在も治療経過が順調であることが報告されている。
現在、RPE細胞の移植には、(1)調製したRPE細胞シートまたは足場材にRPE細胞を播種し調製した足場付きRPE細胞シートを、網膜に形成させた切開創より網膜色素上皮の変性または欠損部位に移植する方法と、(2)RPE細胞懸濁液を同様の部位に注入する方法とがある。移植用細胞の培養はGMPレベルで実施する必要があるので、前者の場合、RPE細胞シートの製造後に細胞調製施設(CPC;Cell Processing Center)から移植手術を行う施設(病院)に輸送されることになる。一方、後者の場合、例えばOcata Therapeutics社の臨床試験では、CPCで製造し凍結保存したRPE細胞を病院に輸送し、病院で解凍し、移植用媒体に懸濁した直後に手術室に持ち込み、移植を実施している。CPCから細胞を凍結状態で病院に輸送できる点で、後者は利便性が高いと考えられる。
しかしながら、RPE細胞の懸濁液を移植する方法には従来から複数の問題があった。例えば、他家RPE細胞を細胞懸濁液で投与すると、移植した細胞が拒絶反応により移植場所に生着しないことが報告されていた(非特許文献1)。また、RPE細胞を細胞懸濁液で移植した場合、移植した細胞が逆流して黄斑上膜を形成するケースがあることが報告されていた(非特許文献2)。発明者らもまた、カニクイザルを用いた他家RPE細胞を細胞懸濁液で投与した数例のケースでは移植した細胞が硝子体内に逆流して黄斑上膜を形成することを確認している(非特許文献3)。また、実際のヒト臨床試験において、iPS細胞由来他家RPE細胞の細胞懸濁液移植で黄斑上膜による網膜浮腫が起こったことも報告している(非特許文献4)。
ところで、ROCK阻害剤を含む培地中でRPE細胞を培養した場合、RPE細胞の接着性の増強、細胞死の抑制、成熟度の亢進について報告(非特許文献5)されているが、RPE細胞を移植する際にRPE細胞懸濁液にROCK阻害剤を含有させることは報告がない。また、特許文献1は、段落0223には「本開示の組成物は・・・ROCK阻害剤を含んでもよい。」との記載があるが、具体的濃度の開示はなく、実際にROCK阻害剤が投与された実施例の開示もない。また、角膜内皮細胞をROCK阻害剤と同時に移植する方法が報告(非特許文献6)されているものの、そもそもRPE細胞とROCK阻害剤の同時投与に関してはなんら言及されておらず、角膜内皮細胞の移植に使用されたROCK阻害剤の最終濃度も100μMであり、比較的高い濃度で使用されていた。以上の通り、RPE細胞を細胞懸濁液で移植する際に生じる有害事象を解決する方法については依然として報告がないままである。
Steven D Schwartz et al., Lancet. 2015 Feb 7;385(9967):509-16
J M Weisz et al., Retina.1999;19(6):540-5
Fujii S et al., Int J Mol Sci. 2020 Apr 27;21(9):3077
Sugita S et al., J Clin Med. 2020, in press.
Ni Y et al., Current Molecular Medicine 2017;17:637-646
Kinoshita S et al., New England Journal of Medicine 2018;378:995-1003
本発明の目的は、黄斑変性症や網膜色素変性症(RP:retinitis pigmentosa)等の網膜変性疾患の治療のために移植されたRPE細胞の生着を促進させる方法、および該移植された他家RPE細胞がレシピエント側のリンパ球によって拒絶されないようにする方法を提供することである。
本発明者らは、移植するiPS細胞由来のRPE細胞懸濁液にROCK阻害剤を加え、サルの網膜に移植した。その結果、移植後の網膜ではRPE細胞の逆流はなく、単層構造を形成して生着していることが確認できた。一方、ROCK阻害剤を加えずにRPE細胞を移植したサルの網膜では、細胞の生着は見られたものの、単層構造ではなく細胞塊として生着していることが確認された。また、ROCK阻害剤処理RPE細胞は、増殖が促進され、アポトーシスが抑制された。さらに、ROCK阻害剤処理RPE細胞は、炎症性サイトカインおよびケモカインの産生量、およびHLAクラスIIの発現量が少なくなることが示された。さらに、ROCK阻害剤は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞および単球の増殖を抑制することによって、炎症反応を抑制する効果が確認された。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、ROCK阻害剤の使用が、RPE細胞の移植治療において、生着の促進、RPE細胞が他家細胞である場合の免疫反応の抑制に有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、ROCK阻害剤の使用が、RPE細胞の移植治療において、生着の促進、RPE細胞が他家細胞である場合の免疫反応の抑制に有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりのものを提供する。
[1]ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤。
[2]ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、[1]に記載の移植用生着促進剤。
[3]網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、[1]または[2]に記載の移植用生着促進剤。
[4]多能性幹細胞がiPS細胞である、[3]に記載の移植用生着促進剤。
[5]ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮細胞の移植用免疫抑制剤。
[6]ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、[5]に記載の移植用免疫抑制剤。
[7]網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、[5]または[6]に記載の移植用免疫抑制剤。
[8]多能性幹細胞がiPS細胞である、[7]に記載の移植用免疫抑制剤。
[9]網膜色素上皮細胞及びROCK阻害剤を含む、移植用医薬組成物。
[10]ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、[9]に記載の移植用医薬組成物。
[11]ROCK阻害剤の濃度が0.01以上100μM未満である、[9]または[10]に記載の移植用医薬組成物。
[11-2]ROCK阻害剤の濃度が0.01~10μMである、[9]または[10]に記載の移植用医薬組成物。
[12]網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、[9]~[11]、[11-2]のいずれか1つに記載の移植用医薬組成物。
[13]多能性幹細胞がiPS細胞である、[12]に記載の移植用医薬組成物。
[14]網膜色素上皮細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞の生着促進方法。
[15]移植された網膜色素上皮細胞の生着の促進における使用のためのROCK阻害剤。
[16]網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤を製造するための、ROCK阻害剤の使用。
[17]網膜色素上皮細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞に対する免疫反応抑制方法。
[18]移植された網膜色素上皮細胞に対する免疫反応の抑制における使用のためのROCK阻害剤。
[19]網膜色素上皮細胞の免疫反応抑制剤を製造するための、ROCK阻害剤の使用。
[20]網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞の移植方法。
[21]網膜色素上皮細胞の移植における使用のための網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物。
[22]移植用医薬組成物を製造するための、網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤の使用。
[1]ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤。
[2]ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、[1]に記載の移植用生着促進剤。
[3]網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、[1]または[2]に記載の移植用生着促進剤。
[4]多能性幹細胞がiPS細胞である、[3]に記載の移植用生着促進剤。
[5]ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮細胞の移植用免疫抑制剤。
[6]ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、[5]に記載の移植用免疫抑制剤。
[7]網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、[5]または[6]に記載の移植用免疫抑制剤。
[8]多能性幹細胞がiPS細胞である、[7]に記載の移植用免疫抑制剤。
[9]網膜色素上皮細胞及びROCK阻害剤を含む、移植用医薬組成物。
[10]ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、[9]に記載の移植用医薬組成物。
[11]ROCK阻害剤の濃度が0.01以上100μM未満である、[9]または[10]に記載の移植用医薬組成物。
[11-2]ROCK阻害剤の濃度が0.01~10μMである、[9]または[10]に記載の移植用医薬組成物。
[12]網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、[9]~[11]、[11-2]のいずれか1つに記載の移植用医薬組成物。
[13]多能性幹細胞がiPS細胞である、[12]に記載の移植用医薬組成物。
[14]網膜色素上皮細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞の生着促進方法。
[15]移植された網膜色素上皮細胞の生着の促進における使用のためのROCK阻害剤。
[16]網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤を製造するための、ROCK阻害剤の使用。
[17]網膜色素上皮細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞に対する免疫反応抑制方法。
[18]移植された網膜色素上皮細胞に対する免疫反応の抑制における使用のためのROCK阻害剤。
[19]網膜色素上皮細胞の免疫反応抑制剤を製造するための、ROCK阻害剤の使用。
[20]網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞の移植方法。
[21]網膜色素上皮細胞の移植における使用のための網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物。
[22]移植用医薬組成物を製造するための、網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤の使用。
本発明によれば、ROCK阻害剤の使用により、移植したRPE細胞懸濁液の網膜下における生着が促進され、移植部位からのRPE細胞の逆流や黄斑上皮の形成を妨げることができる。また、ROCK阻害剤を使用することによって、網膜下に移植されたRPE細胞を細胞塊状ではなく、正常な網膜色素上皮と同様の単層構造に形成させ、生着させることが可能になる。さらに、移植に使用するRPE細胞が他家iPS細胞由来である場合、HLAの不一致による拒絶反応が想定されるところ、ROCK阻害剤の使用により移植されたRPE細胞の炎症性サイトカインおよびケモカインの産生抑制効果ならびにレシピエントのリンパ球(ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、単球)の増殖抑制効果によって、免疫抑制作用が期待できる。
本発明は、ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮(RPE)細胞の移植用生着促進剤(本発明の移植用生着促進剤)を提供する。本発明はまた、ROCK阻害剤を含む、RPE細胞の移植用免疫抑制剤(本発明の移植用免疫抑制剤)を提供する。
本発明においてROCK阻害剤とは、Rhoキナーゼ(ROCK)の作用を阻害する物質であれば制限されない。Rhoキナーゼ(ROCK)は、低分子量Gタンパク質Rhoの下流に位置するセリン/スレオニンキナーゼとして見出された。Rho/ROCKシグナル伝達経路は、アクチン細胞骨格や細胞接着など様々な細胞機能に関わっている。ES細胞やiPS細胞の継代培養では細胞を分散させる必要があるが、これらの幹細胞は分散させた状態で培養するとアポトーシスにより細胞死を起こすことが知られている。分散により起こるアポトーシスには、Rho/ROCKシグナル伝達経路が関わっており、ROCK阻害剤を添加することによりアポトーシスが抑制される(アポトーシス抑制作用)ことが報告されている。さらに、細胞を凍結保存する際にROCK阻害剤を添加すると、解凍後の細胞生存率が上がることが報告されている(細胞生存率改善作用)。これらの報告より、ES細胞やiPS細胞の増殖培養時にROCK阻害剤が添加されるようになった。一方、再生医療用製品には、平衡塩類溶液やDMEM/F12培地等の基本培地を使用し、外来性の成分は含めないのが通常であったところ、本発明者らは、上記の作用に加えて、後述する実施例の通り、ROCK阻害剤は、移植したRPE細胞懸濁液の網膜下における生着を促進し、移植部位からのRPE細胞の逆流や黄斑上皮の形成を妨げること(移植されたRPE細胞の生着促進作用)を見出した。また、ROCK阻害剤は、網膜下に移植されたRPE細胞を細胞塊状ではなく単層構造を形成させて、生着させることを確認した(移植されたRPE細胞の生着促進作用)。さらに、ROCK阻害剤は、移植された他家RPE細胞の炎症性サイトカインおよびケモカインの産生、HLAクラスIIの発現を抑制し、かつレシピエントのリンパ球(ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、単球)の増殖を抑制できた(移植されたRPE細胞に対する免疫反応抑制作用)。
本発明において、ROCK阻害剤は、新たに見出された上記の作用(移植されたRPE細胞の生着促進作用および移植されたRPE細胞に対する免疫反応抑制作用)と同質または実質的に同質である限り、どのような分子であってもよい。「実質的に同質」とは、それらの作用が定性的(例えば、生理学的または薬理学的)に同じであることを示す。したがって、前記作用は同等であることが好ましいが、これらの作用の程度(例えば、約0.1~約10倍、好ましくは約0.5~約2倍)は異なっていてもよい。前記作用の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。そのようなROCK阻害剤としては、例えば、Y-27632 dihydrochloride、Y-27632、Fasudil Hydrochloride、Netarsudil、Chroman 1、SLx-2119、HSD1590、GSK269962A hydrochloride、Exoenzyme C3, clostridium botulinum、Ripasudil、Afuresertib、Thiazovivin、GSK269962A、RKI-1447、Y-33075、GSK429286A、AT13148、H-1152 dihydrochloride、Y-33075 dihydrochloride、LX7101、SAR407899、ROCK-IN-2、Afuresertib hydrochloride、Hydroxyfasudil、GSK180736A、BDP5290、SR-3677、CCG-222740、CMPD101、Rho-Kinase-IN-1、SAR407899 hydrochloride、ROCK inhibitor-2、ZINC00881524、H-1152、Hydroxyfasudil hydrochloride、Fasudil、ROCK2-IN-2、Verosudil、SB-772077B dihydrochloride、GSK-25、CRT0066854 hydrochloride、Ripasudil free base、ROCK-IN-1等が挙げられ、好ましくは、眼科用医薬として市販若しくは開発中又は当該有用性が示唆される化合物が挙げられ、そのような化合物の具体例として、Y-27632 dihydrochloride、Y-27632、Ripasudilなどが挙げられる。
ROCK阻害剤は、自体公知の方法により製造することができる。また、ROCK阻害剤は、市販品を購入して使用することもできる。例えば、Y-27632は富士フイルム和光純薬株式会社などから購入することができる。また、Ripasudilはグラナテック(登録商標)(Kowa)、Fasudil Hydrochlorideはエリル(登録商標)(旭化成ファーマ)等の商品名で市販されている。
上記の通り、ROCK阻害剤は、移植されたRPE細胞の生着促進作用および移植されたRPE細胞に対する免疫反応抑制作用を有するため、RPE細胞の移植用生着促進剤またはRPE細胞の移植用免疫抑制剤として提供される。
本発明においてRPE細胞とは、網膜色素上皮を構成する上皮細胞、及びその前駆細胞をいう。網膜色素上皮細胞であるかは、例えば、細胞マーカー(RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1等)の発現や、細胞の形態(細胞内のメラニン色素沈着、多角形で扁平な上皮様の細胞形態、多角形のアクチン束の形成等)等により確認できる。また、網膜色素上皮細胞の前駆細胞とは、網膜細胞への分化誘導が方向づけられた細胞を意味し、当該前駆細胞であるかは、細胞マーカー(Mitf(色素上皮細胞、色素上皮前駆細胞)、Pax6(色素上皮前駆細胞)、Rx(網膜前駆細胞)、OTX2(網膜前駆細胞)、RPE65(色素上皮細胞)、BEST1(色素上皮細胞))の発現等により確認できる。また網膜色素上皮細胞の機能評価は、例えばサイトカイン(VEGFやPEDF等)の分泌能や貪食能等を指標にして確認できる。これらの機能評価および確認操作は、当業者であれば適宜条件を設定して実施することが可能である。
RPE細胞は、RPE細胞を保有する任意の動物から得ることができるし、多能性幹細胞から自体公知の方法により分化誘導することにより得ることもできるが、多能性幹細胞から分化誘導された細胞がより好ましい。多能性幹細胞としては、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞(ntES細胞)、精子幹細胞(GS細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞及びiPS細胞であり、より好ましくは、iPS細胞である。多能性幹細胞の由来は特に制限されず、例えば、下記のいずれかの多能性幹細胞の樹立が報告されている任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、マウス、ラット等、最も好ましくはヒトがあげられる。
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立されている(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848; Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006),Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585;Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。
本明細書中で使用する体細胞なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞(好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞)をいう。体細胞には、非限定的に、胎児の体細胞、新生児の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば(1)神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)、(2)組織前駆細胞、(3)リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D,et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
ES細胞からRPE細胞を分化誘導する方法としては、例えば、SDIA法(PNAS, 99: 1580-1585, 2002)、SFEB法(Nat. Biotechnol., 26: 215-224, 2008)等が挙げられるが、これらに限定されない。また、iPS細胞からも同様の方法でRPE細胞を分化誘導することができる(例えば、Neurosci. Lett., 458: 126-131, 2009; PLoS One, 8: 409-412, 2011)。あるいは、WO2015/053375、WO2015/053376、WO2015/125941、WO2017/043605等に記載の方法を用いることもできる。
本発明の移植用生着促進剤は、網膜下に移植されたRPE細胞の集団の生着を促進することができる。生着するとは、移植されたRPE細胞の集団が、移植部位においてブルッフ膜(Bruch's membrane)を介して脈絡膜と接着している状態を指す。生着するRPE細胞の集団の割合は、移植されたRPE細胞の集団の少なくとも50%以上(例:50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%またはそれ以上)である。接着したRPE細胞の集団の形態は、ブルッフ膜に接着していれば特に制限されるものではないが、例えば、細胞塊、多層構造、単層構造などが挙げられるが、単層構造を形成していることが好ましい。
本発明の移植用免疫抑制剤は、移植されるRPE細胞が他家細胞である場合、通常、レシピエントのリンパ球によってRPE細胞に対する拒絶反応が予測されるが、その拒絶反応を抑制することができる。拒絶反応の抑制とは、レシピエントにおいては、リンパ球(ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、B細胞、樹状細胞など)の増殖、活性化を抑制することを指す。また、ドナーにおいては、移植される他家RPE細胞の炎症性サイトカインおよびケモカインの産生、HLAクラスIIの発現を抑制することを指す。炎症性サイトカインとしては、これらに限定されないが、例えば、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、IFNγなどが挙げられる。また、炎症性ケモカインとしては、これらに限定されないが、例えば、CXCL11/I-TAC、CCL2/MCP-1、CXCL8/IL-8などが挙げられる。
また、本発明の移植用免疫抑制剤はさらに、別の免疫抑制剤を含んでもよい。そのような免疫抑制剤としては、それらに限定されるわけではないが、例えば、シクロスポリン、ミゾリビン、シクロフォスファミド、アザチオプリン、タクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチルなどが挙げられる。
本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤が投与される対象としては、例えば、黄斑変性症(例、萎縮型及び滲出型加齢黄斑変性症、シュタルガルト病)、網膜色素変性症等の網膜疾患を有する哺乳動物(例、ヒト、マウス、ラット等、好ましくはヒト)が挙げられる。
本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤はさらに、医薬上許容される担体であれば特に制限されないが、例えば、緩衝剤、等張化剤、粘性基剤、キレート剤、pH調整剤、抗酸化剤などを適宜選択して、RPE細胞の生着率、免疫抑制効率に影響を与えない範囲で含有させることができる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、アミノ酸などが挙げられる。
等張化剤としては、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどの糖類、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール類、塩化ナトリウムなどの塩類、ホウ酸などが挙げられる。
粘性基剤としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類などが挙げられる。
キレート剤としては、エデト酸ナトリウム、クエン酸などが挙げられる。
pH調整剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸またはその塩(ホウ砂)、塩酸、クエン酸またはその塩(クエン酸ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム等)、リン酸またはその塩(リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等)、酢酸またはその塩(酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等)、酒石酸またはその塩(酒石酸ナトリウム等)等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、トコフェロール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、アミノ酸などが挙げられる。
等張化剤としては、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどの糖類、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール類、塩化ナトリウムなどの塩類、ホウ酸などが挙げられる。
粘性基剤としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類などが挙げられる。
キレート剤としては、エデト酸ナトリウム、クエン酸などが挙げられる。
pH調整剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸またはその塩(ホウ砂)、塩酸、クエン酸またはその塩(クエン酸ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム等)、リン酸またはその塩(リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等)、酢酸またはその塩(酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等)、酒石酸またはその塩(酒石酸ナトリウム等)等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、トコフェロール等が挙げられる。
本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤のpHは、通常、約5.0~約8.5、好ましくは約7.0~約8.0に調整され、好ましくは、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことができる。
本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤は、前記の対象にRPE細胞の移植と同時にまたは前後して投与される。本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば、成人に使用する場合には、本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤を1回量として、通常50~500μL、好ましくは100~300μLを、1度の手術で対象の網膜下にRPE細胞の移植と同時にまたは前後して投与するのが好都合である。本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤をRPE細胞の移植と前後して投与する場合、RPE細胞の移植前後5分~30分以内に本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤を投与することができる。また、本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤の投与後、投与された対象を仰向けの状態で頭部を固定することが好ましい。それによって、網膜下に投与されたRPE細胞が接着しやすくなり、RPE細胞の逆流が抑制される。固定する時間は、網膜下に投与されたRPE細胞が接着するために十分な時間であれば特に制限されないが、通常、30分~5時間、好ましくは、1時間~4時間、より好ましくは、2時間~3時間が挙げられる。本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤は、必要に応じて、時間をずらして複数回投与されてもよい。
本発明はまた、RPE細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、RPE細胞の生着促進方法(本発明の生着促進方法)を提供する。本発明はまた、RPE細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、RPE細胞に対する免疫反応抑制方法(本発明の免疫反応抑制方法)を提供する。本発明の生着促進方法または免疫反応抑制方法の投与対象、対象疾患、投与方法等は、本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤の投与対象、対象疾患、投与方法等と同一であってよい。
本発明の生着促進方法または免疫反応抑制方法はさらに、ROCK阻害剤を投与された網膜疾患患者を仰向けの状態で頭部を固定することを含んでよい。固定する時間は、網膜下に投与されたRPE細胞が接着するために十分な時間であれば特に制限されないが、通常、30分~5時間、好ましくは、1時間~4時間、より好ましくは、2時間~3時間が挙げられる。
本発明はまた、RPE細胞及びROCK阻害剤を含む、移植用医薬組成物(本発明の移植用医薬組成物)を提供する。
本発明の移植用医薬組成物に含まれるRPE細胞及びROCK阻害剤は、本発明の移植用生着促進剤または移植用免疫抑制剤おいて記載されたRPE細胞及びROCK阻害剤と同一であってよい。
本発明の移植用医薬組成物に含まれるROCK阻害剤の濃度は、移植されたRPE細胞の生着促進作用および移植されたRPE細胞に対する免疫反応抑制作用を保持しつつ、該RPE細胞に損傷を与えない濃度であれば特に制限されるものではないが、ROCK阻害剤の濃度が低すぎると、生着促進作用および免疫反応抑制作用が発揮されず、ROCK阻害剤の濃度が高すぎると、RPE細胞に悪影響を及ぼす場合がある。従って、本発明の移植用医薬組成物に含まれるROCK阻害剤の下限濃度は、通常、0.01μM以上、好ましくは、0.1μM以上、より好ましくは、1μM以上である。また、本発明の移植用医薬組成物に含まれるROCK阻害剤の上限濃度は、通常、100μM未満、好ましくは、50μM以下である。上限値と下限値は適宜組み合わせてよい。また、ROCK阻害剤の濃度は、ROCK阻害剤の種類に応じて好適な範囲が適宜選択されてよい。例えば、Y-276320の濃度は、通常、1~50μM、好ましくは、10μMである。また、例えば、Ripasudilの濃度は、通常、0.1~50μM、好ましくは、0.5~10μMである。
本発明の移植用医薬組成物として調製されるRPE細胞は、RPE細胞を保有する任意の動物から得られた細胞を培養した細胞または多能性幹細胞から自体公知の方法により分化誘導条件下で培養することにより得られた細胞であってもよいし、凍結保存状態から解凍された直後の細胞であってもよい。
調製されるRPE細胞が、培養されたRPE細胞である場合、培養に用いられる基本培地としては、例えば、StemFit(例:StemFit AK03N、StemFit AK02N)(味の素社)、PECM(Primate ES Cell Medium)、GMEM(グラスゴー最小必須培地:Glasgow Minimum Essential Medium)、IMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地:Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、199培地、イーグル最小必須培地(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)、αMEM、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、フィッシャー培地(Fischer's medium)、及びこれらの混合培地などが包含される。
基本培地には、血清(例:ウシ胎仔血清(FBS)、ヒト血清、ウマ血清等)若しくは血清代替物、インスリン、各種ビタミン、L-グルタミン、非必須アミノ酸等の各種アミノ酸、2-メルカプトエタノール、各種サイトカイン(インターロイキン類(IL-2、IL-7、IL-15等)、幹細胞因子(SCF (Stem cell factor))、アクチビンなど)、各種ホルモン、各種増殖因子(白血病抑制因子(LIF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、TGF-β等)、各種細胞外マトリックス、各種細胞接着分子、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン等の抗生物質、フェノールレッド等のpH指示薬などを適宜添加することができる。血清代替物として、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、Knockout Serum Replacement(KSR)、ITS-サプリメント及びこれらの混合物などが包含される。
培養温度は、特に限定されないが、約30~約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2~5%である。
培養されたRPE細胞は、ROCK阻害剤と共にそのまま本発明の移植用医薬組成物として調製されてもよいし、適当な希釈剤により希釈され、遠心分離により洗浄されてもよい。希釈剤としては、生理食塩水やPBSを用いることができる。希釈および洗浄工程は室温ないし約37℃で行ってもよいし、約4℃の冷却下で行ってもよい。洗浄操作は1回のみでもよいし、2ないし数回繰り返すこともできる。
調製されるRPE細胞が、凍結保存されたRPE細胞である場合、解凍された直後に、適当な希釈剤により希釈され、遠心分離により洗浄されることが望ましい。希釈剤としては、生理食塩水やPBSを用いることができる。希釈および洗浄工程は室温ないし約37℃で行ってもよいし、約4℃の冷却下で行ってもよい。洗浄操作は1回のみでもよいし、2ないし数回繰り返すこともできる。
本発明の移植用医薬組成物はさらに、医薬上許容される担体であれば特に制限されないが、例えば、培地、抗生剤、アミノ酸、血清代替物などを適宜選択して、RPE細胞の生着率、免疫抑制効率に影響を与えない範囲で含有させることができる。
培地としては、培養に使用された前記培地が使用されてよい。
抗生剤としては、例えば、アストロマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、フラジオマイシン、アンピシリンなどが挙げられる。
アミノ酸としては、必須アミノ酸(バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、スレオニン、ヒスチジン)、非必須アミノ酸(アルギニン、グリシン、アラニン、セリン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸)の他、タウリンなどが挙げられる。
血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、Knockout Serum Replacement(KSR)、ITS-サプリメント及びこれらの混合物などが包含される。
培地としては、培養に使用された前記培地が使用されてよい。
抗生剤としては、例えば、アストロマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、フラジオマイシン、アンピシリンなどが挙げられる。
アミノ酸としては、必須アミノ酸(バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、スレオニン、ヒスチジン)、非必須アミノ酸(アルギニン、グリシン、アラニン、セリン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸)の他、タウリンなどが挙げられる。
血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、Knockout Serum Replacement(KSR)、ITS-サプリメント及びこれらの混合物などが包含される。
また、本発明の移植用医薬組成物はさらに、別の免疫抑制剤を含んでもよい。そのような免疫抑制剤としては、それらに限定されるわけではないが、例えば、シクロスポリン、ミゾリビン、シクロフォスファミド、アザチオプリン、タクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチルなどが挙げられる。
本発明の移植用医薬組成物におけるRPE細胞の密度は、疾患部位、即ち、黄斑変性症や網膜色素変性症における網膜色素上皮の欠損部位に注入される懸濁液(例えば、50~500μL、好ましくは100~300μL)中に、治療上有効な量のRPE細胞が含まれる限り特に制限はないが、例えば、100~20,000細胞/μL、好ましくは1,000~10,000細胞/μLの細胞密度となるように懸濁することができる。本発明の移植用医薬組成物は、ROCK阻害剤を含有しないRPE細胞の懸濁液よりも、RPE細胞の生着性に優れ、免疫反応も抑制できるので、従来法と同等量の生RPE細胞を移植部位に到達させるのに要する出発RPE細胞数を低減させることができ、移植に必要なRPE細胞の調製に要するコストや時間を削減することができる。
本発明の移植医薬組成物は、適当なシリンジ及び針を含む移植用デバイス(例えば、MedOne0(登録商標) Poly Tip(登録商標) Cannula 25g/38g等)を用いて、例えば、黄斑変性症(例、萎縮型及び滲出型加齢黄斑変性症、シュタルガルト病)、網膜色素変性症等の網膜疾患を有する哺乳動物(例、ヒト、マウス、ラット等、好ましくはヒト)の網膜下に注入することにより、移植することができる。
本発明の移植医薬組成物の投与量は、投与対象、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば、成人に使用する場合には、本発明の移植医薬組成物を1回量として、通常50~500μL、好ましくは100~300μLを、1度の手術で対象の網膜下に投与するのが好都合である。また、本発明の移植医薬組成物の投与後、投与された対象を仰向けの状態で頭部を固定し、3時間維持する。それによって、網膜下に投与されたRPE細胞が接着しやすくなり、RPE細胞の逆流が抑制される。
本発明はまた、網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞の移植方法(本発明の移植方法)を提供する。本発明の移植方法の投与対象、対象疾患、投与方法等は、本発明の移植用医薬組成物の投与対象、対象疾患、投与方法等と同一であってよい。
本発明の移植方法はさらに、本発明の移植用医薬組成物を投与された網膜疾患患者を仰向けの状態で頭部を固定することを含んでよい。固定する時間は、網膜下に投与されたRPE細胞が接着するために十分な時間であれば特に制限されないが、通常、30分~5時間、好ましくは、1時間~4時間、より好ましくは、2時間~3時間が挙げられる。
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例1 Y-27632 ROCK阻害剤の利用
(実験方法)
iPS由来RPE(iPS-RPE)細胞の培養の準備
RPE細胞への分化のために、Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20;56(2):1051-62に記載の通りにヒトiPS細胞(TLHD2、Ff-I01、453F2および253G1株)を培養した。iPS-RPE細胞を確立した後、培地はB27サプリメント(Invitrogen)および2 mM L-グルタミン(Sigma)を補充されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用し、basic FGF (Wako)およびSB431542 (Sigma)を補充されたB27培地中でCELLstartTM (Invitrogen)でコートされたプレートまたはディッシュにRPEコロニーを移し、コンフレントになるまで培養した。いくつかのアッセイではY-27632 ROCK阻害剤(1、10、50および100 μM: Wako)をDMEM培地+10%仔牛血清(FBS)に添加した。研究はヘルシンキ宣言の趣旨に従い、理化学研究所 生命機能科学研究センター(BDR)の倫理委員会によって承認された。
(実験方法)
iPS由来RPE(iPS-RPE)細胞の培養の準備
RPE細胞への分化のために、Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20;56(2):1051-62に記載の通りにヒトiPS細胞(TLHD2、Ff-I01、453F2および253G1株)を培養した。iPS-RPE細胞を確立した後、培地はB27サプリメント(Invitrogen)および2 mM L-グルタミン(Sigma)を補充されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用し、basic FGF (Wako)およびSB431542 (Sigma)を補充されたB27培地中でCELLstartTM (Invitrogen)でコートされたプレートまたはディッシュにRPEコロニーを移し、コンフレントになるまで培養した。いくつかのアッセイではY-27632 ROCK阻害剤(1、10、50および100 μM: Wako)をDMEM培地+10%仔牛血清(FBS)に添加した。研究はヘルシンキ宣言の趣旨に従い、理化学研究所 生命機能科学研究センター(BDR)の倫理委員会によって承認された。
Y-27632存在下におけるiPS-RPE細胞の形態、増殖および色素沈着
iPS細胞(Ff-I01、TLHD2、453F2、454E2:健常ドナー)から誘導された2 x 105 RPE細胞をコーティングされていない24穴培養プレート中で10 μM Y-27632の存在下または非存在下、3日間培養した。FACS分析又は顕微鏡像におけるKi-67陽性細胞によって、該RPE細胞の増殖を評価した。培地(総量2 mL)はDMEM+10% FBSを使用した。また、RPE細胞(454E2)における色素沈着を評価するために、Y-27632の存在下または非存在下、4週間、上記の条件で該細胞を培養した。発明者らは4週間の培養の間、週一回Y-27632を加えた。
iPS細胞(Ff-I01、TLHD2、453F2、454E2:健常ドナー)から誘導された2 x 105 RPE細胞をコーティングされていない24穴培養プレート中で10 μM Y-27632の存在下または非存在下、3日間培養した。FACS分析又は顕微鏡像におけるKi-67陽性細胞によって、該RPE細胞の増殖を評価した。培地(総量2 mL)はDMEM+10% FBSを使用した。また、RPE細胞(454E2)における色素沈着を評価するために、Y-27632の存在下または非存在下、4週間、上記の条件で該細胞を培養した。発明者らは4週間の培養の間、週一回Y-27632を加えた。
Y-27632で処理されたiPS-RPE細胞における細胞間接着アッセイ
発明者らは、Y-27632で処理されたRPE細胞(Ff-I01、TLHD2および253G1)の細胞接着について調べた。10 μM Y-27632の存在下または非存在下、上記の条件で48時間RPE細胞を培養した。細胞を回収後、発明者らは、カルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル(CFSE, Cayman Chemical Company)で2つのRPE細胞を標識し、1 x 105 RPE細胞をコーティングされていない24穴培養プレート中で4時間再培養した。細胞を2回洗浄後、発明者らは、FACSまたは顕微鏡によってプレート上のCFSE陽性RPE細胞(蛍光、緑)を測定した。発明者らは、異なるRPE細胞株でも5回同様の実験を行った。
発明者らは、Y-27632で処理されたRPE細胞(Ff-I01、TLHD2および253G1)の細胞接着について調べた。10 μM Y-27632の存在下または非存在下、上記の条件で48時間RPE細胞を培養した。細胞を回収後、発明者らは、カルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル(CFSE, Cayman Chemical Company)で2つのRPE細胞を標識し、1 x 105 RPE細胞をコーティングされていない24穴培養プレート中で4時間再培養した。細胞を2回洗浄後、発明者らは、FACSまたは顕微鏡によってプレート上のCFSE陽性RPE細胞(蛍光、緑)を測定した。発明者らは、異なるRPE細胞株でも5回同様の実験を行った。
Y-27632で処理されたiPS-RPE細胞におけるアポトーシスアッセイ
iPS-RPE細胞(24穴プレート中2 x 105/穴; Ff-I01、TLHD2および253G1株)を24時間Y-27632 (10 μM)で処理した。培養中の細胞死を評価するため、フローサイトメトリーによってアネキシンV陽性RPE細胞を測定した。染色のために、該RPE細胞(Y-27632処理または未処理iPS-RPE細胞)を細胞染色バッファー(BioLegend)で洗浄し、アネキシンV結合バッファー(BioLegend: catalog no. 420201)で再懸濁した。該細胞をFITC標識抗アネキシンV抗体(BioLegend: catalog no. 640906)で15分間室温で染色した。FACSCantoTM II フローサイトメーター(BD Biosciences)を用いてサンプルを解析した。発明者らは、異なるRPE細胞株でも5回同様の実験を行い、データをFlowJo ソフトウェア(version 9.3.1)で解析した。
iPS-RPE細胞(24穴プレート中2 x 105/穴; Ff-I01、TLHD2および253G1株)を24時間Y-27632 (10 μM)で処理した。培養中の細胞死を評価するため、フローサイトメトリーによってアネキシンV陽性RPE細胞を測定した。染色のために、該RPE細胞(Y-27632処理または未処理iPS-RPE細胞)を細胞染色バッファー(BioLegend)で洗浄し、アネキシンV結合バッファー(BioLegend: catalog no. 420201)で再懸濁した。該細胞をFITC標識抗アネキシンV抗体(BioLegend: catalog no. 640906)で15分間室温で染色した。FACSCantoTM II フローサイトメーター(BD Biosciences)を用いてサンプルを解析した。発明者らは、異なるRPE細胞株でも5回同様の実験を行い、データをFlowJo ソフトウェア(version 9.3.1)で解析した。
Y-27632で処理されたiPS-RPE細胞上のHLAクラスII分子の発現
アッセイ前に、iPS-RPE細胞を組換えヒトIFN-γ (100 ng/mL: R&D systems)で48時間前処理した。Y-27632で処理されたiPS-RPE細胞(コントロールとしては非処理細胞)上のHLAクラスII分子の発現をFACS解析で評価した。染色前に、ヒトFc block(Miltenyi Biotec)で該細胞を4℃、15分間インキュベートした。ヒトFc block染色後、該RPE細胞をFITC標識抗HLAクラスII抗体(HLA-DR、DQ、DP: BioLegend: catalog no. 361705)で4℃、30分間室温で染色した。RPE細胞をさらにFITC標識抗マウスIgGで4℃、30分間室温で染色した。FACSCantoTM IIを用いてRPEサンプルを解析した。
アッセイ前に、iPS-RPE細胞を組換えヒトIFN-γ (100 ng/mL: R&D systems)で48時間前処理した。Y-27632で処理されたiPS-RPE細胞(コントロールとしては非処理細胞)上のHLAクラスII分子の発現をFACS解析で評価した。染色前に、ヒトFc block(Miltenyi Biotec)で該細胞を4℃、15分間インキュベートした。ヒトFc block染色後、該RPE細胞をFITC標識抗HLAクラスII抗体(HLA-DR、DQ、DP: BioLegend: catalog no. 361705)で4℃、30分間室温で染色した。RPE細胞をさらにFITC標識抗マウスIgGで4℃、30分間室温で染色した。FACSCantoTM IIを用いてRPEサンプルを解析した。
リンパ球-移植片細胞免疫応答(LGIR)試験
数人の健常人(全てのHLAはRPE細胞に対して一致しなかった)由来の末梢血単核球(PBMC)を購入(stock PBMC: Precision for Medicine)し、LGIRアッセイのために調製した。発明者らはまた、Y-27632処理または未処理TLHD2 iPS-RPE細胞の2つのRPE細胞を調製した。該RPE株のハプロタイプは、HLA-A*26:01/31:01; HLA-B*39:01/51:01; HLA-C*07:02/14:02; HLA-DRB1*09:01/15:01; HLA-DQB1*03:03/06:02; HLA-DPB1*02:01/05:01であった。該RPE細胞の存在下、該PBMCを10% FBS、ヒト組換えIL-2(BD)、およびその他の物質(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):619-634)含有RPMI1640培地でin vitroで共培養した。抗体情報を含む、LGIRアッセイ(Ki-67 FACS分析)の方法は、Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):619-634の記載に従った。ポジティブコントロールとして、EBV形質転換B細胞も調製した(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):619-634)。FACSCantoTM IIを用いてPBMCサンプルを解析した。
数人の健常人(全てのHLAはRPE細胞に対して一致しなかった)由来の末梢血単核球(PBMC)を購入(stock PBMC: Precision for Medicine)し、LGIRアッセイのために調製した。発明者らはまた、Y-27632処理または未処理TLHD2 iPS-RPE細胞の2つのRPE細胞を調製した。該RPE株のハプロタイプは、HLA-A*26:01/31:01; HLA-B*39:01/51:01; HLA-C*07:02/14:02; HLA-DRB1*09:01/15:01; HLA-DQB1*03:03/06:02; HLA-DPB1*02:01/05:01であった。該RPE細胞の存在下、該PBMCを10% FBS、ヒト組換えIL-2(BD)、およびその他の物質(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):619-634)含有RPMI1640培地でin vitroで共培養した。抗体情報を含む、LGIRアッセイ(Ki-67 FACS分析)の方法は、Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):619-634の記載に従った。ポジティブコントロールとして、EBV形質転換B細胞も調製した(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):619-634)。FACSCantoTM IIを用いてPBMCサンプルを解析した。
Y-27632処理iPS-RPE細胞による食作用
FITC標識ブタ脱落光受容体桿体外節(ROS, 10 μg/cm2)と共にiPS-RPE細胞を37℃で24時間培養し、フローサイトメトリーを用いて解析した。FITC-ROS非存在下で培養されたiPS-RPE細胞(コントロール細胞)もまた調製した(Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20;56(2):1051-62)。
FITC標識ブタ脱落光受容体桿体外節(ROS, 10 μg/cm2)と共にiPS-RPE細胞を37℃で24時間培養し、フローサイトメトリーを用いて解析した。FITC-ROS非存在下で培養されたiPS-RPE細胞(コントロール細胞)もまた調製した(Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20;56(2):1051-62)。
Y-27632処理iPS-RPE細胞におけるRPE特異的マーカーおよび炎症性サイトカインの発現
Y-27632処理iPS-RPE細胞におけるRPE特異的マーカーまたは炎症性サイトカイン/ケモカインを確認するため、発明者らは、定量RT-PCR、ELISA、および免疫組織化学によって数種類の因子を調べた。VEGF-A、PEDF、ベストロフィン-1 (Best1)、RPE65、Pax6およびチロシナーゼ(RPE特異的マーカー)ならびにIL-6、TNF-α、CXCL11/I-TACおよびCCL2/MCP-1 (炎症性サイトカイン/ケモカイン)に対するmRNAの発現を定量RT-PCRを用いて評価した。Y-27632処理iPS-RPE細胞株(TLHD2)から全RNAを単離した。cDNA合成後、qPCR Mastermixおよび高特異的Universal ProbeLibraryアッセイ(全てRoche Diagnostics)を用いることによってLightCycler 480装置でqRT-PCRによって、3つのサンプルで上記の因子およびβ-アクチンの発現を解析した。Best1、RPE65、Pax6およびβ-アクチン (コントロール)に対する試験用プライマーおよびUniversal Probe、ならびにPCR条件はInvest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20;56(2):1051-62の記載に従った。もう1つのプライマーおよびプローブは以下の通りである:
VEGF-A:
L: cgcaagaaatcccggtataa (配列番号1)
R:aaatgctttctccgctctga (配列番号2)
probe #1;
PEDF:
L: gtgtggagctgcagcgtat (配列番号3)
R: tccaatgcagaggagtagca (配列番号4)
probe #57;
チロシナーゼ:
L: gctgccaatttcagctttaga (配列番号5)
R: ccgctatcccagtaagtgga (配列番号6)
probe #47;
IL-6:
L: gatgagtacaaaagtcctgatcca (配列番号7)
R: ctgcagccactggttctgt (配列番号8)
probe #40;
TNF-α:
L: cagcctcttctccttcctgat (配列番号9)
R: gccagagggctgattagaga (配列番号10)
probe #29;
CXCL11/I-TAC:
L: agtgtgaagggcatggcta (配列番号11)
R: tcttttgaacatggggaagc (配列番号12)
probe #76;
CCL2/MCP-1:
L: agtctctgccgcccttct (配列番号13)
R: gtgactggggcattgattg (配列番号14)
probe #40.
結果を分子の相対的発現で示した(ΔΔCt: control cells = 1)。ヒトCCL2/MCP-1 ELISA (R&D Systems)を用いることによって、Y-27632処理iPS-RPE細胞株(TLHD2)、Y-27632未処理コントロールRPE細胞の上清中のCCL2/MCP-1の濃度を測定した。
免疫組織化学によってiPS-RPE細胞(TLHD2)におけるVEGFの発現も測定した。Y-27632処理iPS-RPE細胞またはY-27632未処理コントロールRPE細胞を4% PFA-PBSで15分間室温で固定し、0.3% Triton X-100-PBSで透過処理した。1次抗体として抗ヒトVEGF抗体(abcam: catalog no. ab52917)またはアイソタイプコントロール(ウサギ)を使用し、二次抗体としてAlexa Fluor-488抗ウサギIgG(Invitrogen: catalog no. A11034)を用いた。細胞核をDAPIで対比染色した。Stem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1501-1515に記載の通り、発明者らは共焦点顕微鏡を用いた抗体または平均蛍光強度の測定によってRPE染色を評価した。
Y-27632処理iPS-RPE細胞におけるRPE特異的マーカーまたは炎症性サイトカイン/ケモカインを確認するため、発明者らは、定量RT-PCR、ELISA、および免疫組織化学によって数種類の因子を調べた。VEGF-A、PEDF、ベストロフィン-1 (Best1)、RPE65、Pax6およびチロシナーゼ(RPE特異的マーカー)ならびにIL-6、TNF-α、CXCL11/I-TACおよびCCL2/MCP-1 (炎症性サイトカイン/ケモカイン)に対するmRNAの発現を定量RT-PCRを用いて評価した。Y-27632処理iPS-RPE細胞株(TLHD2)から全RNAを単離した。cDNA合成後、qPCR Mastermixおよび高特異的Universal ProbeLibraryアッセイ(全てRoche Diagnostics)を用いることによってLightCycler 480装置でqRT-PCRによって、3つのサンプルで上記の因子およびβ-アクチンの発現を解析した。Best1、RPE65、Pax6およびβ-アクチン (コントロール)に対する試験用プライマーおよびUniversal Probe、ならびにPCR条件はInvest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20;56(2):1051-62の記載に従った。もう1つのプライマーおよびプローブは以下の通りである:
VEGF-A:
L: cgcaagaaatcccggtataa (配列番号1)
R:aaatgctttctccgctctga (配列番号2)
probe #1;
PEDF:
L: gtgtggagctgcagcgtat (配列番号3)
R: tccaatgcagaggagtagca (配列番号4)
probe #57;
チロシナーゼ:
L: gctgccaatttcagctttaga (配列番号5)
R: ccgctatcccagtaagtgga (配列番号6)
probe #47;
IL-6:
L: gatgagtacaaaagtcctgatcca (配列番号7)
R: ctgcagccactggttctgt (配列番号8)
probe #40;
TNF-α:
L: cagcctcttctccttcctgat (配列番号9)
R: gccagagggctgattagaga (配列番号10)
probe #29;
CXCL11/I-TAC:
L: agtgtgaagggcatggcta (配列番号11)
R: tcttttgaacatggggaagc (配列番号12)
probe #76;
CCL2/MCP-1:
L: agtctctgccgcccttct (配列番号13)
R: gtgactggggcattgattg (配列番号14)
probe #40.
結果を分子の相対的発現で示した(ΔΔCt: control cells = 1)。ヒトCCL2/MCP-1 ELISA (R&D Systems)を用いることによって、Y-27632処理iPS-RPE細胞株(TLHD2)、Y-27632未処理コントロールRPE細胞の上清中のCCL2/MCP-1の濃度を測定した。
免疫組織化学によってiPS-RPE細胞(TLHD2)におけるVEGFの発現も測定した。Y-27632処理iPS-RPE細胞またはY-27632未処理コントロールRPE細胞を4% PFA-PBSで15分間室温で固定し、0.3% Triton X-100-PBSで透過処理した。1次抗体として抗ヒトVEGF抗体(abcam: catalog no. ab52917)またはアイソタイプコントロール(ウサギ)を使用し、二次抗体としてAlexa Fluor-488抗ウサギIgG(Invitrogen: catalog no. A11034)を用いた。細胞核をDAPIで対比染色した。Stem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1501-1515に記載の通り、発明者らは共焦点顕微鏡を用いた抗体または平均蛍光強度の測定によってRPE染色を評価した。
ヒトiPS/ES細胞由来3D網膜から確立された網膜神経節細胞および神経網膜に対するY-27632毒性in vitroアッセイ
網膜における網膜神経節細胞(RGC)および神経網膜(NR)に対するY-27632の毒性を確認するため、発明者らは、ヒトiPS細胞由来3D網膜からRGC、ヒトES細胞由来3D網膜からNRを調製した。TLHD2 iPS細胞由来3D網膜から誘導された1 x 104 RGCを、12穴プレート中で10 μM Y-27632の存在下または非存在下で24時間または7日間培養した。Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Feb 1;59(2):776-787に記載の通り、3D網膜から精製されたRGCを確立し、Brn-3bのようなRGC特異的マーカーを調べた。また、NR (ES細胞由来3D網膜: CRX::Venus)も調製した。具体的には、10 μM Y-27632存在下7日間24穴プレート中で5 x 104 細胞/穴を培養し、Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):771-785に記載の通り、3D網膜から精製されたNRを確立した。該RGCおよびNRの形態を顕微鏡で評価した。発明者らはまた、フローサイトメトリーによってY-27632の存在下、アネキシンV陽性RGCまたはNRを測定した。
網膜における網膜神経節細胞(RGC)および神経網膜(NR)に対するY-27632の毒性を確認するため、発明者らは、ヒトiPS細胞由来3D網膜からRGC、ヒトES細胞由来3D網膜からNRを調製した。TLHD2 iPS細胞由来3D網膜から誘導された1 x 104 RGCを、12穴プレート中で10 μM Y-27632の存在下または非存在下で24時間または7日間培養した。Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Feb 1;59(2):776-787に記載の通り、3D網膜から精製されたRGCを確立し、Brn-3bのようなRGC特異的マーカーを調べた。また、NR (ES細胞由来3D網膜: CRX::Venus)も調製した。具体的には、10 μM Y-27632存在下7日間24穴プレート中で5 x 104 細胞/穴を培養し、Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):771-785に記載の通り、3D網膜から精製されたNRを確立した。該RGCおよびNRの形態を顕微鏡で評価した。発明者らはまた、フローサイトメトリーによってY-27632の存在下、アネキシンV陽性RGCまたはNRを測定した。
In vivo動物モデルにおける移植
サルの取扱いと維持は、理化学研究所 生命機能科学研究センター(BDR)の動物実験倫理委員会のガイドラインと同様、眼および視覚研究における動物の使用および実験動物の使用に対するARVO宣言に従った。発明者らは、まず正常なカニクイザル(Macaca fascicularis)から2種類のiPS細胞、(1) Cyn46 MHCヘテロ接合体サル由来46a iPS細胞および(2) HT-1 MHCホモ接合体サル由来1121A1 iPS細胞を調製した(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):635-648)。正常なカニクイザル(Hekoayu, Utsubo, Ukigori)をEve Bioscience Ltd. (Wakayama, Japan)から購入し、MHC調節サル(ハプロタイプは一致: DrpZ11)をIna Research Inc. (Nagano, Japan)から購入した。iPS-RPE細胞の移植のために、完全な硝子体切除(Accurus, Alcon)を実施し、(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):635-648)に詳細に記載されている通り、iPS-RPE細胞を単一細胞懸濁液となるようにサル移植培地(SFRM-B27培地;DMEM 350 mL (SIGMA D6046), F12 Ham, 150 mL (SIGMA N6658), L-Glutamine 5 mL (SIGMA G7513), P/S 5 mL (GIBCO 15140-122), B27 10 mL (GIBCO 17504-044))に懸濁し、1 x 106 cells/eyeになるように網膜下の空間に移植した。具体的には、ROCK阻害剤Y-27632 (10 μM)を単一細胞懸濁液に加え、Y-27632移植片RPE細胞を手術で網膜に挿入した。コントロールとして、Y-27632未処理RPE細胞も調製した(Hekoayu右眼)。外科手術後、手術したサルの頭部を麻酔であおむけに3時間固定した。
手術後、1、2、4、8週間(DrpZ11サル)ならびに12週間および6か月(Hekoayu)、カラー眼底写真、FA (RetCamIIおよびClarityの両方)およびOCT (Nidek)によって、移植した細胞をモニターした。発明者らは、MHCハプロタイプ不一致のHekoayuサル中のカニクイザルの眼に、シクロスポリンAを含む免疫抑制剤と共に同種異系(allogenic) iPS-RPE細胞を移植した。発明者らは、手術前後でサル由来血清中のシクロスポリンAの濃度をモニターした。発明者らはまた、Utsuboサルに局所ステロイドであるトリアムシノロンアセトニドのテノン嚢下注射(STTA)を行った。発明者らはまた、移植されたサルであるHekoayu、Utsubo、UkigoriおよびDrpZ11においてMHCアリルタイピング(Mafa-class Iおよびclass II)を調べたImmunogenetics. 2015 Oct;67(10):563-78)。発明者らはまた、移植後にNIHイメージJソフトウェアによって移植片面積(pixcel/mm2)を計測した。
網膜組織に対するY-27632の毒性を確認するために、発明者らは、正常なサルの眼(Ukigori 右眼)に10 μM Y-27632を注射した。コントロールとして、発明者らは、左眼にY-27632を含まない生理食塩水のみを注射した。発明者らは、手術後に、カラー眼底、OCT、焦点ERG、およびヘマトキシリンエオシン(H&E)染色の試験によって毒性を評価した。
サルの取扱いと維持は、理化学研究所 生命機能科学研究センター(BDR)の動物実験倫理委員会のガイドラインと同様、眼および視覚研究における動物の使用および実験動物の使用に対するARVO宣言に従った。発明者らは、まず正常なカニクイザル(Macaca fascicularis)から2種類のiPS細胞、(1) Cyn46 MHCヘテロ接合体サル由来46a iPS細胞および(2) HT-1 MHCホモ接合体サル由来1121A1 iPS細胞を調製した(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):635-648)。正常なカニクイザル(Hekoayu, Utsubo, Ukigori)をEve Bioscience Ltd. (Wakayama, Japan)から購入し、MHC調節サル(ハプロタイプは一致: DrpZ11)をIna Research Inc. (Nagano, Japan)から購入した。iPS-RPE細胞の移植のために、完全な硝子体切除(Accurus, Alcon)を実施し、(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):635-648)に詳細に記載されている通り、iPS-RPE細胞を単一細胞懸濁液となるようにサル移植培地(SFRM-B27培地;DMEM 350 mL (SIGMA D6046), F12 Ham, 150 mL (SIGMA N6658), L-Glutamine 5 mL (SIGMA G7513), P/S 5 mL (GIBCO 15140-122), B27 10 mL (GIBCO 17504-044))に懸濁し、1 x 106 cells/eyeになるように網膜下の空間に移植した。具体的には、ROCK阻害剤Y-27632 (10 μM)を単一細胞懸濁液に加え、Y-27632移植片RPE細胞を手術で網膜に挿入した。コントロールとして、Y-27632未処理RPE細胞も調製した(Hekoayu右眼)。外科手術後、手術したサルの頭部を麻酔であおむけに3時間固定した。
手術後、1、2、4、8週間(DrpZ11サル)ならびに12週間および6か月(Hekoayu)、カラー眼底写真、FA (RetCamIIおよびClarityの両方)およびOCT (Nidek)によって、移植した細胞をモニターした。発明者らは、MHCハプロタイプ不一致のHekoayuサル中のカニクイザルの眼に、シクロスポリンAを含む免疫抑制剤と共に同種異系(allogenic) iPS-RPE細胞を移植した。発明者らは、手術前後でサル由来血清中のシクロスポリンAの濃度をモニターした。発明者らはまた、Utsuboサルに局所ステロイドであるトリアムシノロンアセトニドのテノン嚢下注射(STTA)を行った。発明者らはまた、移植されたサルであるHekoayu、Utsubo、UkigoriおよびDrpZ11においてMHCアリルタイピング(Mafa-class Iおよびclass II)を調べたImmunogenetics. 2015 Oct;67(10):563-78)。発明者らはまた、移植後にNIHイメージJソフトウェアによって移植片面積(pixcel/mm2)を計測した。
網膜組織に対するY-27632の毒性を確認するために、発明者らは、正常なサルの眼(Ukigori 右眼)に10 μM Y-27632を注射した。コントロールとして、発明者らは、左眼にY-27632を含まない生理食塩水のみを注射した。発明者らは、手術後に、カラー眼底、OCT、焦点ERG、およびヘマトキシリンエオシン(H&E)染色の試験によって毒性を評価した。
網膜切片に対する免疫組織化学(IHC)
サルを犠死させた後、8週目(DrpZ11)または6か月目(Hekoayu、Utsubo)に回収された眼を固定し、パラフィン(Sigma-Aldrich)に包埋した。網膜切片を5%ヤギ血清でブロックした。免疫細胞/因子(CD3、CD4、CD8、CD20、CD40、MHC-クラスII、IgG、NKG2AおよびIba1)に対する一次抗体と共に切片を4℃で一晩インキュベートした。網膜切片における染色を実施した。抗体情報はStem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1501-1515およびStem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):635-648に記載されている。移植後の移植片を追跡するために、発明者らは、PKH (567 nm: Sigma-Aldrich: catalog no. PKH26GL)でRPE細胞を染色した。イメージは共焦点顕微鏡(LSM700, Zeiss)で取得した。
サルを犠死させた後、8週目(DrpZ11)または6か月目(Hekoayu、Utsubo)に回収された眼を固定し、パラフィン(Sigma-Aldrich)に包埋した。網膜切片を5%ヤギ血清でブロックした。免疫細胞/因子(CD3、CD4、CD8、CD20、CD40、MHC-クラスII、IgG、NKG2AおよびIba1)に対する一次抗体と共に切片を4℃で一晩インキュベートした。網膜切片における染色を実施した。抗体情報はStem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1501-1515およびStem Cell Reports. 2016 Oct 11;7(4):635-648に記載されている。移植後の移植片を追跡するために、発明者らは、PKH (567 nm: Sigma-Aldrich: catalog no. PKH26GL)でRPE細胞を染色した。イメージは共焦点顕微鏡(LSM700, Zeiss)で取得した。
Y-27632処理iPS-RPE細胞におけるpMLCII IHC染色
TrypLE Select(ThermoFisher)を用いて分化したQHJIs01-01 iPSC由来RPE細胞を分散させ、RPEストック溶液中で10 μM Y-27632 (Wako)存在下または非存在下、コートされていないまたはLaminin E8断片(iMatrix511, Matrixosome)でコートされた24穴プレート(Falcon)に播種した。15分から24時間インキュベーション後、RPE細胞を4% PFAで4℃、30分間固定した。該Y-27632処理RPE細胞をAlexa Fluor 594コンジュゲートPhalloidin (x1000: Thermo A12381)およびPhospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)抗体(x200: Cell Signaling, # 3671S)で染色した。pMLCII染色に対する二次抗体としてAlexa Fluor 488コンジュゲートロバ抗ウサギIgGを使用した。time-courseアッセイのために、発明者らは、Y-27632処理または未処理RPE細胞を調製し、インキュベーション時間は15分、30分、60分、3時間、6時間および24 時間だった。濃度アッセイのために、発明者らはまた、0、0.01、0.1、1、10、100 μMの Y-27632で処理されたY-27632処理RPE細胞を調製した。細胞核をDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡BZ-X800 (Keyence)を用いて全サンプルを観察した。
TrypLE Select(ThermoFisher)を用いて分化したQHJIs01-01 iPSC由来RPE細胞を分散させ、RPEストック溶液中で10 μM Y-27632 (Wako)存在下または非存在下、コートされていないまたはLaminin E8断片(iMatrix511, Matrixosome)でコートされた24穴プレート(Falcon)に播種した。15分から24時間インキュベーション後、RPE細胞を4% PFAで4℃、30分間固定した。該Y-27632処理RPE細胞をAlexa Fluor 594コンジュゲートPhalloidin (x1000: Thermo A12381)およびPhospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)抗体(x200: Cell Signaling, # 3671S)で染色した。pMLCII染色に対する二次抗体としてAlexa Fluor 488コンジュゲートロバ抗ウサギIgGを使用した。time-courseアッセイのために、発明者らは、Y-27632処理または未処理RPE細胞を調製し、インキュベーション時間は15分、30分、60分、3時間、6時間および24 時間だった。濃度アッセイのために、発明者らはまた、0、0.01、0.1、1、10、100 μMの Y-27632で処理されたY-27632処理RPE細胞を調製した。細胞核をDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡BZ-X800 (Keyence)を用いて全サンプルを観察した。
統計評価
Student’s t検定 (適宜、両側検定または片側検定)で全統計解析を実施した。Pが0.05未満の場合に、値は統計的に有意であると考えた。
Student’s t検定 (適宜、両側検定または片側検定)で全統計解析を実施した。Pが0.05未満の場合に、値は統計的に有意であると考えた。
(結果)
Y-27632併用他家iPS-RPE細胞混濁液移植カニクイザルモデル(Hekoayu)の左眼術後経過
移植後23週目の左眼のカラー眼底像(Color)および自発蛍光眼底像(AF)の所見では、移植部位に色素を有する移植片RPE細胞の広がり、生着が見られた(図1)。自発蛍光眼底像の後期像(FA late)では移植片RPE細胞からの蛍光露出、即ち拒絶反応はなく、網膜断層像(OCT)においても移植片RPE細胞は生着しており、拒絶反応の所見はなく、網膜に異常は見られなかった(図1)。移植後23週目の左眼のヘマトキシリンエオジン(H&E)染色像でも、移植片RPE細胞が単層構造を形成して生着していることが確認できた(図2)。また、PKHによる免疫組織染色像においても、移植片RPE細胞の生着が見られた(図3)。さらに、この網膜切片を用いた免疫病理学的観察においても拒絶反応は見られず、網膜および脈絡膜は正常に近かった。また、移植後の黄斑上膜の形成は、カラー眼底像、網膜断層像、免疫組織染色像のいずれにおいても見られなかった。
Y-27632併用他家iPS-RPE細胞混濁液移植カニクイザルモデル(Hekoayu)の左眼術後経過
移植後23週目の左眼のカラー眼底像(Color)および自発蛍光眼底像(AF)の所見では、移植部位に色素を有する移植片RPE細胞の広がり、生着が見られた(図1)。自発蛍光眼底像の後期像(FA late)では移植片RPE細胞からの蛍光露出、即ち拒絶反応はなく、網膜断層像(OCT)においても移植片RPE細胞は生着しており、拒絶反応の所見はなく、網膜に異常は見られなかった(図1)。移植後23週目の左眼のヘマトキシリンエオジン(H&E)染色像でも、移植片RPE細胞が単層構造を形成して生着していることが確認できた(図2)。また、PKHによる免疫組織染色像においても、移植片RPE細胞の生着が見られた(図3)。さらに、この網膜切片を用いた免疫病理学的観察においても拒絶反応は見られず、網膜および脈絡膜は正常に近かった。また、移植後の黄斑上膜の形成は、カラー眼底像、網膜断層像、免疫組織染色像のいずれにおいても見られなかった。
Y-27632未使用他家iPS-RPE細胞混濁液移植カニクイザルモデル(Hekoayu)の右眼術後経過
移植後24週目の右眼のカラー眼底像(Color)および自発蛍光眼底像(AF)の所見では、移植部位に色素を有する移植片REP細胞の生着が見られたが、単層構造ではなく細胞塊となっていた。ただし、自家蛍光眼底像の後期像(FA late)において移植片RPE細胞からの蛍光露出(拒絶反応)はなく、網膜断層像(OCT)においても移植片RPE細胞は生着しており、拒絶反応の所見はなく、網膜に異常は見られなかった(図4)。またこの網膜切片のヘマトキシリンエオジン(H&E)染色像でも、移植片RPE細胞が細胞塊であることが確認できた(図5)。
移植後24週目の右眼のカラー眼底像(Color)および自発蛍光眼底像(AF)の所見では、移植部位に色素を有する移植片REP細胞の生着が見られたが、単層構造ではなく細胞塊となっていた。ただし、自家蛍光眼底像の後期像(FA late)において移植片RPE細胞からの蛍光露出(拒絶反応)はなく、網膜断層像(OCT)においても移植片RPE細胞は生着しており、拒絶反応の所見はなく、網膜に異常は見られなかった(図4)。またこの網膜切片のヘマトキシリンエオジン(H&E)染色像でも、移植片RPE細胞が細胞塊であることが確認できた(図5)。
Y-27632併用他家iPS-RPE細胞とROCK阻害剤未使用他家iPS-RPE細胞の生着面積
Y-27632を使用して生着させたiPS-RPE細胞の生着面積とY-27632を使用せずに生着させたiPS-RPE細胞の生着面積をNIHイメージJソフトウェアを用いて計測した。Y-27632を使用した細胞の面積は4.594mm2である一方、Y-27632を使用しない細胞の面積は0.846mm2であった。従って、Y-27632併用他家iPS-RPE細胞は単層構造を形成して生着していることが分かった(図6)。
Y-27632を使用して生着させたiPS-RPE細胞の生着面積とY-27632を使用せずに生着させたiPS-RPE細胞の生着面積をNIHイメージJソフトウェアを用いて計測した。Y-27632を使用した細胞の面積は4.594mm2である一方、Y-27632を使用しない細胞の面積は0.846mm2であった。従って、Y-27632併用他家iPS-RPE細胞は単層構造を形成して生着していることが分かった(図6)。
Y-27632処理iPS-RPE細胞におけるPhospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)の検出
発明者らは、Y-27632前処理RPE細胞においてROCK活性がどのように制御されているかを調べた。免疫組織化学解析では、iPS-RPE細胞におけるpMLCIIの発現がY-27632によって阻害されることが示された(図7)。リン酸化の停止はRPE細胞をY-27632で処理後15分で始まり、少なくとも24時間継続した(図8A)。濃度解析では、100 μM Y-27632を添加後、RPE細胞は傷害されたことが示され(ファロイジンの染色が弱くなった)、10 μMの濃度が最も適切であるように見えた(図8B)。
発明者らは、Y-27632前処理RPE細胞においてROCK活性がどのように制御されているかを調べた。免疫組織化学解析では、iPS-RPE細胞におけるpMLCIIの発現がY-27632によって阻害されることが示された(図7)。リン酸化の停止はRPE細胞をY-27632で処理後15分で始まり、少なくとも24時間継続した(図8A)。濃度解析では、100 μM Y-27632を添加後、RPE細胞は傷害されたことが示され(ファロイジンの染色が弱くなった)、10 μMの濃度が最も適切であるように見えた(図8B)。
Y-27632で前処理したiPS-RPE細胞は炎症性サイトカイン/ケモカイン産生が抑制されている
発明者らは、Y-27632存在下、炎症性サイトカイン/ケモカイン産生についてiPS-RPE細胞を調べた。発明者らは、定量RT-PCRおよびELISAを用いて、Y-27632処理iPS-RPE細胞によるIL-6、TNF-α、CXCL11/I-TACおよびCCL2/MCP-1を調べた。定量RT-PCR解析のデータでは、Y-27632処理iPS-RPE細胞は、IL-6、CXCL11/I-TACおよびCCL2/MCP-1のmRNA発現が少ないが、TNF-α mRNAを発現しなかった(図9)。Y-27632の用量依存アッセイでは、Y-27632処理iPS-RPE細胞は、未処理RPE細胞に比べて、CCL2/MCP-1 mRNA(図10)およびタンパク質(図11)の発現が少なかった。これらの結果から、Y-27632処理RPE細胞は炎症性サイトカイン/ケモカインの産生量が少なくなることが示された。
発明者らは、Y-27632存在下、炎症性サイトカイン/ケモカイン産生についてiPS-RPE細胞を調べた。発明者らは、定量RT-PCRおよびELISAを用いて、Y-27632処理iPS-RPE細胞によるIL-6、TNF-α、CXCL11/I-TACおよびCCL2/MCP-1を調べた。定量RT-PCR解析のデータでは、Y-27632処理iPS-RPE細胞は、IL-6、CXCL11/I-TACおよびCCL2/MCP-1のmRNA発現が少ないが、TNF-α mRNAを発現しなかった(図9)。Y-27632の用量依存アッセイでは、Y-27632処理iPS-RPE細胞は、未処理RPE細胞に比べて、CCL2/MCP-1 mRNA(図10)およびタンパク質(図11)の発現が少なかった。これらの結果から、Y-27632処理RPE細胞は炎症性サイトカイン/ケモカインの産生量が少なくなることが示された。
ROCK阻害剤は活性化リンパ球を直接抑制する
発明者らは、Y-27632がリンパ球の活性化をin vitroで直接的に抑制するか否かを調べた。結果として、混合リンパ球反応(MLR)を実施した場合、Y-27632は、CD4+/Ki-67+ 細胞(増殖性ヘルパーT細胞)、CD8+/Ki-67+ 細胞(増殖性細胞傷害性T細胞)およびCD11b+/Ki-67+細胞(増殖性単球)の細胞増殖を直接的に抑制した(図12、13)。また、Y-27632は、炎症性サイトカインIFN-γの産生を有意に抑制した(図14)。以上より、Y-27632は炎症阻害能を有することを示した。
発明者らは、Y-27632がリンパ球の活性化をin vitroで直接的に抑制するか否かを調べた。結果として、混合リンパ球反応(MLR)を実施した場合、Y-27632は、CD4+/Ki-67+ 細胞(増殖性ヘルパーT細胞)、CD8+/Ki-67+ 細胞(増殖性細胞傷害性T細胞)およびCD11b+/Ki-67+細胞(増殖性単球)の細胞増殖を直接的に抑制した(図12、13)。また、Y-27632は、炎症性サイトカインIFN-γの産生を有意に抑制した(図14)。以上より、Y-27632は炎症阻害能を有することを示した。
実施例2 Ripasudil(リパスジル) ROCK阻害剤の利用
ROCK阻害剤としてY-27632 (Wako)に代えてリパスジル(Toronto Research Chemicals)を用いて以下の通りの方法に従い、各アッセイを行った。
ROCK阻害剤としてY-27632 (Wako)に代えてリパスジル(Toronto Research Chemicals)を用いて以下の通りの方法に従い、各アッセイを行った。
リパスジル存在下におけるiPS-RPE細胞の形態および増殖
iPS細胞(253G1:健常ドナー)から誘導された2 x 105 RPE細胞をコーティングされていない24穴培養プレート中でリパスジル(0.01, 0.1, 1, 10 μM)又はコントロール用としてY-27632 (10 μM)の存在下または非存在下、培養して24時間後のFACS分析、及び培養3日後の顕微鏡像におけるKi-67陽性細胞によって、該RPE細胞の増殖を評価した。培地(総量2 mL)はOpti-MEMを使用した。また、iPS-RPE細胞(253G1)の細胞形態を評価するために、リパスジル(10 μM)又はコントロール用としてY-27632(10 μM)の存在下または非存在下、72時間該細胞を培養した。培地はOpti-MEMを使用した。
(結果)
Ki-67陽性細胞の割合は、リパスジル及びY-27632非存在下では50.5%、リパスジル0.01 μMでは67.1%、リパスジル0.1 μMでは60.0%、リパスジル1 μMでは78.9%、リパスジル10 μMでは85.1%、Y-27632 10 μMでは87.2%であり、リパスジルのRPE細胞増殖効果はY-27632と類似していた。リパスジル10 μM存在下3日間の培養で細胞数がコントロールに比べて約6倍に増えた。培養3日後の顕微鏡像におけるRPE細胞は、リパスジル10 μM で根を張る様に増えて形態も整っており、Y-27632 10 μMと同様の形態であった。
iPS細胞(253G1:健常ドナー)から誘導された2 x 105 RPE細胞をコーティングされていない24穴培養プレート中でリパスジル(0.01, 0.1, 1, 10 μM)又はコントロール用としてY-27632 (10 μM)の存在下または非存在下、培養して24時間後のFACS分析、及び培養3日後の顕微鏡像におけるKi-67陽性細胞によって、該RPE細胞の増殖を評価した。培地(総量2 mL)はOpti-MEMを使用した。また、iPS-RPE細胞(253G1)の細胞形態を評価するために、リパスジル(10 μM)又はコントロール用としてY-27632(10 μM)の存在下または非存在下、72時間該細胞を培養した。培地はOpti-MEMを使用した。
(結果)
Ki-67陽性細胞の割合は、リパスジル及びY-27632非存在下では50.5%、リパスジル0.01 μMでは67.1%、リパスジル0.1 μMでは60.0%、リパスジル1 μMでは78.9%、リパスジル10 μMでは85.1%、Y-27632 10 μMでは87.2%であり、リパスジルのRPE細胞増殖効果はY-27632と類似していた。リパスジル10 μM存在下3日間の培養で細胞数がコントロールに比べて約6倍に増えた。培養3日後の顕微鏡像におけるRPE細胞は、リパスジル10 μM で根を張る様に増えて形態も整っており、Y-27632 10 μMと同様の形態であった。
リパスジルで処理されたiPS-RPE細胞におけるアポトーシスアッセイ(1)
iPS-RPE細胞(24穴プレート中2 x 105/穴; TLHD2株)を24時間リパスジル (0.01、0.1、1および10 μM)又はY-27632 (10 μM)の存在下または非存在下で処理した。培養中の細胞死を評価するため、フローサイトメトリーによってアネキシンV陽性RPE細胞を測定した。染色のために、該RPE細胞(リパスジル処理、Y-27632処理または未処理iPS-RPE細胞)を細胞染色バッファー(BioLegend)で洗浄し、アネキシンV結合バッファー(BioLegend: catalog no. 420201)で再懸濁した。該細胞をFITC標識抗アネキシンV抗体(BioLegend: catalog no. 640906)で15分間室温で染色した。FACSCantoTM II フローサイトメーター (BD Biosciences)を用いてサンプルを解析した。発明者らは、データをFlowJo ソフトウェア(version 9.3.1)で解析した。
(結果)
リパスジルのRPEへのアポトーシス抑制効果は1 μMと10 μMで見られた。リパスジル 10 μMで処理されたiPS-RPE細胞のアネキシンV陽性細胞率(=アポトーシス細胞率)は5.7%で、無処理のiPS-RPE細胞のアネキシンV細胞率が14.6%であり強いRPE細胞アポトーシス抑制効果が見られた。一方、Y-27632の10 μMで処理されたiPS-RPE細胞のアネキシンV陽性細胞率が3.9%なのでリパスジルとY-27632のアポトーシス抑制効果は同等の結果であった。
iPS-RPE細胞(24穴プレート中2 x 105/穴; TLHD2株)を24時間リパスジル (0.01、0.1、1および10 μM)又はY-27632 (10 μM)の存在下または非存在下で処理した。培養中の細胞死を評価するため、フローサイトメトリーによってアネキシンV陽性RPE細胞を測定した。染色のために、該RPE細胞(リパスジル処理、Y-27632処理または未処理iPS-RPE細胞)を細胞染色バッファー(BioLegend)で洗浄し、アネキシンV結合バッファー(BioLegend: catalog no. 420201)で再懸濁した。該細胞をFITC標識抗アネキシンV抗体(BioLegend: catalog no. 640906)で15分間室温で染色した。FACSCantoTM II フローサイトメーター (BD Biosciences)を用いてサンプルを解析した。発明者らは、データをFlowJo ソフトウェア(version 9.3.1)で解析した。
(結果)
リパスジルのRPEへのアポトーシス抑制効果は1 μMと10 μMで見られた。リパスジル 10 μMで処理されたiPS-RPE細胞のアネキシンV陽性細胞率(=アポトーシス細胞率)は5.7%で、無処理のiPS-RPE細胞のアネキシンV細胞率が14.6%であり強いRPE細胞アポトーシス抑制効果が見られた。一方、Y-27632の10 μMで処理されたiPS-RPE細胞のアネキシンV陽性細胞率が3.9%なのでリパスジルとY-27632のアポトーシス抑制効果は同等の結果であった。
リパスジルで処理されたiPS-RPE細胞におけるアポトーシスアッセイ(2)
iPS-RPE細胞(24穴プレート中2 x 105/穴; 253G1株)を24時間リパスジル (10、100、200 μM)の存在下または非存在下で処理した点以外は前記アポトーシスアッセイ(1)と同様の方法により解析し、リパスジル効果の至適濃度を検討した。
(結果)
アポトーシス細胞の割合は、リパスジル非存在下では3.6%、リパスジル10 μMでは3.1%、リパスジル100 μMでは3.6%、リパスジル200 μMでは6.5%であったが、外観上、リパスジルは100 μM以上の高濃度だとRPEの細胞構造が崩れて形態変化、細胞死が誘導されていた。リパスジル10 μMの場合は問題はない。
iPS-RPE細胞(24穴プレート中2 x 105/穴; 253G1株)を24時間リパスジル (10、100、200 μM)の存在下または非存在下で処理した点以外は前記アポトーシスアッセイ(1)と同様の方法により解析し、リパスジル効果の至適濃度を検討した。
(結果)
アポトーシス細胞の割合は、リパスジル非存在下では3.6%、リパスジル10 μMでは3.1%、リパスジル100 μMでは3.6%、リパスジル200 μMでは6.5%であったが、外観上、リパスジルは100 μM以上の高濃度だとRPEの細胞構造が崩れて形態変化、細胞死が誘導されていた。リパスジル10 μMの場合は問題はない。
リパスジル処理iPS-RPE細胞におけるpMLCII IHC染色(リン酸化抑制試験)
iPS-RPE細胞(TLHD2)を分散させ、RPEストック溶液中で10 μM リパスジル存在下または非存在下、Laminin E8断片(iMatrix511, Matrixosome)でコートされた24穴プレート(Falcon)に播種した。24時間インキュベーション後、RPE細胞を4% PFAで4℃、30分間固定し、phospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)抗体(x200: Cell Signaling, # 3671S)で染色した。pMLCII染色に対する二次抗体としてAlexa Fluor 488コンジュゲートロバ抗ウサギIgGを使用した。細胞核をDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡BZ-X800 (Keyence)を用いて全サンプルを観察した。
(結果)
リパスジル非存在下のコントロールと比較して、リパスジルを添加したRPE細胞ではpMCLII染色が減弱していた。このことから、リパスジルを添加したRPE細胞において、下流のリン酸化が停止し、ROCK阻害剤として機能していたことが確認できた。
iPS-RPE細胞(TLHD2)を分散させ、RPEストック溶液中で10 μM リパスジル存在下または非存在下、Laminin E8断片(iMatrix511, Matrixosome)でコートされた24穴プレート(Falcon)に播種した。24時間インキュベーション後、RPE細胞を4% PFAで4℃、30分間固定し、phospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)抗体(x200: Cell Signaling, # 3671S)で染色した。pMLCII染色に対する二次抗体としてAlexa Fluor 488コンジュゲートロバ抗ウサギIgGを使用した。細胞核をDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡BZ-X800 (Keyence)を用いて全サンプルを観察した。
(結果)
リパスジル非存在下のコントロールと比較して、リパスジルを添加したRPE細胞ではpMCLII染色が減弱していた。このことから、リパスジルを添加したRPE細胞において、下流のリン酸化が停止し、ROCK阻害剤として機能していたことが確認できた。
リパスジル処理iPS-RPE細胞におけるPhalloidin IHC染色(毒性試験)
TrypLE Select(ThermoFisher)を用いて、分化したiPS-RPE細胞(TLHD2)を分散させ、RPEストック溶液中でリパスジル(1、10および100 μM)存在下または非存在下、24穴プレート(Falcon)に播種した。24時間インキュベーション後、RPE細胞を4% PFAで4℃、30分間固定した。該リパスジル処理RPE細胞をAlexa Fluor 594コンジュゲートPhalloidin (x1000: Thermo A12381)で染色した。細胞核をDAPIで対比染色した。コンフォーカル顕微鏡 (型番:LSM700、ZEISS)を用いて全サンプルを観察した。
(結果)
リパスジル1 μMと10 μMでは綺麗な染色像が見られた。一方、リパスジル100 μMでは、細胞骨格の染色がかなり減弱しており、100 μMほどの高濃度では毒性があると判断した。
TrypLE Select(ThermoFisher)を用いて、分化したiPS-RPE細胞(TLHD2)を分散させ、RPEストック溶液中でリパスジル(1、10および100 μM)存在下または非存在下、24穴プレート(Falcon)に播種した。24時間インキュベーション後、RPE細胞を4% PFAで4℃、30分間固定した。該リパスジル処理RPE細胞をAlexa Fluor 594コンジュゲートPhalloidin (x1000: Thermo A12381)で染色した。細胞核をDAPIで対比染色した。コンフォーカル顕微鏡 (型番:LSM700、ZEISS)を用いて全サンプルを観察した。
(結果)
リパスジル1 μMと10 μMでは綺麗な染色像が見られた。一方、リパスジル100 μMでは、細胞骨格の染色がかなり減弱しており、100 μMほどの高濃度では毒性があると判断した。
リパスジルによる活性化リンパ球抑制試験
健常人末梢血細胞5名分を混合してリンパ球活性化を促す方法である混合リンパ球反応(MLR)を実施した。リパスジル(1,10,50 μM)又はY-27632(1,10,50 μM)の存在下または非存在下、末梢血細胞を混合して96時間後にFACS解析を行い、リンパ球増殖を評価した。
(結果)
リパスジル及びY-27632非存在下では、リンパ球(CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、CD11b単球)の増殖が見られた。一方、リパスジル10 μM、50 μM添加時は、リンパ球の活性化を抑制しており、Y-27632と同様の効果であった。
健常人末梢血細胞5名分を混合してリンパ球活性化を促す方法である混合リンパ球反応(MLR)を実施した。リパスジル(1,10,50 μM)又はY-27632(1,10,50 μM)の存在下または非存在下、末梢血細胞を混合して96時間後にFACS解析を行い、リンパ球増殖を評価した。
(結果)
リパスジル及びY-27632非存在下では、リンパ球(CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、CD11b単球)の増殖が見られた。一方、リパスジル10 μM、50 μM添加時は、リンパ球の活性化を抑制しており、Y-27632と同様の効果であった。
リパスジルで処理されたiPS-RPE細胞上のHLAクラスII分子の発現
アッセイ前に、iPS-RPE細胞(TLHD2)を組換えヒトIFN-γ(100 ng/mL: R&D systems)で48時間前処理した。リパスジル 10 μM若しくはY-27632 10 μMで処理されたiPS-RPE細胞(コントロールとしては非処理細胞)上のHLAクラスII分子の発現をFACS解析で評価した。染色前に、ヒトFc block(Miltenyi Biotec)で該細胞を4℃、15分間インキュベートした。ヒトFc block染色後、該RPE細胞をFITC標識抗HLAクラスII抗体(HLA-DR、DQ、DP: BioLegend: catalog no. 361705)で4℃、30分間室温で染色した。RPE細胞をさらにFITC標識抗マウスIgGで4℃、30分間室温で染色した。FACSCantoTM IIを用いてRPEサンプルを解析した。
(結果)
HLAクラスII発現細胞の割合は、培地のみで16.8%、リパスジル10 μM処理で10.6%、Y-27632 10 μM処理で10.5%であった。このように、リパスジル 10 μM処理したRPEのHLAクラスIIの発現は低下しており、Y-27632 10 μMと同様の効果であった。
アッセイ前に、iPS-RPE細胞(TLHD2)を組換えヒトIFN-γ(100 ng/mL: R&D systems)で48時間前処理した。リパスジル 10 μM若しくはY-27632 10 μMで処理されたiPS-RPE細胞(コントロールとしては非処理細胞)上のHLAクラスII分子の発現をFACS解析で評価した。染色前に、ヒトFc block(Miltenyi Biotec)で該細胞を4℃、15分間インキュベートした。ヒトFc block染色後、該RPE細胞をFITC標識抗HLAクラスII抗体(HLA-DR、DQ、DP: BioLegend: catalog no. 361705)で4℃、30分間室温で染色した。RPE細胞をさらにFITC標識抗マウスIgGで4℃、30分間室温で染色した。FACSCantoTM IIを用いてRPEサンプルを解析した。
(結果)
HLAクラスII発現細胞の割合は、培地のみで16.8%、リパスジル10 μM処理で10.6%、Y-27632 10 μM処理で10.5%であった。このように、リパスジル 10 μM処理したRPEのHLAクラスIIの発現は低下しており、Y-27632 10 μMと同様の効果であった。
本発明によれば、ROCK阻害剤の使用により、移植したRPE細胞懸濁液の網膜下における生着が促進され、移植部位からのRPE細胞の逆流や黄斑上皮の形成を妨げることができる。また、ROCK阻害剤を使用することによって、網膜下に移植されたRPE細胞を細胞塊状ではなく、正常な網膜色素上皮と同様の単層構造に形成させ、生着させることが可能になる。さらに、移植に使用するRPE細胞が他家iPS細胞由来である場合、HLAの不一致による拒絶反応が想定されるところ、ROCK阻害剤の使用により移植されたRPE細胞の炎症性サイトカインおよびケモカインの産生抑制効果ならびにレシピエントのリンパ球(ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、単球)の増殖抑制効果によって、免疫抑制作用が期待できる。本出願は、日本で出願された特願2020-119312(出願日:令和2年7月10日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (22)
- ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤。
- ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、請求項1に記載の移植用生着促進剤。
- 網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、請求項1または2に記載の移植用生着促進剤。
- 多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項3に記載の移植用生着促進剤。
- ROCK阻害剤を含む、網膜色素上皮細胞の移植用免疫抑制剤。
- ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、請求項5に記載の移植用免疫抑制剤。
- 網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、請求項5または6に記載の移植用免疫抑制剤。
- 多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項7に記載の移植用免疫抑制剤。
- 網膜色素上皮細胞及びROCK阻害剤を含む、移植用医薬組成物。
- ROCK阻害剤がY-27632またはRipasudilである、請求項9に記載の移植用医薬組成物。
- ROCK阻害剤の濃度が0.01以上100μM未満である、請求項9または10に記載の移植用医薬組成物。
- 網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞由来である、請求項9~11のいずれか1項に記載の移植用医薬組成物。
- 多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項12に記載の移植用医薬組成物。
- 網膜色素上皮細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、RPE細胞の生着促進方法。
- 移植された網膜色素上皮細胞の生着の促進における使用のためのROCK阻害剤。
- 網膜色素上皮細胞の移植用生着促進剤を製造するための、ROCK阻害剤の使用。
- RPE細胞の移植と同時にまたは前後してROCK阻害剤を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、RPE細胞に対する免疫反応抑制方法
- 移植された網膜色素上皮細胞に対する免疫反応の抑制における使用のためのROCK阻害剤。
- 網膜色素上皮細胞の免疫反応抑制剤を製造するための、ROCK阻害剤の使用。
- 網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物を網膜疾患患者の網膜下に投与することを含む、網膜色素上皮細胞の移植方法。
- 網膜色素上皮細胞の移植における使用のための網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤を含む移植用医薬組成物。
- 移植用医薬組成物を製造するための、網膜色素上皮細胞およびROCK阻害剤の使用。
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