JP2022513736A - 多能性幹細胞由来の臨床グレードの角膜内皮細胞の作製および凍結保存 - Google Patents

Abstract

ドナー源としての末梢血およびｈＥＳＣを使用する、神経堤細胞（ＮＣＣ）系列を通じたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来のおよび人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の作製および凍結保存は、角膜内皮疾患を処置するためのこれらの重要な細胞の、角膜内皮（ＣＥ）移植およびその他の用途に対するドナー角膜の代替物としての利用可能性を最大化する。【選択図】図１

Description

本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月１２日に出願された米国仮出願第６２／７７８，８６２号の優先権の利益を主張する。
実施形態は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からの臨床グレードの角膜内皮細胞の作製および凍結保存、ならびにその使用に関する。

角膜は、眼の最も外側の透明な層である。角膜は、５つの層：上皮、ボウマン膜、実質、デスメ膜および内皮から構成される。^１角膜内皮（ＣＥ）は、バリアおよびポンプ機能を介して補水を媒介することによって角膜の透明性を維持する上で重要な六角形細胞の単層である。^２ＣＥ細胞密度は、成人ＣＥにおいて約２５００細胞／ｍｍ^２である。^３角膜内皮ジストロフィーおよび外科的外傷は、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の喪失およびＣＥ細胞密度の減少に寄与する主な因子である。ＣＥの生理学的機能は、５００細胞／ｍｍ^２細胞密度未満で損なわれ、角膜浮腫および視力の喪失をもたらす。^３

フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）は、米国および世界中で毎年行われる角膜移植の主な原因である。^４、５角膜移植は視覚の復活においては成功しているが、移植片拒絶および移植用の適切なドナー組織の欠如は、世界で角膜失明を減少させる上での障害であり続けている。

Ｄｅｌｍｏｎｔｅ ＤＷ，Ｋｉｍ Ｔ．Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａ．Ｊ Ｃａｔａｒａｃｔ Ｒｅｆｒａｃｔ Ｓｕｒｇ．２０１１；３７：５８８－５９８ Ｂｏｎａｎｎｏ ＪＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｕｍｐ． Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１２；９５：２－７ Ｃｌａｅｒｈｏｕｔ Ｉ，Ｂｅｅｌｅ Ｈ，Ｋｅｓｔｅｌｙｎ Ｐ．Ｇｒａｆｔ ｆａｉｌｕｒｅ：Ｉ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｏｓｓ．Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００８；２８：１６５－１７３ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ． ２０１６ Ｅｙｅ ｂａｎｋｉｎｇ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ． Ｉｎ： ２０１６ Ｇａｉｎ Ｐ，Ｊｕｌｌｉｅｎｎｅ Ｒ，Ｈｅ Ｚ，Ａｌｄｏｓｓａｒｙ Ｍ，Ａｃｑｕａｒｔ Ｓ，Ｃｏｇｎａｓｓｅ Ｆ，Ｔｈｕｒｅｔ Ｇ．Ｇｌｏｂａｌ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｂａｎｋｉｎｇ．ＪＡＭＡ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１６；１３４：１６７－１７３

本発明の実施形態は、とりわけ、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の作製および凍結保存、ならびにそれらの使用に関する。

特定の実施形態では、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造する方法は、生物学的試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することと、多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０を発現する多能性を誘導するためにＰＢＭＣを再プログラム化することと、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造するための、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む多能性幹細胞の分化と、を含む。特定の実施形態では、細胞を培養する工程は、ヒト組換えタンパク質上で、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を使用してビトロネクチン（ＶＴＮ－Ｎ）上でｉＰＳＣおよびｈＥＳＣを培養することを含む。特定の実施形態では、分化している細胞（ｉＰＳＣおよびｈＥＳＣ）は、神経堤マーカー、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０またはこれらの組み合わせを発現する。特定の実施形態では、角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーは、ＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＯＸＣ１、ＳＬＣ１６Ａ３またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、成熟ＣＥＣは、ＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ３またはこれらの組み合わせを含むマーカーによって同定される。

特定の実施形態では、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造することと、ある処置を必要とする対象の角膜中にＣＥＣを移植することとを含む、角膜関連疾患または障害を予防または処置する方法。特定の実施形態では、角膜疾患または障害は、遺伝性疾患もしくは障害、感染、創傷、炎症性疾患、自己免疫疾患、ドライアイ、ジストロフィーまたはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、角膜疾患または障害は、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）、格子状ジストロフィー、円錐角膜、ヘルペスウイルス感染症、水痘帯状疱疹ウイルス感染症、虹彩角膜内皮症候群（ＩＣＥ）、翼状片、角膜潰瘍、角膜擦過傷または水疱性角膜症を含む。

特定の実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造するための再プログラミング方法は、ａ）ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２またはこれらの組み合わせを発現するウイルス粒子を再プログラミングすることによる細胞の感染と、ｂ）感染された細胞の増殖を支持する培地中で、感染された細胞を培養することと、ｃ）ｉＰＳＣコロニーを単離することと、を含む。特定の実施形態では、多能性マーカーを発現するｉＰＳＣコロニーを選択し、増殖させる。特定の実施形態では、多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、多能性マーカーを発現する細胞は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を使用してヒト組換えビトロネクチン（ＶＴＮ－Ｎ）上で培養される。特定の実施形態では、ｉＰＳＣおよびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、多能性マーカーの遺伝子発現、多能性マーカーのタンパク質発現またはこれらの組み合わせを含む手段によって確認される。

特定の実施形態では、本発明は、患者に細胞を移植する工程を含む、幹細胞治療のための方法を提供し、前記細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）ならびに／または前記患者から単離および採取された体細胞を使用して上述の方法によって得られた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化を誘導することによって取得される。健康なヒトに由来する体細胞から調製されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣのライブラリーとしてｉＰＳＣバンクに保存することができ、ライブラリー中の１種類または複数種類のｉＰＳＣを、幹細胞治療を受ける患者が拒絶反応を起こさない体細胞、組織または器官の調製のために使用することができる。

特定の実施形態では、本発明は、上述の方法により得られた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化を誘導することによって得られた様々な細胞を使用することによって、化合物、医薬、毒物等の生理的機能または毒性を評価する方法をさらに提供する。

特定の実施形態では、組成物は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から製造された凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む。

特定の実施形態では、凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）はバイアルに入れられる。特定の実施形態では、凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）は、凍結保存組成物または培地中で凍結される。

他の態様は、以下で説明されている。

別段の定義がなければ、本明細書で使用されているすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本発明の試験のための実施において、本明細書に記載されているものと類似のまたは均等な任意の方法および物質を使用することができるが、本明細書には、好ましい物質および方法が記載されている。本発明の説明および特許請求の範囲において、以下の用語が使用される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を意図するものではないことも理解すべきである。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を表すために使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。したがって、「ａ ｃｅｌｌ」という表記は、例えば、同じ種類の複数の細胞を含む。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「ともに（ｗｉｔｈ）」またはこれらの変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限りにおいては、このような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）であることが意図される。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」という用語およびそれらの変形は、物品、組成物、装置、方法、過程、システムなどの定義されたまたは記載された要素に関して、包括的または非限定的であり、追加の要素を許容することを意味し、それにより、その定義されたまたは記載された物品、組成物、装置、方法、過程、システムなどがそれらの指定された要素または適宜それらの均等物を含むこと、および他の要素が含まれることが可能であり、定義された物品、組成物、装置、方法、過程、システムなどの範囲／定義中になお属することを示す。

本明細書で使用される場合、「培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）培地」または「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）培地」は、細胞の増殖を支持するように設計された任意の液体調合物を広く指す。細胞の維持および増殖のために設計された調合物を指す場合、「細胞培養培地」という用語が使用される。本技術分野では、誘導培地、増殖培地、分化培地などの表現は、一般的な表現である培養培地の亜種と考えることができる。当業者は、培養培地中または培養培地上で生きた対象を維持し、栄養を与えるために必要な基本成分に精通しており、市販の基本培地が広く利用可能である。典型的には、そのような基本成分は「基礎培地」と呼ばれ、必要なアミノ酸、ミネラルおよび有機化合物を含有する。一般に、基礎培地は、血清などの生物学的供給源から得ることができ、または単離された純粋な成分から組み合わせることができる。所望であれば、基礎培地には、培養培地の特殊な特徴または機能に寄与する物質が補充され得る。様々な実施形態の本細胞培養培地中で使用されるべき適切な基礎培地の非限定的な例としては、ノックアウト血清代替物、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２培地およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書で使用される「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」または「分化する（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）」または「分化している（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ）」は、系列決定の発達過程を指す。「系列」とは、前駆体細胞または前駆細胞が、漸進的な生理学的変化を受けて、特徴的な機能を有する特定の細胞型（例えば、神経細胞、筋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球または内皮細胞）になる、細胞発生の経路を指す。分化は段階的に起こり、それによって細胞は、「最終分化」とも呼ばれる完全な成熟に達するまで徐々により特異的になる。最終分化した細胞は、特定の系列へと運命決定され、分化の最終段階（すなわち、完全に成熟した細胞）に達した細胞である。

「患者」または「個体」または「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され、処置されるべき哺乳動物対象を指し、ヒト患者が好ましい。いくつかの事例では、本発明の方法は、すなわちマウス、ラット、ウサギを含むげっ歯類および霊長類を含むがこれらに限定されない実験動物に、獣医学用途に、および疾患の動物モデルの開発に用途を見出す。

「予防する」、「予防すること」、「予防」などは、一般的には特定の疾患、障害または症状を有する素因がある対象との関連において、疾患、障害、症状などを発症する対象のリスクを一時的または永続的に予防、抑制、阻害もしくは低減する（例えば、臨床症候の不存在によって決定される）または疾患、障害、症状などの開始を遅延させるような方法で（例えば、疾患、障害、症状またはこれらの症候の開始前に）開始される行動方針（本明細書に開示される方法によって製造された分化した幹細胞を投与することなど）を指す。特定の例では、これらの用語は、疾患、障害もしくは症状の進行を遅らせること、または有害なもしくはその他望ましくない状態への疾患、障害もしくは症状の進行を阻害することも指す。本明細書で使用される「予防を必要とする」とは、対象が予防的ケアを必要とするまたは予防的ケアから利益を得るであろうと医師またはその他の介護者によってなされる判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づいて行われる。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、自己再生を経ることができ、複数の細胞型に分化することができる哺乳動物細胞を指す。本明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、天然および非天然の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）（例えば、ヒト胚性幹細胞および遺伝子改変された人工多能性幹細胞）および複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を包含する。したがって、幹細胞という用語は、多能性幹細胞、すなわち人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）；複能性幹細胞、すなわち造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）および表皮幹細胞；ならびに前記幹細胞型のそれぞれの遺伝子改変された変異体を包含する。ｉＰＳＣはＥＳＣ様形態を有し、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＯＸＤ３、ＧＤＦ３、ＣＹＰ２６Ａ１、ＴＥＲＴおよびＺＦＰ４２を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の重要な多能性マーカーを発現する。

本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβ阻害剤」は、ＴＧＦβ受容体に直接結合することによって、またはＳＭＡＤ、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）もしくはミュラー管抑制因子（ＭＩＦ）もしくは上記タンパク質のユビキチン化および分解を促進する物質などのＴＧＦβ受容体経路の任意の構成要素の活性を調節することによって、ＴＧＦβ受容体の活性を低下させる薬剤を指す。

本明細書で使用される場合、疾患を「処置する」とは、対象によって経験される疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症候の頻度または重症度を低下させることを意味する。

本明細書で使用される場合、「ゼノフリー」という用語は、動物に由来する一切の外来性物質または成分が存在しないことを指す。したがって、ヒト細胞培養の場合には、本用語は、非ヒト動物成分を含まない条件を指す。換言すれば、ヒトで使用するために、眼前駆体細胞またはそこから成熟した任意の細胞の製造のためにゼノフリー条件が所望される場合、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）がヒト起源であるように選択される。

図１は、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の生成を示す一連の画像である。２０日目（Ｄ２０）でのＣＥＣ様六角形／多角形の形態を示す、ＣＥＣ分化中の様々な倍率での位相差顕微鏡法。 図２は、免疫細胞化学による、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の性質決定を示す一連の画像である。ａ～ｃは、ｈＥＳＣ由来のＣＥＣの密着帯－１（ＺＯ－１、タイトジャンクションタンパク質）に対する免疫染色、ｄ～ｆは、ヒトＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣ由来のＣＥＣのＺＯ－１に対する免疫染色、ｇ～ｉは、ｈＥＳＣ由来のＣＥＣのＮ－カドヘリンに対する免疫染色、ｊ～ｌは、ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣ由来ＣＥＣのＮ－カドヘリンに対する免疫染色。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色した。画像は、６０倍の倍率を用いてとらえた。スケールバーは１０μｍを表す。 図３は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が角膜内皮細胞（ＣＥＣ）に分化する間の、角膜内皮（ＣＥ）および多能性関連マーカーの遺伝子発現分析を示すグラフである。２０日目（Ｄ２０）に、７つのＣＥ関連マーカー（ＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＯＸＣ１、ＳＬＣ１６Ａ３）および４つの多能性マーカー、すなわちＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０の発現レベルを、ｈＥＳＣ、ｈＥＳＣ由来のＣＥＣおよびＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣ由来のＣＥＣにおいて定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって分析した。注意：すべてのマーカーの発現はＧＡＰＤＨに対して正規化されており、すべての値はｈＥＳＣのそれぞれの発現に対して比較されている。 図４は、フィーダーフリーかつゼノフリー条件下で作製されたＨ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の免疫組織化学的検査による性質決定を示す一連の画像である。ａ～ｃは、ｈＥＳＣ由来のＣＥＣの密着帯－１（ＺＯ－１、タイトジャンクションタンパク質）に対する免疫染色。 図５は、次世代ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）による、凍結保存されていないおよび凍結保存されたＨ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の比較分析の結果を示す。ａは、凍結保存されていないおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣのトランスクリプトームデータセット間の重複を示すベン図である。ｂは、両データセット間の高い相関を示す凍結保存されていないおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣデータセットの正規化された発現を表すピアソン相関（ピアソン相関Ｒ＝０．９７５）である。ｃは、凍結保存されていないおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣトランスクリプトームデータセット内での変動の範囲を示す箱ひげ図である。ｄは、凍結保存されていないおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣトランスクリプトームデータセット内での遺伝子の発現強度分布を表すバイオリン図である。 図６は、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の注射後のウサギにおける再生された角膜内皮（ＣＥ）を示す一連の画像である。１、４、７、１４、２１日および９ヶ月の時点で、凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣを注射されたウサギの眼の代表的な写真。凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣを前房中に注射した後に、右眼は、左の未処置対照眼と同様、透明な角膜を呈する。 図７は、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の注射後のウサギにおける再生された角膜内皮（ＣＥ）の評価を示す一連の画像である。ｃｏｎｆｏｓｃａｎ４走査型顕微鏡を使用して、注射後６ヶ月および９ヶ月で、再生されたＣＥを評価した。注入された眼は、左の未処置眼とほぼ同様のＣＥＣ密度および形状を呈する。 図８は、注射の９ヶ月後での、ウサギにおける、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の注射後の再生された角膜内皮（ＣＥ）の免疫組織化学的検査による性質決定を示す一連の画像である。再生されたＣＥおよび左の未処置対照ＣＥ中で同様の発現パターンを示す、密着帯－１（ＺＯ－１）、ＡＴＰａｓｅナトリウム／カリウムサブユニットα１（Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅα１）およびＮ－カドヘリンに対する免疫染色。注意：細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色した。画像は６０倍の倍率を用いてとらえ、スケールバーは１０μｍを表す。 図９は、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の注射後のサルにおける再生された角膜内皮（ＣＥ）を示す一連の画像である。１、２、４日、および１週間、１ヶ月および１年の時点でのｈＥＳＣ由来ＣＥＣを注射されたサルの眼の代表的な写真。凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣを前房中に注射した後に、右眼は、左の未処置対照眼と同様、透明な角膜を呈する。 図１０は、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の注射後のサルにおける再生された角膜内皮（ＣＥ）の評価を示す一連の画像である。ｃｏｎｆｏｓｃａｎ４走査型顕微鏡を使用して、注射後６ヶ月および１年で、再生されたＣＥを評価した。注入された眼は、左の未処置眼とほぼ同様のＣＥＣ密度および形状を呈する。 図１１は、注射の１年後での、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の注射後の再生された角膜内皮（ＣＥ）の免疫組織化学的検査による性質決定を示す画像である。再生されたＣＥおよび左の未処置対照ＣＥ中で同様の発現パターンを示す、密着帯－１（ＺＯ－１）、ＡＴＰａｓｅナトリウム／カリウムサブユニットα１（Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１）およびＮ－カドヘリンに対する免疫染色。注意：細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色した。画像は６０倍の倍率を用いてとらえ、スケールバーは１０μｍを表す。

本発明は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の発達に部分的に基づく。簡単に記載すると、神経堤細胞（ＮＣＣ）を介して、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣをＣＥＣに分化させた。分化しているｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの形態を、位相差顕微鏡法によって一定の間隔で調べた。並行して、多能性および角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーの発現を定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって調査した。ｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣは強固に接着性であり、ＣＥＣの基本的特徴の１つである六角形様の形状を示した。ＣＥ関連マーカーは、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来のＣＥＣにおいて、ｈＥＳＣ中でのそれぞれのレベルと比較して、２０日目に著しくより高いレベルで発現した。
重要なことに、ｈＥＳＣ由来およびヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＣＥＣ中では、多能性マーカーの残存発現レベルが検出されるに過ぎなかった。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣとしても知られる）は、多能性幹細胞の一種である。

現在、多能性幹細胞は、再生医療の分野において非常に有望である。その目的は、事故、疾患または老化によって変化した組織を修復することである。現在適切な処置が存在しない疾患を処置および治癒する可能性をもたらすので、これは、多大な医学的影響を有する新しい治療分野に相当する。再生医療は、ほとんどの医療分野に適用され、バイオテクノロジー産業の最も有望な発展の１つを構成する。虚血、変性および／または加齢関連疾患は、先進国の集団における主な死亡原因である。

ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、自家移植によって組織を置換または再生するために、置換細胞療法のための自家細胞源を提供する。
さらに、患者特異的ｉＰＳＣは、疾患機序モデル構築および薬物スクリーニングのためのインビトロモデルとして役立ち得る。リプログラミング因子の元来のセット（Ｙａｍａｎａｋａ因子とも呼ばれる）は、遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣおよびＮＡＮＯＧを含む。より最近では、これらの因子のうちの３つを含むいくつかの特定の組み合わせもまたｉＰＳＣを生成することが報告された。他方、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、治療目的のために無限の同種異系細胞源を提供する。

したがって、特定の実施形態では、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造する方法は、生物学的試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離すること、ＰＢＭＣを多能性因子で再プログラム化すること、多能性マーカーを発現する細胞を選択および培養すること、ならびにこれらの細胞を角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を産生するように分化させることを含む。特定の実施形態では、再プログラミングまたは多能性因子は、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の分化因子とともに細胞を培養する工程は、ゼラチン状タンパク質コーティング上で細胞を培養する工程を含む。

特定の実施形態では、ゼラチン状タンパク質は、ヒト組換えビトロネクチンタンパク質を含む。特定の実施形態では、培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２培地およびノックアウト血清代替物またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、培地は、ＴＧＦ－β阻害剤、線維芽細胞増殖因子またはこれらの組み合わせを含む。これらの誘導サプリメントは、多能性幹細胞の眼前駆体細胞への分化を増強し、角膜内皮前駆体細胞などの臨床的に価値のある眼細胞への前駆体細胞のさらなる分化効率を改善する。特定の実施形態では、分化している培養細胞は、神経堤マーカー、角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーまたはこれらの組み合わせを発現する。特定の実施形態では、神経堤マーカーは、ＮＧＦＲ、ＳＯＸ１０またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ＣＥ関連マーカーは、ＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＯＸＣ１、ＳＬＣ１６Ａ３またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、成熟ＣＥＣは、ＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ３またはこれらの組み合わせを含むマーカーによって同定される。

角膜内皮

角膜は、眼組織の前部を覆う眼の最も外側の組織である。角膜の透明性は、明瞭な視力にとって不可欠であり、角膜の透明性の欠如は、角膜浮腫、視力障害、および最終的には失明をもたらし得る。内皮は角膜の最内層であり、角膜の補水の動的調節のために不可欠である。ヒトの体内の他の細胞とは異なり、疾患および／または外傷によって損傷した角膜内皮細胞（ＣＥＣ）は、身体によって修復または置換されないことは注目に値する。毎年米国で行われる角膜移植のほぼ半分は、何らかの形態の角膜内皮疾患に起因する。

したがって、特定の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）が製造され、続いて凍結保存される。特定の実施形態では、ＣＥＣは、ヒト胚性幹細胞から生成される。特定の実施形態では、自家体細胞、例えば、ＰＢＭＣを使用する患者の処置によって、個別化された医療が可能となり、角膜内皮ジストロフィーのためにＣＥＣの再生可能な供給を生み出すための「患者特異的」治療戦略を確立し、ドナー角膜と角膜移植の依存性をいずれも減少させる。あるいは、ヒト胚性幹細胞の使用は、角膜内皮機能不全のためにＣＥＣの無限の同種異系供給を提供する。

神経堤細胞（ＮＣＣ）系列を介したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または末梢血由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を用いる角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の生成は、ＣＥ移植およびその他の用途のためのドナー角膜の代替物として、角膜内皮疾患を処置するためのこれらの重要な細胞の利用可能性を最大化する。

角膜疾患および関連障害

角膜ジストロフィー。角膜ジストロフィーという用語は、角膜に限定される両側性の遺伝的に決定された非炎症性角膜疾患の異質な群を包含する。臨床的には、異常の唯一のまたは主な解剖学的位置に基づいて、角膜ジストロフィーは３つの群に分けることができる。一部は、主に、角膜上皮およびその基底膜またはボウマン層および表層角膜実質（前角膜ジストロフィー）、角膜実質（角膜実質ジストロフィー）、またはデスメ膜および角膜内皮（後角膜ジストロフィー）に影響を及ぼす。ほとんどの角膜ジストロフィーは全身症状を有さず、透明なまたは曇った角膜中に様々な形状の角膜混濁を呈し、様々な程度で視力に影響を及ぼす。角膜ジストロフィーは、単純な常染色体優性、常染色体劣性またはＸ連鎖劣性メンデル遺伝様式を有し得る。ＣＨＳＴ６、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＰＩＰ５Ｋ３、ＳＬＣ４Ａ１１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＧＦＢ１およびＵＢＩＡＤ１遺伝子中の変異によって、異なる角膜ジストロフィーが引き起こされる。

他の角膜ジストロフィーと同様に、表層角膜のジストロフィーは遺伝的に決定され、通常はメンデル形質として遺伝する。大部分の角膜ジストロフィーの独特の表現型は、異なる特定の遺伝子中の変異によって引き起こされる。いくつかの角膜ジストロフィーの表現型は、異なる遺伝子中の変異から生じ、異なる表現型は、同じ遺伝子中の異なる変異の結果であり得る。４つの遺伝子（ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＴＧＦＢ１およびＴＡＣＳＴＤ２）中の変異は、表面角膜に明らかに限定される遺伝性疾患を引き起こすことが現在知られている。

角膜実質ジストロフィー。この群の角膜ジストロフィーには、斑状角膜ジストロフィー（ＭＣＤ）、顆粒状角膜ジストロフィー（ＧＣＤ）Ｉ型、格子状角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、シュナイダー角膜ジストロフィー（ＳＣＤ）、斑点状角膜ジストロフィー（ＦＣＤ）、先天性角膜実質ジストロフィー（ＣＳＣＤ）および後無定形角膜ジストロフィー（ＰＡＣＤ）が含まれる。

後角膜ジストロフィー。後角膜ジストロフィーの群には、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）、後多形性角膜ジストロフィー（ＰＰＣＤ）、先天性遺伝性内皮角膜ジストロフィー（ＣＨＥＤ）およびＸ連鎖内皮角膜ジストロフィー（ＸＥＣＤ）が含まれる。これらの疾患は、角膜内皮およびデスメ膜の異常を特徴とする。後角膜ジストロフィーのほとんどにおいて、角膜内皮による欠損した能動的流体輸送は、角膜実質の過剰な浮腫を引き起こし、これは角膜の透明性を損ない、視力を低下させる。

フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）の有病率は、世界の様々な地域で著しく異なる。フックス角膜内皮ジストロフィーは、米国では一般的で、最も多い角膜ジストロフィーであり、４０歳以上の人口の約４％が罹患している。米国では、ＦＥＣＤは全層角膜移植の主要な適応症であり、この外科的処置は、異なる系統の全角膜移植の１０～２５％を占めた。これは、米国における角膜移植の年間数が３２，０００未満であることを考慮すると、かなりの数である。

フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）は、通常は両眼に発症し、男性よりも女性でわずかに多く見られる進行の遅い疾患である。ＦＥＣＤは、角膜内皮（ＣＥ）中の細胞が徐々に劣化することによって引き起こされ、原因はよく理解されていない。通常、これらの内皮細胞は、角膜内の流体の健康なバランスを維持する。健康な内皮細胞は、角膜の腫脹を防ぎ、角膜を透明に保つ。フックスジストロフィーでは、内皮細胞がゆっくりと死滅し、角膜内での流体の蓄積および腫脹を引き起こす。角膜は厚くなり、視界がぼやけてくる。

疾患が進行するにつれて、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）症候は通常、両眼に影響を及ぼし、症候には、低照度での視力に影響を及ぼすグレア；起床後の朝に生じ、日中に徐々に改善するかすみ目；乱視、光に対する過敏症、夜盲、および夜間に光の周りに光輪が見える；角膜の表面上の痛みを伴う小さな水疱；曇ったまたは濁ったように見える角膜が含まれる。

円錐角膜。円錐角膜は、角膜の進行性の菲薄化である。円錐角膜は、米国において最も一般的な角膜ジストロフィーであり、米国人２，０００人に１人が罹患している。円錐角膜は、１０代および２０代の成人において最も多く見られる。円錐角膜は、角膜の中央を薄くし、外側に膨らみ、丸みを帯びた円錐形状を形成する。角膜のこの異常な湾曲は、複視またはかすみ目、近視、乱視、および光に対する感度の増加を引き起こす可能性がある。円錐角膜を有する少数の人々は、重度の角膜瘢痕を発症し、またはコンタクトレンズに耐えられなくなることがある。これらの人々には、角膜移植が必要になり得る。

虹彩角膜内皮症候群（ＩＣＥ）。ＩＣＥは女性においてより一般的であり、通常３０～５０歳の間に発症する。ＩＣＥは、虹彩の明らかな変化、角膜の腫脹および緑内障という３つの主要な特徴を有する。

虹彩角膜内皮症候群（ＩＣＥ）は、通常、片眼のみに存在する。虹彩角膜内皮症候群は、角膜から虹彩への内皮細胞の移動によって引き起こされる。角膜からの細胞のこの喪失は、角膜の腫脹ならびに虹彩および瞳孔の歪みをもたらす。この細胞の移動は、眼の流体流出チャンネルも遮断し、緑内障を引き起こす。ＩＣＥの進行を止める処置は存在しないが、緑内障は処置可能である。角膜が著しく腫脹して視力が著しく損なわれれば、角膜移植が必要となり得る。

水疱性角膜症。水疱性角膜症は、角膜の浮腫によって引き起こされ、角膜内皮が角膜の正常に脱水された状態を維持できなくなることから生じる。最も頻繁には、水疱性角膜症はフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）または角膜内皮の外傷に起因する。水疱性角膜症の別の頻繁な原因は角膜内皮の外傷であり、眼内手術（例えば、白内障除去）中にまたは設計もしくは配置が不良な眼内レンズインプラントの留置後に起こり得る。白内障除去後の水疱性角膜症は、偽水晶体（眼内レンズインプラントが存在する場合）または無水晶体（眼内レンズインプラントが存在しない場合）水疱性角膜症と呼ばれる。

角膜実質（角膜のより深い層）が腫脹するにつれて、角膜表面上に上皮下液で満たされた水疱が形成され、眼の不快感、視力低下、コントラストの喪失、グレアおよび羞明をもたらす。時には水疱が破裂し、痛みおよび異物感を引き起こす。細菌が破裂した水疱に侵入し、角膜潰瘍をもたらすことがある。

処置の方法

特定の実施形態では、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造することと、何らかの処置を必要とする対象の角膜中にＣＥＣを移植することとを含む、角膜関連疾患または障害を予防または処置する方法。特定の実施形態では、角膜疾患または障害は、遺伝性疾患もしくは障害、感染、創傷、炎症性疾患、自己免疫疾患、ドライアイ、ジストロフィーまたはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、角膜疾患または障害は、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）、円錐角膜、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、虹彩角膜内皮症候群（ＩＣＥ）、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦過傷または水疱性角膜症を含む。

特定の実施形態では、組成物は、治療有効量の、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から製造された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む。

特定の実施形態では、組成物は、治療有効量の、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から得られる角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を作製するために多能性因子を感染させた細胞を含む。実施形態では、本発明の方法はエクスビボで適用される。すなわち、対象の細胞を身体から取り出し、培養中の組成物で処理して切除し、処理された細胞を対象の身体に戻すことができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が合致した細胞株、自家細胞株、同種異系細胞株またはこれらの組み合わせである。

疾患の治療的処置のために人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用する場合、患者から単離された体細胞を使用することが望ましい。例えば、疾患に関与する体細胞、疾患の治療的処置に関与する体細胞などを用いることができる。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の未分化状態および多能性を維持することができる様々な培地が本分野において公知であり、ｉＰＳＣは、適切な培地の組み合わせを使用することによって効率的に単離することができる。単離されたｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの分化能および増殖能は、ｈＥＳＣに対して広く適用されている確認手段を用いることによって、当業者によって容易に確認され得る。

特定の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）のような幹細胞の集団を含むことができる。ＥＳＣは、ヒトを含む多くの動物種から確立されている。これらの細胞は、その多能性を維持しながら積極的に分裂する能力を保持しており、分化の適切な誘導によってほぼすべての臓器に分化することができるので、これらの種類の多能性幹細胞は再生医療のための有用な細胞源である。

いくつかの態様では、細胞が由来するまたは単離される試料は、血液または血液由来試料である。特定の実施形態では、細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。試料には、細胞療法、例えば養子細胞療法の状況における、自家および同種異系の供給源からの試料が含まれる。

いくつかの実施形態では、細胞の単離は、１つまたは複数の調製および／または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例では、例えば、望ましくない成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性のある細胞を溶解または除去するために、細胞は洗浄され、遠心分離され、および／または１つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートされる。いくつかの例では、細胞は、密度、接着特性、サイズ、特定の成分に対する感受性および／または耐性などの１つまたは複数の特性に基づいて分離される。

いくつかの例では、試料は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および／または血小板を含むリンパ球を含有し、いくつかの態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。

いくつかの実施形態では、対象から採取された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去するために、およびその後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地中に入れるために洗浄される。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムおよび／またはマグネシウム（Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋）および／または多くのもしくはすべての二価カチオンを欠く。いくつかの実施形態では、細胞は、洗浄後に、例えばＣａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まないＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁される。特定の実施形態では、血液細胞試料の成分が除去され、細胞が培養培地中に直接再懸濁される。

いくつかの実施形態では、前記方法は、ＰｅｒｃｏｌｌまたはＦｉｃｏｌｌ勾配を通じた遠心分離による末梢血からの白血球の分離などの、密度に基づく細胞分離方法を含む。

いくつかの実施形態では、単離方法は、表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸などの１つまたは複数の特異的分子の細胞内での発現または存在に基づく異なる細胞型の分離を含む。いくつかの実施形態では、このようなマーカーに基づく任意の公知の分離方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの態様における単離は、例えば、このようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションによる、１つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離を含み、続いて一般に、洗浄工程および抗体または結合パートナーが結合した細胞の、抗体または結合パートナーが結合しなかった細胞からの分離を含む。

分離は、特定のマーカーを発現する特定の細胞集団または細胞の１００％濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞に対する陽性選択または濃縮は、このような細胞の数または割合を増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞を完全になくす必要はない。

角膜内皮細胞（ＣＥＣ）が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から作製されたら、細胞は角膜内に移植される。本明細書で具体化されている細胞は、確立された方法に従って移植のために調製される。約３～４週間培養した後、細胞は凍結保存される。これに関して、細胞の増殖特性は、患者ごとに、および細胞型ごとに異なる。細胞の移植の約７２時間前に、表現型の分析のために一定分量を採取し、角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーを発現する細胞の百分率。投与は、単回投与によって達成することができる。

しかしながら、任意の特定の対象に対する角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の治療量および投与の頻度は変動し得、使用される特定の細胞の活性および生存能力、ならびに年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、生着率、薬物の組み合わせ、特定の症状の重症度、および治療を受けている宿主を含む様々な因子に依存することが理解されよう。いくつかの実施形態では、対象中に移植されたＣＥＣの治療有効量は、このような移植された細胞を対象中に生着させることができ、それにより、このような細胞が、所望の生物学的応答を誘発することによって疾患の症候を改善する量である。

より良好な臨床的受容のために、本明細書で使用されるすべての培養培地は、好ましくは実質的にゼノフリーであり、実質的に無血清であり、または既知組成であり、より好ましくはこれらの組み合わせであり、最も好ましくは、同時にゼノフリーであり、無血清であり、かつ既知組成である。本明細書において、実質的にとは、意図的でない微量は無関係であり、臨床または研究規則の下で、ゼノフリー、無血清または既知組成と考えられ、受容され、ここでも当てはまるものを意味する。

キット

特定の実施形態では、薬学的組成物と、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から製造された治療有効量の臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）とを含むキット。

本明細書における配列、特許および刊行物に対するすべての引用は、あたかもそれぞれの独立した特許および刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

［実施例１］
多能性幹細胞由来の臨床グレードの角膜内皮細胞の作製および凍結保存

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からの臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の誘導および凍結保存が本明細書に報告されている。質量分析に基づくタンパク質配列決定を通じて、ゼノフィリック（ｘｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）条件下でのｉＰＳＣ由来ＣＥＣのプロテオームの性質決定を達成し、その後、Ｅｙｅ Ｂａｎｋから得られたヒト角膜内皮（ＣＥ）標本のプロテオームと比較した。この分析は、ドナーＣＥ中で発現されるタンパク質の９０％超がｉＰＳＣ由来ＣＥＣ中に存在するという証拠を与える。同様に、ゼノフィリック条件下でのｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣのトランスクリプトームの性質決定を、次世代ベースのＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）によって完了した。
ｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣの比較トランスクリプトーム解析により、両方のトランスクリプトームに共通する１３，２０８（＞９６％）個の遺伝子が明らかになった。

材料および方法

対象および臨床的確認。ヒト対象および多能性幹細胞を含む研究に対する施設内審査委員会（ＩＲＢ）の承認は、メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部から得られた。対照参加対象は、ヘルシンキ宣言の趣旨と一致するインフォームドコンセントを与えた。

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離および凍結保存。
Ａｇｕらによって公開された手順に従ってＰＢＭＣを単離した。^６簡単に説明すると、０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有する５０ｍｌコニカルチューブ中に、１０ｍｌのヒト末梢血を収集し、２体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加した。１５ｍｌのｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、ニューヨーク州、ニューヨーク）上に上記混合物を穏やかに重層し、４００ｇで３０分間（ブレーキなし）遠心分離した。

５０ｍｌチューブ中に単核球層を静かに採取し、３００ｇで１０分間の遠心分離によってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ペレットを凍結保存した。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）。ビトロネクチン（ＶＴＮ－Ｎ）が被覆されたプレート上で、フィーダーフリー条件において、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、Ｈ９ ｈＥＳＣ（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を培養した。４～５日ごとに０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を継代し、培養培地を毎日交換した。

センダイウイルス送達系を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製。製造者の説明書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）に従い、センダイウイルス送達系を用いて、凍結保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を再プログラム化した。簡潔には、ＰＢＭＣバイアルを液体窒素から取り出し、水浴中にて３７℃で解凍した。続いて、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）でＰＢＭＣを洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ－３Ｌ）、１００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－３（ＩＬ－３）および２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－６（ＩＬ－６）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地（以下、完全培地という。）中で、５％ＣＯ_２が補充された３７℃の加湿インキュベーター内にて４日間培養した。

１ｍｌの完全培地中、丸底チューブ中におよそ５×１０^５細胞／ｍｌの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集し、続いて５、５および３の感染多重度（ＭＯＩ）で再プログラミングウイルス粒子による感染を行った（ＫＯＳ ＭＯＩ＝５、ｈｃ－Ｍｙｃ ＭＯＩ＝５、ｈＫｌｆ４ ＭＯＩ＝３）。感染された細胞を室温で３０分間、１０００ｇで遠心分離した。細胞を１ｍｌの完全培地中に再懸濁し、１２ウェルプレートの単一ウェルに移し、完全培地中で３日間培養した。その後、完全培地を含むＨＥＦ（ヒト胚性線維芽細胞）被覆プレートに細胞を３日間移し、最後に、胚性幹細胞様コロニーが形成されるまで、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）および２０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２培地に移した。胚性幹細胞様の推定ｉＰＳＣコロニーを選択し、性質決定のためにＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中、ビトロネクチン被覆プレート上で培養した。

位相差顕微鏡法。Ｑ－Ｃａｐｔｕｒｅソフトウェア（Ｑｌｍａｇｉｎｇ、サレー、カナダ）を装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を使用して、位相差顕微鏡法を実施した。

フローサイトメトリーによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の性質決定。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源のｉＰＳＣをフローサイトメトリーによって性質決定した。ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバーズ、マサチューセッツ州）一次抗体で、およそ２×１０^５個の細胞を４℃で１時間標識し、続いてＦＩＴＣ結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０に対する；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）で４℃で４０分間処理した。Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＢＤＳｃｉｅｎｃｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して、各試料について合計１万のイベントを取得した。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の性質決定。製造者の説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源のｉＰＳＣ由来の全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）でＲＮＡを定量した。製造者の説明書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を、ＳＴＥＰ ＯＮＥ ＡＢＩ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで行った。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、多能性マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＴＲＡ－１－６０）の発現を定量した。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内在性対照として使用した。デルタ－デルタＣｔ法を使用して相対発現を決定し、以前に報告されたようにＧＡＰＤＨに対して正規化した。^７、８ｑＲＴ－ＰＣＲ分析において使用されたすべてのプライマーは、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲツール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）への分化。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源のｉＰＳＣおよびｈＥＳＣを使用して、以前に公開された手順を修正することによってＣＥＣを作製した。^９簡潔には、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して０日目に、１：７希釈（７０％集密度のプレートを７つのプレートに分割した）で３５ｍｍビトロネクチン被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にｉＰＳＣおよびｈＥＳＣを播種した。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ｉＰＳＣおよびｈＥＳＣを４日間成長させた。４日目に、８０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および８ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の基礎培地中に５００ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）および１０μＭ ＳＢ４３１５４２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を含有する二重Ｓｍａｄ阻害剤培地でＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を置き換えた。

６日目に、８０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および８ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の基礎培地中に、０．１×Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト血小板由来増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質－２（Ｄｋｋ－２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する角膜培地によって、二重Ｓｍａｄ阻害剤培地を置き換えた。７日目に、分化している角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を新しいビトロネクチン被覆プレート（３５ｍｍ）に移し、角膜培地中でさらに１３日間増殖させた。

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の性質決定。２０日目のＨ９ ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣおよび分化ＣＥＣからの全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出した。上記のようにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。上記のようにｑＲＴ－ＰＣＲを用いて、多能性マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＴＲＡ－１－６０）および角膜内皮（ＣＥ）関連マーカー（ＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＯＸＣ１およびＳＬＣ１６Ａ３）の発現を定量した。プライマーは、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲツール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計され、要求に応じて入手可能である。

免疫細胞化学によるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の性質決定。ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来のＣＥＣも免疫細胞化学によって分析した。簡潔には、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間、細胞を固定し、続いて５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした。まず、密着帯－１（ＺＯ１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮ－カドヘリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）一次抗体とともに、４℃で一晩細胞をインキュベートした。次に、室温で２時間、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＺＯ１に対する；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）およびＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｎ－カドヘリンに対する；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）二次抗体で細胞を処理した。４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で核を対比染色した。載置された細胞の画像を、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（３ｉデンバー、コロラド州）を装備したＯｌｙｍｐｕｓ ＬＸ ８１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）を使用してとらえ、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ５を使用して調製した。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の凍結保存ならびにそれらの性質決定。細胞解離緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２０日目の分化されたＣＥＣを剥離し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ細胞凍結保存培地中に再懸濁し、凍結保存した。凍結保存された、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来のＣＥＣを１週間後に培養し、集密状態に達するまで角膜培地中で維持した。上記のように定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、角膜内皮（ＣＥ）関連マーカー（ＡＱＰ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ３、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＯＸＣ１およびＳＬＣ１６Ａ３）の発現を定量した。ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来のＣＥＣは、上記のように、タイトジャンクションタンパク質（ＺＯ－１）、Ｎ－カドヘリンおよびＣＥポンプ機能タンパク質（Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１）の発現についての免疫細胞化学によっても性質決定した。

凍結保存されていないおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣのＲＮＡ－Ｓｅｑ分析。２０日目のｈＥＳＣ由来ＣＥＣ（非凍結保存）および凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣ（液体窒素中で４０日間凍結保存）の次世代ベースのＲＮＡ－Ｓｅｑ分析を行った。簡潔には、凍結保存されていないｈＥＳＣ由来ＣＥＣおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣのそれぞれに対する３つの生物学的複製物をＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製のために使用した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、各試料から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ；パロアルト、カリフォルニア州）上のＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｋｉｔを使用して、抽出されたＲＮＡを検査した。

Ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を用いて、全ＲＮＡをＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの調製に供した。オリゴｄＴビーズを使用するポリアデニル化ＲＮＡ選択のために、およそ１．０μｇの高品質の全ＲＮＡ（＞８．０ ＲＩＮスコア）を使用し、続いて選択されたポリアデニル化ＲＮＡを断片化した。断片化されたＲＮＡを、ランダムプライマーを用いた逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。ｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡへとさらに変換し、これを末端修復して多重化のために特異的なインデックスアダプターを組み込んだ後、精製工程および１５サイクルの増幅を行った。製造者の説明書に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で、増幅されたライブラリーを試験した。

ユニークなインデックス配列を有するＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを等モル比でプールし、４００～５００ｂｐの最終サイズ選択を行った。品質管理の確認後、ＨｉＳｅｑ ２５００（ラピッドランモード）ゲノムアナライザ上の単一レーン中で、３つのＲＮＡ－Ｓｅｑバーコード化された、プールされたライブラリーを配列決定した（２×１００ ｂｐ）。ベースコールは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリアルタイム分析（ＲＴＡ）ソフトウェア（バージョン１．１７．２０）を通じて割り当てられ、ベースコール・ファイルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢＣＬコンバータソフトウェア（Ｖｅｒ．１．９．４）を使用してバイナリフォーマット（ＢＣＬ）からフラット・ファイル・フォーマット（ｑｓｅｑ．ｔｘｔ）に変換された。逆多重化ソフトウェアを使用して、ｑｓｅｑ．ｔｘｔファイルを単一試料ＦＡＳＴＱファイルに逆多重化した。

Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用して、生のＲＮＡ－Ｓｅｑリード（ＦＡＳＴＱ）を処理し、分析した。デフォルトパラメータを使用してＳｅｑＭａｎ ＮＧｅｎ（Ｖｅｒ．１２）でペアードエンドリードをアセンブルし、ヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ１１）へのアラインメントを行った。デフォルトパラメータを使用したマッピングされたペアードエンドリードの正規化、遺伝子発現差異解析および統計解析には、ＡｒｒａｙＳｔａｒ（Ｖｅｒ、１２；ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用した。遺伝子発現の正規化および定量化のためにＦＰＫＭを使用した。^３０Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ ｗｉｔｈ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて、凍結保存されていないｈＥＳＣ由来ＣＥＣおよび凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣの発現差異を推定した。本発明者らは、変化しないことを表す０の平均からの＞２標準偏差（Ｓｔｄ．Ｄｅｖ．）をカットオフ値として選択した。

凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）のウサギの前房中への注射。凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣの注射のために、アセプロマジン（皮下）、デクスメデトミジン（筋肉内）およびケタミン（筋肉内）を使用して、ウサギを麻酔した。疼痛、炎症および免疫学的反応を阻害するために、ウサギには、ブプレノルフィン（皮下）、デキサメタゾン（筋肉内）およびケナログ－４０（筋肉内）も与えた。ウサギを意識消失状態に保つための外科手術中にイソフルランと酸素の混合物を吸入するために気管挿管を行った。外科的処置全体の間に、２２ゲージカテーテルを使用して、ウサギには右耳に１５ｍｌ／時間の速度で乳酸加リンゲル液も注射した。２．５％フェニレフリン溶液および１％トロピカミド溶液を使用して瞳孔を散大させた。

０．５％プロパラカイン塩酸塩眼科用溶液の適用後、８ｍｍの中央角膜上皮表面マークの境界域に１．６ｍｍの切開を導入した。２０ゲージのシリコーン針を使用して、中央角膜の直径８ｍｍの領域中にある固有のＣＥＣを除去した。３０ゲージのカニューレを使用して前房を洗浄し、前房から細胞残屑を除去した。２８ゲージ針を用いて、１００μＭ ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２を補充した２００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の７．５×１０^５の凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣを前房中に注入した。３つの結節された縫合糸（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｓｕｔｕｒｅ）（ナイロン１０－０）によって、切開部を閉じた。細胞注射後に、炎症および免疫反応を阻害するために、ウサギにＴｏｂｒａｄｅｘ眼軟膏も局所投与した。次いで、目を下げる位置（ｅｙｅ－ｄｏｗｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）にウサギを３時間置いて、注射した細胞の接着を増強した。

３時間の細胞の定着に続いて、中間縫合糸を除去し、前房を滅菌ＢＳＳで２回洗浄した。次いで、前房をＢＳＳで再構成し、１つの結節縫合糸（ナイロン１０－０）を使用して切開を閉じた。注射後１０日間、１日３回、Ｔｏｂｒａｄｅｘ眼軟膏を適用した。予備実験において、本発明者らは、ＯＣＴおよびＨ＆Ｅ染色を使用してデスメ膜が無傷であり、機械的にこすり取られた領域にデスメ膜上の細胞が存在しないことを確認した。注射モデルウサギを注射後９ヶ月間飼育し、次いで、その後の分析のために屠殺した。

ウサギの眼の臨床評価。術後眼および対照眼の臨床評価は、ウサギにおいて、異なる時点で、それぞれＴｏｎｏ－Ｐｅｎ、超音波厚度計およびｃｏｎｆｏｓｃａｎ４走査型顕微鏡を使用して眼内圧（ＩＯＰ）、角膜厚およびＣＥＣ密度を評価することによって行った。注射された角膜の写真を異なる時点で撮影した。

ウサギの眼の組織学的評価。注射の９ヶ月後に安楽死溶液の静脈内注射によって、ウサギ（注射および損傷注射モデル）を屠殺した。術後眼および対照眼を取り出し、１０％ホルマリン中で固定し、Ｈ＆Ｅおよび免疫蛍光染色に供した。Ｈ＆Ｅ染色のために、脱パラフィンおよび水和の後、ヘマトキシリンを切片に適用して核を染色した。その後、切片をエオシンで対比染色し、続いて脱水し、載置した。

免疫組織学的分析のために、脱パラフィン、水和および抗原賦活化の後、５％ウシ血清アルブミン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）により室温で４５分間、切片をブロッキング処理した。まず、１：３００ ＺＯ－１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、１：１００ Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１：２５０ Ｎ－カドヘリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）一次抗体とともに、切片を４℃で一晩インキュベートした。次に、１：１００ ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＺＯ－１に対する；ＭｉｌｌｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、１：２００ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１に対する；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１：１００ ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｎ－カドヘリンに対する；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）二次抗体で、切片を室温で２時間処理した。ＤＡＰＩ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で核を対比染色した。

載置された切片の画像は、ソフトウェア（Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３ｉ；デンバー、コロラド州、米国）を装備した顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＬＸ８１；Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）を用いて、各眼から得た少なくとも２つの切片の注射された領域からの無作為の５つの視野ごとにとらえ、画像編集ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ５；Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．サンホセ、カリフォルニア州、米国）を用いて作製した。

凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）のサルの前房中への注射。非ヒト霊長類研究では、機能的ＣＥ単層を形成するための凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣ注入の有効性を評価するために、サルを使用した。サル注射モデルでは、ウサギ注射モデルで行われたのと同じ手順を使用して、サルを麻酔し、挿管した。

上記のウサギ注射モデルで行われた手順に従ってマカク角膜内皮機能不全モデルを調製した後、２８ゲージ針を用いて、１００μＭ ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２を補充した２５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に懸濁された１×１０^６個のＣＥＣを前房中に注射した。３つの結節された縫合糸（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｓｕｔｕｒｅ）（ナイロン１０－０）によって、切開部を閉じた。デクスメデトミジンおよびケタミン鎮静剤を使用して注射後１２日間隔日投与されたＴｏｂｒａｄｅｘ眼軟膏およびケナログ－４０（免疫学的拒絶を阻害するため）の適用を除いて、残りの手順は、ウサギ注射モデルで行われたのと同じであった。

注射モデルサルを注射後１年間飼育し、次いで、その後の分析のために屠殺した。サル損傷注射モデルでは、ウサギ損傷注射モデルで先に行ったように、サルを麻酔し、角膜内皮損傷に供した。前房を滅菌ＢＳＳで再構成し、１０－０ナイロン縫合糸を用いて切開を閉じた。Ｔｏｂｒａｄｅｘ眼軟膏の１日３回局所適用による角膜内皮損傷後に、サルを２日間飼育し、次いで、マカク注射モデルで実施したのと同じ手順を用いて、凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣ注射に供した。損傷注射モデルサルは現在生存しており（注射後３ヶ月）、本発明者らは、注射された凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣのすべての後期オフサイド効果（ｏｆｆｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ）をさらに除外するために、注射後少なくとも２年間にわたって追跡研究のために２匹のマカクを飼育することを計画した。

サルの眼の臨床評価。術後眼および対照眼の臨床評価は、サルにおいて、異なる時点で、それぞれＴｏｎｏ－Ｐｅｎ、超音波厚度計およびｃｏｎｆｏｓｃａｎ４走査型顕微鏡を使用してＩＯＰ、角膜厚およびＣＥＣ密度を評価することによって行った。注射された角膜の写真を異なる時点で撮影した。

サルの眼の組織学的評価。デクスメデトミジンおよびケタミンを用いてサルを鎮静化させ、注射の１年後に安楽死溶液の静脈内注射によって屠殺した。術後眼および対照眼を取り出し、１０％ホルマリン中で固定し、ウサギで実施したのと同じ手順を用いてＨ＆Ｅ染色に供した。免疫蛍光染色では、まず、１：２００ ＺＯ－１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、１：１００ Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１：２５０ Ｎ－カドヘリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）一次抗体とともに、切片を４℃で一晩インキュベートした。次に、１：２００ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ロバ抗マウスＩｇＧ（ＺＯ－１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１およびＮ－カドヘリンに対する；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体で、切片を室温で２時間、処理した。ＤＡＰＩ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で核を対比染色した。ウサギで行われたのと同じ手順を使用して、載置された切片の画像をとらえた。

剖検およびＣＢＣ／血液化学検査。研究の完了時に、ウサギおよびマカクを詳細な剖検およびＣＢＣ／血液化学検査に供した。以下の組織を調べた：眼、脳、腹部および胸部の内臓、腎臓、心臓、肝臓、胃腸管、脾臓、下垂体腺、骨髄を有する大腿骨、膀胱、寛骨大腿、大腿脛骨、環椎後頭関節および精巣。

結果

ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製および検証。１０ｍｌの血液の一定分量を、角膜内皮ジストロフィーの病歴がない健康な６７歳男性から得た。密度勾配遠心分離によって、１０ｍｌの血液の一定分量から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。製造者の説明書に従って多能性因子（ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２）を発現させることによって、組込みのないセンダイウイルス遺伝子送達方法でＰＢＭＣを再プログラム化した。胚性幹細胞様の推定ｉＰＳＣコロニーを選択し、性質決定のために増殖させた。多能性マーカーの発現についてｉＰＳＣコロニーを評価し、ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣにおける定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に匹敵する、多能性マーカー、すなわちＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＴＲＡ－１－６０の発現レベルを明らかにした。ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣは、フローサイトメトリーによって多能性マーカー（ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０）のタンパク質発現についても評価された。フローサイトメトリー分析は、ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣがＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０について高度に陽性であることを実証した（データは示さず）。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）への分化。ＭｃＣａｂｅおよび同僚らは、ｈＥＳＣからのＣＥＣの作製を報告した。^９本発明者らのグループは、最近、末梢血単核細胞ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣからのＣＥＣの作製およびプロテオームプロファイリング、ならびにｈＥＳＣ由来のＣＥＣとｉＰＳＣ由来のＣＥＣの比較トランスクリプトーム分析を報告した。^{１０、１１}この手順は、複能性神経堤細胞（ＮＣＣ）のＣＥＣへの分化に基づいている。ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣ由来およびｈＥＳＣ由来のＣＥＣを作製するために、Ａｌｉおよび同僚らによって報告されたプロトコルを改変する２０日間の手順を採用した。^{１０、１１}分化過程は、最初に、分化しているＣＥＣの形態を調べることによって性質決定された。７日目に、予定されるＣＥＣを細胞解離緩衝液で処理し、新しいビトロネクチン被覆プレートに移した。７日目に新しいビトロネクチンプレートに移すと、ｉＰＳＣおよびｈＥＳＣがＣＥＣに分化することが観察された。２０日目の形態学的検査により、六角形／多角形のＣＥＣが密に充填されていることが明らかになった（図１）。

分化している角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の遺伝子発現および免疫細胞化学的分析。ＣＥＣの基本的な特徴を確認するために、本発明者らは、分化手順中の異なる時点で多能性および角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーに対する定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析を行った。本発明者らは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のＣＥＣへの分化中の４日目および２０日目に、多能性マーカー（上記）およびＣＥ関連マーカー、すなわちＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＯＸＣ１およびＳＬＣ１６Ａ３の発現を調べた。２０日目に、ＣＥＣはＡＱＰ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ２およびＳＬＣ１６Ａ３を発現し、ＣＥＣの成熟を示した。六角形／多角形様細胞を示したｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来ＣＥＣの細胞境界でのタイトジャンクションタンパク質（ＺＯ－１）およびＮ－カドヘリンの発現は、ｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣの構造的完全性を確認する。

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）および免疫細胞化学による、凍結保存されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の検証。２０日目の分化したＣＥＣは、液体窒素中で凍結保存し、１週間後、ＣＥＣを復活させ、集密状態に達するまで培養した。まず、位相差顕微鏡によって凍結保存の効果を評価した。凍結保存されたＣＥＣは、六角形／多角形の形状を有して緊密に接着しており（データは示さず）、凍結保存がｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣの形態に影響を及ぼさないことを示唆している。凍結保存されたＣＥＣの播種密度が重要であることは注目に値し、低密度でのＣＥＣのプレーティングは、ＣＥＣが開放空間中に拡大するにつれて線維芽細胞様形態をもたらす。

次に、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により、角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーの発現を調べた。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、凍結保存前後で角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーの発現レベルが類似していることが明らかになり（データは示さず）、凍結保存がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるＣＥ関連マーカーの発現に影響を及ぼさないという考えがさらに裏付けられた。最後に、タイトジャンクションタンパク質（ＺＯ－１）、Ｎ－カドヘリンおよびＣＥポンプ機能タンパク質（Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１）の発現を免疫細胞化学分析によって調べた。六角形／多角形様細胞を示す凍結保存されたｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来ＣＥＣの細胞境界でのＺＯ－１、Ｎ－カドヘリンおよびＮａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰａｓｅ α１の免疫染色は、凍結保存後のｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来ＣＥＣの構造的完全性が確認する（データは示さず）。

剖検およびＣＢＣ／血液化学検査。眼、脳、腹部および胸部の内臓、腎臓、心臓、肝臓、消化管、脾臓、下垂体腺、膀胱、精巣および骨髄を有する大腿骨の詳細な剖検検査は特筆すべきものではなかった。詳細な剖検研究では、異常な腫瘤は観察されなかった。すべてのＣＢＣ／血液化学パラメータは正常な生理学的範囲内であった。

考察

本明細書では、ゼノフリー条件下でのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞の誘導が報告され、ｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣに対する凍結保存の効果が調べられ、凍結保存がｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣの構造的完全性に影響を及ぼさないことを示唆した。以前、本発明者らのグループは、ＰＢＭＣ起源のｉＰＳＣ由来のＣＥＣの作製およびプロテオームプロファイリングならびにｈＥＳＣ由来およびｉＰＳＣ由来のＣＥＣの比較トランスクリプトーム分析を報告した。

Ａｌｉおよび同僚らによって報告されたプロトコルを修正した２０日間の手順を採用した。^{１０，１１}角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーの高発現、より重要なことには、多能性マーカーの発現の欠如は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）系列への分化を強く支持する。

凍結保存されたｈＥＳＣ由来ＣＥＣの使用に関する主な安全上の懸念は、分化過程を通じて未分化ｈＥＳＣが残存する可能性である。したがって、発明者らは、注射されたウサギ（注射後９ヶ月）および注射されたサルの注射後１年の詳細なＣＢＣ／血液化学プロフィールおよび複数の器官を調べた。すべてのＣＢＣ／血液化学パラメータが正常な生理学的範囲内にあり、剖検検査によって明らかなように、いずれの身体器官にも異常は観察されなかった。

本発明者らの知る限りでは、これは、臨床グレードの、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来のおよび末梢血起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の作製および凍結保存の最初の報告である。

参考文献
１．Ｄｅｌｍｏｎｔｅ ＤＷ，Ｋｉｍ Ｔ．Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａ．Ｊ Ｃａｔａｒａｃｔ Ｒｅｆｒａｃｔ Ｓｕｒｇ．２０１１；３７：５８８－５９８．
２．Ｂｏｎａｎｎｏ ＪＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｕｍｐ．Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１２；９５：２－７．
３．Ｃｌａｅｒｈｏｕｔ Ｉ，Ｂｅｅｌｅ Ｈ，Ｋｅｓｔｅｌｙｎ Ｐ．Ｇｒａｆｔ ｆａｉｌｕｒｅ：Ｉ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｏｓｓ．Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００８；２８：１６５－１７３．
４．Ｅｙｅ Ｂａｎｋ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２０１６ Ｅｙｅ ｂａｎｋｉｎｇ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ．Ｉｎ：２０１６．
５．Ｇａｉｎ Ｐ，Ｊｕｌｌｉｅｎｎｅ Ｒ，Ｈｅ Ｚ，Ａｌｄｏｓｓａｒｙ Ｍ，Ａｃｑｕａｒｔ Ｓ，Ｃｏｇｎａｓｓｅ Ｆ，Ｔｈｕｒｅｔ Ｇ．Ｇｌｏｂａｌ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｂａｎｋｉｎｇ．ＪＡＭＡ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１６；１３４：１６７－１７３．
６．Ａｇｕ ＣＡ，Ｓｏａｒｅｓ ＦＡ，Ａｌｄｅｒｔｏｎ Ａ，Ｐａｔｅｌ Ｍ，Ａｎｓａｒｉ Ｒ，Ｐａｔｅｌ Ｓ，Ｆｏｒｒｅｓｔ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｆ，Ｌｉｎｅｈａｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｈｅｌｄ ａｔ Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｕｐ ｔｏ ４８ ｈｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５；５：６６０－６７１．
７．Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１；２５：４０２－４０８．
８．Ｋｈａｎ ＳＹ，Ｖａｓａｎｔｈ Ｓ，Ｋａｂｉｒ Ｆ，Ｇｏｔｔｓｃｈ ＪＤ，Ｋｈａｎ ＡＯ，Ｃｈａｅｒｋａｄｙ Ｒ，Ｌｅｅ ＭＣ，Ｌｅｉｔｃｈ ＣＣ，Ｍａ Ｚ，ｅｔ ａｌ．ＦＯＸＥ３ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｏｍａｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｒｍｅｄ ＤＮＡＪＢ１．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１０９５３．
９．ＭｃＣａｂｅ ＫＬ，Ｋｕｎｚｅｖｉｔｚｋｙ ＮＪ，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＢＰ，Ｘｉａ Ｘ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＪＬ，Ｌａｎｚａ Ｒ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０：ｅ０１４５２６６．
１０．Ａｌｉ Ｍ，Ｋｈａｎ ＳＹ，Ｖａｓａｎｔｈ Ｓ，Ａｈｍｅｄ ＭＲ，Ｃｈｅｎ Ｒ，Ｎａ ＣＨ，Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＪ，Ｑｉｕ Ｃ，Ｇｏｔｔｓｃｈ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＰＢＭＣ－Ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ，ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１８；５９：２４３７－２４４４．
１１．Ａｌｉ Ｍ，Ｋｈａｎ ＳＹ，Ｋａｂｉｒ Ｆ，Ｇｏｔｔｓｃｈ ＪＤ，Ｒｉａｚｕｄｄｉｎ ＳＡ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈＥＳＣ－ａｎｄ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１８．
均等物

当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (16)

1. 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）への分化と、それらの凍結保存とを含む、臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造する方法。
2. １つまたは複数の分化因子を含む分化培地中で前記細胞を培養する工程が、タンパク質コーティング上で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記分化培地が、１つまたは複数の増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）の阻害剤またはこれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
4. 多能性マーカーを発現する細胞が、前記細胞の分化および凍結保存を誘導するための１つまたは複数の因子とともにタンパク質またはゼラチン状タンパク質混合物中で培養される、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記ゼラチン状タンパク質混合物中で培養された前記細胞が、角膜内皮（ＣＥ）関連マーカーまたはそれらの組み合わせの発現によって決定される角膜内皮細胞（ＣＥＣ）に分化する、請求項４に記載の方法。
6. 凍結保存された臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）が、解凍されたときにそれらの生存能力および／または機能を保持する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記培地が、細胞培養培地、細胞分化培地、ゼラチン状タンパク質混合物、凍結保存培地、薬学的組成物、足場または増殖培地の１つまたは複数を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項１に記載の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から臨床グレードの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を製造すること、および処置を必要とする対象の眼の前房中に前記ＣＥＣを注射することを含む、角膜関連疾患または障害を処置する方法。
9. 角膜疾患または障害が、遺伝性疾患もしくは障害、感染、創傷、炎症性疾患、自己免疫疾患、ドライアイ、ジストロフィーまたはこれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
10. 角膜疾患または障害が、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）、円錐角膜、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、ヘルペスウイルス感染症、水痘帯状疱疹ウイルス感染症、虹彩角膜内皮症候群（ＩＣＥ）、翼状片、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、角膜潰瘍または水疱性角膜症を含む、請求項８に記載の方法。
11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法から取得可能なまたは取得された、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から製造された治療有効量の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む、組成物。
12. 薬学的組成物と、請求項１１に記載の組成物の、または請求項１～７のいずれか一項に記載の方法から取得可能なもしくは取得された、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から製造された治療有効量の角膜内皮細胞（ＣＥＣ）とを含む、キット。
13. 請求項１１に記載の組成物の、または請求項１～７のいずれか一項に記載の方法から取得可能なもしくは取得された、凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含むバイアル。
14. 請求項１１に記載の組成物の、凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む、凍結保存組成物。
15. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法から取得可能な組成物の、凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む、凍結保存組成物。
16. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法から取得された組成物の、凍結保存された角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む、凍結保存組成物。

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