KR20120102709A

KR20120102709A - 인간 ｒｐｅ 세포의 생산 방법 및 인간 ｒｐｅ 세포의 제약 제제

Info

Publication number: KR20120102709A
Application number: KR1020127015530A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 말쿠이트; 린다 레미유; 윌리엄 홈즈; 페드로 휴어타스; 루시 빌너
Original assignee: 어드밴스드 셀 테크놀로지, 인코포레이티드
Priority date: 2009-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2012-09-18
Also published as: IL294095B1; US10485829B2; KR102073730B1; US20130149284A1; IL219787B; IL264430B; IL301479A; US20200113938A1; WO2011063005A3; IL294095B2; EP2501802A2; EP2501802A4; CA2781149A1; WO2011063005A2; US20210060062A9; IL294095A; US11850261B2; IL219787A0; IL281453A; KR20180091125A

Abstract

본 발명은 인간 배아 줄기 세포, 인간 유도 만능 줄기 (iPS), 인간 성체 줄기 세포, 인간 조혈 줄기 세포, 인간 태아 줄기 세포, 인간 중간엽 줄기 세포, 인간 산후 줄기 세포, 인간 다능성 줄기 세포, 또는 인간 배아 생식 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 배아 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포는 성체 및 태아-유래 RPE 세포와 분자상 구분되고, 또한 배아 줄기 세포와 구분된다. 본원에서 기재되는 RPE 세포는 망막 박리 및 황반 변성을 비롯한 망막 변성 상태를 치료하기 위해 유용하다.

Description

인간 ＲＰＥ 세포의 생산 방법 및 인간 ＲＰＥ 세포의 제약 제제{METHODS OF PRODUCING HUMAN RPE CELLS AND PHARMACEUTICAL PREPARATIONS OF HUMAN RPE CELLS}

관련 특허 출원에 대한 상호-참조

본 국제 특허 출원은 그 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 가출원 번호 61/262,002 (2009년 11월 17일자 출원)를 기초로 한 우선권을 주장한다.

망막 색소 상피 ( RPE )

망막 색소 상피 (RPE)는 아래에 놓인 맥락막 (망막 뒤의 혈관층)과 위에 놓인 망막 시각 세포 (예를 들어, 광수용체 - 간상세포 및 원추세포) 사이의 감각신경 망막 밖의 색소 세포층이다. RPE는 광수용체 및 망막의 기능과 건강에 중요하다. RPE는 광색소를 재활용하고, 비타민 A를 전달, 대사 및 저장하고, 간상세포 광수용체 외부 세그먼트를 포식하고, 망막 및 맥락막 사이에서 철 및 소분자를 수송하고, 브루크 (Bruch) 막을 유지하고 보다 우수한 영상 해상도를 허용하기 위해 미광 (stray light)을 흡수함으로써 광수용체 기능을 유지한다 (문헌 [Engelmann and Valtink (2004) "RPE Cell Cultivation." Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1): 65-67] 참조; 또한 [Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, in STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009)] 참조).

성숙한 RPE는 흑색 색소 세포의 자갈돌 (cobblestone) 세포 형태, 및 세포성 레틴알데히드-결합 단백질 (CRALBP) (첨단부 미세융모 내에서 또한 발견되는 36-kD 세포질 레틴알데히드-결합 단백질) (Eisenfeld, et al. (1985) Experimental Research 41(3): 299-304); RPE65 (레티노이드 대사에 관여하는 65 kD 세포질 단백질) ([Ma, et al. (2001) invest Opthalmol Vis Sci. 42(7): 1429-35]; [Redmond (2009) Exp Eye Res. 88(5): 846-847]); 베스트로핀 (베스트 (Best) 난황형 황반 이영양증 유전자 (VMD2)의 막 국재화된 68 kD 생성물) (Marmorstein, et al. (2000) PNAS 97(23): 12758-12763), 및 색소 상피 유래 인자 (PEDF) (혈관억제 특성이 있는 48-kD 분비형 단백질) ([Karakousis, et al. (2001) Molecular Vision 7: 154-163]; [Jablonski, et al. (2000) The Journal of Neuroscience 20(19): 7149-7157])를 비롯한 RPE 세포 마커를 특징으로 한다.

RPE의 변성은 범맥락막위축, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성 (연령-관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 및 스타르가르트(Stargardt)병 (노란점 안저)과 같은, 광수용체 손상 및 실명을 일으키는 많은 시력-변경 병과 연관된 망막 박리, 망막 이형성증, 또는 망막 위축을 야기할 수 있다 (WO 2009/051671).

범맥락막위축

범맥락막위축은 눈의 맥락막모세혈관층, 망막 색소 상피, 및 광수용체의 변성을 일으키는 X-연관 열성 망막 변성 질환이다. Rab 에스코트 (escort) 단백질-1 (REP-1)을 코딩하는 CHM 유전자에서 돌연변이가 범맥락막위축을 일으킨다. REP-1은 Rab 단백질 (세포내 트래픽킹에 관여함)에 부착하고, Rab 단백질을 소기관 막으로 안내한다. 돌연변이체 REP-1 단백질은 Rab 단백질을 호위할 수 없어서, 기능적 Rab 단백질의 결핍을 일으킨다. 이러한 Rab 단백질의 결핍이 세포내 트래픽킹의 붕괴를 야기하고, RPE의 괴사를 일으킨다. 아동기에, 야맹증이 일반적인 최초 증상이다. 질환이 진행함에 따라, 환자는 종종 불규칙한 고리로서 시작하여 점차 중심 시력을 향해 내부로 및 주변 시력을 향해 외부로 모두 확장하는 시력 손실을 겪는다 (Genetics Home Reference (U.S. National Library of Medicine) [October 17, 2010]). 현재, 범맥락막위축에 대해 이용가능한 치료는 없으며, 그에 대한 치료법이 필요하다.

당뇨병성 망막병증

당뇨병성 망막병증은 가장 흔한 당뇨성 눈 질환이고, 미국에서 실명의 주요 원인이다. 당뇨병성 망막병증은 망막의 혈관의 변화에 의해 유발되고, 4개의 병기로 일어난다. 먼저, 미세동맥류가 망막 혈관에서 발생한다 (경증 비증식성 망막병증). 질환이 진행함에 따라, 혈관이 차단되어 중등도 비증식성 망막병증을 일으킨다. 보다 많은 혈관이 차단됨에 따라, 망막의 몇몇 영역에서 혈액 공급을 박탈시킨다 (중증 비증식성 망막병증). 마지막으로, 영양을 위해 망막에서 보내는 신호가 새로운 혈관의 성장을 촉발하지만 (증식성 망막병증), 이들 새로운 혈관은 비정상적이고 취약하다. 새로운 비정상적인 혈관은 망막을 따라 및 눈의 내부에서 유리체액의 표면을 따라 성장한다. 혈관의 구조적 완전성이 악화함에 따라 (부분적으로 당뇨병에 근본적인 인슐린/당 불균형으로 인한 오스몰랄농도의 변화 때문), 혈액을 누출하여, 중증 시력 손실 및 심지어 실명을 일으킨다 ("Diabetic Retinopathy" (MayoClinic.org) [February 11, 2010]). 일반적으로, 당뇨병성 망막병증은 단지 수술에 의해 제어되거나 늦추어질 수 있지만 치료될 수 없고, 환자는 대체로 계속하여 시력 문제를 겪는다. 따라서, 개선된 당뇨병성 망막병증 치료법이 필요하다.

황반 변성

연령-관련 황반 변성 (AMD)은 미국 및 유럽에서 법적 실명의 가장 일반적인 원인이다. 황반하 RPE의 위축 및 맥락막 신생혈관형성 (CNV)의 발생이 이차적으로 중심 시력의 상실을 일으킨다. AMD의 초기 징후는 망막 색소 상피와 브루크 막 사이의 퇴적물 (결정체 (druse))이다. 중심 기하적 위축 ("건성 AMD")이 망막 아래에서 망막 색소 상피층에 대한 위축으로부터 생기고, 이것은 눈의 중심 부분에서 광수용체 (간상세포 및 원추세포)의 손실을 통해 시력 손실을 일으킨다. 신생혈관 또는 삼출성 AMD ("습성 AMD")는 궁극적으로 황반 아래에 혈액 및 단백질 누출을 일으키는 브루크 막을 통한 맥락막모세혈관층 내의 비정상적인 혈관 성장 (맥락막 신생혈관형성) 때문에 시력 손실을 일으킨다. 이들 혈관으로부터 출혈, 누출, 및 반흔형성 치료하지 않고 두면 궁극적으로 광수용체에 비가역적인 손상과 급속한 시력 손실을 야기한다. 황반 변성에 대한 현재의 치료에는 라니비주맙 (루센티스 (LUCENTIS)®) 또는 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN)®)을 사용한 항-혈관신생 요법, 광응고술 (레이저 수술), 베르테포르핀 (비쥬다인 (VISUDYNE)®)을 사용한 광역학 요법, 및 황반하 출혈 대체 수술이 있다 ("Macular Degeneration." (MayoClinic.org) [October 2010]). 그러나, 이들 치료법의 목표는 추가의 시력 손실을 저지하기 위한 것이고, 불행하게도 존재하는 손상은 역전될 수 없다. 따라서, 황반 변성의 치료법이 매우 필요하다.

색소성 망막염 ( RP )

색소성 망막염 (RP)은 전세계에 대략 150만 명의 사람이 걸려 있는 망막에서 광수용체 (예를 들어, 간상세포 및 원추세포)를 손상시키는 일군의 유전병이다. 예를 들어, 상염색체 열성 RP는 시스 (cis) 레틴알데히드 결합 단백질 또는 RPE65의 돌연변이에 의해 야기된다. RP의 진행은 느리고 환자마다 다르다. RP 환자는 모두 일부 시력 손실을 겪고, 전형적인 초기 증상으로서 야맹증에 이어서 터널 시야 (tunnel vision)가 있고, 일부는 전체 시력을 잃을 수 있다 ("Retinitis Pigmentosa." American Optometric Association (October 2010)). 비타민 A 및 루테인을 사용한 치료가 RP의 진행을 늦추는데 약간의 가능성을 보였지만, 효과적인 치료법은 이용가능하지 않다.

망막 박리

열공 망막 박리, 삼출, 장액, 또는 2차 망막 박리, 및 견인 망막 박리를 비롯한 망막 박리는 아래에 놓인 지지 조직의 층으로부터 망막이 벗겨지는 눈의 장애이다. 초기 박리는 국소적일 수 있지만, 신속하게 치료하지 않으면 전체 망막이 박리될 수 있어서 시력 손실 및 실명을 일으킬 수 있다 (Ghazi and Green (2002) Eye 16: 411-421 참조). 소수의 망막 박리는 안구에의 무딘 외상 (blunt blow), 관통하는 외상 및 진탕증을 비롯한 외상에서 야기된다. 현재의 치료는 응급 눈 수술이지만 성공률이 단지 대략 85%이고, 심지어 성공하더라도 환자는 시력 손실 및 인위적인 시각 (visual artifact)을 겪을 수 있다 (문헌 [Facts About Retinal Detachment [NEI Health Information] (October 2010)] 참조). 따라서, 망막 박리에 대한 치료법이 필요하다.

스타르가르트병 ( 노란점 안저 )

스타르가르트병 (노란점 안저)은 양 눈의 중심 시력의 점진적인 손실을 야기하지만 주변 시력을 해치지 않는, 상염색체 열성 및 우성 형태를 모두 포함하는 일종의 황반 변성이다. 스타르가르트병의 환자는 망막의 원추세포 수용체 세포의 점진적인 악화를 경험한다. 원추세포는 황반에 집중되어 있고, 중심 시력 및 색상을 담당한다. 시간 경과에 따라, 이들 이환된 세포는 중심 시력 내에 검은색 구멍을 형성시키고 색상 감지 능력이 궁극적으로 침범된다 ([Gass and Hummer (1999) Retina 19(4): 297-301] 및 [Aaberg (1986) Tr. Am. Ophth. Soc. LXXXIV: 453-487] 참조). 현재, 스타르가르트병에 대한 이용가능한 치료법은 없다.

의약에서 RPE 세포

시각 및 망막 건강을 유지하는데 있어서 RPE의 중요성의 면에서, RPE, 및 시험관내에서 RPE 세포를 생산하기 위한 방법은 상당히 중요하다 (문헌 [Lund, et al, (2001) Progress in Retinal and Eye Research 20(4): 415-449] 참조). 예를 들어, 문헌 [Gouras, et al. (2002) Investigative Ophthalmology & Visual Science 43(10): 3307-311]에 보고된 연구에서는 정상 마우스로부터의 RPE 세포를 트랜스제닉 RPE65^-/- 마우스 (망막 변성의 마우스 모델)로 이식하는 것을 기재하였다. 고라스 (Gouras)는 건강한 RPE 세포의 이식이 RPE65^-/- 마우스에서 망막 변성을 보이지만, 3.7주 후에, 그의 건강에 좋은 효과는 감소하기 시작하였음을 개시한다. 문헌 [Treumer, et al. (2007) Br J Opthaimol 91 : 349-353]에서는 연령-관련 황반 변성 (AMD)이 있는 환자에서 중심와 맥락막 신생혈관형성 (CNV)의 제거 후에 자가 RPE-맥락막 시트의 성공적인 이식을 기재하였지만, 상기 절차는 평균 시력의 중등도 증가만을 제공하였다.

또한, RPE 세포는 뇌의 만성 변성 질환인 파킨슨병을 치료하는데 있어서 가능한 요법으로서 제안되었다. 이 질환은 기저핵의 영역에서 특수한 뉴런 세포의 변성에 의해 야기된다. 파킨슨병의 환자에서 도파민성 뉴런의 사멸이 중요한 신경전달물질인 도파민의 합성을 감소시킨다. 표준 요법은 L-도파를 사용한 의학 요법이다. L-도파는 기저핵에서 도파민으로 대사되고, 상실된 내인성 신경전달물질의 기능을 넘겨받는다 (문헌 [McKay, et al. (2006) Exp Neurol. 20(1): 234-243] 및 [NINDS Parkinson's Disease Information Page (September 23, 2009)] 참조). 그러나, L-도파 요법은 수년 후에 그 활성을 잃는 바, 따라서, 파킨슨병에 대한 새로운 요법이 필요하다. 예를 들어, 문헌 [Ming and Le (2007) Chinese Medical Journal 120(5): 416-120]에서는 파킨슨병을 치료하기 위해 유익한 신경영양성 및 항염증성 시토카인을 공급하기 위해 눈 공여자로부터 파킨슨 환자의 선조체로 RPE 세포의 이식을 제안하였다.

그러나, 인간 공여자로부터 얻은 RPE 세포는 몇 가지 다루기 힘든 문제가 있다. 먼저, 눈 공여자가 부족하고, 현재 필요량이 기증된 눈 조직에 의해 충족될 수 있는 수준을 초과한다. 예를 들어, 인간 공여자로부터 얻은 RPE 세포가 이용가능한 조직의 본질적으로 제한된 풀 (pool)이고, 이 때문에 광범한 사용을 위한 규모 확대가 제한된다. 두번째로, 인간 공여자로부터의 RPE 세포는 병원체로 오염될 수 있고, 유전자 결함이 존재할 수 있다. 세번째로, 기증된 RPE 세포는 시신 (cadaver)으로부터 유래한다. 시신에서 얻은 RPE 세포는 RPE 세포가 노화에 근접하여 (예를 들어, 보다 짧은 말단소체 (telomere)) 이식 후의 제한된 유용 수명을 가질 수 있다는 수명이라는 추가의 문제를 갖는다. 태아의 조직으로부터 유래된 RPE 세포에 대한 의존은 상기 문제를 해결하지 못하는데, 그 이유는 상기 세포가 매우 느린 증식 잠재력을 보이기 때문이다. 또한, 태아의 세포는 처리시마다 크게 상이하고, 이식 전에 안전성에 대한 특성화되어야 한다. 예를 들어, 문헌 [Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, in STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009)] 참조. 임의의 인간으로부터 얻은 조직은 또한 면역학적 반응 (이식편-거부)을 야기하는 조직 적합성 문제를 가질 수 있다. 또한,시신에서 얻은 RPE 세포는 이식에 유용한 충분한 품질을 갖지 않을 수 있다 (예를 들어, 세포는 안정하거나 기능적이지 않을 수 있다). 네번째로, 인간 공여자로부터의 RPE 세포의 공급은 공여자 동의 문제를 야기할 수 있고, 치료를 위한 RPE 세포의 수거 및 사용을 복잡하게 하는 규제 장벽을 통과하여야 한다. 다섯번째로, 근본적인 제한은 자가 이식에서 이식된 RPE 세포가 AMD의 발생을 야기할 수 있는 동일한 유전 정보를 보유한다는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Binder, et al. (2007) Progress in Retinal and Eye Research 26(5): 516-554] 참조. 여섯번째로, 자가 이식에 사용된 RPE 세포는 AMD가 노인 환자에서 발생할 수 있기 때문에 이미 노화에 근접한 세포이다. 따라서, RPE 세포의 보다 짧은 유용 수명은 치료 용도에서 그의 유용성을 제한한다 (예를 들어, RPE 세포는 잘 이식되지 않을 수 있고, 보다 완전한 시력 회복을 위해 충분히 오래 지속될 가능성이 작다). 일곱번째로, 장기 요법에서 성공하기 위해서, 이식된 RPE 세포는 RPE 층 내로 통합되고 맥락막 및 광수용체와 연결되어야 한다. 여덟번째로, AMD 환자 및 노인 환자는 또한 브루크 막의 변성으로 고통받고, 이것은 RPE 세포 이식을 복잡하게 만든다 ([Guilapalli, et al. (2005) Exp Eye Res. 80(2): 235-48] 참조). 따라서, 치료 용도를 위한 RPE 세포의 공급원에 대한 큰 필요성이 존재한다.

배아 줄기 세포 유래 RPE 세포 ( hESC - RPE 세포)

인간 배아 줄기 세포 (hES)는 임상 용도를 위한 교체 RPE 세포의 유망한 공급원으로 간주된다. 문헌 [Idelson, et al. (2009) Cell Stem Cell 5: 396-408] 참조. 그러나, 기형종 형성의 위험 및 면역 거부 문제를 극복하기 위한 강력한 면역억제 약물의 필요성을 비롯하여 수많은 문제가 치료제로서 그의 사용을 계속 막고 있다. 예를 들어, 문헌 [Wang, et al. (2010) Transplantation]에서는 마우스 배아 줄기 세포가 RPE 세포로 분화된 후, 색소성 망막염의 마우스 모델 (Rpe65 ^rd12 / Rpe ^rd12 C57BL6 마우스) 내로 이식된 연구가 기재되어 있다. RPE 세포가 이식된 Rpe65 ^rd12 / Rpe ^rd12 마우스가 7개월의 기간 동안 유의한 시력 회복을 보였지만, 이것은 망막 박리 및 종양에 의해 악화되었다.

또한, 기본적인 연구로부터 임상 적용으로부터의 전환은 집합적으로 현재의 우수 의약품 제조 기준 (Good Manufacturing Practices) (GMP) 및 현재의 우수 조직 관리 기준 (Good Tissue Practices) (GTP)로 불리는 미국 식약청 (U.S. Food and Drug Administration)에 의해 제시된 가이드라인을 지켜야 하기 때문에 불가능하다. 세포 요법 생성물, 예컨대 hES 세포-유래 RPE의 임상 제조의 측면에서, GTP는 공여자 동의, 추적 관리 및 감염성 질환 스크리닝을 결정하고, GMP는 인간에 사용하기 위한 지속적으로 안전하고 효과적인 생성물을 생산하는 설비, 공정, 시험, 및 실무에 관련된다 (Lu, et al. Stem Cells 27: 2126-2135 (2009)). 따라서, 이식 요법에 사용하기 적합한 매우 많은 RPE 세포의 생산을 위한 체계적이고 유도된 방법에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 만능 (pluripotent) 줄기 세포로부터 RPE 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포로부터 최종적으로 분화된 기능적 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 제공한다. 이들 방법은 치료 방법 (및 용도), 스크리닝 검정에 사용하기 위한 매우 많은 기능적 분화된 RPE 세포를 생산하기 위해, 및 RPE의 기본적인 생물학을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포의 제약 제제를 포함하는 제제를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(a) 만능 줄기 세포를 제공하고;

(b) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하여 배상체 (embryoid body)를 형성시키고;

(c) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 배상체를 배양하여 부착 배양액을 형성시키고;

(d) 고밀도 체세포 배양액의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (c)의 세포를 배양하고, 이에 의해 망막 색소 상피 (RPE) 세포가 세포의 배양액에 나타나고;

(e) (d)의 배양액을 해리시키고;

(f) 배양액으로부터 RPE 세포를 선택하고, RPE 세포를 성장 인자로 보충된 별개의 배양액 함유 배지에 이송하여 RPE 세포의 농축 배양액을 생산하고;

(g) RPE 세포의 농축 배양액을 증식시켜 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하는 것

을 포함하는, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은

(a) 만능 줄기 세포를 제공하고;

(b) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하여 배상체를 형성시키고;

(e) (d)의 배양액을 해리시키고;

(g) RPE 세포의 농축 배양액을 증식시키고;

(h) RPE 세포의 농축 배양액을 배양하여 성숙한 RPE 세포를 생산하는 것

을 포함하는, 성숙한 RPE 세포의 실질적으로 순수한 배양액의 생산 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 포유동물 만능 줄기 세포일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 인간 배아 줄기 (hES) 세포, 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 인간 성체 줄기 세포, 인간 조혈 줄기 세포, 인간 태아 줄기 세포, 인간 중간엽 줄기 세포, 인간 산후 줄기 세포, 인간 다능성 줄기 세포, 또는 인간 배아 생식 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 만능 줄기 세포일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 유럽 인간 배아 줄기 세포 등록소 (European Human Embryonic Stem Cell Registry) - hESCreg에 제시된 hES 세포주일 수 있다

한 실시양태에서, 본 발명은 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제를 포함하는 RPE 세포의 제제를 제공한다. 예시적인 RPE 세포는 만능 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포, iPS 세포, 할구 (blastomere), 내세포괴, 또는 단성생식에 의해 활성화될 수 있는 난모세포로부터 분화될 수 있다. 상기 만능 줄기 세포는 재조합 또는 유전자 조작 (예를 들어, 요구되는 치료 단백질을 발현하거나 또는 유전자 결함, 예컨대 황반 변성에 관련되는 유전자의 발현을 제거하도록 조작)될 수 있다. RPE 세포는 망막 변성 질환을 치료하기 위해 제형화되고 사용될 수 있다. 추가로, 만능 줄기 세포-유래 RPE 세포는 RPE 세포 생존을 조정하는 작용제를 (시험관내에서 및/또는 생체내에서) 확인하기 위한, RPE 세포 성숙을 연구하기 위한, 또는 RPE 세포 성숙을 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 상기 스크리닝 검정을 사용하여 확인되는 작용제는 시험관내에서 또는 생체내에서 사용될 수 있고, 망막 변성 질환을 치료하기 위해 단독으로 또는 RPE 세포와 조합되어 사용될 수 있는 추가의 치료제를 제공할 수 있다.

한 실시양태에서, (a)의 만능 줄기 세포는 유전자 조작될 수 있다.

한 실시양태에서, (a), (b), (c), (d), (f), (g), 또는 (h)의 배지는 혈청 비함유 B-27 보충물을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, (a), (b), (c), (d), (f), (g), 또는 (h)의 배지는 혈청 비함유 B-27 보충물을 함유하지 않는다.

한 실시양태에서, (b)의 세포는 적어도 약 7-14일 동안 배양된다. 또 다른 실시양태에서, (c)의 세포는 적어도 약 7-10일 동안 배양된다. 추가의 실시양태에서, (e)의 세포는 적어도 약 14-21일 동안 배양된다.

한 실시양태에서, (a), (b), (c), (d), (f), (g), 또는 (h)의 배지는 MDBK-GM, 옵티프로(OptiPro) SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM이다. 또 다른 실시양태에서, (f)의 성장 인자는 EGF, bFGF, VEGF, 또는 재조합 인슐린-유사 성장 인자이다. 추가의 실시양태에서, 배지 (g)는 헤파린, 히드로코르티손, 또는 아스코르브산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포의 농축 배양액을 증식시키기 위해 사용되는 배양 배지는 미분화된 만능 줄기 세포의 성장 또는 유지를 지지하지 않는다.

한 실시양태에서, 단계 (e)는 배양액을 트립신, 콜라게나제, 디스파제, 파파인, 콜라게나제와 디스파제의 혼합물, 및 콜라게나제와 트립신의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 효소와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (e)는 기계적 파쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 감소된 HLA 항원 복잡성을 갖는다.

한 실시양태에서, 방법은 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시키는 조건 하에 상기 RPE 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하고, 상기 알파 인테그린 서브유닛은 1-6 또는 9이다. 또 다른 실시양태에서, 조건은 망가니즈에 대한 노출, CD29에 대한 항체에 대한 노출, 또는 상기 RPE 세포의 적어도 약 4회의 계대배양을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항-CD29 항체는 모노클로날 항체 HUTS-21 또는 모노클로날 항체 (mAb) TS2/16이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 망막 변성의 치료에 적합한 RPE 세포의 제약 제제를 제공하고, 상기 RPE 세포는 다음 특성 중의 적어도 하나를 갖는다:

(a) 이식 후에 적어도 약 1개월 동안 표현형을 유지하거나,

(b) 적어도 약 1개월 동안 배양액 내에서 그의 표현형을 유지하거나,

(c) 이식 후에 숙주 내로 통합되거나,

(d) 이식 후에 실질적으로 증식하지 않거나.

(e) 식세포작용성 (phagocytositic)이거나,

(f) 비타민 A를 전달, 대사 또는 저장하거나,

(g) 이식 후에 망막과 맥락막 사이에서 철을 수송하거나,

(h) 이식 후에 브루크 막에 부착하거나,

(i) 이식 후에 미광을 흡수하거나,

(j) 알파 인테그린 서브유닛의 발현 증가를 보이거나, 또는

(k) 인간 공여자로부터 유래된 RPE 세포보다 더 긴 말단소체를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 언급된 특성의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 식세포작용성이고, 인간 공여자로부터 유래된 RPE 세포보다 더 긴 말단소체를 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 RPE 세포를 포함하는, 망막 변성의 치료에 사용하기 위한 제약 제제를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 망막 변성은 스타르가르트병, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 범맥락막위축, 색소성 망막염, 망막 박리, 망막 이형성증, 또는 망막 위축으로 인한 것이다.

한 실시양태에서, RPE 세포의 제약 제제는 현탁액, 겔, 또는 콜로이드의 형태로 이식을 위해 제형화된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 매트릭스, 기재, 스캐폴드 (scaffold), 또는 이식편과 함께 이식을 위해 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 제제는 눈의 망막하 공간에 투여하기 위해 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 제제는 적어도 약 10³-10⁹개의 RPE 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, RPE 세포 제제는 성숙한 RPE 세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포 제제는 본질적으로 성숙한 RPE 세포로 이루어진다. 추가의 실시양태에서, 제제는 적어도 약 75% RPE 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 제제는 바이러스, 박테리아, 및/또는 진균 오염이 실질적으로 없다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 제약상 허용되는 담체 내에 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 제제는 눈에 투여하기 위해 제형화된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 망막하 공간에 투여하기 위해 제형화된다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 이식시에 망막 내로 통합될 수 있는 기능적 RPE 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 제제에는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 및 인간 배아 줄기 세포 (hES)가 실질적으로 없다. 추가의 실시양태에서, 제제는 우수 의약품 제조 기준 (GMP) 부합성이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 약 10⁴개의 인간 RPE 세포를 포함하는 동결보존된 제제를 제공하고, 여기서 제제는 인간 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제이고, RPE 세포는 RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 Mit-F를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 약 85%의 RPE 세포는 해동 후에 생존력을 보유한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 인간 만능 줄기 세포로부터 분화된 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제를 제공하고, 여기서 RPE 세포는 mRNA 및 단백질 수준에서 RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 Mit-F를 발현하고, 세포에는 실질적으로 Oct-4, NANOG, 및 Rex-1의 발현이 결여된다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포를 포함하고, 여기서 적어도 성숙한 분화된 RPE 세포는 mRNA 및 단백질 수준에서 PAX2, pax-6, 및 티로시나제를 추가로 발현한다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포로부터 분화된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 망막 변성의 치료를 위한 의약의 제조에서 RPE 세포의 제약 제제의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(a) RPE 세포를 배양하고,

(b) 상기 RPE 세포를 수거하고,

(c) 상기 RPE 세포를 원심분리하고,

(d) 상기 RPE 세포를 10% DMSO/90% FBS 용액 내에 재현탁하는 것

을 포함하는, RPE 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, RPE 세포는 Ca² ⁺/Mg⁺ DPBS로 세척된다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 베스트로핀이 세포 막에서 조직화될 때까지 배양되었다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 중간 색소침착 수준에 도달할 때까지 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (a)는 RPE 세포의 적어도 2개의 배양 용기의 배양을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 수거되고, 단일 로트 (lot)로 조합된다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 수거되고, RPE 세포의 조합 동안 FBS 내에 저장된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 기재되는 유효량의 RPE 세포를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는 망막 변성의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 망막 변성은 범맥락막위축, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 망막 박리, 색소성 망막염, 또는 스타르가르트병으로 인한 것이다.

한 실시양태에서, 제제는 현탁액, 매트릭스, 겔, 콜로이드, 스캐폴드, 또는 기재 내에서 이식된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 눈의 망막하 공간 내로의 주사에 의해 투여된다.

추가의 실시양태에서, 유효량은 적어도 약 20,000-200,000개의 RPE 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 적어도 약 20,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 또는 200,000개의 RPE 세포이다.

한 실시양태에서, 방법은 대상에서 망막전위도 (electroretinogram) 반응, 시운동력 (optomotor acuity) 역치, 또는 휘도 역치를 측정함으로써 방법의 효능을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제제는 바이러스, 박테리아, 또는 진균 오염이 실질적으로 없다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 이식시에 망막 내로 통합될 수 있는 기능적 RPE 세포이다. 추가의 실시양태에서, RPE 세포는 이식 후에 시력을 개선한다.

본 발명은 눈 장애의 치료를 위한 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 눈 장애, 특히 전체적으로 또는 부분적으로 내인성 RPE 층의 손상 또는 붕괴에 의해 야기되거나 악화되는 눈 장애의 증상 (예를 들어, 망막 변성)의 치료 또는 개선을 위한 RPE 세포의 사용을 수반한다.

한 실시양태에서, 본원에서 기재되는 RPE 세포에는 망막 변성을 야기할 수 있는 유전자 돌연변이가 실질적으로 없다.

한 실시양태에서, RPE 세포는 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 50:50 PDLGA, 85:15 PDLGA, 및 INION GTR® 생분해성 막 (생체적합성 중합체의 혼합물)과 함께 이식될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 이식 후에 브루크 막에 부착하고, 극성을 확립하고, 수여자의 조직 내로 통합된다,

한 실시양태에서, RPE 세포는 이식 후에 시력을 개선할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 이식 후에 시력을 실질적으로 개선할 수 있다.

한 실시양태에서, RPE 세포는 표 3 또는 4에 제시된 GTP 및/또는 GMP 규정 중 적어도 하나에 부합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 우수 의약품 제조 기준 (GMP)에 따라 생산될 수 있다. 추가의 실시양태에서, RPE 세포는 우수 조직 관리 기준 (GTP)에 따라 생산될 수 있다. 추가의 실시양태에서, RPE 세포는 표 4에 언급된 기준 중 적어도 하나를 충족할 수 있다. 추가의 실시양태에서, RPE 세포는 표 4에 언급된 기준 중 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개를 충족할 수 있다.

한 실시양태에서, RPE 세포에는 Oct-4, NANOG, Rex-1, 알칼리성 포스파타제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 및 DPPA-4를 포함하고 이로 제한되지 않는 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현이 결여된다. 또 다른 실시양태에서, RPE 세포는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MitF, Otx2, PAX2, Pax-6, 및 티로시나제를 포함하고 이로 제한되지 않는 RPE 세포 마커를 발현한다. 추가의 실시양태에서, RPE 세포는 표 5에 나열된 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, 여기서 적어도 하나의 유전자의 발현은 인간 ES 세포에서의 발현에 비해 RPE 세포에서 증가한다. 추가의 실시양태에서, RPE 세포는 표 6에 나열된 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, 여기서 적어도 하나의 유전자의 발현은 인간 ES 세포에서의 발현에 비해 RPE 세포에서 감소한다. 한 실시양태에서, RPE 세포는 증가된 알파 인테그린 서브유닛 발현을 보인다. 또 다른 실시양태에서, 알파 인테그린 서브유닛은 알파 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 9이다. 또 다른 실시양태에서, 발현은 mRNA 발현, 단백질 발현, 또는 mRNA와 단백질 발현 둘 모두이다.

본 발명은 (a) 동결보존된 RPE 세포의 바이알을 해동하고, (b) RPE 세포를 배지 내에 재현탁하고, (c) RPE 세포를 원심분리하고, (d) RPE 세포를 배지 내에 재현탁하고, (e) RPE 세포를 바이알 내에 분취하고, (f) 임상 부위로 전달하는 것을 포함하는, 임상 부위에 RPE 제제를 제공하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 재현탁 및 원심분리 단계는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 반복될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RPE 생성물은 단계 (e)를 완료하고 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10시간 내에 임상 부위로 수송된다. 추가의 실시양태에서, 바이알은 표지될 수 있다.

본 발명은 또한 (a) RPE 세포를 생산하고, (b) 소비자에게 전달하기 위해 판매용 RPE 세포 제제를 제조하는 것을 포함하는, 판매용 RPE 세포 제제의 제공 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 RPE 세포를 동결보존하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 상기 판매용 RPE 세포 제제의 제공을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 방법은 RPE 세포 제제의 광고를 포함한다.

본 발명은 위 또는 아래에서 설명되는 측면 및 실시양태들의 임의의 조합을 고려한다. 예를 들어, 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 임의의 조합을 포함하는 RPE 세포의 제제는 본원에서 기재되는 임의의 병태의 치료에 사용될 수 있다. 유사하게, 출발 물질로서 인간 배아 줄기 세포를 사용하여 RPE 세포를 생산하기 위한 본원에서 기재되는 방법은 출발 물질로서 임의의 인간 만능 줄기 세포를 사용하여 유사하게 수행될 수 있다.

도 1-7은 RPE 세포의 생산을 위한 예시적인 프로토콜을 도시한 것이다.
도 1 RPE 세포의 생산: 단계 1 - MEF 피더 세포 (feeder cell)의 제조. MEF 피더 세포는 약 10-20 nm/mL 인간 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 약 8-16 ng/mL 인간 bFGF의 존재 하에 배양될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, in STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009)] 참조.
도 2 RPE 세포의 생산: 단계 2 - hES 세포의 시딩 및 팽창
도 3 RPE 세포의 생산: 단계 3 - 배상체 형성.
도 4 RPE 세포의 생산: 단계 4 - RPE 유도. RPE 세포의 집합체는 6-8주 내에 나타날 수 있고, 여기서 RPE 세포는 배상체의 표면 상에 나타날 수 있고, 이어서 시간 경과에 따라 전체 배상체에 서서히 퍼질 수 있다.
도 5 RPE 세포의 생산: 단계 5 - RPE 팽창 및 분화. 한 실시양태에서, RPE 세포 배양액은 느슨한 또는 단리된 세포를 제거하기 위해 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 세척될 수 있다. 본 발명자들은 이것이 RPE 세포의 수율을 놀랍게도 개선함을 밝혀내었다. RPE 세포는 RPE-특이적 세포 마커, 예컨대 CRALBP, 베스트로핀, RPE65, 및 PEDF의 발현에 의해 특성화될 수 있다. RPE 세포는 또한 RPE-특이적 식세포작용 검정 및 비타민 A 대사 검정을 비롯한 기능 시험에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells; in STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009)] 참조.
도 6 RPE 세포의 생산: 단계 6 - 수거, 배양, 및 동결보존. 한 실시양태에서, RPE 세포의 수개의 플라스크에 시딩하고 증식시켜 다량의 RPE 세포를 얻을 수 있다. RPE 세포의 개개의 플라스크가 수거되기 때문에 (예를 들어, T-75 플라스크), RPE 세포는 수거 단계 동안 약 4℃에서 FBS 내에 저장될 수 있다. 추가로, RPE 세포는 디스트로핀이 세포 막에서 조직화되고 PAX6 발현이 낮을 때 동결보존을 위해 준비된 것으로 간주될 수 있다. 본 발명자들은 이것이 동결보존된 RPE 세포의 생존력을 놀랍게도 개선함을 밝혀내었다.
도 7 RPE 세포의 생산: 단계 7 - 동결보존된 RPE 세포의 해동 및 제약 제제
도 8은 RPE 세포에서 ES 및 RPE 마커의 Log 상향조절 또는 하향조절을 각각 도시한 것이다. RPE의 7개의 대표적인 로트의 평균 ± SD 상대적인 유전자 발현이 제시된다. 데이터는 각각의 샘플에 대해 β-액틴 대조군 수준으로 정규화하고, MA09 hES 세포에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 표현한다. 4개의 상향조절된 RPE 마커 (예를 들어, RPE-65, PAX6, 베스트로핀, 및 MIT)는 좌측에 제시되고; 3개의 하향조절된 hES 마커 (예를 들어, OCT4, NANOG 및 SOX2)는 우측에 제시된다.
도 9는 P60 및 P90 모두에서 ERG 반응에 의한 광 플래시 시험에 반응한 외 (a-파) 및 내 (b-파) 망막의 전기 활성을 도시한 것이다. RPE 이식 동물에서 ERG 반응은 샴 (sham) 대조군보다 유의하게 더 우수한 반응을 달성하였다 (p < 0.05, t-검정).
도 10은 RPE 처리 눈이, 샴-처리한 눈 및 처리하지 않은 눈보다 유의하게 더 우수하게 기능함을 보여주는 시운동 데이터 시스템으로부터의 데이터를 도시한 것으로, 샴 및 비처리 대조군보다 각각 약 50% 및 100%의 시력 개선을 제시한다 (p < 0.05, t-검정).
도 11 P100에서의 휘도 역치 - 상구 (superior colliculus)에 걸쳐 기록된 휘도 역치 반응, 각각의 곡선 (평균 SEM)은 망막 영역의 비율을 보여주고 (y-축), 여기서 시력 역치는 x-축 상의 상응하는 값 미만이다 (로그 단위, 배경 조도 0.02 cd/m²에 상대적). 별표는 이식된 및 샴-수술된 눈에 대한 곡선이 통계적으로 상이한 지점을 나타낸다 (t-검정, p < 0.05).
도 12는 인간 ES 세포-유래 RPE 세포의 상이한 배치에서의 시험관내 성숙 및 색소침착 정도를 도시한 것이다. hES 세포는 (A) 낮은 (L1), (B) 중간 (L2), 및 (C) 높은 (L3) 색소침착 수준을 제시하도록 성숙하였다. (A): 위상차 영상; 축척 막대 = 200 ㎛. (B 및 C): 호프만 변조 콘트라스트 영상 (Hoffman modulation contrast image); 축척 막대 = 100 ㎛.
도 13은 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 hES 세포-RPE 세포의 비교 평가를 도시한 것이다. (A): 시험관내 분화 과정에 걸쳐 조사된 hES 세포, 신경외배엽, 및 최종적으로 분화된 RPE 세포에 특이적인 유전자의 역전사-PCR 분석. 시점은 hES 세포, EB, 초기 중간체를 나타내는 도말된 EB (EB/RPE), 새로 분화된 RPE 세포를 함유하는 세포의 혼합된 집단, 잔여 전구 세포 (혼합된), 정제된 RPE (도 12A에 상응), 및 완전히-성숙한 RPE (도 12C에 상응)에 상응한다. (B): hESC-특이적 및 RPE-특이적 마커의 웨스턴 블롯 분석. APRE-19 세포 (상부 레인)는 단백질체 (proteomic) 마커 발현의 비결정적인 패턴을 보여준다. 액틴은 단백질 로딩 대조군으로서 사용된다. hES 세포 (중앙 레인)로부터 유래된 RPE (하부 레인)는 hES 세포-특이적 단백질 Oct-4, NANOG, Rex-1, TDGF1, 및 DPPA4를 발현하지 않는다. 그러나, RPE 세포는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, Pax2, Otx2, MitF, 및 Tyr의 분화된 RPE의 모든 마커를 발현한다.
도 14는 주요 성분 분석 도면이다. 성분 1은 69%의 변이성이 세포 종류를 나타냄을 나타내고, 성분 2는 세포주를 나타낸다 (즉, 유전적 변이성). 유전자 발현 프로파일의 선형에 가까운 산포 (near-linear scatter)는 hES 세포로부터 유래된 RPE의 개체발생을 특성화한다.
도 15 (a): 시운동 반응에 의해 측정된 시력은 5,000, 20,000, 50,000, 75,000, 및 100,000개의 세포로 처리된 동물의 수행능이 P90일에 샴 주사 및 비처리 대조군 (p < 0.01 )보다 유의하게 더 우수함을 보여준다 (예를 들어, 정상 래트에서 0.6 c/d에 비해 0.563 c/d의 수치). (b): 인간 RPE 세포의 망막하 주사 후에 몇몇 시점에서 Elovl4 마우스에서 시험된 시력은 세포-주사 동물의 수행능이 매질-주사 및 비처리 대조군 (p < 0.05)보다 유의하게 더 우수함을 보여주었다. 일부는 정상 마우스에서의 0.35 c/d에 비해 P63에서 0.32 c/d의 수치를 보였고, 대조군 동물은 0.28 c/d의 수치를 보였다. (c-f): 상구 (SC)에 걸쳐 기록된 휘도 역치 반응; 각각의 곡선 (평균 ± SEM)은 망막 영역의 비율을 보여주고 (y-축), 여기서 시력 역치는 x-축 상의 상응하는 값 미만이다 (로그 단위, 배경 조도 0.02 cd/m²에 비해). 세포 주사군은 대조군보다 유의하게 더 우수하고: 곡선은 동물에서 (c) 20,000개의 RPE 세포 용량에서 SC 내의 28%의 영역; (d) 50,000개의 RPE 세포 용량에서 약 45%의 영역; (e) 75,000개의 RPE 세포 용량에서 약 40%의 영역; (f) 100,000개의 RPE 세포 용량에서 약 60%의 영역; 및 매질 대조군의 단지 3%의 영역이 2.2 로그 단위의 역치를 갖는다는 것을 보여주었다. 점선 - 세포-처리군 및 실선 - 매질 대조군. 약어: c/d, 사이클/디그리 (cycle/degree).
도 16은 시간에 따른 시력 및 휘도 역치의 변화를 도시한 것이다. 배치 및 시력에 의해 측정된 효과의 수명: 모든 시점 (P60-P240)에서의 세포-주사군은 대조군보다 유의하게 더 높은 시력을 가졌지만 (p < 0.01); 상이한 색소 수준으로서 실질적인 차이가 존재하지 않는다 (p > 0.05). 약어: c/d, 사이클/디그리.
도 17은 RCS 래트 모델에서 RPE 세포의 효능에 대한 색소침착의 효과의 비교를 도시한 것이다. 래트에 저, 중간 또는 고 색소침착 수준에서 50,000개의 RPE 세포를 이식하였다. 상기 래트를 샴 수술 및 비처리 대조군과 비교하였다.
도 18 중간 색소침착으로 100,000개의 RPE 세포 용량을 투여한 마우스로부터의 휘도 역치 지도의 2가지의 예. 휘도 역치는 비처리 측면에 대해 심각한 악화를 보이고, 1/2 초과의 영역이 P98에 비해 P187에서 비반응성인 반면, 세포 주사 측면에 대해서는 역치의 일부 감소가 발생하였지만 반응성은 계속 감수성이다 (P98에서 0.7 로그 단위 대 P187에서 1.0 로그 단위).
도 19는 P90에서 (A) 정상, (B) 세포 주사, 및 (C) 비처리한 눈의 광수용체를 보여주는, 세포-주사 및 비처리한 RCS 망막의 조직학적 조사를 도시한 것이다 (B의 화살표는 회복된 광수용체를 나타내고; C의 화살표는 잔류 광수용체를 나타낸다). (D-F): (D) 5,000 및 (E 및 F) 50,000 용량에서 회복된 광수용체 (E의 화살표는 회복된 광수용체를 나타내고; 원추세포 어레스틴 (arrestin)은 F에서 회복된 원추세포 광수용체를 보여주었다). (G): 면역형광- 및 (H) 면역조직화학-염색된 인간 특이적 항체는 공여자 세포 (화살표)가 P240에서 숙주 RPE 층과 긴밀하게 접촉하는 층을 형성함을 보여준다. (I): 비조직화된 망막 층상배열 (lamination)을 갖는, P240에서의 전형적인 비처리 망막 (좌측 화살표는 RPE 세포가 내망막 내로 이동함을 나타내고; 우측 화살표는 붕괴된 내핵층을 나타낸다). 축척 막대 = 25 ㎛. 약어: INL; 내핵층; IPL: 내망상층; ONL: 외핵층; RPE, 망막 색소 상피; RGC: 망막 신경절 세포.

발명의 상세한 설명

본원에 기재된 발명을 충분히 이해될 수 있도록, 다음 상세한 설명을 제시한다. 본 발명의 다양한 실시양태는 상세하게 설명되고, 제시되는 실시예에 의해 추가로 예시될 수 있다.

정의

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련인에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되는 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명 또는 본 발명의 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질을 아래에 기재한다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시를 위한 것으로서, 본 발명을 제한하고자 의도되지 않는다.

본 발명을 추가로 규정하기 위해, 다음 용어 및 정의를 본원에 제공한다.

본원 명세서에서 및 하기 청구의 범위 전체에 걸쳐 사용되는 바, 부정관사 ("a", "an") 및 정관사 ("the")의 의미는 문맥상 다른 의미를 분명하게 나타내지 않는 한 복수 참조물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바 "유효량"은 질환 치료를 위해 환자에게 투여될 때 상기 질환 치료에 효과를 보이기에 충분한 화합물 또는 세포의 양을 대체로 의미한다. 유효량은 예방에 효과적인 양, 및/또는 억제에 효과적인 양일 수 있다. 유효량은 징후/증상을 감소시키기에 효과적인 양, 징후/증상의 발생률을 억제하기에 효과적인 양, 징후/증상의 발생률의 중증도를 감소시키기에 효과적인 양, 징후/증상의 발생을 제거하기에 효과적인 양, 징후/증상의 발생을 느리게 하기에 효과적인 양, 징후/증상의 발생을 억제하기에 효과적인 양, 및/또는 징후/증상의 발생의 예방에 효과적인 양일 수 있다. "유효량"은 치료할 환자의 질환 및 그의 중증도 및 연령, 체중, 병력, 감수성 및 이전에 존재하는 병태에 따라 변할 수 있다. 용어 "유효량"은 본 발명의 목적상 "치료 유효량"과 동의어이다.

본원에서 사용되는 바 "배아" 또는 "배아의"는 모체 숙주의 자궁막 내로 착상되지 않은 발생하는 세포 덩어리를 대체로 의미한다. "배아 세포"는 배아로부터 단리되거나 배아에 함유된 세포이다. 또한, 이것은 2세포기만큼 일찍 얻은 할구, 및 응집된 할구를 포함한다.

본원에서 사용되는 바 "배아 줄기 세포" (ES 세포)는 세포주로서 연속적으로 계대배양된 포배 또는 상실배의 내세포괴로부터 유래된 세포를 대체로 의미한다. ES 세포는 난세포와 정자의 수정 또는 DNA, 핵 전달, 처녀생식으로부터, 또는 HLA 영역에서 동형접합성을 갖는 ES 세포를 생성하는 수단에 의해 유도될 수 있다. 또한, ES 세포는 접합체, 할구, 또는 정자 및 난세포의 융합에 의해 생성된 포배기 포유동물 배아, 핵 전달, 처녀생식, 또는 염색질의 재프로그래밍 및 세포를 생성하기 위해 재프로그래밍된 염색질의 혈장 막 내로의 후속 통합으로부터 유도된 세포를 의미할 수 있다. 배아 줄기 세포는 그의 공급원 또는 그를 생산하기 위해 사용되는 특정 방법과 무관하게 (i) 3개의 모든 배엽층의 세포로 분화하는 능력, (ii) 적어도 Oct-4 및 알칼리성 포스파타제의 발현, 및 (iii) 면역손상된 동물 내로 이식될 때 기형종을 생산하는 능력을 기초로 하여 확인될 수 있다.

본원에서 사용되는 바 "배아-유래 세포" (EDC)는 상실배-유래 세포, 포배-유래 세포, 예를 들어 내세포괴, 배순 (embryonic shield), 또는 낭배의 외피 (epiblast)의 세포, 또는 초기 배아의 다른 만능 줄기 세포, 예를 들어 원시 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 및 이들의 유도체를 대체로 의미한다. 또한, "EDC"는 응집된 단일 할구로부터의 할구 및 세포괴 또는 상이한 발생기로부터의 배아를 포함하지만, 세포주로서 계대배양된 인간 배아 줄기 세포를 제외한다.

본원에서 사용되는 바 "황반 변성"은 브루크 막, 신경 망막, 및 망막 색소 상피의 비정상과 연관된 중심 시력의 점진적인 상실을 특징으로 하는 질환을 대체로 의미한다. 황반 변성 질환은 연령-관련 황반 변성, 노쓰 캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 (Sorsby) 안저 이영양증, 스타르가르트병, 패턴 이영양증, 베스트병, 말라티아 레벤티니즈 (malattia leventinese), 도인 (Doyne) 벌집 맥락막염, 우성 드루젠 (drusen), 및 방사상 드루젠을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바 "만능 줄기 세포"는 그의 미분화된 상태를 보유하고, 정상 핵형 (예를 들어, 염색체)을 보이고, 적절한 조건 하에 모든 3개의 배엽층 (즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화하는 능력을 가지면서 시험관내에서 연장된 또는 실질적으로 무한한 증식이 가능한 세포를 대체로 의미한다.

본원에서 사용되는 바 "만능 배아 줄기 세포"는 (a) 면역결핍 (SCID) 마우스에 이식될 때 기형종을 유도할 수 있고; (b) 모든 3개의 배엽층 (예를 들어, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포 종류)의 세포 종류로 분화할 수 있고; (c) 적어도 하나의 분자 배아 줄기 세포 마커를 발현하는 (예를 들어, Oct 4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, NANOG, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1을 발현하는) 세포를 대체로 의미한다.

본원에서 사용되는 바 "RPE 세포", "분화된 RPE 세포", "ES-유래 RPE 세포"는 본 발명의 방법을 사용하여 만능 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포를 대체로 의미하기 위해 명세서 전체에 걸쳐서 교환가능하게 사용될 수 있다. 이 용어는 세포의 성숙 수준과 무관하게 분화된 RPE 세포를 총칭하기 위해 사용되고, 따라서 다양한 성숙 수준의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포는 그들의 자갈돌 형태 및 색소의 초기 외형에 의해 가시적으로 인식될 수 있다. 또한, RPE 세포는 배아 줄기 세포 마커, 예컨대 Oct-4 및 NANOG 발현의 실질적인 결여를 기초로 하여, 및 RPE 마커, 예컨대 RPE-65, PEDF, CRALBP, 및 베스트로핀의 발현을 기초로 하여 분자적으로 확인될 수 있다. 따라서, 달리 특정되지 않으면, RPE 세포는 본원에서 사용되는 바와 같이 시험관내에서 만능 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 바 "성숙한 RPE 세포" 및 "성숙한 분화된 RPE 세포"는 RPE 세포의 초기 분화 후에 발생하는 변화를 대체로 의미하기 위해 명세서 전체에 걸쳐 교환가능하게 사용될 수 있다. 구체적으로, RPE 세포는 부분적으로는 초기 색소의 출현을 기초로 하여 인식될 수 있지만, 분화 후에 성숙한 RPE 세포는 향상된 색소침착을 기초로 하여 인식될 수 있다.

본원에서 사용되는 바 "색소화"는 임의의 수준의 색소침착, 예를 들어 RPE 세포가 ES 세포로부터 분화할 때 초기에 발생하는 색소침착을 대체로 의미한다. 색소침착은 세포 밀도 및 분화된 RPE 세포의 성숙에 따라 상이할 수 있다. RPE 세포의 색소침착은 RPE 세포의 말단 분화 후에 평균적인 RPE 세포와 동일할 수 있다. RPE 세포의 색소침착은 RPE 세포의 말단 분화 후에 평균적인 RPE 세포보다 더 큰 색소화일 수 있다. RPE 세포의 색소침착은 말단 분화 후에 평균적인 RPE 세포보다 더 작은 색소화일 수 있다.

본원에서 사용되는 바 질환의 "징후"는 환자의 검사에 의해 발견가능한, 질환을 나타내는 임의의 비정상; 질환의 주관적인 징표인 증상과 달리 질환의 객관적인 징표를 대체로 의미한다.

본원에서 사용되는 바 질환의 "증상"은 환자에 의해 경험되고 질환을 나타내는, 임의의 병적인 현상 또는 구조, 기능, 또는 감각의 이상을 대체로 의미한다.

본원에서 사용되는 바 "요법", "치료", "치료하는", 또는 "치료"는 질환의 치료, 질환 또는 그의 임상 증상의 발생의 정지 또는 감소, 및/또는 질환의 완화, 질환 또는 그의 임상 증상의 경감의 유도를 대체로 의미한다. 요법은 질환, 질환의 징후 및/또는 증상의 예방, 억제, 치료, 치유, 구제, 경감, 완화 및/또는 이로부터의 구제를 포함한다. 요법은 진행중인 질환 징후 및/또는 증상 (예를 들어, 실명, 망막 악화)이 있는 환자에서 징후 및/또는 증상의 완화를 포함한다. 또한, 요법은 "예방" 및 "방지"를 포함한다. 예방은 환자에서 질환의 치료 후에 발생하는 질환의 억제 또는 환자에서 질환의 발생률 또는 중증도의 감소를 포함한다. 요법의 목적상 용어 "감소된"은 징후 및/또는 증상의 임상에서의 유의한 감소를 대체로 의미한다. 요법은 재발 또는 재발 징후 및/또는 증상 (예를 들어, 망막 변성, 시력 저하)의 치료를 포함한다. 요법은 언제든 징후 및/또는 증상의 발생 방해 및 기존의 징후 및/또는 증상의 감소 및 기존의 징후 및/또는 증상의 제거를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 요법은 만성 질환 ("유지") 및 급성 질환의 치료를 포함한다. 예를 들어, 치료는 재발 또는 징후 및/또는 증상 (예를 들어, 실명, 망막 변성)의 재발의 치료 또는 억제를 포함한다.

망막 색소 상피 ( RPE ) 세포

본 발명은, 만능 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포로부터 분화될 수 있으며, 배아 줄기 세포, 성체-유래 RPE 세포, 및 태아-유래 RPE 세포와 분자상 구분되는 RPE 세포를 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도 RPE 세포가 만능 줄기 세포로부터 생산되는 방법이 생성되는 RPE 세포의 구조적 및 기능적 특징을 결정할 때 핵심 인자임을 발견하였다. 본 발명자들은 상기한 방법에 의해 생산되는 RPE 세포가 이전의 방법 및 RPE 세포의 공급원과 상이한 RPE 세포 생성물을 생산함을 밝혀내었다. 예를 들어, 본원에서 기재되는 제조 공정 단계는 상기 세포가 천연 RPE 세포와 밀접하게 유사하고 태아 유래 RPE 세포 또는 RPE 세포주 (예를 들어, APRE19)와 구분되도록 별개의 구조적 및 기능적 특징을 최종 RPE 세포 생성물에 부여한다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포를 생산하는 방법은 ES 세포에 허용되지 않는다. 따라서, ES 세포는 본원에서 기재되는 배양 공정에서 지속될 수 없고, RPE 세포 배양액 및 제제에 허용되지 않는 오염의 위험을 나타내지 않는다.

본 발명에 의해 제공되는 세포 종류는 RPE 세포, RPE 전구 세포, 홍채 색소 상피 (IPE) 세포, 및 다른 시력 연관 신경 세포, 예컨대 개재 (internuncial) 뉴런 (예를 들어, 내핵층 (INL)의 "릴레이" 뉴런) 및 무축삭 (amacrine) 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 망막 세포, 간상세포, 원추세포, 및 각막 세포 및 눈의 혈관계를 제공하는 세포를 제공한다.

RPE 세포는 망막 박리, 망막 이형성증, 또는 망막 위축으로 인한, 또는 범맥락막위축, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성 (연령-관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 및 스타르가르트병 (노란점 안저)과 같은, 광수용체 손상 및 실명을 일으키는 많은 시력-변경 병과 연관된 망막 변성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.

RPE 세포는 비-RPE 세포 종류로 탈분화되지 않는 안정한, 최종적으로 분화된 RPE 세포일 수 있다. 본원에서 기재되는 RPE 세포는 각막, 망막하, 또는 동물 내로의 다른 투여시에 망막 내로 퉁합되는 능력을 특징으로 하는 기능적 RPE 세포일 수 있다.

배아 줄기 세포 (ES) 분화 과정 동안 망막 색소 상피 (RPE)로의 발생기를 특성화하기 위해, 몇몇 검정을 사용하여 각각의 대표적인 발생기에 중요한 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 몇몇의 유전자가 RPE 세포에서 mRNA 및 단백질 수준에서 발현됨이 밝혀졌다. ES 및 RPE 세포 마커의 발현 수준은 예를 들어 PCR (예를 들어, RT-PCT, 정량적 PCR, 실시간 PCR) 또는 노던 (Northern) 블로팅에 의해 mRNA 수준에서, 또는 예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역블롯, 또는 다른 면역검정에 의해 단백질 수준에서 결정될 수 있다.

배아 줄기 세포의 만능성은 부분적으로는 2개의 전사 인자 Oct4 (Pou5f1) 및 NANOG의 미세한 상호 균형에 의해 유지된다. ES 세포 분화 동안, 상기 유전자의 발현은 하향조절되고, 최근의 연구는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 과다메틸화를 원인으로 제시하였다. 상기 유전자의 하나 또는 둘 모두의 발현의 결여는 세포 분화와 연관된 유전자의 전사 활성화를 유발한다. 예를 들어, PAX6은 RPE-특이적 유전자, 예컨대 티로시나제 (Tyr), 및 하류 표적, 예컨대 RPE-65, 베스트로핀, CRALBP, 및 PEDF를 전사시키기 위한 Mit-F 및 Otx2의 협동을 통해 성숙한 RPE 세포를 최종적으로 분화시키기 위해 PAX2와 함께 작용하는 것으로 밝혀졌다.

RPE 세포는 표 5에 나열된 RPE 세포 마커를 발현할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포 유전자 RPE65, PAX2, PAX6, 및 티로시나제, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 MitF의 발현 수준은 천연 생성 RPE 세포에서의 수준과 동등할 수 있다. RPE 세포의 성숙 수준은 적어도 하나의 PAX2, PAX6, 및 티로시나제의 발현, 또는 그 각각의 발현 수준에 의해 평가될 수 있다.

이와 대조적으로, RPE 세포는 표 6에 나열된 ES 세포 마커를 발현하지 않을 수 있다. 예를 들어, ES 세포 유전자 Oct-4, NANOG, 및/또는 Rex-1의 발현 수준은 ES 세포에서보다 RPE 세포에서 약 100-1000배 더 낮을 수 있다. 예를 들어, RPE 세포에는 옥타머 결합 단백질 4 (Pou5f1로도 알려져 있는 Oct-4), 발생 단계 특이적 배아 항원 (SSEA)-3 및 SSEA-4, 종양 거부 항원 (TRA)-1-60, TRA-1-80, 알칼리성 포스파타제, NANOG, 및 Rex-1을 포함하고 이로 제한되지 않는 ES 세포 마커의 발현이 실질적으로 결여될 수 있다. 따라서, ES 세포에 비해, RPE 세포에는 Oct-4, NANOG, 및/또는 Rex-1의 발현이 실질적으로 결여된다,

본원에서 기재되는 RPE 세포는 또한 비배양된 RPE 세포 또는 다른 RPE 세포 제제에 비해 알파 인테그린 서브유닛 1-6 또는 9의 상승된 발현 수준을 보일 수 있다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1, 2, 3, 4, 5, 또는 9의 상승된 발현 수준을 보일 수 있다. 본원에서 기재되는 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1-6의 발현을 촉진하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 망가니즈 및 활성화 모노클로날 항체 (mAb) TS2/16을 포함하고 이로 제한되지 않는 인테그린-활성화제와 함께 배양될 수 있다. 문헌 [Afshari, et al. Brain (2010) 133(2): 448-464] 참조. RPE 세포는 라미닌 (1 ㎍/mL) 상에 도말되고, 적어도 약 8, 12, 24, 36, 또는 48시간 동안 Mn² ⁺ (500 μM)에 노출될 수 있다. 또한, RPE 세포는 몇몇의 계대배양 (예를 들어, 적어도 약 4, 5, 6, 7, 또는 8회의 계대배양)을 위해 배양될 수 있고, 이것은 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시킨다.

표 1은 RPE 세포를 확인하거나 특성화하기 위해 사용될 수 있는 RPE 세포의 일부 특징을 설명한다. 특히, RPE 세포는 정상 핵형을 보이고, RPE 마커를 발현하고, hES 마커를 발현하지 않을 수 있다.

본 발명의 RPE 세포에서 mRNA 및 단백질의 별개의 발현 패턴은 당업계의 세포, 예컨대 hES 세포, ARPE-19 세포, 및 태아의 RPE 세포로부터 상기 RPE 세포를 분리하는 마커의 세트를 구성한다. 구체적으로, 상기 세포는 적어도 하나의 마커의 mRNA 또는 단백질 수준에 의해 평가될 수 있는 발현 또는 발현의 결여를 기초로 하여 확인 또는 특성화될 수 있다는 점에서 상이하다. 예를 들어, RPE 세포는 표 5 또는 6에 나열된 적어도 하나의 마커의 발현 또는 발현의 결여를 기초로 하여 확인 또는 특성화될 수 있다. 또한, 문헌 [Liao, et al. (2010) Human Molecular Genetics 19(21): 4229-38] 참조. 또한, RPE 세포는 그들의 구조적 특성에 따라 확인 및 특성화되고, 또한 다른 세포로부터 구별될 수 있다. 따라서, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 hES 세포, 태아의 RPE 세포, 또는 ARPE-19 세포에서 발현되지 않은 다중 유전자를 발현하였다. WO 2009/051671; 문헌 [Dunn, et al. (1996) Exp Eye Res. 62(2): 155-169] 참조.

또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 세포의 색소침착 정도를 기초로 하여 확인 또는 특성화될 수 있다. 분화 후 색소침착은 세포의 RPE 상태의 변화를 나타내지 않는다 (예를 들어, 세포는 계속 분화된 RPE 세포이다). 오히려, 분화 후 색소의 변화는 RPE 세포가 배양되고 유지되는 밀도에 상응한다. 성숙한 RPE 세포는 초기 분화 후에 증가된 색소침착을 갖는다. 예를 들어, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 분화된 RPE 세포에 비해 증가된 색소침착을 갖는 성숙한 RPE 세포일 수 있다. 신속하게 분열하는 분화된 RPE 세포는 약하게 색소화된다. 그러나, 세포 밀도가 최대 용량에 도달할 때, 또는 RPE 세포가 특이적으로 성숙할 때, RPE는 그의 특징적인 표현형의 육각형 형태를 취하고, 멜라닌 및 리포푸신의 축적에 의해 색소침착 수준을 증가시킨다. 따라서, 색소침착의 초기 축적은 RPE 분화의 표시자로서 기능하고, 세포 밀도와 연관된 증가된 색소침착은 RPE 성숙의 표시자로서 기능한다. 예를 들어, RPE 세포는 적어도 어느 정도로 색소화될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 인간 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있고, 이 세포는 색소화되고, 인간 망막 색소 상피 세포가 아닌 세포에서는 발현되지 않는 적어도 하나의 유전자를 발현한다.

성숙한 RPE 세포는 색소침착이 감소하도록 보다 낮은 밀도에서 계대배양될 수 있다. 이와 관련하여, 성숙한 RPE 세포는 RPE 세포를 생산하도록 배양될 수 있다. 상기 RPE 세포는 RPE 분화의 마커를 발현하는 계속 분화된 RPE 세포이다. 따라서, RPE 세포가 분화를 시작할 때 발생하는 색소침착의 초기 발생과 대조적으로, 분화 후 색소침착 변화는 현상학적 (phenomenological) 변화이고, RPE 운명과 벗어난 세포의 탈분화를 반영하지 않는다.

본원에서 기재되는 RPE 세포는 시험관내에서 오랜 기간 동안 그의 표현형을 유지할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 그의 표현형을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회의 계대배양 동안 유지할 수 있다. RPE 세포는 그의 표현형을 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 유지할 수 있다. RPE 세포는 그의 표현형을 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 동안 유지할 수 있다.

또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 이식 후에 그의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 이식 후에 수여자의 수명 동안 그의 표현형을 유지할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 이식 후에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 그의 표현형을 유지할 수 있다. 또한, RPE 세포는 이식 후에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 동안 그의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 이식 후에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 그의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 이식 후에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20년 동안 그의 표현형을 유지할 수 있다.

RPE 세포는 신생혈관형성을 방지하는 능력이 증가되어 있다. RPE 세포는 텔로머라제가 단축되어 적어도 10%의 세포의 정상 복제 수명이 경과하도록 환자로부터의 체세포를 노화시키고 상기 체세포를 혈관신생 억제제, 예컨대 색소 상피 유래 인자 (PEDF/EPC-1)를 과다발현하는 세포를 생성하기 위해 핵 전달 공여자 세포로서 사용함으로써 생성될 수 있다. 별법으로, 상기 세포는 신생혈관형성을 억제하는 외인성 유전자로 유전적으로 변형될 수 있다.

RPE 세포의 제제

본 발명은 RPE 세포의 제제를 제공한다. 본원에서 기재되는 발명은 RPE 세포, RPE 세포의 실질적으로 정제된 집단, RPE 세포를 포함하는 제약 제제, 및 RPE 세포의 동결보존된 제제를 제공한다. 본원에서 기재되는 RPE 세포에는 적어도 하나의 단백질, 분자, 또는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 불순물이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다 (예를 들어, "단리됨"). RPE 세포는 인간 RPE 세포를 포함하는 포유동물 세포일 수 있다. 본 발명은 또한 인간 RPE 세포, 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 집단, 인간 RPE 세포를 포함하는 제약 제제, 및 인간 RPE 세포의 동결보존된 제제를 제공한다. 제제는 인간 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포, 인간 iPS 세포-유래 RPE 세포를 포함하는 제제, 및 분화된 ES-유래 RPE 세포를 포함하는 실질적으로 정제된 (비-RPE 세포에 대해) 제제일 수 있다.

RPE 세포 집단은 상이한 성숙 수준의 분화된 RPE 세포를 포함할 수 있거나, 또는 특정 성숙 수준의 분화된 RPE 세포에 대해 실질적으로 순수할 수 있다. RPE 세포는 상이한 성숙/색소침착 수준의 RPE 세포를 포함하는 실질적으로 정제된 제제일 수 있다. 예를 들어, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액은 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포를 모두 함유할 수 있다. 성숙한 RPE 세포 중에서, 색소의 수준은 상이할 수 있다. 그러나, 성숙한 RPE 세포는 색소침착의 증가된 수준 및 보다 원주인 형태를 기초로 하여 RPE 세포와 가시적으로 구별될 수 있다. RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 상이한 성숙 수준의 RPE 세포 (예를 들어, 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포)를 포함한다. 상기 예에서, 색소침착을 나타내는 마커의 발현에 대해 제제에 걸쳐 가변성이 존재할 수 있다. 세포 배양액 내의 RPE 세포의 색소침착은 균질할 수 있다. 또한, 세포 배양액 내의 RPE 세포의 색소침착은 불균질할 수 있고, RPE 세포의 배양액은 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포를 모두 포함할 수 있다. RPE 세포를 포함하는 제제는 비-RPE 세포 종류에 대해 실질적으로 순수하지만 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포의 혼합물을 함유하는 제제를 포함한다. RPE 세포를 포함하는 제제는 또한 비-RPE 세포 종류 및 다른 성숙 수준의 RPE 세포 모두에 대해 실질적으로 순수한 제제를 포함한다.

배양액 내의 성숙한 분화된 RPE 세포의 비율은 배양액의 밀도를 저하시킴으로써 감소될 수 있다. 따라서, 본원에서 기재되는 방법은 보다 작은 비율의 성숙한 RPE 세포를 함유하는 배양액을 생산하기 위해 성숙한 RPE 세포의 집단의 계대배양을 추가로 포함할 수 있다. 제제 내의 RPE 세포의 수는 성숙 수준과 무관하게 및 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포의 상대적인 비율과 무관하게 분화된 RPE 세포를 포함한다. 제제 내의 RPE 세포의 수는 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 RPE 세포의 수를 의미한다. 제제는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 분화된 RPE 세포를 포함할 수 있다. 제제는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 성숙한 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 혼합된 집단을 포함할 수 있다.

본 발명은 색소화되고, 인간 RPE가 아닌 세포에서는 발현되지 않는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 인간 RPE 세포를 포함하는 세포 배양액을 제공한다. 예를 들어, 상기 RPE 세포는 천연 인간 RPE 세포와 실질적으로 동일한 RPE65, PEDF, CRALBP, 및 베스트로핀의 발현을 가질 수 있다. RPE 세포는 성숙 수준에 따라 PAX2, Pax-6, MitF, 및/또는 티로시나제 중의 하나 이상의 발현에 대해 상이할 수 있다. 또한, 분화 후 색소침착의 변화가 PAX2 발현의 변화와 상관관계가 있음에 주목한다. 성숙한 RPE 세포는 색소침착 수준, PAX2, Pax-6, 및/또는 티로시나제의 발현 수준에 의해 RPE 세포와 구별될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 RPE 세포는 RPE 세포에 비해 보다 높은 색소침착 수준 또는 PAX2, Pax-6, 및/또는 티로시나제의 보다 높은 발현 수준을 가질 수 있다.

적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% RPE 세포를 포함하는 제제는 비-RPE 세포에 대해 실질적으로 정제될 수 있다. RPE 세포 제제에는 본질적으로 비-RPE 세포가 존재하지 않거나 또는 RPE 세포로 이루어질 수 있다. 예를 들어, RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 비-RPE 세포 종류를 포함할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포 제제는 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, 또는 0.0001% 미만의 비-RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 제제는 비-RPE 세포 및 다른 성숙 수준의 RPE 세포 모두에 대해 실질적으로 순수할 수 있다. 제제는 비-RPE 세포에 대해 실질적으로 정제될 수 있고, 성숙한 RPE 세포에 대해 농축될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 RPE 세포에 대해 농축된 RPE 세포 제제에서, 적어도 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100%의 RPE 세포는 성숙한 RPE 세포이다. 제제는 비-RPE 세포에 대해 실질적으로 정제될 수 있고, 성숙한 RPE 세포보다 분화된 RPE 세포에 대해 농축될 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 RPE 세포는 성숙한 RPE 세포가 아니라 분화된 RPE 세포일 수 있다.

RPE 세포 제제는 적어도 약 1x10³, 2x10³, 3x10³, 4x10³, 5x10³, 6x10³, 7x10³, 8x10³, 9x10³, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000-10,000, 50,000-100,000, 100,000-200,000, 200,000-500,000, 300,000-500,000, 또는 400,000-500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 20,000-50,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 제제는 적어도 약 1x10³, 2x10³, 3x10³, 4x10³, 5x10³, 6x10³, 7x10³, 8x10³, 9x10³, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000-10,000, 50,000-100,000, 100,000-200,000, 200,000-500,000, 300,000-500,000, 또는 400,000-500,000개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 20,000-50,000개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다.

본원에서 기재되는 제제에는 HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, CMV, HTLV-1, HTLV-2, 파르보바이러스 B19, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스, 또는 헤르페스바이러스 6의 존재를 포함하고 이로 제한되지 않는 박테리아, 바이러스, 또는 진균 오염 또는 감염이 실질적으로 없을 수 있다. 본원에서 기재되는 제제에는 미코플라스마 오염 또는 감염이 실질적으로 없을 수 있다.

또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 이식 후에 기능적 RPE 세포로서 작용할 수 있고, 여기서 RPE 세포는 이식된 세포를 받은 환자에서 감각신경 망막과 맥락막 사이에 단층을 형성한다. RPE 세포는 또한 영양소를 인접한 광수용체에 공급하고 식세포작용에 의해 흘린 (shed) 광수용체 외부 세그먼트를 처리할 수 있다. 추가로, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 눈 공여자로부터 유래된 세포보다 더 적은 노화를 겪을 수 있다 (예를 들어, RPE 세포는 눈 공여자의 것보다 "더 젊다"). 이 때문에, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 눈 공여자로부터 유래된 세포보다 더 긴 유용 수명을 가질 수 있다.

우수 의약품 제조 기준 (GMP) (예를 들어, 제제는 GMP-부합성임) 및/또는 현재의 우수 조직 관리 기준 (GTP) (예를 들어, 제제는 GTP-부합성일 수 있음)에 따라 RPE 세포를 포함하는 제제를 제조할 수 있다.

RPE 세포 배양액

본 발명은 또한 인간 RPE 세포를 포함하는 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 제공한다. 본원에서 기재되는 RPE 배양액은 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; 또는 9,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 배양액은 적어도 약 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포는 성숙한 RPE 세포의 배양액을 생산하기 위해 추가로 배양된다. RPE 세포는 성숙될 수 있고, 요구되는 성숙 수준이 얻어질 때까지 RPE 세포를 예를 들어 MDBK-MM 배지 내에서 추가로 배양할 수 있다. 이것은 성숙 동안 색소침착 수준의 증가를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. MDBK-MM 배지에 대한 대안으로서, 기능적으로 동등하거나 유사한 배지를 사용할 수 있다. RPE 세포의 성숙을 위해 사용된 특정 배지에 무관하게, 배지는 임의로 성장 인자 또는 작용제로 보충될 수 있다. RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포 둘 모두가 분화된 RPE 세포이다. 그러나, 성숙한 RPE 세포는 분화된 RPE 세포에 비해 증가된 색소 수준을 특징으로 한다. 성숙 수준 및 색소침착은 분화된 RPE 세포의 배양 밀도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조정될 수 있다. 따라서, RPE 세포의 배양액은 성숙한 RPE 세포를 생산하기 위해 추가로 배양될 수 있다. 별법으로, 성숙한 RPE 세포를 함유하는 배양액의 밀도는 성숙한 분화된 RPE 세포의 비율을 감소시키고 분화된 RPE 세포의 비율을 증가시키기 위해 감소될 수 있다.

RPE 세포는 상기 세포의 메신저 RNA 전사체를 생체내에서 유도된 세포와 비교함으로써 확인될 수 있다. 세포의 분취액은 배아 줄기 세포의 RPE 세포로의 분화 동안 다양한 간격으로 채취하고, 상기한 임의의 마커의 발현을 위해 분석된다. 상기 특징을 통해 분화된 RPE 세포를 구별할 수 있다.

RPE 세포 배양액은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 또는 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 분화된 RPE 세포를 포함하는 실질적으로 정제된 배양액일 수 있다. 실질적으로 정제된 배양액은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 또는 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 성숙한 분화된 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 배양액은 우수 의약품 제조 기준 (GMP) (예를 들어, 배양액은 GMP-부합성임) 및/또는 현재의 우수 조직 관리 기준 (GTP) (예를 들어, 배양액은 GTP-부합성일 수 있음)에 따라 제조할 수 있다.

RPE 세포의 동결보존된 제제

RPE 세포는 저장을 위해 동결될 수 있다. RPE 세포는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법 (예를 들어, 극저온 동결)에 의해 저장될 수 있고, 세포의 저장을 위해 임의의 적절한 온도에서 동결될 수 있다. 예를 들어, 세포는 약 -20℃, -80℃, -120℃, -130℃, -135℃, -140℃, -150℃, -160℃, -170℃, -180℃, -190℃, -196℃에서, 세포의 저장을 위해 적절한 임의의 다른 온도에서 동결될 수 있다. 극저온 동결된 세포는 적절한 용기에 저장되고, 세포 손상 위험을 감소시키고 세포가 해동시 생존할 가능성을 최대화하기 위해 저장을 위해 제조될 수 있다. RPE 세포는 분화 후에, 시험관내 성숙 후에, 또는 일정 시간 배양 후에 즉시 동결보존될 수 있다. 또한, RPE 세포는 실온에서 유지되거나, 또는 예를 들어 약 4℃에서 냉장될 수 있다.

이와 유사하게, RPE 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다. RPE 세포는 수거되고, 완충제 또는 배지 내에 세척하고, 계수하고, 농축시키고 (원심분리를 통해), 동결 매질 (예를 들어, 90% FBS/10% DMSO) 내에 제형화될 수 있거나, 또는 상기 단계의 임의의 조합으로 처리될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포를 몇몇 배양 용기 내에 시딩하고 연속 팽창시킬 수 있다. RPE 세포를 수거하고 약 4℃에서 FBS 내에 유지하면서, RPE 세포의 몇몇의 플라스크는 단일 로트로 조합된다. 또한, RPE 세포는 염수 용액 (예를 들어, DPBS)으로 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 세척될 수 있다. 또한, RPE 세포는 디스트로핀이 세포 막에서 조직화되고 PAX6 발현이 낮은 후에 동결보존될 수 있다. 추가로, 바이알은 1차 및/또는 2차 라벨로 표지될 수 있다. 라벨 상의 정보는 세포의 종류 (예를 들어, hRPE 세포), 로트 번호 및 일자, 세포의 수 (예를 들어, 1x10⁶개 세포/mL), 유효 기간 (예를 들어, 바이알이 그 이전에 사용되어야 하는 권장 일자), 제조 정보 (예를 들어, 명칭 및 주소), 주의 사항, 및 저장 수단 (예를 들어, 액체 질소 내의 저장)을 포함할 수 있다.

본원에서 기재되는 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 50,000-100,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 20,000-500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 또는 100,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 또는 9x10⁹개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존된 RPE 세포 제제의 RPE 세포는 인간 RPE 세포를 포함하는 포유동물 RPE 세포일 수 있다.

또한, 본원에서 기재되는 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 50,000-100,000개의 RPE 세포/mL을 포함할 수 있다. 또한, 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 20,000-500,000개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 또한,동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 및 100,000개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존된 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰개의 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존된 RPE 세포 제제의 RPE 세포는 인간 RPE 세포를 포함하는 포유동물 RPE 세포일 수 있다.

본 발명의 RPE 세포는 동결보존 후에 저장으로부터 회복될 수 있다. 또한, 동결보존으로부터 회복된 RPE 세포는 그의 생존력 및 분화 상태를 유지한다. 예를 들어, 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 RPE 세포는 동결보존 후에 생존력 및 분화를 유지할 수 있다. 또한, 본 발명의 RPE 세포는 동결보존되고, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 저장된 후에 그의 생존력을 유지할 수 있다. 본 발명의 RPE 세포는 또한 동결보존되고, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 저장된 후에 그의 생존력을 유지할 수 있다. 본 발명의 RPE 세포는 동결보존되고, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7년 동안 저장된 후에 그의 생존력을 유지할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 RPE 세포는 적어도 약 4년 동안 동결보존되고, 적어도 약 80% 생존력을 보일 수 있다. RPE 세포를 포함하는 동결보존 제제에는 DMSO가 실질적으로 없을 수 있다.

RPE 세포의 생산 방법

본 발명은 만능 줄기 세포로부터 RPE 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하여 생산할 수 있는 세포 종류는 RPE 세포, RPE 전구 세포, 홍채 색소 상피 (IPE) 세포, 및 다른 시력 연관 신경 세포, 예컨대 개재 뉴런 (예를 들어, 내핵층 (INL)의 "릴레이" 뉴런) 및 무축삭 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 추가로, 망막 세포, 간상세포, 원추세포, 및 각막 세포가 생산될 수 있다. 또한, 눈의 혈관계를 제공하는 세포가 본원에서 기재되는 방법에 의해 생산될 수 있다.

특정 이론에 매이지 않으면서, 본 발명자들은 본원에서 기재되는 방법이 페어드-박스 (Paired-box) 6 (PAX6) 전사 인자의 발현을 유도하기 위해 MAP-키나제 및 잠재적인 C-Jun 말단 키나제 경로의 신호를 전달하기 위해 FGF, EGF, WNT4, TGF-베타, 및/또는 산화적 스트레스를 통해 작용할 수 있음을 밝혀냈다. PAX6은 RPE-특이적 유전자, 예컨대 티로시나제 (Tyr), 및 하류 표적, 예컨대 RPE-65, 베스트로핀, CRALBP, 및 PEDF를 전사시키기 위한 Mit-F 및 Otx2의 협동을 통해 성숙한 RPE 세포를 최종적으로 분화시키기 위해 PAX2와 함께 상승적으로 작용한다. WO 2009/051671, 도 1 참조.

본원에서 기재되는 RPE 세포는 만능 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포로부터 분화될 수 있고, 배아 줄기 세포, 성체-유래 RPE 세포, 및 태아-유래 RPE 세포와 분자상 구분된다. 본 발명자들은 놀랍게도 RPE 세포가 만능 줄기 세포로부터 생산되는 방법이 생성되는 RPE 세포의 구조적 및 기능적 특징을 결정할 때 핵심 인자임을 발견하였다. 본 발명자들은 상기한 방법에 의해 생산되는 RPE 세포가 이전의 방법 및 RPE 세포의 공급원과 상이한 RPE 세포 생성물을 생산함을 밝혀내었다. 예를 들어, 본원에서 기재되는 제조 공정 단계는 상기 세포가 천연 RPE 세포와 밀접하게 유사하고 태아 유래 RPE 세포 또는 RPE 세포주 (예를 들어, APRE19)와 구분되도록 별개의 구조적 및 기능적 특징을 최종 RPE 세포 생성물에 부여한다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포를 생산하는 방법은 ES 세포에 허용되지 않는다. 따라서, ES 세포는 본원에서 기재되는 배양 공정에서 지속될 수 없고, RPE 세포 배양액 및 제제에 허용되지 않는 오염의 위험을 나타내지 않는다.

본 발명은 (a) 만능 줄기 세포를 제공하고; (b) 만능 줄기 세포를 영양소 풍부 저 단백질 배지 내에서 배상체로서 배양하고, 여기서 배지는 임의로 혈청 비함유 B-27 보충물을 포함하고; (c) 배상체를 영양소 풍부 저 단백질 배지 내에서 부착 배양액으로서 배양하고, 여기서 배지는 임의로 혈청 비함유 B-27 보충물을 포함하고; (d) (c)의 세포의 부착 배양액을 영양소 풍부 저 단백질 배지 내에서 배양하고, 여기서 배지는 혈청 비함유 B-27 보충물을 포함하지 않고; (e) 고밀도 체세포 배양액의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (d)의 세포를 배양하고, 이에 의해 RPE 세포가 세포의 배양액에 나타나고; (f) (e)의 배양액을 효소와 접촉시키고; (g) 배양액으로부터 RPE 세포를 선택하고, RPE 세포를 성장 인자를 보충한 배지를 함유하는 별개의 배양액으로 옮겨 RPE 세포의 농축 배양액을 생산하고; (h) RPE 세포의 농축 배양액을 증식시켜 RPE 세포를 생산하는 것을 포함하는, RPE 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법 단계는 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하기 위해 적어도 1회 수행될 수 있다. 또한, 상기 방법 단계는 보다 많은 RPE 세포를 생산하기 위해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 반복될 수 있다.

추가로, 본 발명은 또한 (a) 만능 줄기 세포를 제공하고; (b) 만능 줄기 세포를 영양소 풍부 저 단백질 배지 내에서 배상체로서 배양하고, 여기서 배지는 임의로 혈청 비함유 B-27 보충물을 포함하고; (c) 배상체를 영양소 풍부 저 단백질 배지 내에서 부착 배양액으로서 배양하고, 여기서 배지는 임의로 혈청 비함유 B-27 보충물을 포함하고; (d) 단계 (c)의 세포의 부착 배양액을 영양소 풍부 저 단백질 배지 내에서 배양하고, 여기서 배지는 혈청 비함유 B-27 보충물을 포함하지 않고; (e) 고밀도 체세포 배양액의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (d)의 세포를 배양하고, 이에 의해 RPE 세포가 세포의 배양액에 나타나고; (f) (e)의 배양액을 효소와 접촉시키고; (g) 배양액으로부터 RPE 세포를 선택하고, RPE 세포를 성장 인자를 보충한 배지를 함유하는 별개의 배양액으로 옮겨 RPE 세포의 농축 배양액을 생산하고; (h) RPE 세포의 농축 배양액을 증식시키고; (i) RPE 세포의 농축 배양액을 배양하여 성숙한 RPE 세포를 생산하는 것을 포함하는, 성숙한 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법 단계는 성숙한 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하기 위해 적어도 1회 수행될 수 있다. 또한, 상기 방법 단계는 보다 많은 성숙한 RPE 세포를 생산하기 위해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 반복될 수 있다.

임의의 연결된 단계를 위해, 세포는 적어도 약 1-10주 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 적어도 약 3-6주 동안 배양될 수 있다. 임의의 연결된 단계를 위해, 세포는 약 1일 내지 50일, 예를 들어, 적어도 약 1-3, 3-4, 7, 4-9, 7-10, 7-12, 8-11, 9-12, 7-14, 14-21, 및 3-45일 동안 배양될 수 있다. 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50일 동안 배양될 수 있다. 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 8, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 2-4 및 3-6시간 동안 배양될 수 있다. 각각의 상기 연결된 방법 단계를 위해, 세포는 각각의 단계에서 동일한 시간 동안 또는 하나 이상의 단계에서 상이한 시간 동안 배양될 수 있다. 추가로, 임의의 상기 연결된 방법 단계는 보다 많은 RPE 세포를 생산하기 위해 반복될 수 있다 (예를 들어, 매우 많은 RPE 세포를 생산하기 위해 규모가 확대될 수 있다).

본원에서 기재되는 방법에서, RPE 세포는 EB의 부착 배양액 내의 세포 중에서 분화하기 시작할 수 있다. RPE 세포는 그들의 자갈돌 형태 및 색소침착의 초기 발생을 기초로 하여 가시적으로 인식될 수 있다. RPE 세포가 계속 분화하면서, RPE 세포의 집합체가 관찰될 수 있다. 도 4 참조.

배상체의 배양액 내의 비-RPE 세포의 집합체 중에서 RPE 세포를 선택하거나, 또는 부착 세포의 계대배양을 용이하게 하기 위해서 기계적 또는 효소적 방법을 사용한다. 예시적인 기계적 방법은 피펫을 사용한 적정 또는 바늘을 사용한 절단을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 효소적 방법은 세포 해리를 위한 적절한 임의의 효소 (예를 들어, 트립신 (예를 들어, 트립신/EDTA), 콜라게나제 (예를 들어, 콜라게나제 B, 콜라게나제 IV), 디스파제, 파파인, 콜라게나제와 디스파제의 혼합물, 콜라게나제와 트립신의 혼합물)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 비-효소 용액, 예컨대 고 EDTA-함유 용액, 예를 들어 행크 (Hanks) 기반 세포 해리 완충제가 세포를 해리하기 위해 사용된다.

RPE 세포는 배상체로부터 분화한다. EB로부터 RPE 세포의 단리는 시험관내에서 농축 배양액 내에서의 RPE 세포의 팽창을 허용한다. 인간 세포에 대해, RPE 세포는 90일 미만 동안 성장한 EB로부터 얻을 수 있다. 또한, RPE 세포는 적어도 약 7-14일 동안, 14-28일 동안, 28-45일 동안, 또는 45-90일 동안 성장한 인간 EB에서 발생할 수 있다. 만능 줄기 세포, 배상체, 및 RPE 세포를 배양하기 위해 사용된 배지를 임의의 간격에서 제거하고/하거나 동일한 또는 상이한 배지로 교체할 수 있다. 예를 들어, 배지는 적어도 약 0-7일, 7-10일, 10-14일, 14-28일, 또는 28-90일 후에 제거 및/또는 교체될 수 있다. 또한, 배지는 적어도 매일, 격일로, 또는 적어도 3일마다 교체될 수 있다.

RPE 세포를 농축하고 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 확립하기 위해, RPE 세포는 기계적 및/또는 화학적 방법을 사용하여 서로 및 비-RPE 세포로부터 해리된다. 이어서, RPE 세포의 농축된 집단을 제공하기 위해 RPE 세포의 현탁액을 새로운 배지 및 새로운 배양 용기에 옮길 수 있다. 도 5 참조.

RPE 세포는 해리된 세포로부터 선택되고, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하기 위해 별개로 배양될 수 있다. RPE 세포는 RPE 세포와 연관된 특징을 기초로 하여 선택된다. 예를 들어, RPE 세포는 자갈돌 세포 형태 및 색소침착에 의해 인식될 수 있다. 추가로, 세포성 레틴알데히드-결합 단백질 (CRALBP) (첨단부 미세융모 내에서도 발견되는 세포질 단백질); RPE65 (레티노이드 대사에 관여하는 세포질 단백질); 베스트로핀 (베스트 난황형 황반 이영양증 유전자 (VMD2)의 생성물), 및 색소 상피 유래 인자 (PEDF) (혈관억제 특성이 있는 48 kD 분비형 단백질)를 비롯하여 몇몇의 공지의 RPE 마커가 존재한다. 상기 마커의 메신저 RNA 전사체는 PCR (예를 들어, RT-PCR) 또는 노던 블롯을 사용하여 검정될 수 있다. 또한, 상기 마커의 단백질 수준은 면역블롯 기술 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 검정될 수 있다.

RPE 세포는 또한 세포 기능을 기초로 하여, 예컨대 흘린 간상세포 및 원추세포 외부 세그먼트의 식세포작용, 미광의 흡수, 비타민 A 대사, 레티노이드의 재생, 및 조직 복구에 의해 선택될 수 있다. 또한, 평가는 거동 시험, 형광 혈관조영술, 조직학, 폐쇄소대 (tight junctions) 전도성, 또는 전자 현미경을 사용한 평가를 사용하여 수행될 수 있다.

RPE 세포의 농축 배양액은 적절한 배지, 예를 들어, EGM-2 배지에서 배양될 수 있다. 상기 또는 기능적으로 동등하거나 유사한 배지는 성장 인자 또는 물질 (예를 들어, bFGF, 헤파린, 히드로코르티손, 혈관 내피 성장 인자, 재조합 인슐린-유사 성장 인자, 아스코르브산, 또는 인간 표피 성장 인자)로 보충될 수 있다. RPE 세포는 배양시에 장기간 (예를 들어, > 6주)에 걸쳐 표현형이 안정할 수 있다.

만능 줄기 세포

본원에서 기재되는 방법은 RPE 세포를 생산하기 위해 만능 줄기 세포를 사용할 수 있다. 적합한 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 배아-유래 줄기 세포, 및 유도 만능 줄기 세포 (만능 줄기 세포가 유도되는 방법과 무관함)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 만능 줄기 세포는 예를 들어 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예시적인 만능 줄기 세포는 포배기 배아의 내세포괴 (ICM)로부터 유래된 배아 줄기 세포, 및 난할기 또는 상실배기 배아 (임의로 나머지 배아를 파괴하지 않으면서)의 하나 이상의 할구로부터 유래된 배아 줄기 세포를 포함한다. 상기 배아 줄기 세포는 수정에 의해 또는 무성 수단, 예를 들어 체세포 핵 전달 (SCNT), 처녀생식, 세포 재프로그래밍, 및 동정생식에 의해 생산되는 배아 물질로부터 생성될 수 있다. 또한, 적합한 만능 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포, 인간 배아-유래 줄기 세포, 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (만능 줄기 세포가 유도되는 방법과 무관함)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

만능 줄기 세포 (예를 들어, hES 세포)는 배상체 (EB)를 생산하기 위해 현탁 배양액으로서 배양할 수 있다. 배상체는 약 7-14일 동안 현탁액에서 배양될 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, EB는 7일 미만 동안 (7, 6, 5, 4, 3, 2일 미만, 또는 1일 미만) 또는 14일 초과 동안 현탁액에서 배양될 수 있다. EB를 B-27 보충물을 보충한 배지 내에서 배양할 수 있다.

EB를 현탁 배양액에서 배양한 후, EB를 부착 배양액을 생산하기 위해 이송할 수 있다. 예를 들어, EB를 배지 내에서 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 도말할 수 있다. 부착 배양액으로서 배양될 때, EB는 현탁액 내에서 성장될 때와 동일한 종류의 배지 내에서 배양할 수 있다. 배지는 세포를 부착 배양액으로서 배양할 때 B-27 보충물로 보충되지 않을 수 있다. 또한, 배지는 초기에 (예를 들어, 약 7일 이하 동안) B-27로 보충되지만, 나머지 기간 동안 B-27의 부재 하에 부착 배양액으로서 배양된다. EB는 부착 배양액으로서 적어도 약 14-28일 동안 배양할 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, EB는 약 14일 미만 (14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 미만, 또는 1일 미만) 또는 약 28일 초과 동안 부착 배양액으로서 배양할 수 있다.

인간 배아 줄기 세포

인간 배아 줄기 (hES) 세포는 본원에서 기재되는 방법에서 만능 줄기 세포로서 사용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포 (hES)는 포배의 내세포괴 (ICM)의 자손체이고, 실질적으로 무한적으로 만능 상태로 유지될 수 있다. hES 세포는 임의로 배아를 파괴하지 않으면서 초기 난할기 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래될 수 있다. hES 세포는 예컨대 피더 세포의 존재 또는 부재 하에 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양할 수 있다. 예를 들어, hES 세포는 MDBK-GM, hESC 배지, 인비트로젠(INVITROGEN)® 줄기 세포 배지, 옵티프로 SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM에서 배양될 수 있다 (Stem Cell Information (Culture of Human Embryonic Stem Cells (hESC)) [NIH website, 2010] 참조). hES 세포는 GMP 기준에 따라 사용되고 유지될 수 있다.

규정된 조건에서 피더층 상에서 배양액 내에서 성장될 때, hES 세포는 특이적 형태를 유지하여, 핵 대 세포질의 높은 비, 세포 사이의 투명한 경계, 및 예리한 굴절가능한 콜로니 경계를 갖는, 작은 치밀하게 밀집된 세포로 이루어진 평평한 콜로니를 형성한다. hES 세포는 분자 마커의 세트, 예컨대 옥타머 결합 단백질 4 (Pou5f1로도 알려져 있는 Oct-4), 발생 단계 특이적 배아 항원 (SSEA)-3 및 SSEA-4, 종양 거부 항원 (TRA)-1-60, TRA-1-80, 알칼리성 포스파타제, NANOG, 및 Rex-1을 발현한다. 소정의 계통으로 분화하는 ICM의 세포와 유사하게, 배양액 내의 hES 세포는 분화를 위해 유도될 수 있다. 예를 들어, hES 세포는 본원에서 기재되는 규정된 조건 하에서 인간 RPE로 분화될 수 있다.

인간 ES 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, hES 세포는 난자 및 정자의 시험관내 수정의 생성물인 포배기 배아로부터 유래될 수 있다. 별법으로, hES 세포는 임의로 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 초기 난할기 배아로부터 제거된 하나 이상의 할구로부터 유래될 수 있다. hES 세포는 핵 전달을 사용하여 생성될 수 있다. 또한, 동결보존된 hES 세포를 사용할 수 있다.

사용될 수 있는 인간 배아 줄기 세포는 MA01, MA09, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 배아 줄기 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (또한, NIH 인간 배아 줄기 세포 등록소 참조). 사용될 수 있는 예시적인 인간 배아 줄기 세포주는 MA09 세포이다. MA09 세포의 단리 및 제조는 이전에 문헌 [Klimanskaya, et al. (2006) "Human Embryonic Stem Cell lines Derived from Single Blastomeres." Nature 444: 481-485]에 기재되었다.

hES 세포는 초기에 뮤린 피더 지지 (MEF) 세포와 동시-배양할 수 있다. MEF 세포는 동시-배양액 내에 hES 세포를 접종하기 전에 미토마이신 C에 노출시켜 유사분열을 불활성화시킬 수 있고, 따라서 MEF는 배양액 내에서 번식하지 않는다. 도 1 참조. 추가로, hES 세포 배양액을 현미경으로 검사하고, 비-hES 세포 형태를 함유하는 콜로니는 줄기 세포 절단 도구를 사용하여 집어서 폐기한다. 도 2 참조. 배상체 형성을 위한 접종을 위해 hES 세포의 수거 후에, 추가의 MEF 세포가 방법에 사용되지 않는다. 도 3 참조. MEF 제거와 본원에서 기재되는 RPE 세포 수거 사이의 시간은 MEF-비함유 세포 배양액 내에서 최소한 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회의 계대배양 및 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100일일 수 있다. 또한, MEF 제거와 RPE 세포 수거 사이의 시간은 MEF-비함유 세포 배양액 내에서 최소한 적어도 약 3회의 계대배양 및 적어도 약 80-90일일 수 있다. 본원에서 기재되는 생산 방법에 의해, 본원에서 기재되는 RPE 세포 배양액 및 제제에는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 및 인간 배아 줄기 세포 (hES)가 실질적으로 없을 수 있다.

유도 만능 줄기 세포 ( iPS 세포)

추가의 예시적인 만능 줄기 세포는 인자 ("재프로그래밍 인자")의 조합물의 발현 또는 발현 유도에 의해 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성되는 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포)를 포함한다. iPS 세포는 태아, 출생후, 신생아, 소아, 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. iPS 세포는 세포 은행으로부터 얻을 수 있다. 별법으로, IPS 세포는 RPE 세포로의 분화 개시 전에 당업계에 공지된 방법에 의해 새로 생성될 수 있다. iPS 세포의 제조는 RPE 세포의 생산에서 초기 단계일 수 있다. iPS 세포는 특정 환자 또는 조직-일치 RPE 세포를 생성하기 위한 목적으로 일치된 공여자로부터의 물질을 사용하여 특이적으로 생성될 수 있다. iPS 세포는 실질적으로 면역원성이 아닌 보편적인 공여자 세포이다.

유도 만능 줄기 세포는 체세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 발현 또는 발현의 유도에 의해 생산될 수 있다. 체세포는 섬유모세포, 예컨대 피부 섬유모세포, 활액 섬유모세포, 또는 폐 섬유모세포, 또는 비-섬유모세포성 체세포이다. 체세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 인자를 발현함으로써 재프로그래밍된다. 재프로그래밍 인자는 Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, c-Myc, 및 Klf4로부터 선택될 수 있다. 재프로그래밍 인자의 발현은 체세포를 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 적어도 하나의 물질, 예컨대 작은 유기 분자 물질과 접촉시킴으로써 유도될 수 있다.

또한, 체세포는 재프로그래밍 인자가 발현되고 (예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용하여) 재프로그래밍 인자의 발현이 유도되는 (예를 들어, 작은 유기 분자를 사용하여) 조합 접근법을 사용하여 재프로그래밍될 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍 인자는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 체세포에서 발현될 수 있다. 또한, 재프로그래밍 인자는 비-통합 벡터, 예컨대 에피좀 플라스미드를 사용하여 체세포에서 발현될 수 있다. 재프로그래밍 인자가 비-통합 벡터를 사용하여 발현될 때, 인자는 체세포의 전기천공, 형질감염, 또는 벡터를 사용한 형질전환을 사용하여 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 마우스 세포에서, 통합 바이러스 벡터를 사용한 4개의 인자 (Oct3/4, Sox2, c-myc, 및 Klf4)의 발현이 체세포의 재프로그래밍을 위해 충분하다. 인간 세포에서, 통합 바이러스 벡터를 사용한 4개의 인자 (Oct3/4, Sox2, NANOG, 및 Lin28)의 발현이 체세포의 재프로그래밍을 위해 충분하다.

재프로그래밍 인자가 세포에서 발현된 후, 세포는 배양될 수 있다. 시간이 경과하면서, ES 특징을 갖는 세포가 배양 접시에 나타난다. 세포는 예를 들어 ES 형태를 기초로 하여, 또는 선택가능한 또는 검출가능한 마커의 발현을 기초로 하여 선택되고 계대배양될 수 있다. 세포는 ES 세포와 유사한 세포의 배양액을 생산하기 위해 배양될 수 있고 - 이는 추정 iPS 세포이다.

iPS 세포의 만능성을 확인하기 위해, 세포를 하나 이상의 만능성 검정으로 시험할 수 있다. 예를 들어, 세포는 ES 세포 마커의 발현에 대해 시험될 수 있고; 세포는 SCID 마우스 내에 이식될 때 기형종을 생산하는 능력에 대해 평가할 수 있고; 세포는 3개의 모든 배엽층의 세포 종류를 생산하도록 분화하는 능력에 대해 평가할 수 있다. 만능 iPS 세포를 얻은 후, 이는 RPE 세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

복잡성이 감소된 RPE 세포를 얻기 위한 인간 배아 줄기 세포에서 MHC 유전자의 조작

인간 배아 줄기 (hES) 세포는 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리는, 그 각각이 인간 집단에 존재하는 적어도 하나의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 (hemizygous), 동형접합성, 또는 비접합성 (nullizygous)인 줄기 세포를 포함할 수 있고, 상기 줄기 세포의 라이브러리의 각각의 멤버는 라이브러리의 나머지 멤버에 비해 MHC 대립유전자의 상이한 세트에 대해 반접합성, 동형접합성, 또는 비접합성이다. 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리는 인간 집단에 존재하는 모든 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동형접합성, 또는 비접합성인 줄기 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 하나 이상의 조직적합성 항원 유전자에 대해 동형접합성인 줄기 세포는 하나 이상의 (및 일부 실시양태에서, 모든) 상기 유전자에 대해 비접합성인 세포를 포함한다. 유전자 좌위에 대한 비접합성은 유전자가 그 좌위에서 효과가 없음 (즉, 그 유전자의 두 대립유전자가 결실되거나 불활성화됨)을 의미한다.

hES 세포는 세포의 MHC 복합체 내의 자매 염색체의 대립유전자 중의 하나에 대한 변형을 포함할 수 있다. 유전자 변형을 생성하기 위한 다양한 방법, 예컨대 유전자 표적화가 MHC 복합체 내의 유전자를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 세포 내의 MHC 복합체의 변형된 대립유전자는 동일한 대립유전자가 자매 염색체 상에 존재하도록 동형접합성이 되도록 후속적으로 조작될 수 있다. 이형접합성의 상실 (LOH)과 같은 방법이 MHC 복합체 내에 동형접합성 대립유전자를 갖도록 세포를 조작하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 모 대립유전자로부터의 MHC 유전자의 세트 내의 하나 이상의 유전자는 반접합성 세포를 생성하기 위해 표적화될 수 있다. MHC 유전자의 다른 세트는 널 세포주 (null line)를 만들기 위해 유전자 표적화 또는 LOH에 의해 제거될 수 있다. 상기 널 세포주는 다른 점에서는 일정한 유전자 배경을 갖는 반접합성 또는 동형접합성 은행을 만들기 위해 HLA 유전자의 어레이, 또는 개별적인 유전자를 제거하기 위한 배아 세포주로서 추가로 사용될 수 있다. 모든 MHC 유전자에 대해 비접합성인 줄기 세포는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 유전자 표적화 및/또는 이형접합성의 상실 (LOH)에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2004/0091936, 2003/0217374 및 2003/0232430, 및 미국 특허 가출원 번호 60/729,173 참조.

따라서, 본 발명은 감소된 MHC 복잡성을 갖는, RPE 세포의 라이브러리를 포함하여 RPE 세포를 얻는 방법에 관한 것이다. 감소된 MHC 복잡성을 갖는 RPE 세포는 환자 일치와 연관된 여려움을 제거할 수 있기 때문에 치료 용도를 위해 이용가능한 세포의 공급을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 MHC 복합체의 유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이 되도록 조작된 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.

본 발명은 또한 ES 세포의 몇몇의 세포주가 선택되고 RPE 세포로 분화된 RPE 세포 (및/또는 RPE 계통 세포)의 라이브러리를 제공한다. 상기 RPE 세포 및/또는 RPE 계통 세포는 세포 기반 요법이 필요한 환자에게 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 그 각각이 인간 집단에 존재하는 적어도 하나의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동형접합성, 또는 비접합성인 RPE 세포의 라이브러리를 제공하고, 상기 RPE 세포의 라이브러리의 각각의 멤버는 라이브러리의 나머지 멤버에 비해 MHC 대립유전자의 상이한 세트에 대해 반접합성, 동형접합성, 또는 비접합성이다. 본 발명은 인간 집단에 존재하는 모든 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동형접합성, 또는 비접합성인 인간 RPE 세포의 라이브러리를 제공한다.

배양 배지

고밀도 배양액을 지지할 수 있는 임의의 배지, 예컨대 바이러스, 박테리아, 또는 진핵 세포 배양을 위한 배지가 본원에서 기재되는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 배지는 고 영양소, 단백질-비함유 배지 또는 고 영양소, 저단백질 배지일 수 있다. 또한, 배지는 영양소 성분, 예컨대 알부민, B-27 보충물, 에탄올아민, 페투인, 글루타민, 인슐린, 펩톤, 정제된 지단백질 물질, 나트륨 셀레나이트, 트랜스페린, 비타민 A, 비타민 C, 또는 비타민 E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 영양소 풍부 저 단백질 배지는 배양액에서 세포의 성장을 지지하고 저 단백질 함량을 갖는 임의의 배지일 수 있다. 예를 들어, 영양소 풍부, 저 단백질 배지는 MDBK-GM, 옵티프로 SFM, VP-SFM, DMEM, RPMI 배지 1640, IDMEM, MEM, F-12 영양소 혼합물, F-10 영양소 혼합물 EGM-2, DMEM/F-12 배지, 배지 1999, 또는 MDBK-MM을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한 표 2를 참조한다. 또한, 영양소 풍부 저 단백질 배지는 배아 줄기 세포의 성장 또는 유지를 지지하지 않는 배지일 수 있다.

저 단백질 배지를 사용할 때, 배지는 적어도 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.20%, 0.10%, 0.05%, 0.02%, 0.016%, 0.015%, 또는 0.010% 동물-유래 단백질 (예를 들어, 10% FBS)을 함유할 수 있다. 저 단백질 배지에 존재하는 단백질의 비율에 대한 언급은 배지 단독을 지칭하고, 예를 들어 B-27 보충물에 존재하는 단백질을 설명하지 않음을 유의한다. 따라서, 세포가 저 단백질 배지 및 B-27 보충물에서 배양될 때, 배지에 존재하는 단백질의 비율이 더 높을 수 있음이 이해된다.

저 단백질 또는 단백질 비함유 배지는 혈청 비함유 B-27 보충물로 보충된다. B27 보충물의 영양 성분은 비오틴, L-카르니틴, 코르티코스테론, 에탄올아민, D+-갈락토스, 환원된 글루타티온, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 셀레늄, 트리아이오도-1-티로닌 (T3), DL-알파-토코페롤 (비타민 E), DL-알파-토코페롤 아세테이트, 소 혈청 알부민, 카탈라제, 인슐린, 수퍼옥시드 디스뮤타제, 및 트랜스페린을 포함할 수 있다. 세포가 B-27로 보충된 단백질 비함유 배지에서 배양될 때, 단백질 비함유는 B-27 첨가 전의 배지를 의미한다.

본원에서 기재되는 성장 인자, 작용제, 및 다른 보충물은 단독으로 또는 배지에 포함하기 위한 다른 인자, 작용제 또는 보충물과 조합되어 사용될 수 있다. 인자, 작용제 및 보충물은 배지에 즉시, 또는 세포 배양 동안 또는 후에 임의의 시점에 첨가될 수 있다.

배지는 또한 보충물, 예컨대 헤파린, 히드로코르티손, 아스코르브산, 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청), 또는 성장 매트릭스 (예를 들어, 소 각막 상피로부터의 세포외 매트릭스, 마트리겔 (MATRIGEL)® (기저막 매트릭스), 또는 젤라틴), 피브로넥틴, 피브로넥틴의 단백질 분해 단편, 라미닌, 트롬보스폰딘, 아그레칸, 및 신데잔을 함유할 수 있다.

배양 배지는 하나 이상의 인자 또는 작용제로 보충될 수 있다.

사용될 수 있는 성장 인자는 예를 들어 EGF, FGF, VEGF, 및 재조합 인슐린-유사 성장 인자를 포함한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 성장 인자는 또한 6Ckine (재조합), 악티빈 A, α-인터페론, 알파-인터페론, 암피레굴린, 안지오게닌, β-내피 세포 성장 인자, 베타 셀룰린, β-인터페론, 뇌 유래 신경 영양 인자, 카르디오트로핀-1, 섬모 신경 영양 인자, 시토카인-유도된 호중구 화학유인물질-1, 내피 세포 성장 보충물, 에오탁신, 표피 성장 인자, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, 에리트로포이에틴, 에스트로겐 수용체-α, 에스트로겐 수용체-β, 섬유모세포 성장 인자 (산성/염기성, 헤파린 안정화된, 재조합), FLT-3/FLK-2 리간드 (FLT-3 리간드), 감마-인터페론, 아교세포주-유래 신경 영양 인자, Gly-His-Lys, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, GRO-알파/MGSA, GRO-B, GRO-감마, HCC-1, 헤파린-결합 표피 성장 인자 유사 성장 인자, 간세포 성장 인자, 헤레굴린-알파 (EGF 도메인), 인슐린 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-1/IGF-1 복합체, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 II, 2.5S 신경 성장 인자 (NGF), 7S-NGF, 대식세포 염증성 단백질-1β, 대식세포 염증성 단백질-2, 대식세포 염증성 단백질-3α, 대식세포 염증성 단백질-3β, 단핵구 화학주성 단백질-1, 단핵구 화학주성 단백질-2, 단핵구 화학주성 단백질-3, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, NGF-β (인간 또는 래트 재조합), 온코스타틴 M (인간 또는 마우스 재조합체), 뇌하수체 추출물, 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 플레이오트로핀, 란테스 (rantes), 줄기 세포 인자, 기질 세포-유래 인자 1B/프리-B 세포 성장 자극 인자, 트롬보포이에틴, 전환 성장 인자 알파, 전환 성장 인자-β1, 전환 성장 인자-β2, 전환 성장 인자-β3, 전환 성장-인자-β5, 종양 괴사 인자 (α 및 β), 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 작용제는 시토카인, 예컨대 인터페론-α, 인터페론-α A/D, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-γ-유도가능 단백질-10, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-15, 인터류킨-17, 각질세포 성장 인자, 렙틴, 백혈병 억제 인자, 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 대식세포 염증성 단백질-1α를 포함한다.

배양 배지는 17B-에스트라디올, 부신 피질 자극 호르몬, 아드레노메둘린, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 융모 성선 자극 호르몬, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, 코르티코스테론, 덱사메타손, 에스트리올, 여포 자극 호르몬, 가스트린 1, 글루카곤, 성선 자극 호르몬, 히드로코르티손, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, L-3,3',5'-트리아이오도티로닌, L-3,3',5'-트리아이오도티로닌, 렙틴, 황체 형성 호르몬, L-티록신, 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬, 프로게스테론, 프로락틴, 세크레틴, 성 호르몬 결합 글로불린, 갑상선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 방출 인자, 티록신-결합 글로불린, 및 바소프레신을 포함하고 이로 제한되지 않는 호르몬 및 호르몬 길항제로 보충될 수 있다. 배양 배지는 항-저밀도 지단백질 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체, 내부 항체, 항-알파 인터페론 수용체 사슬 2 항체, 항-c-c 케모킨 수용체 1 항체, 항-CD 118 항체, 항-CD 119 항체, 항-콜로니 자극 인자-1 항체, 항-CSF-1 수용체/c-fins 항체, 항-표피 성장 인자 (AB-3) 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체, 항-표피 성장 인자 수용체, 포스포-특이적 항체, 항-표피 성장 인자 (AB-1) 항체, 항-에리트로포이에틴 수용체 항체, 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-에스트로겐 수용체, C-말단 항체, 항-에스트로겐 수용체-B 항체, 항-섬유모세포 성장 인자 수용체 항체, 항-섬유모세포 성장 인자, 염기성 항체, 항-감마-인터페론 수용체 사슬 항체, 항-감마-인터페론 인간 재조합 항체, 항-GFR 알파-1 C-말단 항체, 항-GFR 알파-2 C-말단 항체, 항-과립구 콜로니-자극 인자 (AB-1) 항체, 항-과립구 콜로니-자극 인자 수용체 항체, 항-인슐린 수용체 항체, 항-인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 항체, 항-인터류킨-6 인간 재조합 항체, 항-인터류킨-1 인간 재조합 항체, 항-인터류킨-2 인간 재조합 항체, 항-렙틴 마우스 재조합 항체, 항-신경 성장 인자 수용체 항체, 항-p60, 닭 항체, 항-부갑상선 호르몬-유사 단백질 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체-B 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자-알파 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-레티노산 수용체-알파 항체, 항-갑상선 호르몬 핵 수용체 항체, 항-갑상선 호르몬 핵 수용체-알파 1/Bi 항체, 항-트랜스페스페린 수용체/CD71 항체, 항-전환 성장 인자-알파 항체, 항-전환 성장 인자-B3 항체, 항-종양 괴사 인자-알파 항체, 및 항-혈관 내피 성장 인자 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 인자에 대한 항체로 보충될 수 있다.

본원에서 기재되는 방법에 사용하기 적합한 성장 배지를 표 2에 나열한다.

치료 방법

본원에서 기재되는 방법에 의해 생산되는 RPE 세포, 및 RPE 세포를 포함하는 제약 제제는 세포-기반 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 시험관내에서 만능 줄기 세포로부터 유래하는 RPE 세포를 포함하는 유효량의 제약 제제의 투여를 포함하는, 망막 변성을 수반하는 병태의 치료 방법을 제공한다. 망막 변성을 수반하는 병태는 예를 들어 범맥락막위축, 당뇨병성 망막병증, 망막 위축, 망막 박리, 망막 이형성증, 및 색소성 망막염을 포함한다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 연령-관련 황반 변성 (건성 또는 습성), 노쓰 캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증, 스타르가르트병, 패턴 이영양증, 베스트병, 말라티아 레벤티니즈, 도인 벌집 맥락막염, 우성 드루젠, 및 방사상 드루젠을 포함하고 이로 제한되지 않는 황반 변성의 치료 방법에 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 파킨슨병 (PD)의 치료 방법에 사용될 수 있다.

세포 이식의 공통적인 특징은 낮은 이식편 생존이고, 예를 들어 많은 세포 이식 연구에서 이식 직후 (예를 들어, 1주 이내) 세포가 상실되는 경향이 있다. 이러한 세포의 상실은 이식된 세포의 거부에 의한 것이 아니라 특정 비율의 세포가 이식 부위에서 유지되지 못하기 때문으로 보인다. 상기 세포 유지의 결여는 많은 인자, 예컨대 아래에 놓인 구조에 대한 세포의 부착 실패, 충분한 영양소의 결여, 또는 이식 부위에서의 물리적 스트레스에 의할 가능성이 가장 높다. 상기 세포수의 초기 감소 후에, 이식 후 다양한 시점에서의 세포 생존은 연구마다 상당히 상이할 수 있다. 따라서, 일부 연구는 수의 꾸준한 감소를 보여주고, 다른 연구는 이식된 세포가 안정한 수에 도달할 수 있다는 결과를 보여준다. 그러나, 이식 성공의 고려시에 중요한 인자는 세포 이식 후 생존 이식편을 갖는 수여자의 비율이다.

이전의 제제와 대조적으로, 본원에서 기재되는 제약 제제 내의 RPE 세포는 이식 후에 장기간 생존할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 생존할 수 있다. 추가로, RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주; 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개월; 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 생존할 수 있다. 또한, RPE 세포는 이식 수여자의 수명 내내 생존할 수 있다. 추가로, 본원에서 기재되는 RPE 세포의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 수여자가 이식된 RPE 세포의 생존을 보일 수 있다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 이식 수여자 내의 RPE 층 내로 성공적으로 통합되어 반연속적인 세포주를 형성하고, 중요한 RPE 분자 마커 (예를 들어, RPE65 및 베스트로핀)의 발현을 유지할 수 있다. 본원에서 기재되는 RPE 세포는 또한 브루크 막에 부착하여 이식 수여자 내에서 안정한 RPE 층을 형성할 수 있다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포에는 ES 세포가 실질적으로 없고, 이식 수여자는 이식 부위에서 비정상적인 성장 또는 종양 형성을 보이지 않는다.

망막 변성과 연관된 병태로부터 고통받는 환자의 치료 방법은 본 발명의 조성물을 국소 (예를 들어, 안내 주사 또는 본 발명의 제약 제제를 포함하는 매트릭스의 삽입에 의해) 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 제제의 안내 투여는 예를 들어 유리체, 각막 경유, 결막하, 공막 근처, 후공막 (posterior scleral), 및 눈의 테논낭하 (sub-tenon) 부위 내로의 전달을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,794,704; 7,795,025; 6,943,145; 및 6,943,153 참조.

본 발명은 또한 감소된-복잡성의 배아 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포를 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 환자에게 인간 RPE 세포를 투여하는 것을 수반하는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하고; (b) 환자의 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC 단백질을 확인하고; (c) 본 발명의 RPE 세포 생산 방법에 의해 제조된 감소된 MHC 복잡성의 인간 RPE 세포의 라이브러리를 제공하고; (d) 상기 환자의 세포 상의 MHC 단백질에 일치하는 RPE 세포를 라이브러리로부터 선택하고; (e) 단계 (d)로부터의 임의의 세포를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 지역 센터, 예컨대, 병원, 의원, 의사 사무실, 및 다른 의료 시설에서 수행될 수 있다. 또한, 환자에 대한 일로서 선택된 RPE 세포가 소량 저장된 경우, 이는 환자 치료 전에 팽창될 수 있다.

RPE 세포는 또한 비배양된 RPE 세포 또는 이식 전의 다른 RPE 세포 제제에 비해 알파 인테그린 서브유닛 1-6 또는 9의 발현을 증가시키는 조건 하에 배양될 수 있다. 본원에서 기재되는 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 9의 발현 수준을 상승시키기 위해 배양될 수 있다. 본원에서 기재되는 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1-6의 발현을 촉진하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 망가니즈 및 활성화 모노클로날 항체 (mAb) TS2/16을 포함하고 이로 제한되지 않는 인테그린-활성화제와 함께 배양될 수 있다. 문헌 [Afshari, et al. Brain (2010) 133(2): 448-464] 참조.

특정 치료법, 투여 경로, 및 보조 요법은 특정 병태, 병태의 중증도, 및 환자의 전체 건강을 기초로 하여 조정될 수 있다. RPE 세포를 포함하는 제약 제제의 투여는 증상의 중증도 저하 및/또는 환자의 병태의 추가의 악화 방지에 효과적일 수 있다. 예를 들어, RPE 세포를 포함하는 제약 제제의 투여는 환자의 시력을 개선할 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서, RPE 세포의 투여는 임의의 시력 손실 또는 다른 증상을 충분히 회복시키는데 효과적일 수 있다. 또한, RPE 세포 투여는 내인성 RPE 층의 손상 증상을 치료할 수 있다.

RPE 세포의 제약 제제

RPE 세포는 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 단독으로 또는 제약 제형의 성분으로서 투여될 수 있다. 대상 화합물은 의약으로 사용하기 위한 임의의 편리한 방식으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 투여에 적합한 제약 제제는 하나 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액 (예를 들어, 평형 염 용액 (BSS)), 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 항산화제, 완충제, 정균제, 용질 또는 현탁제 또는 비후제를 함유할 수 있는 멸균 주사가능 용액 또는 분산액 내로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 RPE 세포를 포함할 수 있다.

투여될 때, 본 발명에서 사용하기 위한 제약 제제는 발열원-비함유의 생리학상 허용되는 형태일 수 있다. 본원에서 기재되는 방법에 사용되는 RPE 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 겔, 콜로이드, 슬러리, 또는 혼합물로 이식될 수 있다. 또한, 제제는 바람직하게는 망막 또는 맥락막 손상 부위로 전달하기 위해 유리체액 내로 점성 형태로 봉입되거나 주사될 수 있다. 또한, 주사시에, 동결보존된 RPE 세포는 목적하는 오스몰랄농도 및 망막하 주사에 의한 투여를 위한 농도를 달성하기 위해 이용가능한 평형 염 용액으로 재현탁될 수 있다.

본 발명의 RPE 세포는 안내 주사에 의해 제약상 허용되는 안과용 제형으로 전달될 수 있다. 유리체내 주사에 의해 제형을 투여할 때, 예를 들어 용액은 최소 부피가 전달될 수 있도록 농축될 수 있다. 주사를 위한 농도는 본원에서 기재되는 인자에 따라 효과적이고 비독성인 임의의 양일 수 있다. 환자의 치료를 위한 RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 10⁴개 세포/mL의 용량으로 제형화될 수 있다. 환자의 치료를 위한 RPE 세포 제제는 적어도 약 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 10¹⁰개 RPE 세포/mL의 용량으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 내에 제형화될 수 있다.

본원에서 기재되는 RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; 또는 9,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 1x10²-1x10³, 1x10²-1x10⁴, 1x10⁴-1x10⁵, 또는 1x10³-1x10⁶개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 10,000, 20,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 또는 200,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 50-200 ㎕의 부피에 적어도 약 20,000-200,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 150 ㎕의 부피에 적어도 약 180,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포는 세포가 눈의 이환된 영역, 예를 들어 전방, 후방, 유리체, 안구방수, 유리체액, 각막, 홍채/섬모, 수정체, 맥락막, 망막, 공막, 맥락막상강, 결막, 결막하 공간, 공막외강, 각막내강, 각막외강, 평면부 (pars plana), 수술에 의해 유도된 무혈관 영역, 또는 황반을 관통할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 제제가 눈 표면과 접촉한 상태로 유지되도록 전달을 위해 제약상 허용되는 안과용 비히클 내에 제형화될 수 있다.

본원에서 기재되는 방법에 따라 투여되는 제제의 부피는 투여 방식, RPE 세포의 수, 환자의 연령 및 체중, 및 치료되는 질환의 종류 및 중증도와 같은 인자에 따라 결정될 수 있다. 주사에 의해 투여될 때, 본 발명의 RPE 세포의 제약 제제의 부피는 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 또는 5 mL일 수 있다. 부피는 적어도 약 1-2 mL일 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여될 경우, 본 발명의 RPE 세포의 제약 제제의 부피는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200 ㎕ (마이크로리터)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제제의 부피는 적어도 약 10-50, 20-50, 25-50, 또는 1-200 ㎕일 수 있다. 본 발명의 제제의 부피는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 ㎕일 수 있다.

예를 들어, 제제는 적어도 약 1x10³, 2x10³, 3x10³, 4x10³, 5x10³, 6x10³, 7x10³, 8x10³, 9x10³, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴개의 RPE 세포/㎕를 포함할 수 있다. 제제는 2000개의 RPE 세포/㎕, 예를 들어, 100,000개의 RPE 세포/50 ㎕ 또는 180,000개의 RPE 세포/90 ㎕를 포함할 수 있다.

망막 변성의 치료 방법은 면역억제제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 사용할 수 있는 면역억제제는 항-림프구 글로불린 (ALG) 폴리클로날 항체, 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 폴리클로날 항체, 아자티오프린, 바실릭시맙 (BASILIXIMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 시클로스포린 (시클로스포린 A), 다클리주맙 (DACLIZUMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스, 미코페놀산, 리툭시맙 (RITUXIMAB)® (항-CD20 항체), 시롤리무스, 및 타크롤리무스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 면역억제제는 적어도 약 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg으로 투여될 수 있다. 면역억제제를 사용할 때 이들은 전신 또는 국소 투여될 수 있고, RPE 세포의 투여 전에, 투여와 함께 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 면역억제제 치료는 RPE 세포의 투여 후에 수주, 수개월, 수년 또는 무한정 지속된다. 예를 들어, 환자에게 RPE 세포 투여 후에 6주 동안 5 mg/kg 시클로스포린이 투여될 수 있다.

망막 변성의 치료 방법은 단일 용량의 RPE 세포의 투여를 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 기재되는 치료 방법은 RPE 세포가 일정 기간에 걸쳐 다수회 투여되는 치료 과정을 포함할 수 있다. 예시적인 치료 과정은 매주, 격주, 매월, 분기별, 연 2회, 매년 치료를 포함할 수 있다. 별법으로, 치료는 다중 투여가 초기에 필요하고 (예를 들어, 처음 1주 동안 매일 투여), 이어서 보다 적은 빈도의 투여가 필요한 단계들로 진행될 수 있다.

안내 주사에 의해 투여될 경우, RPE 세포는 환자의 수명 전체에 걸쳐 1회 이상 주기적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 1년에 1회, 6-12개월에 1회, 3-6개월에 1회, 1-3개월에 1회, 또는 1-4주에 1회 전달될 수 있다. 별법으로, 보다 빈번한 투여는 특정 병태 또는 질환에 대해 바람직할 수 있다. 임플란트 또는 장치에 의해 투여될 경우, RPE 세포는 1회 투여되거나 또는 특정 환자 및 치료되는 질환 또는 병태에 대해 필요에 따라 환자의 수명 전체에 걸쳐 1회 이상 주기적으로 전달될 수 있다. 유사하게, 시간 경과에 따라 변하는 치료법이 고려된다. 예를 들어, 보다 빈번한 치료가 처음에 필요할 수 있다 (예를 들어, 매일 또는 매주 치료). 시간 경과에 따라, 환자의 상태가 개선되면서, 덜 빈번한 치료가 필요하거나 심지어 추가 치료가 전혀 필요하지 않을 수 있다.

본원에서 기재되는 방법은 대상체에서 망막전위도 반응, 시운동력 역치, 또는 휘도 역치를 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 방법은 눈에서 세포의 면역원성 또는 세포의 이동을 모니터링함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링할 수 있다.

RPE 세포는 망막 변성 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 실명의 치료에서 RPE 세포를 포함하는 제제의 사용을 포함한다. 예를 들어, 인간 RPE 세포를 포함하는 제제는 당뇨병성 망막병증, 황반 변성 (연령-관련 황반 변성, 예를 들어, 습성 연령-관련 황반 변성 및 건성 연령-관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 및 스타르가르트병 (노란점 안저)과 같은, 광수용체 손상 및 실명을 일으키는 많은 시력-변경 병과 연관된 망막 변성을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 제제는 당뇨병성 망막병증, 황반 변성 (연령-관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 및 스타르가르트병 (노란점 안저)과 같은, 광수용체 손상 및 실명을 일으키는 많은 시력-변경 병과 연관된 망막 변성을 치료하기 위해 망막에 투여될 수 있으며, 적어도 약 5,000-500,000개의 RPE 세포 (예를 들어, 100,00개의 RPE 세포)를 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 RPE 세포는 인간 RPE 세포일 수 있다. 그러나, 인간 세포는 인간 환자뿐만 아니라 동물 모델 또는 동물 환자에서도 사용될 수 있음을 유의한다. 예를 들어, 인간 세포를 망막 변성의 마우스, 래트, 고양이, 개, 또는 비-인간 영장류 모델에서 시험할 수 있다. 추가로, 인간 세포는 예컨대 수의학에서 그를 필요로 하는 동물을 치료하기 위해 치료 목적으로 사용될 수 있다.

투여 방식

제약 제제는 투여 경로에 따라 제약상 허용되는 담체 내에 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제제는 눈의 망막하 공간에 투여하기 위해 제형화될 수 있다. RPE 세포를 포함하는 제제는 동일한 환자의 한쪽 눈에 또는 두 눈에 투여될 수 있다. 두 눈으로의 투여는 순차적이거나 동시에 이루어질 수 있다. 예를 들어, RPE 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 용액, 슬러리, 겔, 또는 콜로이드로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 RPE 세포는 주사 (예를 들어, 유리체내 주사)에 의해, 또는 장치 또는 임플란트 (예를 들어, 임플란트)의 일부로서 국소 투여될 수 있다. 예를 들어, 제제는 눈의 망막하 공간 내로 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 제제는 각막을 경유하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포는 유리체 절제 수술을 사용하여 망막하 공간 내로 이식될 수 있다. 추가로, 주사시에, RPE 세포는 목적하는 오스몰랄농도 및 망막하 주사에 의한 투여를 위한 농도를 달성하기 위해 상업적으로 이용가능한 평형 염 용액으로 재현탁될 수 있다.

투여 방법에 따라, RPE 세포는 완충된 전해질 평형 수용액, 윤활성 중합체, 광유 또는 바셀린 기재 연고, 다른 오일, 리포솜, 시클로덱스트린, 서방성 중합체 또는 겔이 존재하는 완충된 전해질 평형 수용액에 첨가될 수 있다.

RPE 세포와 함께 사용하기 위한 매트릭스

본원에서 기재되는 방법은 임플란트 또는 장치로서 본 발명의 RPE 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 생분해성 중합체 매트릭스 내에 분산된 활성 물질을 포함하는, 눈 질환을 치료하기 위한 생침식성 임플란트이고, 여기서 활성 물질의 적어도 약 75%의 입자의 직경은 약 10 ㎛ 미만이다. 생침식성 임플란트는 눈 영역에 이식하기 위한 크기이다. 눈 영역은 전방, 후방, 유리체 공간, 맥락막, 맥락막상강, 결막, 결막하 공간, 공막외강, 각막내강, 각막외강, 공막, 평면부, 수술에 의해 유도된 무혈관 영역, 황반, 및 망막 중의 임의의 하나 이상일 수 있다. 생분해성 중합체는 예를 들어 폴리(락틱-코-글리콜)산 (PLGA) 공중합체, 생분해성 폴리(DL-락틱-코-글리콜산) 필름, 또는 PLLA/PLGA 중합체 기재일 수 있다. 중합체 내의 락트산 대 글리콜산 단량체의 비는 약 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 중량비, 보다 바람직하게는 약 50/50이다. PLGA 공중합체는 생침식성 임플란트의 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 내지 약 90 중량%일 수 있다. PLGA 공중합체는 생침식성 임플란트의 약 30 내지 약 50 중량%, 바람직하게는 약 40 중량%일 수 있다. RPE 세포는 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리락트산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 50:50 PDLGA, 85:15 PDLGA, 및 INION GTR® 생분해성 막 (생체적합성 중합체의 혼합물)과 함께 이식될 수 있다. 미국 특허 번호 6,331,313; 7,462,471; 및 7,625,582를 참조한다. 또한, 문헌 [Hutala, et al. (2007) "In vitro biocompatibility of degradable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues: Direct contact studies." Journal of Biomedical Materials Research 83A(2): 407-413]; [Lu, et al. (1998) J Biomater Sci Polym Ed 9: 1187-205]; 및 [Tomita, et al. (2005) Stem Cells 23: 1579-88]을 참조한다.

스크리닝 검정

본 발명은 RPE 세포 성숙을 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들어, 인간 ES 세포로부터 분화된 RPE 세포는 RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 확인된 작용제는 단독으로 또는 치료법의 일부로서 RPE 세포와 조합되어 사용될 수 있다. 별법으로, 확인된 작용제는 시험관내에서 분화된 RPE 세포의 생존을 개선하기 위해 배양 방법의 일부로서 사용될 수 있다.

RPE 세포는 제약, 화학, 또는 생명공학 회사, 병원, 또는 학술 또는 연구 기관과 같은 환경에서 연구 도구로서 사용될 수 있다. 상기 사용은 예를 들어 시험관내에서 또는 생체내에서 RPE 생존을 촉진하기 위해 사용될 수 있는, 또는 RPE 성숙을 촉진하기 위해 사용될 수 있는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 검정에서 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포의 사용을 포함한다. 확인된 작용제는 예를 들어 그들의 잠재적인 용도를 평가하기 위해 단독으로 또는 RPE 세포와 조합되어 시험관내에서 또는 동물 모델에서 연구될 수 있다.

본 발명은 RPE 세포를 제공하고, 상기 RPE 세포를 작용제와 접촉시키고, 상기 RPE 세포를 성숙 징후에 대해 평가한 후, 작용제가 RPE 세포가 성숙 징후를 보이도록 유도할 때 RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 확인하는 것을 포함하는, RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 성숙 징후는 본원에서 논의되는 색소침착 수준, 유전자 발현 수준, 및 형태일 수 있다.

상업적 적용 및 방법

본 발명의 특정 측면은 상업적인 품질에 도달하는 RPE 세포의 생산에 관한 것이다. RPE 세포는 대규모로 생산되고, 필요한 경우 저장되고, 병원, 임상의 또는 다른 의료 시설에 공급될 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정 측면은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RPE 세포의 생산, 저장, 및 분배 방법에 관한 것이다. RPE 생산 후에, RPE 세포는 수거, 정제되고, 환자의 치료 전에 임의로 저장될 수 있다. RPE 세포는 임의로 환자 특이적이거나 또는 HLA 또는 다른 면역학 프로필을 기초로 하여 특이적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 환자가 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 황반 변성 (연령-관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 망막 위축, 망막 박리, 망막 이형성증, 및 스타르가르트병 (노란점 안저)과 같은 적응증을 보일 경우, RPE 세포는 적시에 주문하고 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상업적인 규모로 세포를 얻기 위해 RPE 세포를 생산하는 방법, 상기 방법으로부터 유도된 RPE 세포를 포함하는 세포 제제, 및 RPE 세포를 병원 및 임상의에게 제공 (즉, 생산, 임의로 저장 및 판매)하는 방법에 관한 것이다. 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 분화된 RPE 세포의 생산은 상업적인 용도를 위해 규모가 확대될 수 있다.

본 발명은 또한 판매를 위해 제제를 분배하기 위한 분배 시스템 확립을 포함하고 제약 제제의 판매를 위한 판매 부서를 확립하는 것을 포함할 수 있는 제약 사업의 수행 방법을 제공한다.

본 발명은 RPE 세포를 병원, 의료 센터, 및 임상의에게 공급하고, 이에 의해 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RPE 세포가 저장되고, 병원, 의료 센터, 또는 임상의의 신청에 의해 주문되고 RPE 세포 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 병원, 의료 센터, 또는 임상의는 환자 특이적 데이터를 기초로 하여 RPE 세포를 주문하고, RPE 세포가 환자의 상세한 상태에 따라 생산되고, 이어서 주문한 병원 또는 임상의에게 공급된다. 예를 들어, 특정 RPE 세포 제제는 환자에 적합하도록 선택된 후에, 환자 치료를 위한 적절한 품질에 도달하도록 생산이 확대된다.

본 발명의 추가의 측면은 일치된 세포를 잠재적인 환자 수여자에게 제공할 수 있는 RPE 세포의 라이브러리에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 조직적합성 항원에 동형접합성인 RPE 세포 제제를 제공하는 단계를 포함하는, 제약 사업의 수행 방법을 제공하고, 여기서 세포는 본원에 개시된 방법에 의해 팽창될 수 있는 RPE 세포의 라이브러리를 포함하는 상기 세포의 은행으로부터 선택되고, 각각의 RPE 세포 제제는 인간 집단에 존재하는 적어도 하나의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이고, 상기 RPE 세포의 은행은 세포의 은행 내의 다른 멤버에 비해 MHC 대립유전자의 상이한 세트에 대해 각각 반접합성 또는 동형접합성인 세포를 포함한다. 상기한 바와 같이, 유전자 표적화 또는 이형접합성의 상실은 RPE 세포를 유도하기 위해 사용되는 반접합성 또는 동형접합성 MHC 대립유전자 줄기 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 환자로부터 인간 ES 세포를 얻고, 이어서 ES 세포로부터 유도되는 RPE 세포를 생성하고 팽창시키는 방법을 포함한다. 상기 RPE 세포는 저장될 수 있다. 추가로, 상기 RPE 세포는 그로부터 ES가 얻어진 환자 또는 그 환자의 친척의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 개시내용은 인간 RPE 세포가 망막 변성 장애 환자에 대한 무한정의 세포 공급원을 제시하는 잘 규정되고 재현가능한 조건 하에 인간 ES 세포로부터 신뢰가능하게 분화되고 팽창될 수 있음을 입증한다. 상기 세포의 농도는 이용가능성에 의해 제한되지 않고, 오히려 개체의 정확한 임상 필요성에 따라 적정될 수 있다. 동일한 세포 집단의 환자의 생애에 걸친 반복된 주사 또는 이식도 의사에 의해 필요한 것으로 평가될 때 시행될 수 있을 것이다. 또한, 그로부터 RPE 세포가 생성될 수 있는, 일치하는 또는 감소된-복잡성의 HLA hES 세포주의 은행을 생성하는 능력은 면역억제 약물 및/또는 면역조정 프로토콜에 대한 필요성을 잠재적으로 감소시키거나 제거할 수 있다.

본 발명은 이제 다음 실시예를 참조로 하여 보다 충분히 설명될 것이고, 실시예는 단지 예시적인 것이고, 상기 설명된 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

본 발명은 이제 일반적으로 설명되지만 다음 실시예를 참조로 하여 보다 쉽게 이해될 것이고, 실시예는 단지 본 발명의 특정 측면 및 실시양태의 예시의 목적으로 포함되고, 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

실시예 1

HES 세포를 사용한 인간 RPE 세포의 제조 방법

마우스 배아 섬유모세포 (MEF)를 약 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 보충한 MEF-GM 배지 내에서 성장시켰다. 충분한 수의 MEF가 얻어지면, 미토마이신-C로 MEF를 유사분열을 차단하고 젤라틴으로 코팅된 6-웰 플레이트 내에 시딩함으로써 피더 세포를 제조하였다. 도 1을 참조한다. hES의 바이알을 해동하고, MEF 피더 세포 상에 시딩하고, hES 성장 배지 내에서 동시-배양하였다. 표 2 및 도 2를 참조한다. hES 세포를 약 1:3의 분할비로 수회 팽창시켰다. 충분한 수의 hES 세포가 번식했을 때, 세포를 수거하고, 저부착 6-웰 플레이트에서 EB 형성 배지 내에 현탁 배양액에 넣었다 (이것은 배상체 (EB)의 형성을 허용한다). 표 2 및 도 3을 참조한다.

이어서, RPE의 파생 (outgrowth)을 허용하도록 EB를 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트로 옮겼다. 초기 성장 배지는 EB 파생 배지이지만, 일단 EB가 부착되면 EB 유지 배지로 교체하였다. 표 2를 참조한다. 배양액이 약 70% 융합 (confluent)일 때, 배지를 MDBK-MM으로 교체하였다. 일단 충분한 수의 RPE 세포 집합체가 가시화되면, RPE 세포를 단리하고 융합까지 EGM-2 배지 내에서 추가로 번식시켰다. 융합될 때, RPE 세포를 세포가 중간 색소 형태 및 색소침착에 도달할 때까지 MDBK-MM 내에서 배양하였다. 도 4 및 5를 참조한다. 이어서, RPE 세포를 수거하고, 약 -135℃ 미만에서 동결 저장하였다 (예를 들어, 액체 질소의 증기상 내에서). 도 6을 참조한다. RPE 세포는 GMP에 부합하게 생산하였다. 따라서, 상기 방법은 이식에 사용하기 위해 적합한 유효량의 인간 RPE 세포를 생성한다.

실시예 2

hES 세포의 시딩 및 팽창

동결보존된 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 해동하고, hES-GM으로 세척하고, 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트 내에서 유사분열을 불활성화시킨 마우스 배아 지지 (MEF) 세포 상에 접종하였다. 도 7 참조. hES의 각각의 바이알의 내용물 (약 1백 만개의 동결보존된 세포)을 6-웰 플레이트의 1개의 웰 내로 시딩하고, hES 및 MEF의 동시-배양액을 약 60-80% 융합까지 약 4-9일 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 동안, 배양액을 현미경으로 검사하고: 대부분 hES 형태를 보이는 보다 큰 콜로니를 자발적 분화를 방지하기 위해 보다 작은 조각으로 분산시켰다. 분화된 세포로 이루어진 부분을 제거함으로써, 큰 영액의 미분화된 세포를 갖는 모자이크 (mosaic) 콜로니를 다듬었다. 주로 분화된 세포 또는 비 hES 세포 형태를 함유하는 콜로니는 콜로니의 형태에 대한 지표로서 사진을 이용하여 줄기 세포 절단 도구를 사용하여 집어서 폐기하였다. 도 2를 참조한다.

60-80% 융합일 때, hES 세포를 Ca² ⁺/Mg² ⁺-비함유 DPBS로 세척하고 분리시까지 약 2-5분 동안 0.05% 트립신/EDTA로 처리함으로써 계대배양하였다. 트립신을 MEF-GM으로 중화시키고, 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. 이어서, hES 세포를 새로운 MEF 피더층 상에 재시딩하였다. hES 세포를 약 1:4 또는 그 이하의 분할비로 수회 팽창시켰다. 도 3을 참조한다.

충분한 수의 hES 세포가 번식했을 때, hES 세포를 수거하였다. 세포를 Ca² ⁺/Mg² ⁺-비함유 DPBS로 세척하고 분리시까지 약 2-5분 동안 0.05% 트립신/EDTA로 처리하였다. 트립신을 MEF-GM으로 중화시키고, 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. 이어서, hES 세포를 EB 형성 배지 (EB-FM) 내에 재현탁하였다.

추가의 MEF 세포를 사용하지 않았다. MEF 제거 및 RPE 세포 수거 사이의 시간은 MEF-비함유 세포 배양액 내에서 3회의 계대배양 및 약 80-90일이었다. 상기 방법에 의해 제조된 hES 세포를 추가로 시험하였고, 예를 들어, 마우스 특이적 마커에 대해 검정함으로써 MEF 세포가 실질적으로 없는 것을 확인하였다. 상기 방법에 의해 제조된 hES 세포의 시험시에, hES 세포는 MEF 세포가 실질적으로 없는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

인간 배상체 형성 및 파생

hES 세포를 저부착 6-웰 플레이트 상에 접종하고 (1:2의 분할비로), 배상체가 형성되고 성숙할 때까지 약 7-12일 동안 배양하였다. 현탁액 내의 배상체를 저부착 웰로부터 수거하고, EB-FM 내에 재현탁하고, 젤라틴-코팅된 6-웰 배양 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 배상체가 부착하도록 약 3-4일 동안 방해 없이 배양하였다. 이때, 배지를 EB 성장 배지 (EB-GM)로 교체하였다. 배양액이 약 70% 융합일 때 (예를 들어, 약 9-12일 후), 배지를 RPE 유지 배지 (RPE-MM)로 교체하였다. 도 3을 참조한다. 부착된 EB로부터의 세포 파생은 RPE-MM 내의 배양액 내에서 적절한 수의 색소화 집합체가 가시화될 때까지 (예를 들어, RPE-MM으로 교체한 지 약 35-50일 후) 지속하였다. 따라서, 비-인간 세포가 실질적으로 없고 따라서 "이종이식" 물질이 아닌 배상체가 형성되고 단리되었다. 이어서, 이들 EB를 분화시켜 인간 RPE 세포를 생산할 수 있다.

실시예 4

인간 배상체를 위한 동결보존된 hES 세포의 사용

동결보존된 hES 세포 (예를 들어, MA01 및 MA09)를 해동하고 L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 및 B-27 보충물을 보충한 옵티프로 SFM 또는 MDBK-성장 배지 내에서 Lo-결합 눈클론(Nunclon) 페트리 접시 상에 현탁 배양액으로 넣었다. hES 세포는 앞서 초기 난할기 인간 배아로부터 생검한 단일 할구로부터 유래되었다. 나머지 인간 배아는 파괴하지 않았다. 세포를 배상체 (EB)로서 적어도 약 7-14일 동안 배양하였다.

적어도 약 7-14일 후에, EB를 돼지 껍질로부터의 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 도말하였다. EB를 B-27 보충물 없이 L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 옵티프로 SFM 또는 MDBK-성장 배지 내에서 적어도 약 추가의 14-28일 동안 부착 배양액으로서 성장시켰다. EB의 부착 배양액 내의 세포들 사이에서부터, RPE 세포는 가시화되고, 그들의 자갈돌 세포 형태 및 색소침착의 출현에 의해 인지되었다. 따라서, 동결보존된 hES 세포를 해동하고 배양하고 사용하여 다시 MEF 세포를 사용하지 않으면서 인간 RPE 세포를 생산하기 위해 사용될 수 있는 EB를 형성할 수 있다.

실시예 5

인간 RPE 세포 유도

직경 약 1 mm 이하의 연갈색 내지 암갈색 집합체의 약 10-30 조각이 각각의 웰 내에서 가시화될 때 인간 RPE 세포 유도가 개시되었다. 이것은 RPE-MM으로 전환된 후 약 40-50일을 필요로 할 수 있다. 색소화 조각을 함유하는 배상체 세포 파생물은 세포 집합체가 분리될 때까지 Ca² ⁺/Mg² ⁺를 갖는 DPBS 내에서 타입 IV 콜라게나제 내에서 인큐베이션함으로써 수거하였다. 분리된 세포 집합체를 RPE-MM 내에서 3회 세척하고, 100 mm 비-조직 (초저부착) 배양 접시로 옮겼다. 입체현미경 하에, 색소화 세포의 집합체를 줄기 세포 절단 도구를 사용하여 비-색소화 세포 집합체로부터 기계적으로 분리하였다. 모든 색소화 집합체가 단리된 후, 옮겨졌을 수 있는 임의의 비-색소화 집합체를 제거하기 위해 수집한 집합체를 입체현미경 하에 검사하였다. 색소화 세포 집합체를 RPE-MM 내에서 세척한 후, 0.25% 트립신-EDTA 및 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물 내에서 해리시켰다. 해리된 세포를 MEF-GM 내에서 세척하여 트립신을 중화하고, 원심분리하였다. 세포 펠릿을 RPE 성장 배지 (RPE-GM) 내에 재현탁시킨 후, 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트 내에 도말하였다. 도 4를 참조한다. 따라서, 비-인간 피더 세포를 사용하지 않으면서, hES 세포가 실질적으로 없는 인간 RPE 세포의 배양액을 분화하고 단리시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조된 인간 RPE 세포는 비-인간 세포가 실질적으로 없고 (따라서, 이종이식 물질이 아님) hES 세포가 실질적으로 없는 (따라서, 종양 발생성이 아님) 것으로 간주될 수 있다.

실시예 6

인간 RPE 팽창

재현탁시킨 인간 RPE 세포를 RPE-GM 내에서 젤라틴-코팅된 4-웰 또는 6-웰 플레이트 상으로 각각 50,000 또는 250,000개의 세포의 밀도로 접종하고, 융합까지 (약 8-11일) 배양하였다. 이때, 배지를 RPE-MM으로 교체하고, RPE 배양액이 중간 수준의 색소침착을 보일 때까지 약 9-14일 동안 인큐베이션하였다. 계대배양 0 (P0) RPE 배양액은 0.25% 트립신-EDTA 및 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물을 사용하여 수거하고, MEF-GM으로 중화시키고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포 펠릿을 RPE-GM 내에 재현탁하고, 젤라틴-코팅된 플레이트 상으로 1:3 내지 1:6의 비로 재접종하였다. RPE 세포 배양액을 적어도 2회 팽창시켰다 (2회의 1:3 내지 1:6 분할을 겪음 (계대배양 2 지정). 이때, 인간 RPE 세포를 수거하였다. 상기 방식으로, 치료상 유용한 양의 인간 RPE 세포 (예를 들어, 적어도 약 1 x 10³ - 1 x 10⁶개의 RPE 세포)에 도달하는 것을 포함하여 RPE 세포 수를 크게 증가시킬 수 있다.

실시예 7

성숙한 인간 RPE 세포의 번식

RPE 세포를 부착 배양액 내에서 배양하였다. 분화된 RPE 세포가 부착 배양액 내에 나타남에 따라, 분화된 RPE의 집합체는 세포 형태에 기반하여 가시적으로 눈에 띌 수 있다. 동결된 콜라게나제 IV (20 mg/ml)을 해동하고 7 mg/ml로 희석하였다. 콜라게나제 IV를 RPE 집합체를 함유하는 부착 배양액에 적용하였다 (6-웰 플레이트 내에서 각각의 웰에 1.0 ml). 약 1-3시간에 걸쳐, 콜라게나제 IV는 세포 집합체를 해리시켰다. RPE 집합체를 배양액 내의 다른 세포로부터 해리시킴으로써, RPE 세포의 농축된 현탁액을 얻었다. 농축된 RPE 세포 현탁액을 배양 플레이트로부터 제거하고, 10 ml의 MEF 배지가 담긴 100 mm 조직 배양 접시로 옮겼다. 색소화 덩어리를 줄기 세포 절단 도구 (스웨메드-비트롤라이프 (Swemed-Vitrolife))를 사용하여 3 ml의 MEF 배지를 담은 6-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 모든 덩어리를 집은 후, 색소화 세포의 현탁액을 7 ml의 MEF 배지를 담은 15 ml 원추형 튜브로 옮기고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 0.25% 트립신 및 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물 5 ml을 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 덩어리가 거의 남지않을 때까지 세포를 5 ml 피펫 내에서 피펫팅함으로써 분산시켰다. 5 ml의 MEF 배지를 세포에 첨가하고, 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 EGM-2 배양 배지 내에 원래의 배양액 1:3의 분할비로 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 도말하였다. 도 4를 참조한다.

EGM-2 배지 내에서 연속 배양함으로써 RPE 세포의 배양액을 팽창시켰다. 필요한 경우에 0.25% 트립신 EDTA 및 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물을 사용하여 1:3 내지 1:6 비로 세포를 계대배양하였다. 성숙한 분화된 RPE 세포를 농축시키기 위해, 세포를 EGM-2 내에서 거의 융합도로 성장시켰다. 이어서, RPE 세포의 성숙을 추가로 촉진하기 위해 배지를 MDBK-MM (SAFC 바이오사이언시즈 (SAFC Biosciences))로 교체하였다. 따라서, 치료 방법에서 사용하기 위해 성숙한 인간 RPE 세포를 제조할 수 있다.

실시예 8

RPE 세포 수거 및 동결보존

인간 RPE 세포를 거의 융합도로 성장시키고 배지를 RPE 유지 배지로 교체하였다. 이어서, 세포가 중간 색소 형태 및 색소침착에 도달할 때까지 RPE 세포를 배양하였다. 이것은 적어도 약 1개월의 추가 배양 시간이 소요될 수 있다. 중간 색소는 약 절반의 세포를 치밀한 자갈돌 상태로 및 배양액 내의 절반을 보다 연한 덜 치밀한 형태로 함유하는 것으로 보이는 배양액에 기초한 것이다. 공정을 표준화하는 것을 돕기 위해 사진을 이용할 수 있다. 해동 후 생존력이 유지되고, 세포의 회복력이 높은 색소보다 더 양호하고, 약물은 다른 형태와 유사한 효능을 보이기 때문에, 중간 색소 형태를 선택하였다.

세척하고 0.25% 트립신-EDTA로 처리하여 배양액 내의 P2 또는 P3 중간-색소화 RPE 세포를 수거하였다. 분리된 RPE 세포를 MEF-GM으로 세척하여 트립신을 중화시키고, 원심분리하고, 계수하고, 90% FBS 및 10% DMSO의 용액 내에 1백 만개의 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 1 mL의 세포 생성물 현탁액을 적절하게 표지한 멸균 1.2 mL 냉동바이알 내로 분배하였다. 바이알을 1-3일 동안 -80℃에서 저장한 후, 액체 질소 저장기의 증기상 (-135℃)으로 옮겼다. 도 6을 참조한다. 따라서, RPE 세포의 동결보존된 제제를 제조할 수 있다.

실시예 9

GTP 및/또는 GMP 규정에 대한 부합성

인간 RPE 세포 (수거된 또는 동결보존된 바이알로부터 해동시킨)를 표 3에 제시된 GTP 및/또는 GMP 규정에 따라 시험하고 특성화할 수 있다. 또한 21 C.F.R. § 210 및 § 211을 참조한다.

표 4는 이식 요법에 사용하기 위한 RPE 세포 제제를 비롯한 RPE 세포의 생산 동안 특성화 및 자격 (qualification)에 대해 수행할 수 있는 시험의 설명을 제공한다. 본원에서 기재되는 방법에 따라 생산된 RPE 세포를 표 4에 나열된 적어도 하나의 시험에 의해 시험할 수 있다.

이들 분석은 인간 RPE 세포의 대표적인 배양액 및 제제에 대해 수행하고, 본원에서 기재되는 방법이 GTP 및/또는 GMP 기준에 부합한 치료상 유용한 양의 인간 RPE 세포를 생산하였음을 확인하였다. 또한, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 표 3 또는 4에 언급된 적어도 하나의 기준에 합치할 수 있다. 따라서, 본원에서 기재되는 방법을 이용하여, 치료 용도 (예를 들어, 망막 변성의 치료)에서 사용하기 위해 GTP 및/또는 GMP 기준에 부합하는 치료상 유용한 양의 인간 RPE 세포를 생산할 수 있다.

실시예 10

RPE 특성화 및 시험

RPE 세포를 젤라틴 상에 시딩할 수 있다. 젤라틴 상에 시딩된 RPE 세포는 분할하고 초기 부착 부위로부터 떨어져 이동할 때 대체로 느슨한 색소침착 및 상피 형태를 보인다 (예를 들어, 문헌 [Klimanskaya, et al. (2004) Cloning and Stem Cells 6(3): 1-29, 도 1] 참조). 그러나, 일다 융합도가 재확립되면, RPE 세포는 상피 형태로 되돌아가고 색소를 재-표현할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌의 도 2 참조). RPE 세포가 RPE 분자 마커, 식세포작용 활동에 대한 분석, 및 우발성 (adventitious) 바이러스의 부재 확인을 포함하여 그들의 RPE 표현형 (예를 들어, 표현형 안정성)을 유지하는 것을 확인하기 위해 다양한 시험을 수행할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 참조).

RPE 분자 마커

RPE 세포는 생체내에서 베스트로핀, RPE65, CRALBP, 및 PEDF를 포함한 몇몇 특징적인 RPE 단백질을 발현한다 (예를 들어, 상기 문헌, 도 3). hES 세포의 RPE-유사 분화된 유도체의 색소화 상피 형태는 증식하는 배양액 내에서 잃고, RPE 분자 마커 RPE65, CRALBP, 베스트로핀, 및 PEDF의 존재뿐만 아니라 융합도에 도달시에 재-확립될 수 있다. 따라서, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 천연 RPE 세포와 유사하다 (또한 상기 문헌 참조).

식세포작용 검정

RPE 세포의 특성화를 위한 기능 시험은 표지된 간상세포 단편 또는 형광 에스. 아우렐리우스 (S. aurelius) 입자를 사용한 검정을 이용하는 RPE-특이적 식세포작용을 포함한다. RPE 세포는 흘린 광수용체 단편의 식세포작용을 통해 광수용체에 대한 기능적 지지체를 제공한다. 따라서, 식세포작용은 RPE 세포를 확인하는 주요 기능적 특징을 나타낸다.

대략 500,000개의 제형화된 RPE 세포를 4-웰 플레이트의 젤라틴-코팅된 웰 내에 시딩하고 중간-색소침착이 관찰될 때까지 배양할 수 있다. 이어서, 세포를 형광 에스. 아우렐리우스 입자와 함께 적어도 약 24-36시간 동안 약 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 음성 대조군은 동일한 기간 동안 약 1-4℃에서 인큐베이션한 동일한 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS로 3회 세정하여 나머지 입자를 제거하고, PBS 중 2% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 2회 세정하고, 형광 도립 현미경 하에 검사하고 사진촬영할 수 있다.

본원에서 기재되는 방법에 따라 생산된 인간 RPE 세포는 라텍스 비드 및 광수용체 단편을 모두 포식할 수 있다.

형태 평가

시험관내에서 수동으로 정제한 hES 세포-분화된 RPE는 팽창기 동안 배양액 내에서 중요한 형태적 사건을 겪을 수 있다. 얇은 배양액 내에 도말한 단일-세포 현탁액은 탈색소화하고, 세포는 표면적이 증가하는 경향이 있다. 인간 RPE 세포는 세포가 신속하게 분열할 때 팽창 동안 상기 형태를 유지한다. 그러나, 세포 밀도가 최대 용량에 도달할 때, RPE는 그의 특징적인 표현형인 육각형 형태를 취하고, 멜라닌 및 리포푸신의 축적에 의해 색소침착 수준을 증가시킬 수 있다.

생산 공정의 지속 기간 내내 위상차 도립 광학 현미경을 사용하여 일상적인 형태 평가를 수행할 수 있다. 디지털 현미경사진을 핵심 단계에서 취할 수 있다. RPE 표현형의 유지를 확인하기 위해 형태 평가를 수행할 수 있다. 본원에서 기재되는 방법에 따라 생산된 인간 RPE는 9개월 이상 지속하는 안정한 RPE 표현형을 보인다. 실시예 19를 참조한다.

핵형 분석

단지 세포가 정상 배수체 (예를 들어, 인간에 대해 46개 염색체)를 유지하는지 보장하기 위해 핵형 분석 (예를 들어, G-밴딩 및 FISH에 의한 분석)을 수행할 수 있다. 상기 핵형 분석은 예를 들어, EB 형성을 위한 hES 세포의 수거 및 접종 후에, RPE 세포의 P1 계대배양액의 접종 후에, 및 본원에서 기재되는 RPE 세포의 수거 후에 동결보존 전에 수행할 수 있다. 본원에서 기재되는 방법에 따라 생산된 인간 RPE는 안정한 핵형을 보인다 (예를 들어, 인간에 대해 46개 염색체). 표 1을 참조한다.

우발성 바이러스

RPE 세포에서 바이러스 오염의 부재를 확인하기 위해, RPE 세포의 배치 (batch) (RPE MA09p32)를 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조하였다. 임의의 바이러스가 발현될 최대 기회를 받도록 보장하기 위해 RPE 세포를 추가로 2회 계대배양한 후 수거하고 바이러스에 대해 시험하였다. 계대배양 4에서, RPE MA09p32+4 세포를 수거하고 불현성 바이러스 및 시험관내 바이러스에 대해 시험하였다. 세포의 일부를 1회 더 계대배양한 (로트 RPE MA09p32+5) 후 바이러스 입자의 초미세구조에 대해 평가하였다. 이들 세포는 바이러스 오염이 실질적으로 없고, 이것은 RPE 세포의 제조가 숨겨진 바이러스를 생성시키지 않음을 나타낸다.

안정성 시험

RPE 세포가 동결보존 후에 요구되는 특징을 생성할 수 있음을 입증하기 위해, RPE 세포의 바이알을 해동하고 특성화할 수 있다. 이어서, RPE 세포를 동결의 1, 2, 3, 6, 12, 18 및 24개월 후에 시험할 수 있다. RPE 세포의 바이알을 제조하고, 동결보존하고, 해동한 후 시험하였다. 이들 RPE 세포는 정상적인 46개 염색체 (XX) 핵형†을 보였고, 생존가능하고, 바이러스가 실질적으로 없고, 냉동저장의 6-9개월 후에 생존가능하였다. 추가로, RPE 세포는 정상적인 46개 염색체 (XX) 핵형†을 보였고, 생존가능하고, 바이러스가 실질적으로 없고, 냉동저장의 1-4년 후에 생존가능하였다.

†이들 RPE 세포는 여성 인간 배아 줄기 세포주 MA09로부터 유래되었다 (문헌 [Klimanskaya, et al. (2007) Nat Protoc. 2(8): 1963-72] 및 [Klimanskaya, et al. (2006) Nature 444(7118): 481-5] 참조).

실시예 11

RPE 세포의 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링

RPE 마커의 존재 및 ES 마커의 부재에 대해 시험하기 위해 단일 할구-유래 hES 세포주 MA01 및 MA09 둘 모두로부터 유래한 인간 RPE 세포에 대해 마이크로어레이를 통한 전반적 유전자 발현 분석을 수행하였다. 추가로, 태아 RPE, ARPE-19, 및 망막모세포종 세포주를 대조군으로서 분석하였다.

데이터는 RPE에 대한 상기 표현형 변화가 특히 PAX6, PAX2, Otx2, MitF, 및 Tyr의 발현에 관하여 이들 세포의 전반적 유전자 발현 패턴의 변화에 의해 유도됨을 나타낸다. 각각의 hES 세포주를 그의 RPE 상대물에 비교하는 ANOVA 분석을 기초로 하여, 본 발명자들은 100개의 최고 및 최저 발현 유전자를 선택하였고, 만능성 및 눈 발생에 관련된 유전자를 선택하기 위해 컴퓨터 분석을 수행하였다. 상향조절된 유전자를 표 5에 제시한다. 하향조절된 유전자를 표 6에 제시한다.

마이크로어레이 검정의 결과는 본원에서 기재되는 방법에 의해 제조된 RPE 세포가 hES 세포, 태아의 RPE 세포, 또는 ARPE-19 세포에 의해 발현되지 않는 다수의 유전자를 발현함을 입증한다. 본 발명의 ES-세포 유래된 RPE 세포에서 mRNA 및 단백질 발현의 독특한 분자 지문은 이들 RPE 세포를 당업계의 세포, 예컨대 hES 세포, ARPE-19 세포, 및 태아 RPE 세포와 구분되도록 만드는 마커의 세트, 예컨대 RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRABLP, Otx2, Mit-F, PAX6 및 PAX2를 구성한다.

실시예 12

정량적, 실시간, 역전사 PCR ( QPCR )에 의해 측정된 RPE -특이적 mRNA 발현

망막 색소 상피 (RPE)로의 인간 배아 줄기 세포 (hES) 분화 과정 동안 발생기를 특성화하기 위해, 발생의 각각의 대표적인 기에 핵심적인 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 검정을 사용하였다. RPE 분화 과정에서 관심있는 세포 종류-특이적 mRNA 전사체의 풍부도의 정량적 및 상대적 측정치를 제공하기 위해 qPCR을 개발하였다. qPCR을 이용하여 인간 배아 줄기 세포 내에서, 눈 발생 동안 신경망막 세포 내에서, 및 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포 내에서 발현된 유전자를 결정하였다. 각각의 세포 종류에 대한 유전자를 아래 표 7에 나열한다.

hES-특이적 유전자는 Oct-4 (POU5F1), NANOG, Rex-1, TDGF-1, SOX-2, 및 DPPA-2를 포함하는 것으로 결정되었다. 신경 외배엽/신경 망막에 특이적인 유전자는 CHX1O, NCAM, 네스틴, 및 β-튜불린을 포함한다. 반대로, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포는 qPCR 측정에 의해서 PAX-6, PAX2, RPE-65, PEDF, CRALBP, 베스트로핀, MitF, Otx-2, 및 Tyr을 발현하는 것으로 밝혀졌다.

qPCR 시험으로부터 명백한 바와 같이, hES-특이적 유전자는 hES로부터 유래된 RPE 세포에서 심하게 하향조절되는 (거의 1000배) 반면, RPE 및 신경외배엽에 특이적인 유전자는 hES로부터 유래된 RPE 세포에서 광대하게 상향조절된다 (약 100배). 추가로, 완전 성숙한 RPE의 qPCR 분석은 RPE-특이적 마커 RPE65, 티로시나제, PEDF, 베스트로핀, MitF, 및 PAX6의 높은 수준 발현을 입증하였다. 이것은 MitF의 Pax2-유도된 조절 및 최종적으로 분화된 RPE와 연관된 유전자의 하류 활성화에 관한 현재의 문헌과 일치한다.

검정의 결과는 본원에서 기재되는 방법에 의해 제조된 RPE 세포가 hES 세포 또는 신경 외배엽/신경 망막 세포에 의해 발현되지 않는 다수의 유전자를 mRNA 수준에서 발현함을 입증한다. 따라서, 본 발명의 ES-세포 유래된 RPE에서 mRNA의 독특한 분자 지문은 이들 RPE 세포를 당업계의 세포, 예컨대 hES 세포 및 신경 외배엽/신경 망막 세포와 구분되도록 만드는 마커의 세트, 예컨대 RPE-65, 티로시나제, 베스트로핀, PEDF, Mit-F, 및 PAX6을 구성한다. 상기 검정은 또한 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조된 인간 RPE 세포 제제가 hES 세포 오염이 실질적으로 없음을 확인해준다.

실시예 13

웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 RPE -특이적 단백질 발현

인간 RPE 세포에서 발현된 단백질을 확인하기 위해, hES-특이적 및 RPE-특이적 마커의 하위세트를 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다. 액틴을 단백질 로딩 대조군으로서 사용하였다.

웨스턴 블롯 분석은 hES 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포가 hES-특이적 단백질 Oct-4, NANOG, 및 Rex-1을 발현하지 않는 반면, 이들은 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, 및 Otx2를 발현함을 확인한다. 따라서, 이들 단백질은 hES 세포로부터 분화된 RPE 세포의 중요한 마커이다. 반대로, APRE-19 세포는 단백질체 마커 발현의 비결정적인 패턴을 보였다 (WO 2009/051671, 도 6 참조).

검정의 결과는 본원에서 기재되는 방법에 의해 제조된 RPE 세포가 hES 세포 또는 APRE-19 세포에 의해 발현되지 않는 다수의 유전자를 단백질 수준에서 발현함을 입증한다. 따라서, 본 발명의 ES-세포 유래된 RPE 세포에서 단백질 발현의 독특한 분자 지문은 이들 RPE 세포를 당업계의 세포, 예컨대 hES 세포 및 APRE-19 세포와 구분되도록 만드는 마커의 세트, 예컨대 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, 및 Otx2를 구성한다. 상기 검정은 또한 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조된 인간 RPE 세포 제제가 hES 세포 오염이 실질적으로 없음을 확인해준다.

실시예 14

인간 RPE 세포의 동결보존된 제제

인간 RPE 세포가 동결보존 전에 중간 색소침착의 수준에 도달하는 것을 요구하는 것이 바람직하다. 세포가 동결보존을 위해 준비되었는지 결정하기 위해 PCR을 이용할 수 있다 (예를 들어, 적절한 수준의 RPE 특이적 마커). 제조된 인간 RPE 세포의 7개의 로트 (090621, 090606, 1211606, AB3, A090609, A090714, 및 A020101R04)를 선택된 hES 및 RPE 마커에 대해 검정하였다.

각각의 로트에 대해, 7개의 마커에 대한 qRT-PCR 검정을 적어도 2 및 5일까지의 별개의 날에 삼중으로 수행하였다. 데이터를 각각의 실행 동안 각각의 샘플 내에서 관찰된 β-액틴 발현에 대해 표준화하고, 각각의 실험 실행에서 또한 결정된 MA09 hES 참조물 내의 발현 수준에 비교하였다 (인간 RPE 세포의 이들 7개의 로트를 제조하기 위한 방법에서 MA09 hES 세포를 만능 줄기 세포로서 사용하였다). 이어서, 7개의 로트 각각에 대해, 각각의 마커에 대한 평균 발현을 계산하였다. 이어서, 각각의 로트에 동일한 가중치를 제공하기 위해, 7개의 RPE 로트에 대한 평균의 평균을 결정하였다. 4개의 RPE 마커 및 3개의 hES 마커에 대한 개별적인 RPE 로트 평균 및 종합적 평균을 표 8에 제시한다. 각각의 마커에 대해 최고 및 최저의 개별 관찰된 값을 또한 제시한다. 표 8에 제시된 데이터를 도 8에 도시된 막대 그래프에서 플로팅하였다.

검정의 결과는 본원에서 기재되는 방법에 의해 제조된 인간 RPE 세포가 hES 세포에 의해 발현되지 않는 다수의 유전자를 발현함을 입증한다. 따라서, 본 발명의 ES-세포 유래된 RPE 세포에서 단백질 발현의 독특한 분자 지문은 이들 RPE 세포를 hES 세포와 구분되도록 만드는 마커의 세트, 예컨대 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, 및 Otx2를 구성한다. 따라서, 본원에서 기재되는 인간 RPE 세포는 RPE 세포 마커, 즉, RPE65, PAX6, 베스트로핀, 및 MITF의 상향조절, 및 ES 세포 마커, 즉, OCT4, NANOG, 및 SOX2의 하향조절을 보이고, 이것은 인간 RPE 세포가 완전 분화되고 그들의 만능성을 상실함을 확인한다. 상기 검정은 또한 인간 RPE 세포 제제가 hES 세포 오염이 실질적으로 없음을 확인해준다. 또한, 이들 RPE 세포는 바람직한 수준의 색소침착이 있고, 따라서 해동 후에 높은 수준의 생존력을 가지면서 동결보존되고 해동될 수 있다.

실시예 15

인간 RPE 세포의 제약 제제

인간 RPE 의 제약 제제의 제조

인간 RPE 세포의 제약 제제를 클래스 (Class) 100 생물학적 안전 캐비넷 내에서 무균 상태로 제조할 수 있다. 제약 제제에 사용된 희석제는 알콘 (ALCON) BSS 플러스 (Plus)^® 안내 관류 용액 (멸균 평형 염 용액; 밀리리터 (mL)당 염화나트륨 (NaCl) 7.14 mg, 염화칼륨 (KCl) 0.38 mg, 염화칼슘 2수화물 (CaCl₂*H₂O) 0.154 mg, 염화마그네슘 6수화물 (MgCl₂*6H₂O) 0.2 mg, 이염기성 인산나트륨 (HNa₂PO₄) 0.42 mg, 중탄산나트륨 (NaHCO₃) 2.1 mg, 덱스트로스 0.92 mg, 글루타티온 디술피드 0.184 mg, 및 pH를 조정하기 위해 수산화나트륨 및/또는 염산 및 주사용수 함유)일 수 있다. pH는 약 7.5이고, 오스몰랄농도는 약 305 mOsm/Kg이다.

주사 전에, RPE 세포를 사용을 위해 해동할 수 있다. 세포의 바이알을 액체 질소 동결기로부터 제거하고, 37℃에서 수조 내에 넣고, 전체 내용물이 액체가 될 때까지 계속 교반할 수 있다. 각각의 냉동바이알에 대해, 해동된 내용물을 1 mL의 RPE-MM 내에 재현탁하고 별개의 멸균 50 mL 튜브로 옮길 수 있다. RPE-MM을 각각의 원추형 튜브에 첨가하여 부피를 40 mL로 한다. 이어서, 튜브를 원심분리하고, 상청액을 흡인시키고, 펠릿을 40 mL의 BSS-플러스 내에 재현탁할 수 있다. 세포 현탁액을 다시 원심분리하고, 상청액을 흡인시킬 수 있다. 펠릿을 제2 부피의 40 mL의 BSS-플러스 내에 재현탁하고, 세포를 3번째로 원심분리에 의해 펠릿화할 수 있다.

생성되는 펠릿을 해동된 바이알 당 약 75 ㎕의 BSS-플러스 내에 재현탁하고, 세포를 0.5 mL 멸균 미세원심분리관에 옮길 수 있다. 생존가능한 세포 계수를 수행할 수 있고, 적절한 부피의 BSS-플러스를 첨가하여 투약을 위한 적절한 밀도의 세포를 달성한다. 인간 RPE 세포의 제약 제제는 적어도 약 85%의 제제 생존력을 가질 수 있다. 이들 세포는 제조 후 적어도 약 4시간 동안 상기 생존력을 유지할 수 있다. 제형화된 생성물의 200 μL 샘플을 멸균 미세원심분리관에 넣을 수 있다. 바이알을 수술 시설로의 수송을 위해 얼음 상에 놓을 수 있으며, 이는 제조 후 적어도 약 4시간 동안 안정하다 (예를 들어, 세포는 제조의 적어도 약 4시간 이내에 치료에서 사용될 수 있다). 도 7을 참조한다.

제약 제제 내의 DMSO 수준

RPE 세포의 3개의 예시적인 로트: 090621, MA09p334+2, 및 MA01p50+4. 각각의 로트를 해동하고, 1333개의 생존가능한 세포/㎕의 세포 밀도 (예를 들어, 약 2x10⁵ 세포 용량과 동등함)를 달성하도록 최종 용량 제제를 본원에서 기재되는 바와 같이 제조하였다. 세포 현탁액의 200 ㎕ 샘플을 냉동바이알에 옮기고, -20℃에서 동결시키고, 기체 크로마토그래피를 이용하여 DMSO 잔류 수준의 결정을 위한 시험 실험실로 운송하였다.

결과는 RPE 로트 090621, MA09p334+2, 및 MA01p50+4의 제약 제제의 제조가 극히 낮은 DMSO 잔류 수준 (ppm)을 생성시켰음을 나타낸다 (예를 들어, 임상 투여를 위해 허용되는 것으로 간주되는 수준 미만). 따라서, 설명된 RPE 세포의 제조는 임상 투여를 위해 허용되는 DMSO 잔류 수준을 생성시킨다.

제약 제제 내의 내독소 수준

RPE 세포의 3개의 예시적인 로트: 090621, MA09p334+2, 및 MA01p50+4. 각각의 로트를 해동하고, 1333개의 생존가능한 세포/㎕의 세포 밀도 (예를 들어, 약 2x10⁵ 세포 용량과 동등함)를 달성하도록 최종 용량 제제를 앞서 설명되는 바와 같이 제조하였다. 세포 현탁액의 100 ㎕ 샘플을 냉동바이알에 옮기고, 4℃에서 저장하고, 0.001 EU/mL의 민감도로 동역학적 비탁 검정을 이용하여 내독소 수준을 위한 시험 실험실로 운송하였다.

결과는 RPE 로트 090621, MA09p34+2, 및 MA01p50+4를 사용하는 임상 제형의 제조가 각각 < 0.100, 0.993 및 < 0.100 EU/mL의 내독소 수준을 생성시켰음을 나타낸다. 따라서, 본원에서 기재되는 방법에 따른 RPE 세포의 제조는 임상 투여를 위해 허용되는 내독소 수준을 생성시킨다. 따라서, 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조된 인간 RPE 세포는 제조되고, 저장되고, 해동되고, 치료 용도에 적합한 제약 제제로 제형화될 수 있다.

실시예 16

모세관 및 캐뉼라 세포 전달 시스템

바늘/주사기 및 캐뉼라 시스템을 작은 부피 (예를 들어, 약 2-3 ㎕)에서 약 1x10⁵개 인간 RPE 세포의 세포 용량에서 인간 RPE 세포의 손상/상실 (예를 들어, 세포 생존력/활성, 주사기에 대한 세포 부착)에 대해 시험하였다.

모세관 세포 전달 시스템

RPE 로트 090621의 동결보존된 바이알을 해동하고, 제약 제제로 제형화하였다. 생성되는 RPE를 BSS-플러스 내에 제형화하고, 50,000개의 생존가능한 세포/마이크로리터 (㎕)로 재현탁하였다.

사용된 모세관 전달 시스템은 25 ㎕ 해밀턴 (Hamilton) 주사기 및 월드 프리시젼 인스트루먼츠 (World Precision Instruments (WPI))에서 제조한 표준 유리 모세관 (Standard Glass Capillaries: 4 인치 (100 mm); 1.5/0.84 OD/ID (mm) 필라멘트, 천연 가스를 사용하여 불꽃 연마됨)이었다.

해밀턴 주사기 및 유리 모세관을 사용 전에 고압멸균하였다. 튜브를 주사기 및 바늘을 사용하여 70% 멸균 에탄올로 플러싱하였다. 이어서, 사용 전에 멸균 PBS로 철저히 플러싱하였다. 20 게이지 주사기 바늘을 주사기에 끼웠다. 튜브의 한 말단을 바늘에 맞게 끼우고, 튜브의 다른 말단은 모세관 위에 삽입하였다.

BSS-플러스를 모세관, 튜브 및 주사기 내로 넣었다. 이어서, 세포와 배지 사이에 기포가 존재하는 것을 확실하게 하기 위해 튜브의 약 2-3 인치가 빌 때까지 BSS-플러스를 방출하였다. 약 10-12 ㎕의 세포 현탁액을 모세관 내로 넣었다. 약 2 ㎕의 세포 현탁액을 약 10-20초 간격에 걸쳐 멸균 미세원심분리관 내로 분배하였다. 약 16 ㎕가 약 1.5-2분에 걸쳐 전달될 때까지 분배를 8회 반복하였다.

이어서, RPE 세포를 생존가능한 세포수 및 배양액에서 성장하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 모세관을 통해 전달된 RPE 세포의 샘플을 트리판 블루 배제에 의해 생존가능한 세포에 대해 시험하고, 전달되지 않은 동일한 제형화된 RRE 세포와 비교하였다. 또한, 대조군 및 모세관 적용 세포를 1 mL의 RPE 성장 배지에 웰당 50,000개의 생존가능한 세포로 4-웰 플레이트에 시딩하였다. 4일 동안 배양한 후, 대조군 및 모세관 전달 RPE 세포를 트립신으로 처리하고, 세포 계수를 수행하였다.

동결보존된 RPE 세포 (로트 090621)의 바이알을 해동하고, 세척하고, BSS-플러스 내에 50,000개의 생존가능한 세포/마이크로리터의 농도로 재현탁하였다. 제형화된 RPE의 생존력은 88%이었다. 모세관 시스템을 통해 전달된 RPE 제제 대 대조군 세포에 대해 수행된 생존가능한 세포 계수는 표 9에 제시된다.

장기 생존을 평가하기 위해서, RPE 모세관 전달된 및 대조군 RPE 세포의 분취액을 웰 당 50,000개의 생존가능한 세포로 시딩하고, 4일 동안 배양한 후, 수거하고 계수하였다. 이들 결과를 또한 표 8에 제시한다.

모세관-주사된 및 비-주사된 RPE는 생존력, 생존가능한 세포 수 또는 배양액 내에서 번식하는 능력에 대해 차이를 보이지 않았다. 전임상 연구에서 사용된 모세관-주사 시스템은 RPE 수, 생존력 또는 배양액에서 증식하는 그의 능력에 대해 유해한 효과를 보이지 않았다.

캐뉼라 세포 전달 시스템

세포 전달 시스템, 즉 30-게이지의 각진 경질 주사 (Angled Rigid Injection) 캐뉼라 (시너제틱스 인크. (Synergetics Inc.))의 사용이 RPE 세포의 생존력 또는 생존가능성에 대한 영향을 갖지 않음을 확인하기 위한 연구를 수행하였다. 이 연구는 800개의 세포/㎕ 및 1,000개의 세포/㎕의 명목 세포 농도로 수행하였다.

동결보존된 RPE 세포 (로트 090621)를 해동하고, MDBK-MM 배지로 세척하고, BSS-플러스로 재현탁하였다. 재현탁시킨 RPE 세포를 원심분리하고, 400 ㎕의 BSS-플러스로 새로운 미세원심분리관 내에 다시 재현탁하였다. 생존가능한 세포 계수를 세포 현탁액에 대해 수행하고, 농도를 표적 농도의 ± 5%로 조정하였다. 경질 주사 캐뉼라를 1 mL TB 주사기에 무균 상태로 부착시키고, 200 ㎕의 세포 현탁액을 캐뉼라를 통해 주사기 내로 넣었다. 관 내의 잔여 200 ㎕를 "비-캐뉼라"으로 표지하였다. 주사기 내의 세포 현탁액을 10초에 걸쳐 10-15 ㎕의 속도로 새로운 미세원심분리관 내로 분배하였다.

생존가능한 세포 계수를 "캐뉼라-주사된" 샘플에 대해 수행하였다. "비-캐뉼라" 및 "캐뉼라" 샘플 모두로부터 10,000개의 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 세포를 RPE-GM에 배양하였다. 또 다른 세포 계수를 장기 생존 상태를 평가하기 위해서 접종 후에 3-4일 동안 수행하였다. 캐뉼라-주사된 샘플 및 비-캐뉼라 주사된 샘플에 대한 세포 계수를 표 10에 제시한다.

캐뉼라 계대배양 후의 생존가능한 세포의 수/㎕는 표 9에 제시된 바와 같이 비-주사된 RPE 세포와 대등하였다. 또한, 접종 후 3-4일 동안 생존가능한 세포의 수는 유의하게 상이하지 않았다. 본원에서 제시된 데이터는 인간 RPE 세포의 투여를 위해 사용될 수 있는 바늘/주사기 및 캐뉼라 시스템이 세포의 손상/손실 (예를 들어, 세포 생존력/활성, 주사기에 대한 세포 부착) 없이 작은 부피 (예를 들어, 약 2-3 ㎕)에서 1x10⁵개의 인간 RPE 세포까지의 세포 용량을 전달할 수 있음을 입증한다. 결론적으로, 캐뉼라/주사기 계대배양은 RPE 세포의 생존력 또는 생존가능성에 실질적으로 영향을 주지 않는다. 이것은 래트 및 마우스에서 망막하 주사 후에, RPE 세포가 현미경에서 및 인간 특이적 항원을 사용한 면역염색을 이용할 때 모두 보인다는 전임상 데이터와 일치한다.

실시예 17

RPE 세포는 종양 발생성이 아니다.

본원에서 기재되는 RPE 세포의 생산 방법은 RPE 세포 제제로부터 ES 세포를 제거하여, 기형종 형성의 위험을 감소시킨다. 이것은 본원에서 기재되는 RPE 세포에서 hES의 존재를 검출하기 위한 검정에서 확인되었다. 본원에서 기재되는 인간 RPE 세포를 종양 형성에 대해 시험하였고, 상기 종양은 검출되지 않았다.

연구에 적합한 것으로 고려되는 NIH-III 누드 마우스를 세포 이식 전에 칭량하였다. 총 27마리의 동물을 hES 세포로 처리하고, 30마리의 동물을 RPE 세포로 처리하고, 10마리의 동물은 처리하지 않고 두었다. 모든 이식 절차가 완료된 후, 56마리의 수컷 마우스 (19.6 내지 26.0 g의 무작위 선발)를 각각의 군에 대해 간단한 무작위 선발을 통해 다음 표에서 확인되는 각각의 대조군 및 처리군으로 분류하였다.

부검시에, 동물을 안락시키고, 순차적으로, 군을 번갈아가며 부검하였다. 동물을 4, 12 및 40주 (동물 모델의 대략적인 수명)에 평가하였다. 각각의 동물의 한쪽 눈만을 처리하였기 때문에, 각각의 동물은 그 자체의 대조군으로 기능하였다.

hES 세포군에서는 100%의 동물에서 유의한 종양 형성이 관찰되었고, 일부는 4주의 이른 시기에 관찰되었다. 이와 대조적으로, RPE 처리 동물은 동물의 수명 내내 종양을 형성하지 않았다. 따라서, 인간 RPE 세포 제제는 이식 후에 종양 형성의 위험을 갖지 않는다. 따라서, 인간 RPE 세포 제제는 이식 (예를 들어, 치료 용도)에 사용하기 위해 허용된다.

실시예 18

RPE 세포는 안정하고, 이식 후에 동물 모델에 통합된다

세포-기반 요법 (예를 들어, 이식)의 성공 및 유용성에 대한 근본적인 제한은 이식 후에 이식된 세포가 생존하고 그의 표현형을 유지하고 통합되고 기능을 수행할 수 없다는 점이다. 22마리의 NIH-III 마우스의 눈에 주사한 후 RPE 세포의 안정성 및 통합을 평가하기 위해서, 이식된 인간 RPE 세포의 존재 및 표현형 안정성을 면역형광 (인간 분자 마커를 검출하기 위해) 및 PCR (인간 DNA를 검출하기 위해)에 의해 확인하였다. 1주, 1개월, 3개월, 및 9개월 시점에서, hRPE는 그의 물리적 특징에 의해 (예를 들어, 마우스 모델에서 그의 mRNA 및 단백질 발현 및 인간 DNA의 존재에 의해) 다른 세포로부터 구분되어 확인되었다.

동시- 면역형광

인간 RPE 세포가 주사된 마우스 눈에서, 인간 RPE 세포는 인간 미토콘드리아 항원 및 베스트로핀 항원 모두에 대한 양성 동시-면역형광에 의해 확인되었고, 주사 9개월 후에 마우스 망막 색소 상피 세포층 내에, 망막 아래에, 후방 내에 또는 남아있는 반흔 내에 위치하였다. 광학 현미경 하에, 양성 염색 세포의 형태를 작은 황갈색 세포질내 색소에 의해 편심적으로 치환된 둥근 핵이 있는 입방형 세포의 대체적으로 선형인 배열로서 특성화하였고, 이것은 망막 색소 상피 세포와 일치하였다.

인간 미토콘드리아 및 베스트로핀 모두에 대해 양성으로 염색된 세포는 RPE 층 내에서, 망막하 위치에서, 반흔 내에서 선형 내지 작은 둥근 응집체로서, 또는 후방 유리체 공간 내에서 작은 응집체로서 확인되었다. 구체적으로, RPE와 일치하는 면역형광 세포는 상기 연구에서 관찰된 12개의 마우스 눈 중 8개에서 마우스 RPE 층 및 망막하 공간 내에서 확인되었다. 4개의 마우스 눈 중 2개에서, RPE 세포는 또한 후방 내에서 및 4마리의 마우스 중 1마리에서 확인되었고, RPE 세포는 반흔에서 확인되었다. RPE 세포는 염색을 위해 준비한 12개의 눈 중 3개에서 관찰되지 않았다.

명시야 광학 현미경 하에서, 모든 사례에서, 양성-염색 인간 세포의 형태는 작은 황갈색 세포질내 색소에 의해 편심적으로 치환된 둥근 핵이 있는 4 내지 10개의 입방형 세포의 조직화된 선형 배열로서 특성화하였고, 이것은 망막 색소 상피 세포와 일치하였다. 마우스 RPE와 회합할 때, 인간 세포는 기부에 위치하는 핵 및 정점에 위치하는 색소화 과립이 있는, 기저막을 따라 전형적인 극성을 보였다. 인간 세포는 인간 세포가 마우스 RPE에 비해 더 적고 더 작은 황갈색 색소화 과립을 갖고 약간 더 크기 때문에 마우스 RPE와 구분될 수 있다. 명시야 현미경의 조건 하에 조사된 절편에서 비정상적인 성장의 증거는 존재하지 않았다.

이소형 또는 음성 항체 대조군은 임의의 특이적인 염색을 보이지 않았다. 비처리한 눈은 임의의 형광에 대해 일관되게 음성이었다.

인간 DNA 의 검출

모든 코호트 (cohort) 내에 동물간 변이가 널리 존재하지만, 인간 DNA는 최종 (이식 후에 9개월) 시점에서 분석된 22마리의 마우스를 포함하여 시험된 모든 이식된 마우스에서 검출되었다. DNA는 50,000개의 RPE 세포를 투여한 마우스에 비해 100,000개 세포 용량을 투여한 마우스에서 일반적으로 더 높았다. DNA 함량의 지속적인 증가 또는 감소를 보이지 않으면서 9개월까지 관찰 기간 전체에 걸쳐 존재하는 비교적 지속적인 DNA 수준이 존재한다. 추가로, 조직병리학적 평가를 통해 RPE 세포는 9개월까지 동물 눈에서 생존하였음이 확인되었다.

이식된 인간 RPE 세포를 투여한 눈은 전형적인 RPE 형태를 갖는 베스트로핀 양성 세포의 건강한 띠를 보였다. 종양은 100% hES 용량이 주사된 마우스를 제외하고 상기 군 또는 임의의 다른 코호트에서 검출되지 않았다.

이들 데이터는 NIH-III 마우스 모델이 유의한 시간 간격 동안 주사된 인간 RPE 세포의 생존을 지지함을 보여준다. 변성 망막 질환에 대한 줄기 세포-기반 치료법을 개발하기 위한 주요 장애물은 수여자 망막 내로 이식된 망막 줄기 세포의 빈약한 통합 및 분화이다. 이와 반대로, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 잘 관용되고, 안정하고, 종양을 형성하지 않으면서 투여 후에 환자 내로 통합된다.

실시예 19

인간 RPE 세포는 눈 조직에서의 주사 후에 장기간 생존한다

세포 기반 치료 (예를 들어, 이식)의 성공 및 유용성에 대한 근본적인 제한은 이식 후에 이식된 세포가 장기간 생존할 수 없고 기형종 형성 위험이 있다는 점이다. 본 실시예의 목적은 주사 1, 3 및 9개월 후에 RPE 세포의 형태를 확인하고, 위치를 결정하고, 특성화하는 것이었다. 이식된 인간 RPE 세포는 200일까지에 걸쳐 대표적인 동물에서 생존하였고, 눈에 종양 형성 또는 비-망막 인간 세포의 증거가 존재하지 않았다. 이용한 Ki67 염색에서 평가된 동물에 대해 9개월 시점에서 세포 증식을 평가하였다. 상기 어떤 연구에서도 증식이 관찰되지 않았다.

선택된 눈 조직 절편을 인간 미토콘드리아, 인간 베스트로핀, 및 인간 Ki67의 존재에 대해 염색하였다. 항-인간 미토콘드리아 염색은 인간 세포 기원을 확인하기 위한 투명한 마커로서 사용되었다. 베스트로핀은 망막 색소 상피 세포에서 발현되는 기저측부 혈장 막 단백질이고, RPE 기원을 확인하기 위해 사용되었다. Ki67은 잘 알려진 세포 증식 마커이다 (예를 들어, 문헌 [Magdelenat (1992) J, Immunol. Methods 150(1-2): 133-43] 참조).

면역형광 염색은 관심있는 세포 내의 색소의 존재에 의해 항원을 입증하고 베스트로핀 및 Ki67에 대한 절편의 이중 염색을 용이하게 하기 위해 면역퍼옥시다제 염색 대신 선택되었다. 본 연구에서 Ki67 염색은 1개월 및 3개월 시점에서만 수행되었다.

양성 및 음성 대조군 조직은 최소의 비특이적 배경 염색과 함께 특이적, 감수성 및 재현가능한 염색을 보였다. 선홍색 점상 세포질 염색으로서 인간 미토콘드리아에 대해 염색된 세포는 Cy3 580 nm 필터로 관찰되었다. 밝은 녹색 기저측부 막 염색으로서 베스트로핀에 대해 염색된 세포는 즐렉사(Zlexa) 488/디라이트(Dylight)488-550 nm 필터로 관찰되었다. Ki67 염색은 핵에 대해 특이적이고, 동일한 필터 하에서 밝은 녹색이었다. 마우스 조직과 교차 반응성이 존재하지 않기 때문에 항체는 인간-특이적인 것으로 보였다. 그러나, 일부 배경 염색은 대체로 망막 광수용체, 혈관벽, 콜라겐 또는 골격근과 회합되어 일부 절편에서 보이지만, 휘도 수준, 염색 패턴 및 위치를 기초로 하여 쉽게 구분되었다.

이소형 또는 음성 항체 대조군은 임의의 특이적인 염색을 보이지 않았다. 비처리한 눈은 임의의 형광에 대해 일관되게 음성이었다

모든 시점에서, 인간 미토콘드리아 및 베스트로핀 모두에 대해 양성인 세포 염색은 RPE 층 내에서, 망막하 위치에서, 때로 반흔 내에서 선형 내지 작은 둥근 응집체로서, 또는 후방 유리체 공간 내에서 작은 응집체로서 확인되었다. 모든 사례에서, 상기 인간 세포의 형태는 작은 황갈색 세포질내 색소에 의해 치환된 둥근 핵이 있는 조직화된 입방형 상피 세포로서 특성화되었고, 이것은 색소화 상피 세포와 일치하였다. 마우스 RPE와 회합할 때, 인간 세포는 기부에 위치하는 핵 및 정점에 위치하는 색소화 과립이 있는, 기저막을 따라 전형적인 극성을 보였다. 인간 세포는 인간 세포가 마우스 RPE에 비해 더 적고 더 작은 황갈색 색소화 과립을 갖고 약간 더 크기 때문에 마우스 RPE와 구분될 수 있다.

1개월 시점에, RPE 세포는 100,000개의 세포를 투여한 6마리의 마우스 중에서 5마리에서 RPE 내 및/또는 망막하에서 선형의 조직화된 세포로서 쉽게 확인되고, 핵 Ki67-양성 염색은 RPE 세포가 확인된 5마리의 마우스 눈 중에서 4마리에서 관찰되었다. 50,000개의 세포를 투여한 마우스에서, RPE 세포는 6마리의 마우스 눈 중 3마리에서 관찰되었고, Ki67-양성 세포는 또한 상기 동일한 3마리의 마우스 눈에서 관찰되었다.

3개월 시점에, 대부분의 슬라이드는 중등도 절편 인공물을 가졌지만, RPE 세포의 작은 응집체가 100,000개의 세포를 투여한 6마리 마우스 중 2마리에서 및 50,000개의 세포를 투여한 6마리 마우스 중 3마리에서 RPE 및/또는 망막하 공간 내에서 확인되었다. Ki67 염색을 100,000개의 세포를 투여한 2마리 마우스 및 50,000개의 세포를 투여한 4마리 마우스에 대해 수행하였고: Ki67 양성 염색이 6마리의 마우스 중 4마리에서 인간 RPE 세포에서 관찰되었다. Ki67에 대한 염색은 RPE에 대한 염색이 적절했던 2마리의 마우스에서 관찰되지 않았다 (50,000개의 세포 용량군 모두에서). 100,000개의 세포를 투여한 2마리의 마우스에서, 단지 일부의 RPE 세포만이 확인되었고, Ki67 상태 평가에 부적절한 것으로 간주되었다.

9개월 시점에, 면역양성 RPE 세포가 100,000개의 세포를 투여한 6마리의 마우스 눈 중 5마리 및 50,000개의 세포를 투여한 5마리의 마우스 눈 중 2마리에서 마우스 RPE 및/또는 망막하 공간에서 확인되었다. 11마리의 마우스 중 1마리 (100,000개의 세포를 투여한 동물 번호 743)에서, 면역양성 RPE 세포는 후방 및 반흔에서 확인되었고; 1마리의 동물 (50,000개의 세포를 투여한 동물 번호 744)에서, RPE 세포는 반흔에서만 관찰되었다. RPE 세포는 9개월 시점에서 50,000개의 세포군에서 염색을 위해 준비된 5개의 눈 중 2개에서 확인되지 않았다. Ki67 염색은 상기 군의 슬라이드에 대해 수행되지 않았다

결론

인간 망막 색소 상피 세포가 주사된 마우스 눈에서, RPE 세포는 인간 미토콘드리아 항원 및 베스트로핀 항원 모두에 대한 양성 동시-면역형광에 의해 확인되었고, 주사 9개월 후에 마우스 망막 색소 상피 세포층 내에, 망막 아래에, 후방 내에 또는 남아있는 반흔 내에 위치하였다. 명시야 광학 현미경 하에, 양성 염색 세포의 형태를 작은 황갈색 세포질내 색소에 의해 편심적으로 치환된 둥근 핵이 있는 입방형 세포의 대체적으로 선형인 배열로서 특성화하였고, 이것은 망막 색소 상피 세포와 일치하였다. 상기 세포의 하위세트는 주사 1개월 및 3개월 후에 증식 마커 Ki67에 대한 핵 양성을 보였다.

기능은 생후 180일 (즉, 이식 후에 160일)까지 기준선 수준으로 악화되었다. 기능이 감소되는 시점에, 병리학적 소견의 징후는 존재하지 않았다.

또한, 잔여 망막의 외형도 조사하였다. 불리한 소견은 존재하지 않았다. 인간 핵 마커 염색에 의해 관찰되는 공여자 세포 생존의 빈도는 작지만, 대부분의 이식된 동물에서 광수용체 생존은 명백하였다. 외부로부터의 세포 성장의 또는 내망막 내의 비정상적인 세포 패턴의 소견은 존재하지 않았다.

공여자 세포가 일부의 상기 눈에서 더 이상 명백하지 않다는 사실에도 불구하고, 이식 세포가 도입된 영역에서 RCS 래트에서 정상 망막 외형 (즉, 혈관 이상, 판 장애 (laminar disorder)가 없음)이 관찰되었다. 광수용체는 존재하는 경우에도 P21 이식 후에 생후 100일에서 일반적으로 관찰되는 것보다 그 수가 더 적었다. 공여자 세포의 잠재적인 종양 성장에 대한 증거는 조사된 임의의 눈에서 볼 수 없었다.

인간 색소화 상피 세포가 래트 망막 색소 상피 세포의 세그먼트 내에서 확인되었고, 따라서 수술 후 > 220일까지 대표적인 동물에서 인간 세포를 확인하였다. 세포는 RPE 형태와 일치하였고, 베스트로핀에 대해 양성이었다. 따라서, 통합되어 안정한 기능적 망막 색소 상피층을 형성하는, 본원에서 기재되는 인간 RPE 세포는 이식될 수 있다.

다른 이식 위치와 달리, 눈은 작은 장기이고, 망막하 공간 내로 이식될 수 있는 세포의 수는 다른 병태에 대해 다른 부위 내로 주사될 수 있는 수백만 개의 세포에 비해 매우 적다 (예를 들어, 100,000개의 RPE 세포). 추가로, 다양한 동물 모델에서 이식된 세포 (예를 들어, 이종, 동종이형, 동계, 또는 자가)의 생존율은 일반적으로 낮다. 공여자 세포는 이식 후에 (예를 들어, 수일 내지 3주) 쉽게 검출될 수 있지만, 시간 경과에 따라 생존이 점진적으로 감소하여, 일반적으로 동물 모델 연구에서 1% 미만의 장기간 생존을 야기한다. 예를 들어, 문헌 [Wang, et al. (2005) Invest Opthalmol Vis Sci 46(7): 2552-60]은 면역억제된 RCS 래트 눈에서 이식 후 6주에서의 5% 내지 28주에서의 0.2%까지 생존 인간 RPE 세포의 상실을 보고하였다. 문헌 [Carr, et al. (2009) PLoS One 4(12): 8152]에는 인간 iPS-RPE 세포가 이식 13주 후에 검출가능하지 않았음이 개시되어 있다. 문헌 [Del Priore, et al. (2003) Invest Opthalmol Vis Sci 44(9): 4044-53]에서는 토끼 눈 모델에서 12주 후에 < 1%의 돼지 RPE 세포를 발견하였고, 문헌 [Canola, et al. (2007) Invest Opthalmol Vis Sci 48(1): 446-54]은 단지 0.44%의 주사된 세포만이 3개월시에 생존함을 보여주었다. 본원에서 기재되는 방법에서, 이식된 RPE 세포의 일부만이 (예를 들어, > 1%) 장기간 생존할 수 있다 (예를 들어, 9개월에 걸쳐). 그러나, 본 발명자들은 시력 개선에 영향을 주기 위해 단지 적은 수의 세포만이 필요함을 발견하였다.

실시예 20

다양한 전달 절차의 평가

본 실시예의 목적은 망막하 수포 (bleb)를 생성하는 방법인 특정 유리체 절제술에서 비-인간 영장류에서 RPE 세포의 망막하 주사, 및 세포 용량을 조사하는 것이었다. 줄기 세포 이식편 거부의 위험 및 세포 주사의 결과로서 망막 생리에 대한 임의의 해로운 효과의 존재도 조사되었다. 연구는 8마리의 동물 (16개의 눈)을 이용하였다. 모든 동물에게 표 14의 스케쥴에 따라 주사하였다.

수술을 2일에 수행하였다: 제1 수술일에 다음 단계를 따랐다: 동물에게 삽관한 후, 눈 주위의 영역을 아이오딘 용액으로 수술 준비를 하였다. 1060 드레이프를 사용하여 눈 수술을 위해 동물을 씌웠다. 각각의 동물에 대해, 우측 눈을 먼저 수술하고, 이어서 좌측 눈을 수술하였다. 바라커 (Barraquer)-타입 검경을 삽입하였다. 윤부결막절개를 상측두 사분면에 생성하였다. 지혈을 달성하기 위해 공막 베드 (scleral bed)를 습윤 필드 (wet-field) 소작술로 소작하였다. 공막절개는 20 게이지 MVR 블레이드로 윤부 3 mm 뒤에 생성하였다. 플러그 (plug)를 삽입하고, 윤부결막절개 및 공막절개를 생성하기 위해 상비측 사분면에서 유사한 절차를 수행하였다.

일부 대상체에 대해, 후유리체를 상승시키기 위해 말단-세척 광 파이프 (end-irrigating light pipe), 유리체 절제기, 및 손에 쥐는 (hand-held) 세척 콘택트 수정체를 사용하여 유리체 절제를 수행하였다. 이어서, 19 게이지 말단-세척 광 파이프, 시너제틱스 망막하 주입기, 및 마케머 (Machemer) 세척 콘택트 수정체를 사용하여 망막하 수포를 생성하였다. 이어서, 망막하 픽 (pick)을 사용하여 세포를 주사하였다. 이어서, 공막 절개부를 6-0 비크릴 (Vicryl) 봉합사로, 결막 윤부결막절개부를 6-0 플레인 구트 (plain gut) 봉합사로 봉합하였다. 지나세프 (Zinacef) (세푸록심, 125 mg) 및 데카드론 (Decadron) (덱사메타손, 10 mg)을 결막하 주사로서 양쪽 눈에 투여하였다. 에리트로마이신 연고를 양쪽 눈 위에 도포하였다.

제2일차 수술시에, 다음 단계를 따랐다: 동물에게 삽관한 후, 눈 주위의 영역을 아이오딘 용액으로 수술 준비를 하였다. 1060 드레이프를 사용하여 눈 수술을 위해 동물을 씌웠다. 각각의 동물에 대해, 우측 눈을 먼저 수술하고, 이어서 좌측 눈을 수술하였다. 바라커-타입 검경을 삽입하였다. 윤부결막절개를 상측두 사분면에 생성하였다. 지혈을 달성하기 위해 공막 베드를 습윤 필드 소작술로 소작하였다. 공막절개는 20 게이지 MVR 블레이드로 윤부 3 mm 뒤에 생성하였다. 플러그를 삽입하고, 윤부결막절개 및 공막절개를 생성하기 위해 상비측 사분면에서 유사한 절차를 수행하였다. 이어서, 19 게이지 말단-세척 광 파이프, 시너제틱스 망막하 주입기, 및 마케머 세척 콘택트 수정체를 사용하여 망막하 수포를 생성하였다. 이어서, 망막하 픽을 사용하여 50 마이크로리터의 줄기 세포 (2000개의 세포/마이크로리터)를 각각의 수포 내로 주사하였다. 이어서, 공막 절개부를 6-0 비크릴 봉합사로, 결막 윤부결막절개부를 6-0 플레인 구트 봉합사로 봉합하였다. 지나세프 (세푸록심, 125 mg) 및 데카드론 (덱사메타손, 10 mg)을 결막하 주사로서 양쪽 눈에 투여하였다. 에리트로마이신 연고를 양쪽 눈 위에 도포하였다. 각각의 수술 후에, 망막 사진 촬영 및 ERG를 수행하였다. 종료시에, 모든 동물에 대해 전체 부검을 수행하고, 눈을 조직학적으로 검사하였다.

요약하면, 기술은 세척 광 파이프 및 망막하 캐뉼라를 사용하여 2 포트 (two port) 평면부 방법으로 개량되었고, 본 발명자들은 망막하 공간에 대한 성공적인 이식을 조직학적으로 확인하였다. 또한, 요구될 경우, 유리체 절제를 수행할 수 있다.

망막하 수포 형성을 위한 한 적합한 방법은 다음과 같다: 망막은 평형 염 용액 (BBS)이 담긴 스크류 플런저 (screw plunger)가 있는 해밀턴 1 ml 주사기에 연결된 시너제틱스 망막하 캐뉼라로 접근될 수 있다. BSS는 서서히 주사되어 망막 절개부를 형성될 수 있고, 이어서 작은 망막하 수포가 발생한다. 이것은 망막 외상을 최소화할 수 있다. 이어서, 캐뉼라를 망막 절개부를 통해 도입하고, BSS 주사를 다시 시작하여 수포를 정확한 부피로 계속 팽창시킬 수 있다. 부드러운 망막 마사지 과정은 수포 내의 장력을 방출한다. 시너제틱스 캐뉼라를 제거할 수 있고, 튜브에 연결된 30-게이지 허리케인 인스트루먼츠 (Hurricane Instruments) 바늘 및 세포가 미리 로딩된 주사기를 도입할 수 있다. 정확한 캐뉼라 위치를 보장하고 역류를 최소화하기 위해 직접 보면서 약 1분에 걸쳐 세포를 주사할 수 있다. 상기 기기 사용 절차는 인간에 사용하기 적합하다.

망막 사진 촬영 및 전기생리학 시험을 각각의 눈에 대해 수술전 및 2주 및 1개월 시점에 수행하였다. 완전한 망막 재부착이 24시간 내에 관찰되었고, 다초점 ERG 기록은 병상의 어떠한 전기생리학적 증거를 보이지 않았다. 전체적으로, 8마리의 성체 히말라야 원숭이의 15개의 눈에 대해 조직학적 검사를 수행하였고; 하나의 눈은 내안구염이 발생하여 연구로부터 제외하였다. BrdU 표지를 사용하여 인간 RPE 세포를 검출하였다. 세포는 망막하 공간에 위치하는 것으로 관찰되었고, 망막 재부착, 망막 형태의 매우 우수한 보존, 및 염증 또는 거부의 결여와 연관된다.

실시예 21

광수용체 내의 RPE 세포는 RCS 래트 모델에서 회복된다

출생후 제21일 - 23일 (P21 - 23)에, RCS 래트 (n=14)를 안락사시키고, 공막 경유 방법을 통한 20,000개의 hRPE 세포/눈의 망막하 주사를 상부 측두 망막 영역 내로 시행하였다. 대조군 래트에는 배지 단독을 주사하였다 (n=8). 비-이영양성 유사유전자형 (congenic) 래트가 비교를 위해 이용가능하였다. 모든 동물에게 2주 동안 매일 덱사메타손 (1.6 mg/kg, i.p.)을 주사하고, 동물이 안락사할 때까지 세포 주사 수일 전에 음용수 내에 투여된 시클로스포린-A (210 mg/L; 생성 혈액 농도: 250-300 ㎍/L) 상에 유지하였다.

시각 기능을 시험하기 위해, 광 플래시에 반응한 외부 (a-파) 및 내부 (b-파) 망막의 전기 활성을 P60 및 P90 모두에서 ERG 반응에 의해 시험하였다. P60에서, a-파 ERG 반응은 RCS 래트에서 정상적으로 상실되고, P90에서, b-파 반응은 심하게 격감되어 이식편-관련 효과가 배경 성능보다 우선하여 인식될 수 있다. P60에서, hES-RPE 이식 동물은 a-파 (31 ± 27 대 6 ± 17 V), b-파 (108 ± 46 V 대 36 ± 33 V) 및 원추세포 b-파 (57 + 19 대 28 ± 13 V)에 대해 샴-주사된 동물보다 유의하게 더 우수한 반응을 달성하였다 (p ≤ 0.05, t-검정) (도 9).

시운동 시험은 공간 시력 (spatial acuity)의 척도를 제공하기 위해 사용되었다. P100 샴-주사된 래트에서, 0.29 ± 0.03 c/d의 역치 반응이 기록되었고, 비처리 동물은 0.21 ± 0.03 c/d의 수치를 보였다. 반대로, 세포-이식 래트는 샴 주사된 래트보다 유의하게 더 우수한 0.42 ± 0.03 c/d의 수준을 유지하였다 (p ≤ 0.05, t-검정) (도 10).

시운동 시험에서 평균 및 최고 실행자를 휘도 역치 반응 시험을 위해 각각의 군으로부터 선택하였다. hRPE 세포 투여 (n = 7), 샴 주사 (n = 5), 및 비처리 (n = 6) 동물로부터 결과를 얻었다. 비-이영양성 래트에서, 0.6 로그 단위 미만의 역치 반응이 기록되었다. P100에서, 전체 시약에 걸친 비처리 RCS 래트 뉴런은 2.7 로그 단위 또는 이보다 우수한 역치로 반응하지 못하였고, 반응은 샴-주사된 래트에서 18%의 영역으로부터 유도될 수 있었다. 비교하면, 세포-주사된 래트는 2.7 로그 단위 또는 이보다 우수한 역치를 갖는 52%의 소구 (collicular) 영역을 보였고, 최고 지점은 1.3 로그 단위이었다 (도 11).

망막의 조직학적 검사는 RPE-특이적 마커 (RPE65 및 베스트로핀)에 대해서도 염색하는 인간 특이적 핵 마커의 존재를 입증하였다. 인간-특이적인 증식 세포 핵 항원 (PCNA)을 사용한 염색은 음성이었고, 이것은 hRPE 세포의 증식이 없음을 나타낸다. 추가로, 조직학은 염증 또는 면역 세포 침윤 없이 및 세포 증식 또는 종양 형성 없이 세포 집단이 지속됨을 보여주었다.

본 연구 결과는 모든 3개의 기능적 평가에 의해 결정될 때 대조군에 비해 유의한 시력 회복이 존재함을 나타낸다. 세포는 RCS 래트 내로 이식 후에 장기간 (> 100일) 생존하였고, 망막 내로 이동하지 않으면서 망막하 공간에 위치하였다. 대규모 광수용체 회복 (외핵층 내 깊이 위치하는 5-7개의 세포) 이외에, 시운동 시스템에 의해 측정된 상대적인 능력은 hES-유래 hRPE로 처리된 동물이 샴 및 비처리 대조군보다 유의하게 더 우수하게 기능함을 보여주었다 (각각 시각 능력의 50% 및 100% 개선; 시력은 정상 비-이영양성 래트의 약 70%임). 또한, 임의의 종양 형성의 증거가 없었다.

상기 실험에서, RPE 세포의 이식은 시각 기능의 유지 또는 개선을 가져왔다. 따라서, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 망막 변성 질환의 치료, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD) 및 노인성 황반 변성 (SMD)의 개선을 위한 세포 요법에 사용될 수 있다.

실시예 22

황반 변성의 전임상 모델에서 인간 배아 줄기 세포로부터의

RPE 의 장기간 안전성 및 기능

결과의 요약

본원에서 기재되는 RPE 세포는 연령-관련 황반 변성 및 스타르가르트병의 치료에 사용될 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 각각 망막 변성 및 스타르가르트병의 동물 모델인 RCS 래트 및 Elovl4 마우스 모두에서 hESC-유래 RPE를 사용한 장기간 기능적 회복을 제시한다. 우수 의약품 제조 기준-부합성 hESC-RPE는 연장된 기간 (> 220일) 동안 RCS 래트에서의 망막하 이식에서 생존하였다. 세포는 기형종 형성 또는 불리한 병리학적 반응을 보이지 않으면서 용량-의존성 방식으로 시각 기능 및 광수용체 완전성을 유지하였다. 거의 정상의 기능적 측정치가 RCS 래트에서 > 60일 생존에서 기록되었다. 안전 문제를 추가로 처리하기 위해, 비임상 시험 관리 기준 (Good Laboratory Practice)-부합성 연구를 NIH-III 면역-결핍 마우스 모델에서 수행하였다. 장기간 데이터 (동물의 생애에 걸친)는 hESC-RPE의 망막하 이식 후에 기형종/종양 형성의 거시적 또는 미시적 증거를 보이지 않았다 (문헌 [Lu, et al. (2009) Stem Cells 27: 2126-2135] 참조).

동물 및 실험 설계

색소화 이영양성 RCS 래트 (n = 79) 및 ELOVL4 마우스 (n = 28)를 주 실험에 사용하였다. NIH III 면역 누드 마우스 (n = 45)를 안전성 연구에 사용하였다. RCS 래트에 대해, 동물을 이들이 투여받은 용량에 따라 5개의 군으로 분류하였다. 이들은 5x10³ (5,000)개/눈(n = 21), 2x10⁴ (20,000)개/눈 (n = 21), 및 5x10⁴ (50,000)개/눈 (n = 21)이었다. 모든 투여군의 동물에게 저, 중간 및 고 색소침착의 세포를 투여하였다. 모든 상기 투여군 동물에게 저, 중간 및 고 색소침착의 세포를 투여하였다 (표 14). 추가의 비교를 위해, 2개의 군을 추가하였다: 중간 색소침착의 7.5x10⁴ (75,000)개/눈의 세포를 투여한 동물 (n = 8)의 군 및 1x10⁵ (100,000)개/눈의 세포를 투여한 동물 (n = 8)의 군. ELOVL4 마우스의 경우, 눈에 중간 색소침착의 5x10⁴ (50,000)개/눈의 세포를 투여하였다. 주 실험의 모든 동물은 동물이 희생될 때까지 이식 1일 전부터 음용수 내에 투여된 경구 시클로스포린 A (210 mg/L; 생성 혈액 농도: 약 300 ㎍/L) 상에 유지하였다. 덱사메타손의 복강내 주사는 세포 및 대조군 주사된 래트에서 수술 후 2주 동안 (1.6 mg/kg/일) 및 비처리 동물에서 단독으로 2주 동안 시행하였다. 모든 동물을 12시간 명/암 사이클 하에 유지하였다.

세포 제제

hES 세포의 배양 및 성숙한 RPE 세포로의 분화.

모든 세포 제조 절차는 엄격한 환경 제어 모니터링 시스템 및 통상적인 미생물 시험법 하에 ISO 클래스 7 클린룸 시설 내에서 ISO 클래스 5 생물안전 캐비넷 내에서 수행하였다. 단일-할구 hESC 세포주 MA01 및 MA09를 이전에 본원에서 기재한 바와 같이 유지하였다. 0.05% 트립신-EDTA로 처리하여 hES 세포를 1차 마우스 배아 섬유모세포 층으로부터 해리시키고, 약 7일 동안 B-27 보충물을 함유하는 화학적으로 규정된 최소 필수 배지 (MEM)-기반 배지 (MDBK-GM)에서 EB 형성을 허용하기 위해 6-웰 저부착 플레이트에 시딩하고, 젤라틴-코팅된 (0.1%) 접시 상에 도말하여 RPE 콜로니가 가시화될 때까지 두었다. 4 mg/ml 타입 IV 콜라게나제에 3시간 노출시켜 RPE를 정제하고, 유리 피펫을 사용하여 손으로 단리하였다. 정제된 RPE를 젤라틴-코팅된 조직 배양 플레이트 상에 시딩하고, 요구되는 밀도에 도달할 때까지 EGM-2 배지에서 팽창시켰고, 이때 배양액은 MEM-기반 배지 (MDBK-MM)로 복귀시키고, 적절한 표현형이 달성될 때까지 배양하였다. 0.25% 트립신-EDTA 및 행크 기반 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물을 사용하여 RPE를 배양액으로부터 해리시키고, 90% 소 태아 혈청 및 10% 디메틸술폭시드 내에 동결보존하였다.

정량적, 실시간, 역전사 -폴리머라제 연쇄 반응.

RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 트리졸 (TRIzol) 시약을 사용하여 세포로부터 추출하였다. 용리된 RNA를 분광광도측정법으로 정량하고, 10 ㎍을 DNase 소화시키고, 올리고dT 및 무작위 헥사머 프라이머의 혼합물을 사용하고 콴티테크 (QUANTITECH)® 역전사 키트를 사용하여 역전사 반응을 수행하였다. 50 ng/웰의 cDNA를 hESC 및 망막 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용한 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에서 주형으로서 사용하였다. 모든 qPCR 반응을 삼중으로 수행하고, 생성되는 값을 평균 역치 사이클 (CT)로 조합하였다. qPCR의 효율은 GAPDH 프라이머를 사용한 상대적인 표준 곡선의 기울기로부터 계산되었다. 상대적인 양자화는 실시간 SYBR 녹색 형광을 측정하는 스트라타젠 (STRATAGENE)® MX3005P QPCR 시스템을 사용하여 결정하였고, ΔΔCT 방법에 의해 계산되었다. 차이 배수는 식 2의 ΔΔCT - ΔΔCt를 사용하여 계산된다. mRNA 전사체의 발현 프로파일은 hES 세포 내의 mRNA 수준과 비교한 차이 배수로서 제시된다.

마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링

인간 애피메트릭스® HGU133 플러스 2.0 마이크로어레이 플랫폼을 사용한 전반적 유전자 발현 분석을 단일 할구-유래 hESC 세포주 MA01 및 MA09 및 이 각각으로부터 유래된 생성 RPE 세포 모두에 대해 수행하였다. 추가로, 태아 RPE, ARPE-19, 및 망막모세포종 세포주를 대조군으로서 사용하였다.

웨스턴 블롯 분석.

면역블롯 분석을 바이오-라드(BIO-RAD)® 미니-프로테안(Mini-Protean) 및 미니-트랜스블롯 셀(Mini-Transblot Cell)을 사용하여 표준 SDS-PAGE 방법에 따라 수행하였다. 웨스턴 라이트닝(Western Lightning) 화학발광 시약 및 코닥 (KODAK)® 4000MM 디지탈 영상화 스테이션을 사용하여 단백질 밴드를 가시화하였다. DPPA4, TDGF1 β-액틴, CHX-10, Otx2, REX1, RPE65, PAX6, 베스트로핀, CRALBP, Pax2, MitF, NANOG, Oct4, PEDF, 및 Tyr에 특이적인 상업적으로 이용가능한 항체 및 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 2차 항체를 사용하였다.

이식 프로토콜

세포 이식 전에, 세포를 해동하고, 평형 염 용액 (BSS)으로 세척하고, BSS에 현탁하였다. 저, 중간, 및 고 색소로 지정된 3개의 세포주를 상이한 용량군에 투여하였다. 이를 표 15에 요약한다. 당업계에 공지된 기법을 이용하여, 2 ㎕의 BSS 배지에 현탁된 세포의 현탁액을 튜브에 의해 25-㎕ 해밀턴 주사기에 부착된 미세 유리 피펫 (내경, 75-150 ㎛)을 사용하여 작은 공막 절개부를 통해 한쪽 눈의 망막하 공간 내로 전달하였다. 안내 압력을 감소시키고 세포의 유출을 제한하기 위해 각막을 천자하였다. 샴-수술군을 운반 배지만 주사한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 처리하였다. 색소화 이영양성 RCS 래트에게 P21에 단측 망막하 주사에 의해 세포주 (n = 79개의 눈)를 투여하고; 대조군 래트에게는 샴 단독으로 처리하거나 (n = 35개의 눈) 또는 비처리하였다 (n = 29개의 눈). P28의 Elovl4 마우스에게 세포를 투여하고 (n = 12개의 눈), 샴 단독으로 처리하거나 (n = 8개의 눈), 또는 비처리하였다 (n = 8개의 눈). 주사 직후, 망막 손상 또는 혈관 장애의 징후에 대해 안저를 검사하였다. 상기 문제를 보이는 임의의 동물은 연구로부터 제외하고, 최종 동물 계수에서 배제하였다.

공간 시력.

수직 사인파 격자 (vertical sine wave grating)가 배치된 회전 실린더의 가상 3차원 공간을 투사하는, 정사각형으로 배열된 4개의 컴퓨터 모니터를 포함하는 시력측정 시험 장치를 사용하여 동물을 공간 시력에 대해 시험하였다. 제어되지 않은 동물을 정사각형의 중앙의 플랫폼에 놓고, 반사적인 머리 움직임을 격자로 추적하였다. 동물 머리 중심에 "실린더"를 다시 맞춤으로써 격자의 공간 빈도를 고정시켰다. 시력 역치는 다음 반응이 사라질 때까지 정신물리학 계단 (psychophysics staircase) 진행을 사용하여 격자의 공간 빈도를 증가시키고 시력을 규정함으로써 정량하였다. 래트를 한달 간격으로 P60으로부터 P240까지 시험하였다. 또한, Elovl4 마우스를 수술 3, 5, 7, 및 11주 후에 상기 장치에서 시험하였다.

휘도 역치.

이것은 공간 시력으로부터 기능의 상이한 척도를 제공하기 위해 연구되었고, 앞에서 설명한 절차에 따라 유리-코팅된 텅스텐 전극 (저항: 0.5 MΩ; 주파수폭 500 Hz 내지 5 KHz)을 사용하여 상구 (SC)의 표면에 근접하여 단일 및 다단위 활성을 기록함으로써 달성하였다. 기록은 래트에서만 수행하고, 양호한 대표적인 시운동 결과를 기초로 하여 선택하고: 마우스는 상기 시험으로 조사하지 않았다. 5°스팟 (spot)의 휘도는 배경 활성의 2배의 반응이 얻어질 때까지 5.2 로그 단위의 기준선 수준에 걸쳐 중성 밀도 필터 (0.1 로그 단위의 최소 단계)를 사용하여 변경하였고: 이것은 시야의 그 지점에 대한 역치 수준으로 규정되었다. 총 15-20개의 위치를 각각의 SC로부터 기록하였다. 모든 동물을 약 P100에서 기록하고, 일부는 약 P190의 제2 시점에서 다시 연구하였다. 데이터는 규정된 수준 미만의 휘도 역치를 갖는 SC 영역의 비율의 그래프로서 및 원 결과로서 표현된다.

조직학

기능 시험의 끝에, 모든 동물을 나트륨 펜토바르비탈의 과다투여로 안락사시키고, 포스페이트-완충 염수를 관류시켰다. 눈을 적출하고, 2% 파라포름알데히드 내에 1시간 동안 침지시키고, 수크로스로 침윤시키고, 광 절단 온도에서 함침하고, 냉동 미세절단기 (cryostat)로 10-㎕ 수평 절편으로 절단하였다. 4개의 절편 (50 ㎛ 간격의)을 슬라이드당 수집하고, 수집된 4개 절편의 5개 시리즈를 제공하였다. 한개를 주사 부위 및 망막 층상배열의 완전성을 평가하기 위해 크레실 바이올렛으로 염색하였다. 나머지 슬라이드는 이전의 프로토콜에 따라 항체 염색을 위해 사용하고, 일반적인 및 공초점 현미경에 의해 조사하였다.

안전성 연구.

RCS 래트 연구에 대해 상기한 바와 동일한 방법을 사용하여 세포를 제조하고, 이식하였다. 군당 최소 6마리의 NIH-III 마우스에게 3개의 시간 기반 코호트 군 (n = 36)에서 MA09 단일 할구 세포주로부터의 hES 세포 또는 hESC-유래 RPE를 주사하였다. 동물을 코호트를 기초로 하여 1, 3, 및 9+개월에 CO₂ 흡입에 치사시킨 후, 사혈하였다. 또한, 3개의 음성 대조군 동물을 각각의 코호트에 대해 연구에 포함시켰다 (n = 9). 생활 연구 평가는 통상적인 임상 평가 및 체중 분석, 및 희생전 임상 화학을 포함하였다. 사후에 눈을 적출하고, 차가운 4% 파라로픔알데히드에 최대 1주 동안 침지시켰다. 조직을 파라핀에 포매하고, 절편화하였다. 선택된 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 슬라이드를 망막 층상배열 및 종양 형성을 평가하기 위해 현미경으로 검사하였다.

hESC -유래 RPE 의 분화 및 특성화

cGMP-부합성 세포 제조 공정을 사용하여 인간 RPE 세포를 생성하였다. RPE의 3가지 상이한 배치를 RPE 성숙의 중요한 표시자인 색소침착의 형태 평가를 기초로 하여 (도 15) 각각의 할구-유래 hESC 세포주로부터 생성하였다.

각각의 생산 실행은 1x10⁶개의 hES 세포의 동결된 단일 앰플로부터 약 50x10⁶개의 RPE 세포를 생성하였다. 이 양은 약 500마리의 래트 또는 50-100명의 인간 대상체에게 투여하기에 충분하다. 추가로, 본원에서 기재되는 방법은 이용가능한 규모 확대 기술, 예컨대 생물반응기 배양 또는 대규모 유체 처리 시스템에 전적으로 적합하다.

RPE 분화 동안 발생기를 특성화하기 위해, 각각의 발생기에 핵심인 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 몇몇 검정을 이용하였다. RPE 분화 과정과 연관된 세포 종류-특이적 mRNA 전사체의 풍부도의 정량적 및 상대적 측정치를 제공하기 위해 qPCR을 개발하였다. hESC 만능성 (Oct -4, NANOG, Rex -1, TDGF1, Sox2, DPPA2 , 및 DPPA4), 신경외배엽 중간체 (PAX6 및 Chx10), 및 RPE (RPE -65, 베스트로핀, CRALBP, PEDF, MitF, Otx -2, Tyr, 및 Pax2)와 연관된 일군의 유전자를 각각 qPCR에 의해 확립하고 검정하였다. 세포 제조 품질 관리에 관하여, 모든 줄기 관련 유전자의 현저한 감소 및 모든 망막-연관 유전자의 동시 증가 (10배 내지 100배의 수준의)는 허용되는 출하 기준으로 간주되었다.

도 13은 hES 세포 (d0), 배상체 (EB, d7), 도말된 EB (d14), 새로 형성된 RPE와 덜 분화된 세포의 혼합된 집단 (혼합된, d28), 정제된 초기 RPE (eRPE, d35), 및 완전히 성숙한 색소화 RPE (mRPE, d56)로부터의 샘플을 비롯하여 성숙한 RPE로의 분화 동안 전사체의 유전자 발현 프로파일을 보여준다. hESC-특이적 유전자의 발현 수준의 전진적인 감소 (도 13A)에는 신경외배엽 및 RPE-특이적 유전자의 수준 증가가 수반되었다. 약한 색소화 RPE (도 12)는 hESC보다 1,000배 더 적은 양의 Oct -4, NANOG, Sox2, 및 DPPA4; < 10,000배 더 적은 TDGF1; 및 50배 더 적은 Rex -1 및 DPPA2를 발현하였다. 또한, 세포는 10배 내지 100배 더 많은 양의 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, 및 MitF를 발현하였고, RPE에서 MitF/Otx2의 하류 표적인 Tyr을 > 100,000,000배 발현하였다. 상기 세포 집단은 상기 단계가 배아 세포로부터 유래된 RPE의 "미성숙" 집단을 나타내기 때문에 PAX6 및 CHX10과 같은 유전자를 발현하고, 신경망막 및/또는 신경외배엽의 세포 발달과 연관된 마커를 계속 발현할 수 있다.

시험관내 성숙 과정 동안 RPE가 겪는 표현형 변화는 qPCR에 의해 특성성화되었다 (도 12A-C). 도 12A는 보다 높은 정도의 색소침착 및 다각형 세포 경계를 갖는 RPE (도 12C에 상응)가 RPE-특이적 유전자의 보다 높은 발현을 유지함을 보여준다. 특히, 색소침착 및 RPE-특이적 유전자 발현의 높은 수준은 Pax2 발현의 발생 및 MitF, Otx2, 및 Tyr 발현의 급격한 증가와 상관관계가 있다. MitF 발현, 및 이어서 Tyr 발현은 배아 발생 동안 Pax2 및 PAX6의 상승작용을 통해 RPE에서 달성된다.

hESC -유래 RPE 에서 선택된 전사체의 단백질체 확인

관심 유전자가 단백질 수준에서 발현되는지를 확인하기 위해, 초기 전사 프로파일 패널의 모든 표적을 웨스턴 분석에 의해 검정하였다. 내부 대조군으로서, hESC-유래 RPE를 qPCR 및 웨스턴 분석에 의해 ARPE-19 세포주와 비교하였다. 도 10A는 hESC-RPF가 ARPE-19와 유사한 수준의 RPE-특이적 전사체를 발현하지만, hESC-RPE는 상기 단백질 (RPE65, PEDF, Pax2, 및 베스트로핀)의 보다 풍부한 수준을 발현함을 보여준다. 추가로, hES 세포에 의해 발현된 단백질은 최종 분화된 세포 생성물에서 모두 하향조절된다. 줄기 관련 단백질의 소실 (면역블롯에 의한) 및 망막-연관 단백질의 동시 출현은 본원에서 기재되는 RPE 세포를 나타낸다.

hESC - RPE 에서 전반적인 유전자 발현의 생물정보학적 분석

시험관내에서 관찰된 형태적 변화의 생물학적 관련성을 휴먼 애피메트릭스® HG-U133 플러스 2.0 마이크로어레이 플랫폼에서 각각 3개의 상이한 형태를 갖는 두 hESC 세포주, 대조군 및 몇몇 "참조" 세포주의 유전자 발현 프로파일링 및 후속적인 정보 분석에 의해 평가하였다. 도 14는 2개의 주요 변수, 즉 세포 종류 및 세포주 (각각 x축 및 y축)가 전반적 유전자 발현에 대해 생성하는 변이에 대한 공헌을 나타내는 주요 성분 분석 (PCA) 산포도를 보여준다. 선형 진행이 RPE 색소침착의 3개의 수준을 통해 미분화된 (hES 세포) 상태로부터 관찰되었다. 흥미롭게도, 탈색소화 RPE 세포 (도 12A 참조)는 ARPE-19 및 태아의 RPE 모두에 보다 근접하여 군집하고; 여기서 후자는 시험관내에서 세포의 상기 배치와 유사한 형태적 특징을 보인다. RPE 세포의 보다 심한 색소화 배치는 시험된 임의의 다른 세포 종류보다 hES 세포 및 망막모세포종 세포 (RB)로부터 더 멀리 군집하는 것으로 보인다. MA01 및 MA09로부터의 RPE의 색소화 배치들은 PCA와 중복되지 않지만, 이들은 태아의 RPE 및 ARPE-19의 것에 서로 유사한 크기의 정도 내에 존재한다. 함께 고려할 때, 상기 데이터는 보다 심한 색소화 hESC-RPE 세포가 가장 분화되고, "엄격성"을 갖거나 또는 암 관련 유전자를 발현하는 세포로부터 가장 유전적으로 분지되는 것으로 간주될 수 있음을 제시한다.

RPE 의 병원체 시험 및 안정성

치료 용도를 위해 RPE 세포 제제를 사용할 때 고려되는 중요한 기준은 생성물 안전성 (예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 물질의 오염 또는 감염)이다. 광범한 배양 및 분화 과정 동안 RPE 세포가 오염이 없는 것을 보장하기 위해, 적용가능한 미생물 및 바이러스 물질에 대한 미국 식약청 및 의약품 규제 조화 국제 회의 (International Conference on Harmonization) 가이드라인에 따라 다음 시험을 수행하였다: 미국 약전 (United States Pharmacopeia) 막 여과 무균성, 형광색소-기반 미코플라스마, 바이러스 입자에 대한 투과 전자 현미경, 우발성 물질에 대한 시험관내 조직 배양 안전성 시험, 생체내 불현성 바이러스 검출, PCR-기반 역전사효소 검출, HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, CMV, HTLV-1 및 -2, 파르보바이러스 B19, 엡스타인-바 바이러스, 및 헤르페스바이러스 6. 추가로, 세포는 G-밴딩 핵형 분석에 의해 세포유전학적으로 분석되었다. 그 결과에 의해, 상기 세포주가 핵형상 안정하고 감염성 병원체가 실질적으로 없는 것으로 확인되었다.

RCS 래트에서 투여 연구

효능에 대한 상이한 용량의 효과를 표시자로서 시운동 반응을 사용하여 적정하였다. P90 (이식 70일 후)에서의 결과를 도 15a에 요약한다. 공간 시력의 회복 개선은 5,000 내지 50,000에서 발생하였고, 이후에는 세포 용량을 100,000으로 2배 증가하여도 효능에 대해 유의한 효과가 나타나지 않았다. 세포-주사군 사이의 실행자는 정상 래트에서 0.6 사이클/디그리 (c/d)에 비해 0.536 c/d의 값을 보였고, 이것은 정상 값의 약 90%이다. 샴 및 비처리군 사이에 유의한 차이가 존재하지 않았고, 이들은 세포-주사군보다 유의하게 더 악화되었다 (p < 0.01).

또한, 휘도 역치를 시운동 반응에 대한 그의 능력에 의해 선택된 래트의 하위세트에서 측정하였다. 고 감수성 영역은 도 15c-15f에 표시된 바와 같이 세포가 도입된 망막의 영역에 상응하였다. 통계적 비교를 위해, 실시예의 상기 부분에 위한 데이터는 그로부터 설계된 수준보다 우수한 역치가 위치에 상관없이 기록되는 시야 제시 영역의 비율로서 제시된다. 이것은 전체 효능의 간단한 표시자, 및 공간 고려로부터 분리하여 생각되는 반응 수치를 제공한다. 50,000에서 기록된 전체 감수성은 20,000보다 우수하지만, 공간 시력에서는 50,000과 75,000 사이에서 유의하게 변하지 않음이 분명하다. 예를 들어, 약 45%의 SC는 2.2 로그 단위의 역치를 50,000개의 세포/눈에서 제시하였고, 약 40%는 75,000개의 세포/눈에서 제시하였다. 일반적으로, 100,000에서의 평균 반응 수준이 보다 우수하였고, 더 낮은 용량보다 더 오래 지속되는 회복을 보였다. 도 15 및 16 참조.

색소침착 결과

시력에 대해 색소 군 사이에 유의한 차이가 존재하지 않지만 (도 17), 샴 또는 비처리 대조군에 비해, 모든 색소군은 P40과 P240 사이의 모든 시점에서 유의하게 더 우수한 시력을 보였다.

RCS 래트에서 배치 및 효과의 지속

시운동력의 경미한 차이가 상이한 색소 수준 사이에서 관찰되었지만 (표 14), 이는 유의하지 않았다. 이와 대조적으로, 세포-주사군과 배지-주사 및 비처리 대조군 사이에 연구된 모든 시점에서 유의한 차이가 존재하였다. 도 16 참조. 시간 경과에 따라, 모든 세포 군 및 용량 수준에 대해 시운동력 반응이 감소하였다.

시간 경과에 따라 휘도 반응이 얼마나 악화되는지 조사하기 위해, 역치를 개개의 래트에서 2개의 시점에서 기록하였다. 그 예를 도 18에 제시한다. 도시된 바와 같이, 휘도 역치는 비처리 측면에 대해 심각한 악화를 보이고, 1/2 초과의 영역이 P98에 비해 P187에서 비반응성인 반면, 세포 주사 측면에 대해서는 역치의 일부 감소가 발생하였지만 반응성은 계속 감수성이다 (P98에서 0.7 로그 단위 대 P187에서 1.0 로그 단위). 세포 주사을 시행한 동물로부터의 원 데이터: 휘도 역치 반응을 상구 (SC) 내의 다수 지점으로부터 동일한 래트에서 P98 (도 18A에 제시됨) 및 P187 (도 18B에 제시됨)에서 기록하였다. 이 방법은 눈의 시야에 걸쳐 광에 대한 기능적 감수성을 정량한다. 지세도 (topographical map)는 좌측 및 우측에서 SC 내의 각각 15 및 16개의 지점에서 휘도 역치 반응 (0.02 cd/m²의 배경 조도에 비해 로그 단위로 측정됨)을 도시한 것이다. 도 18A에서, 처리 측면 내의 휘도 역치 반응의 모든 지점은 2.0 로그 단위 미만이고, 비처리 측면에서 모든 지점은 2.3 로그 단위 초과이다. 표 15B는 동일한 동물이 P187에 기록되고 (수술 후 > 5개월); P98에 비해 광에 대한 감수성 악화가 존재하지만; 비처리한 눈 (영역의 1/2에 걸쳐 반응을 보이지 않음)보다 여전히 유의하게 더 우수함을 보여준다. 약어: c/d, 사이클/디그리. 도 18 참조.

Elovl4 마우스에서 효능

동일한 시운동 장치에 의해 시험된 정상 마우스의 시력은 래트에서보다 더 낮았다 (0.35 대 0.6 c/d). 비처리한 Elovl4 마우스에서, 시력은 광수용체 변성이 P28에서의 0.34 c/d로부터 P105에서의 0.24 c/d로 진행되면서 악화되었다. 도 15b. hESC-RPE의 망막하 주사는 시험된 모든 시점에서 대조군보다 시력을 개선하였다. 세포-주사된 눈은 샴-주사한 및 비처리 대조군에서의 0.26 ± 0.03 c/d에 비해 P63 (수술 5주 후)에서 0.32 ± 0.04 c/d의 수치를 보였다. 도 15b. 통계 분석은 세포-주사된 군과 대조군 사이의 차이가 유의함을 나타내었다 (t 검정, p < 0.05).

RCS 래트의 조직학적 검사

일반적인 망막 구조.

세포-주사, 샴, 비처리, 및 정상 대조 래트로부터의 망막 절편을 크레실 바이올렛으로 염색하고, 광학 현미경 하에 검사하였다. P90에서, 정상 대조군 (도 19A)에 비해, 세포-주사된 망막은 광수용체의 5 내지 6개의 층을 가졌고 (도 19B), 비처리 망막은 단지 단일 층만이 잔류하였다 (도 19C). 기능적 결과에 따라, 5,000/눈 용량은 샴-수술된 군보다 약간 더 우수한 광수용체 회복 (도 19D)을 보인 반면 (1차적으로 주사 부위 주위의 국재화된 광수용체 회복), 20,000/눈은 보다 우수한 광수용체 회복을 도출하였다. 50,000/눈 및 그 초과의 용량은 보존된 원추세포를 갖는 보다 큰 망막 영역에 걸쳐 일관된 광수용체 회복을 보였다 (도 19E, 19F). P150에서, 세포-주사된 망막은 2 내지 3개 세포 깊이의 외핵층을 계속 갖고, 내망막 층상배열이 붕괴되지 않았다. 이와 대조적으로, 비처리 및 샴-수술한 망막 둘 모두는 망막 층상배열의 뒤틀림을 야기하는, 비정상적인 혈관 형성, RPE 세포, 및 비정상적인 혈관을 따라 이동하는 내망막 뉴런을 비롯한 전형적인 2차 병상을 보였다. P240에서, 세포-주사된 망막은 1 내지 2개 세포 깊이의 외핵층을 계속 갖고, 내망막이 질서정연한 층상배열을 계속 보였다. 이와 대조적으로, 대조군 망막에서는 진행된 변성이 명백하였다: 내핵층의 두께는 1층 내지 다중층으로 불규칙하게 되었고; RPE 세포는 내망막으로 이동하였고; 비정상적인 혈관이 보였다 (도 19I).

항체 염색.

공여자 세포를 확인하기 위해 인간 특이적 핵 마커 MAB1281을 사용하였다. 이들은 1 내지 2개 세포 깊이의 층을 형성하고, 이전 연구에서 관찰된 바와 같이 숙주 RPE 층 내로 통합되었다 (도 19G, 19H). 광수용체 회복은 공여자 세포의 분포 제한을 넘어서 계속되었고, 이것은 회복이 적어도 부분적으로는 확산가능한 효과에 의해 야기됨을 시사한다. 원추세포 어레스틴 항체는 원추세포 광수용체가 P90에서 비조직화된 세그먼트로 보존됨 (도 19F)을 보여주었다. 공여자 세포는 적어도 P249까지 계속 볼 수 있었다 (도 19G 및 19H). 계속된 공여자 세포 분열 (예를 들어, 증식하는 세포 핵 항원 마커에 의해 제시되는)의 표시는 존재하지 않았다.

안전성 평가

NIH III 마우스에서의 연구.

기형종 형성의 장기간 위험을 NIH III 마우스 모델에서 시험하였다. NIH III 마우스를 그의 면역-결핍 상태에 대해 선택하였고; 누드 마우스는 T 세포, NK 세포, 및 성숙 T-독립 B 림프구가 결핍되도록 만드는 3개의 돌연변이를 갖는다. 그러나, NIH III 마우스는 눈 색소침착을 보유하고, 이것은 망막하 이식 수술에 대한 보다 우수한 가시화를 제공한다. 수술 기법은 RCS 연구에서 수행한 바와 동일하였다. 연구는 3개의 시점, 즉 1, 3, 및 9개월 (동물의 대략적인 수명; 코호트당 n = 6)에 걸쳐 100,000개의 RPE 세포 용량의 기형종 형성 잠재력을 결정하기 위해 hESC-RPE를 미분화된 hES 세포 (양성 대조군)와 비교하였다. 미분화된 hES 세포가 투여된 동물과 대조적으로, hESC-유래 RPE가 주사된 임의의 동물에서는 기형종 또는 종양 형성이 발견되지 않았다. 추가로, 기본적인 동물 안전성 평가는 대조군과 비교할 때 정상이었다.

RCS 래트에서 종양 발생성 성장의 부재.

RCS 래트 이식 연구에서, 가장 긴 시점을 포함하여 조사된 79개의 세포-주사된 망막의 어느 것도 비제어된 세포 증식에 대한 임의의 증거를 보이지 않았다. 기형종 및/또는 종양 형성의 증거는 없었다.

논의

이들 결과는 인간 임상 시험에 사용하기 위해 적용될 수 있는 제조 조건 하에서 생산되는 hESC-유래 RPE 세포의 장기간 안전성 및 효능이 본원에서 기재됨을 보여준다. 조건을 갖춘 범위 한계 (최종 RPE 생성물의 "정체성"을 구성하는 것)를 갖는 검정의 개발 이외에, 제조 절차가 임의의 감염성 질환 또는 우발성 물질을 RPE 세포 내로 도입하지 않음을 보장하기 위해 심도있는 병원체 시험을 수행하였다.

상기 GMP-부합성 세포의 기능성을 확인하기 위해, 용량-반응 및 장기간 효능 모두를 인간 망막 질환의 상동성 모델에서 평가하였다. hES 세포의 증식 특성 때문에, 비임상 시험 관리 기준 ("GLP") 조건 하에서 안전성의 증거는 hESC-유래 세포 생성물을 임상으로 보내기 위해 필수적이다. 상기 상세히 설명한 심도있는 특성화는 세포 정체성의 보장을 제공하고, 본원에서 제시하는 장기간 종양 발생성 연구는 hESC-RPE 세포가 안전하고 NIH III 면역-결핍 마우스의 생애 동안 기형종 및/또는 종양을 형성하지 않는다는 강한 증거를 제공한다. RCS 래트의 망막하 공간으로 도입한 후, hESC-유래 세포는 또한 병리학적 결과의 증거를 보이지 않으면서 8개월을 초과하여 생존하였다.

또한, 본원에서 기재되는 방법에 따라 생산된 hESC-RPE 세포는 용량-의존성 방식으로 시각 기능을 회복하였고: 5,000으로부터 50,000으로 세포 농도가 증가하면서, 시력 및 휘도 역치 반응 모두에서 측정된 기능적 회복이 개선되었다. 50,000으로부터 100,000까지, 도입되는 세포수의 허용성이 존재하고, 최적 용량의 2배가 계속 효과적이다. 이전의 설치류 연구는 RPE 세포가 단층 또는 이중층으로서 신속하게 분산되고 불멸화된 RPE 세포주의 20,000개의 세포가 약 20%의 망막 영역 (12.56 mm²)을 점유할 수 있음을 보여주었다. 연령-관련 황반 변성 망막에서, 내부 황반의 직경은 3 mm이고: 이것은 약 40,000개 세포의 용량이 내부 황반 영역을 덮기 위해 사용될 수 있지만, 보다 큰 세포수가 보다 큰 영역을 덮을 수도 있음을 의미한다.

Elovl4 마우스에서 유의하게 개선된 시각 능력은 황반 질환 (이 경우에, Elovl4 유전자에서 돌연변이에 의해 유발되는 스타르가르트병의 환자의 하위세트)을 치료하기 위한 세포 기반 요법에 대한 세포 선택으로서 hESC-RPE의 가치를 상승시킨다. 스타르가르트병은 소아 황반 변성의 가장 빈번한 형태 중의 하나이다. 일부 회복이 성장 인자 전달, 예컨대 인자 방출 세포 (캡슐화 세포), 예컨대 섬모 신경 영양 인자를 생산하기 위해 형질도입된 ARPE19 세포 또는 슈반 (Schwann) 세포의 직접적인 주사에 의해 달성될 수 있지만, 상기 방법은 RPE 세포의 다른 기능을 대체할 수 없다. hESC-RPE 세포는 ARPE-19보다 천연 RPE에 보다 근접하게 유사한 분자 프로파일을 갖고, 따라서 간단한 인자 전달을 넘어서서 ARPE-19보다 더 넓은 범위의 RPE 기능을 책임질 수 있다. 예를 들어, 특정 메카니즘에 매이지 않지만, hESC-RPE 세포는 hESC-RPE 세포가 시험관내에서 라텍스 비드를 포식할 수 있기 때문에 숙주 RPE의 중요한 기능을 대체할 수 있다. 그러나, 광수용체 회복의 위치가 공여자 세포 분포의 영역을 넘어서기 때문에, 회복 효과의 일부는 확산가능한 영양 인자 효과에 의해 매개될 수 있다.

이들 결과는 면역-결핍 동물에서 hESC-유래 RPE 세포의 장기간 안전성, 및 임상 시험에 적합한 GMP 조건을 사용하여 질환의 2개의 상이한 동물 모델에서 그의 장기간 기능을 보여준다. 수술 후 200일에 걸쳐 래트의 망막 색소 상피 세포층에 통합되거나 부착된, 분화된 인간 망막 색소 상피 세포의 존재가 확인되었다. 모든 경우에, 상기 인간 세포의 형태는 작은 황갈색 세포질내 색소에 의해 치환된 둥근 핵이 있는 조직화된 입방형 상피 세포로서 특성화되었고, 이것은 색소 상피 세포와 일치하였다. 마우스 RPE와 회합할 때, 인간 세포는 기부에 위치하는 핵 및 정점에 위치하는 색소화 과립이 있는, 기저막을 따라 전형적인 극성을 보였다 (도 13, 14). 인간 세포는 인간 세포가 마우스 RPE에 비해 더 적고 더 작은 황갈색 색소화 과립을 갖고 약간 더 크기 때문에 마우스 RPE와 구분될 수 있다. 따라서, P240에서 (즉, 이식 220일 후에), 공여자 세포는 생존하고, 광수용체는 회복되고, 시각 기능의 수준은 보존된다. 따라서, 본원에서 기재되는 방법은 다양한 망막 변성 질환의 효능있는 치료를 위한 RPE 세포의 안정한 무한정의 공급원으로서 기능할 수 있다.

실시예 23

배아 줄기 세포로부터의 RPE 세포를 이용한 시각 기능의 회복

요약

인간 배아 줄기 세포-유래 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 망막 변성에 대해 잘 특성화되고 연구된 설치류 모델인 로열 칼리지 오브 서전스 (Royal College of Surgeons) (RCS) 래트에서 망막 변성의 진행을 지연시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 이들 동물은 흘린 광수용체 외부 세그먼트의 포식을 수행하는 RPE의 능력을 손상시키는, MER 티로신 키나제 (MERTK)에 대한 유전자의 돌연변이를 보유한다. 상기 RPE 세포의 기능이상은 시간 경과에 따라 간상세포 및 원추세포 둘 모두의 점진적인 상실을 야기한다. 흥미롭게도, MERTK의 인간 종간 오르토로그 (orthologue) 내의 돌연변이는 망막 변성을 야기하고, 이에 의해 환자는 나이가 들어감에 따라 진행성 불량한 시력 및 시야 상실을 보인다.

RPE 세포는 질환 진행을 억제하기 위해 망막 변성의 초기 (P21)에 RCS 래트 눈에 망막하 주사되었다. 동물을 다음과 같이 3개의 군으로 분류하였다: 세포-주사군, 평형 염 용액 (BSS)-주사 대조군 및 비처리 눈. 세포 (50,000, 75,000 및 100,000개의 세포)를 세포 전달을 위한 비히클로서 BSS를 사용하여 주사하였다. 면역 억제를 위해, 시클로스포린을 연구 동안 음용수 (210 mg/L)에 첨가하였다. RPE 세포 주사의 효능을 2가지 시각적 기능 시험, 즉 시운동 반응 및 상구 (SC)로부터의 휘도 역치 기록, 이어서 크레실 바이올렛 염색을 포함하는 형태 검사 (전체적인 망막 층상배열 및 광수용체 두께에 대한)에 의해 평가하였다. 추가로, 면역염색은 생존 인간 세포 및 그의 RPE 표현형에 대한 인간 RPE-특이적 마커 베스트로핀을 확인하기 위해 인간 핵에 대한 항체 또는 인간 미토콘드리아 항체를 사용하여 수행하였다. BSS 주사 단독 및 비처리 눈 모두를 대조군으로서 사용하고, 이들을 모든 시점에서 세포 주사군과 함께 조사하였다.

결과 - 시운동 반응

수직 사인파 격자가 배치된 회전 실린더의 가상 3차원 공간을 투사하는, 정사각형으로 배열된 4대의 컴퓨터 모니터를 포함하는 시력측정 시험 장치 (세레브랄머캐닉스 (CerebralMechanics), 캐나다 레트브리지)를 사용하여 동물을 공간 시력에 대해 시험하였다. 제어되지 않은 동물을 정사각형의 중앙의 플랫폼에 놓고, 반사적인 머리 움직임을 격자로 추적하였다. 동물 머리 중심에 실린더를 다시 맞춤으로써 격자의 공간 빈도를 고정시켰다. 시력 역치는 다음 반응이 사라질 때까지 정신물리학 계단 진행을 사용하여 격자의 공간 빈도를 증가시키고 시력을 규정함으로써 정량하였다.

모든 세포-주사 및 대조군 래트를 P60으로부터 P240까지 시험하고, P60 시점을 세포 주사과 대조군 사이의 차이가 검출될 수 있는 가장 빠른 시점으로서 선택하였다.

세포-주사된 동물은 시험된 모든 시점에서 BSS 주사 및 비처리 대조군보다 유의하게 더 우수한 기능을 보였다 (p < 0.01). 대부분의 세포-주사된 동물은 P90에서 0.5 사이클/디그리 초과의 시력을 보였는데, 이것은 비-이영양성 래트의 시력 (0.52-0.60 c/d)(8)과 유사하고, 반면 BSS-주사 및 비처리 대조 동물에서는 0.25-0.30 c/d의 평균이 기록되었다.

상구로부터 휘도 역치 기록

본 시험은 인간에서 시야 분석을 위해 임상에서 사용되는 험프리 (Humphrey) 시험과 유사하다. 동물의 경우에, 전극이 이식되고, 감수성 기기를 사용하여 측정된다. 휘도 역치를 평가하기 위해, 상구 (SC)의 표재층 내의 단일 및 다단위 활성을 기록하였다.

기록은 유리-코팅된 텅스텐 전극 (저항: 0.5 MΩ, 주파수폭 500 Hz - 5 KHz)을 사용하여 SC의 표재층으로부터 100-300 ㎛의 깊이까지 수행되었다. 뇌에 접근하기 위해 직경 약 100 ㎛의 작은 개두술을 시행하였다. 해부학적으로, 망막 신경절 세포는 대측 상구 (SC)로 돌출되고, 따라서 우측 눈은 신호를 SC의 좌측면에 보낸다. 비-이영양성 래트 망막에, 광 자극에 대해 매우 감수성인 10-12개의 광수용체층이 존재한다. 즉, 정상 망막은 매우 낮은 광 자극에 반응할 것이고, 따라서 정상 동물은 낮은 휘도 역치 (0.2-0.4 로그 단위)를 갖는다. 광수용체의 상실 때문에, P90에서 이영양성 래트 망막에서, 동물은 고강도 광 자극에만 반응할 것이고, 따라서 상기 동물은 높은 휘도 역치 (2.5-3.0 로그 단위)를 갖는다. 단위는 로그 규모로 표현되기 때문에, 정상 망막에서의 0.2 로그 단위는 이영양성 망막에서의 2.5 로그 단위보다 100배 초과로 광에 더 감수성이다.

보다 낮은 휘도 역치는 BSS 단독 및 비처리 대조 눈과 비교해 세포-주사된 눈에서 기록되었다. 몇몇의 세포-주사된 눈은 비처리된 다른 한 눈에서의 3.0 로그 단위에 비해 0.7-0.8 로그 단위의 휘도 역치를 가졌다 (광 자극에 100배 초과로 더 감수성임).

SC로부터 기록된 휘도 역치는 망막 내의 광수용체의 양과 밀접한 상관관계가 있다. 광수용체가 보다 많은 동물은 광 자극에 보다 감수성이었는데, 즉, 보다 낮은 휘도 역치를 가졌다. 예를 들어, 한 래트는 광범한 광수용체 보존을 보였고, 이것은 공여자 세포 분포와 상관관계가 있다. 시운동 반응은 비처리한 눈에서의 0.25 c/d에 비해 0.50 c/d의 시력을 보여주었고, 휘도 역치 기록은 비처리 대조군에서의 3.0 로그 단위에 비해 P90에서 0.8 로그 단위의 수치를 보였고, 이것은 광 자극에 대해 100배 초과로 더 감수성인 것이다.

조직학

전체적인 망막 층상배열

실험 종료시에, 모든 동물을 나트륨 펜토바르비탈의 과다투여로 안락사시키고, 포스페이트-완충 염수를 관류시켰다. 눈을 적출하고, 파라포름알데히드 내에 1시간 동안 침지시키고, 수크로스로 침윤시키고, OCT 배지에 함침하고, 수평 냉동절편으로 절단하였다. 세포-주사, BSS-주사 및 비처리 대조군으로부터의 모든 망막 절편을 망막 층상배열에 대해 크레실 바이올렛으로 염색하고, 주사 부위를 확인하였다. 비정상적인 성장, 기형종 형성 또는 임의의 다른 원치 않는 병상에 대한 증거는 존재하지 않았다.

HES - RPE 세포 생존

래트 눈에서 인간 공여자 세포의 생존을 확인하기 위해, 절편을 항-인간 미토콘드리아 및 항-인간 베스트로핀 항체로 이중 염색하였다. 동결된 눈 절편은 원래 항-인간 미토콘드리아 염색에 필요한 거친 항원 회복 절차에 대해 의도되지 않았고; 따라서 많은 수의 절편이 상실되었다 (슬라이드로부터 완전히 또는 부분적으로 떨어져 불량한 형태를 이룸). 본 검정은 눈 형태를 우수하게 보존하면서 항-인간 핵 및 베스트로핀에 대한 이중 염색을 허용하도록 추가로 최적화되었다. RPE 세포는 34마리의 동물 중 13마리 (38%)에 존재하는 것으로 확인되었다. 대부분의 인간 세포 (RPE 세포가 유리체내강에서 발견된 한 동물을 제외하고는 모두)는 장기간 생존 종료점 (P180-249)에서 발견되고, 래트 RPE 층 내로 통합되고, 모두 전형적인 RPE 형태를 갖고, 생체내에서 이식 후에 장기간 RPE 정체성의 생존 및 보존을 확인하는 RPE 마커 베스트로핀에 대해 양성이었다.

광수용체 보존 및 공여자 세포 분포

P90에서 BSS 대조군 주사시에 주사 부위 주위의 국재화된 1-2개의 광수용체층 또는 비처리 망막에서의 광수용체의 단일층에 비해, 세포-주사된 망막에 3-6개의 광수용체층이 존재하였고, 따라서 이것은 광수용체 보존이 이식된 RPE 세포와 연관됨을 제시한다. BSS-주사된 눈에서, 광수용체의 1-2개 세포 두께의 국소 회복이 P90-100 경에 주사 부위에 인접하여 관찰되었지만; 그 효과는 본 연구에서 조사된 추후 시점에서는 더 이상 보이지 않았다. 또한, 휘도 역치 기록도 주사 2개월 후에 상기 효과를 보였다 (대체로 한 지점은 보다 낮은 휘도 역치를 가졌다). 시간 경과에 따라, BSS 주사의 효과는 사라진 반면, 세포-주사된 망막에서 광수용체 보존이 P249까지 관찰되었다 (주사 후 225일에 걸쳐). 추가로, 진행성 변성에 과련된 2차 병상이 주로 억제되었지만, BSS 주사 및 비처리 망막에서, 혈관 병상 및 내망막 내로 이동하는 내망막 뉴런을 비롯한 전형적인 2차 변화가 분명하게 나타났다. 인간 특이적 항체 염색은 주사 후 225일에 걸친 기간 동안의 hRPE 세포 생존을 보여주었다. hES-RPE 세포의 분포는 보존된 광수용체와 상관관계가 있었다.

결론

본 실시예에서 조사된 모든 망막에서, 세포 주사 후에 형태 및 기능 둘 모두의 장기간 보존이 입증되었다. RPE 세포는 적어도 225일 동안 생존하고, 래트 RPE 층 내로 통합되고, RPE 세포 특이적 마커 베스트로핀을 발현하였다. 원치 않는 과다성장 또는 기형종 형성에 대한 증거는 발견되지 않았다. 따라서, 본원에서 기재되는 RPE 세포는 이식되어, 생존하고, 그의 표현형을 유지하고, 망막 변성에서 시력을 회복시킬 수 있다.

실시예 24

당뇨병성 망막병증 환자의 치료

당뇨병성 망막병증으로 진단받은 인간 환자는 적어도 약 100,000개의 인간 RPE 세포 (예를 들어, 50 ㎕ 내의 100,000개의 RPE 세포)를 포함하는 제약 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. RPE 세포 제제는 망막하 공간 내로 주사된다. 환자는 6주 동안 5 mg/kg 시클로스포린의 치료 과정에 적용된다. 환자는 부작용 발생에 대해 모니터링된다. 환자의 시력은 치료 후에 적어도 6개월 동안 모니터링되고 시험된다.

실시예 25

연령-관련 황반 변성 환자의 치료

연령-관련 황반 변성으로 진단받은 인간 환자는 적어도 약 100,000개의 인간 RPE 세포 (예를 들어, 50 ㎕ 내의 100,000개의 RPE 세포)를 포함하는 제약 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 이식 전에, RPE 세포는 알파-인테그린 서브유닛 발현을 증가시키는 조건 하에 배양될 수 있다. RPE 세포 제제는 망막하 공간 내로 주사된다. 환자는 6주 동안 5 mg/kg 시클로스포린의 치료 과정에 적용된다. 환자는 부작용 발생에 대해 모니터링된다. 환자의 시력은 치료 후에 적어도 6개월 동안 모니터링되고 시험된다.

실시예 26

색소성 망막염 환자의 치료

색소성 망막염으로 진단받은 인간 환자는 적어도 약 100,000개의 인간 RPE 세포 (예를 들어, 50 ㎕ 내의 100,000개의 RPE 세포)를 포함하는 제약 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. RPE 세포 제제는 망막하 공간 내로 주사된다. 환자는 6주 동안 5 mg/kg 시클로스포린의 치료 과정에 적용된다. 환자는 부작용 발생에 대해 모니터링된다. 환자의 시력은 치료 후에 적어도 6개월 동안 모니터링되고 시험된다.

실시예 27

스타르가르트 병의 환자의 치료

스타르가르트병 (노란점 안저)으로 진단받은 인간 환자는 적어도 약 100,000개의 인간 RPE 세포 (예를 들어, 50 ㎕ 내의 100,000개의 RPE 세포)를 포함하는 제약 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. RPE 세포 제제는 망막하 공간 내로 주사된다. 환자는 6주 동안 5 mg/kg 시클로스포린의 치료 과정에 적용된다. 환자는 부작용 발생에 대해 모니터링된다. 환자의 시력은 치료 후에 적어도 6개월 동안 모니터링되고 시험된다.

모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 미국 특허 가출원 번호 60/998,766 (2007년 10월 12일자 출원), 60/998,668 (2007년 10월 12일자 출원), 61/009,908 (2008년 1월 2일자 출원), 및 61/009,911 (2008년 1월 2일자 출원)의 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 추가로, WO 2009/051671의 개시내용도 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

당업자는 단지 통상적인 실험을 통해 본원에서 기재되는 발명의 구체적인 실시양태의 많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

(a) 만능 줄기 세포를 제공하고;
(b) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하여 배상체를 형성시키고;
(c) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 배상체를 배양하여 부착 배양액을 형성시키고;
(d) 고밀도 체세포 배양액의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (c)의 세포를 배양하고, 이에 의해 망막 색소 상피 (RPE) 세포가 세포의 배양액에 나타나고;
(e) (d)의 배양액을 해리시키고;
(f) 배양액으로부터 RPE 세포를 선택하고, RPE 세포를 성장 인자로 보충된 별개의 배양액 함유 배지에 이송하여 RPE 세포의 농축 배양액을 생산하고;
(g) RPE 세포의 농축 배양액을 증식시켜 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하는 것
을 포함하는, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양액을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 (multipotent) 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포인 방법.
제2항에 있어서, 만능 줄기 세포가 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포인 방법.
제1항에 있어서, (a)의 만능 줄기 세포가 유전자 조작된 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (f), 또는 (g)의 배지가 혈청 비함유 B-27 보충물을 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (f), 또는 (g)의 배지가 혈청 비함유 B-27 보충물을 함유하지 않는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (g)의 성장 인자가 EGF, bFGF, VEGF, 또는 재조합 인슐린-유사 성장 인자인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (g)의 배지가 헤파린, 히드로코르티손, 또는 아스코르브산을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 세포가 적어도 약 7-14일 동안 배양되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 세포가 적어도 약 7-10일 동안 배양되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 세포가 적어도 약 14-21일 동안 배양되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (f), 또는 (g)의 배지가 MDBK-GM, 옵티프로(OptiPro) SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (e)가 배양액을 트립신, 콜라게나제, 디스파제, 파파인, 콜라게나제와 디스파제의 혼합물, 및 콜라게나제와 트립신의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (e)가 기계적 파쇄를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 만능 줄기 세포가 감소된 HLA 항원 복잡성을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현을 결여하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포 마커가 Oct-4, NANOG, Rex-1, 알칼리성 포스파타제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 또는 DPPA-4인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 RPE 세포 마커를 발현하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 RPE 세포 마커가 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MitF, Otx2, PAX2, Pax-6, 또는 티로시나제인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 추가로 배양되어 성숙한 RPE 세포의 배양액을 생산하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포가 종양 발생성이 아닌 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 배양액에 마우스 배아 피더 세포 (MEF) 및 인간 배아 줄기 세포 (hES)가 실질적으로 없는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포를 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시키는 조건 하에 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛이 1-6 또는 9인 방법.
제23항에 있어서, 상기 조건이 망가니즈에 대한 노출, CD29에 대한 항체에 대한 노출, 또는 상기 RPE 세포의 적어도 약 4회의 계대배양을 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 HUTS-21 또는 모노클로날 항체 (mAb) TS2/16인 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포의 농축 배양액을 증식시키기 위해 사용되는 배양 배지가 미분화된 만능 줄기 세포의 성장 또는 유지를 지지하지 않는 것인 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 표 4에 언급된 기준 중 적어도 하나를 충족시키는 것인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 우수 의약품 제조 기준 (Good Manufacturing Practices; GMP)에 따라 수행되는 것인 방법.
(a) 만능 줄기 세포를 제공하고;
(b) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하여 배상체를 형성시키고;
(c) 영양소 풍부 저 단백질 배지에서 배상체를 배양하여 부착 배양액을 형성시키고;
(d) 고밀도 체세포 배양액의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (c)의 세포를 배양하고, 이에 의해 망막 색소 상피 (RPE) 세포가 세포의 배양액에 나타나고;
(e) (d)의 배양액을 해리시키고;
(f) 배양액으로부터 RPE 세포를 선택하고, RPE 세포를 성장 인자로 보충된 별개의 배양액 함유 배지에 이송하여 RPE 세포의 농축 배양액을 생산하고;
(g) RPE 세포의 농축 배양액을 증식시키고;
(h) RPE 세포의 농축 배양액을 배양하여 성숙한 RPE 세포를 생산하는 것
을 포함하는, 성숙한 RPE 세포의 실질적으로 순수한 배양액의 생산 방법.
제30항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포인 방법.
제31항에 있어서, 만능 줄기 세포가 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포인 방법.
제30항에 있어서, (a)의 만능 줄기 세포가 유전자 조작된 것인 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (f), (g), 또는 (h)의 배지가 혈청 비함유 B-27 보충물을 함유하는 것인 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (f), (g), 또는 (h)의 배지가 혈청 비함유 B-27 보충물을 함유하지 않는 것인 방법.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 세포가 적어도 약 7-14일 동안 배양되는 것인 방법.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 세포가 적어도 약 7-10일 동안 배양되는 것인 방법.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, (e)의 세포가 적어도 약 14-21일 동안 배양되는 것인 방법.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (f), (g), 또는 (h)의 배지가 MDBK-GM, 옵티프로 SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM인 방법.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, (f)의 성장 인자가 EGF, bFGF, VEGF, 또는 재조합 인슐린-유사 성장 인자인 방법.
제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 (g)가 헤파린, 히드로코르티손, 또는 아스코르브산을 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (e)가 배양액을 트립신, 콜라게나제, 디스파제, 파파인, 콜라게나제와 디스파제의 혼합물, 및 콜라게나제와 트립신의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (e)가 기계적 파쇄를 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 만능 줄기 세포가 감소된 HLA 항원 복잡성을 갖는 것인 방법.
제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현을 결여하는 것인 방법.
제45항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포 마커가 Oct-4, NANOG, Rex-1, 알칼리성 포스파타제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 또는 DPPA-4인 방법.
제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 RPE 세포 마커를 발현하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 RPE 세포 마커가 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MitF, Otx2, PAX2, Pax-6, 또는 티로시나제인 방법.
제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포를 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시키는 조건 하에 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제49항에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛이 1-6 또는 9인 방법.
제49항에 있어서, 상기 조건이 망가니즈에 대한 노출, CD29에 대한 항체에 대한 노출, 또는 상기 RPE 세포의 적어도 약 4회의 계대배양을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 HUTS-21 또는 모노클로날 항체 (mAb) TS2/16인 방법.
제30항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포의 농축 배양액을 증식시키기 위해 사용되는 배양 배지가 미분화된 만능 줄기 세포의 성장 또는 유지를지지하지 않는 것인 방법.
제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 표 4에 언급된 기준 중 적어도 하나를 충족하는 것인 방법.
제30항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 우수 의약품 제조 기준 (GMP)에 따라 수행되는 방법.
RPE 세포가 다음 특성 중의 적어도 하나를 갖는 것인, 망막 변성의 치료에 적합한 RPE 세포의 제약 제제:
(a) 이식 후에 적어도 약 1개월 동안 표현형을 유지하거나,
(b) 적어도 약 1개월 동안 배양액 내에서 그의 표현형을 유지하거나,
(c) 이식 후에 숙주 내로 통합되거나,
(d) 이식 후에 실질적으로 증식하지 않거나.
(e) 식세포작용성 (phagocytositic)이거나,
(f) 비타민 A를 전달, 대사 또는 저장하거나,
(g) 이식 후에 망막과 맥락막 사이에서 철을 수송하거나,
(h) 이식 후에 브루크 (Bruch) 막에 부착하거나,
(i) 이식 후에 미광을 흡수하거나,
(j) 알파 인테그린 서브유닛의 발현 증가를 보이거나, 또는
(k) 인간 공여자로부터 유래된 RPE 세포보다 더 긴 말단소체를 갖는다.
제1항의 방법에 의해 제조된 RPE 세포의 제약 제제.
제30항의 방법에 의해 제조된 RPE 세포의 제약 제제.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 RPE 세포의 제약 제제.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 따른 유효량의 RPE 세포를 포함하는, 망막 변성의 치료에 사용하기 위한 제약 제제.
제60항에 있어서, 망막 변성이 스타르가르트 (Stargardt)병, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 범맥락막위축, 색소성 망막염, 망막 박리, 망막 이형성증, 또는 망막 위축으로 인한 것인 제제.
제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 현탁액, 겔, 또는 콜로이드의 형태로 이식을 위해 제형화되는 것인 제제.
제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 매트릭스, 기재, 스캐폴드, 또는 이식편과 함께 이식을 위해 제형화되는 것인 제제.
제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 눈의 망막하 공간으로의 투여를 위해 제형화되는 것인 제제.
제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 10³-10⁹개의 RPE 세포를 포함하는 제제.
제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 성숙한 RPE 세포를 포함하는 것인 제제.
제66항에 있어서, RPE 세포가 본질적으로 성숙한 RPE 세포로 이루어지는 것인 제제.
제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현을 결여하는 것인 제제.
제68항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포 마커가 Oct-4, NANOG, Rex-1, 알칼리성 포스파타제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 또는 DPPA-4인 제제.
제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 RPE 세포 마커를 발현하는 것인 제제.
제70항에 있어서, 상기 RPE 세포 마커가 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MitF, Otx2, PAX2, Pax-6, 또는 티로시나제인 제제.
제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 표 5에 나열된 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, 적어도 하나의 유전자의 발현이 인간 ES 세포에서의 발현에 비해 RPE 세포에서 증가되는 것인 제제.
제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 표 6에 나열된 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, 적어도 하나의 유전자의 발현이 인간 ES 세포에서의 발현에 비해 RPE 세포에서 감소되는 것인 제제.
제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 증가된 알파 인테그린 서브유닛 발현을 보이는 것인 제제.
제74항에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛이 알파 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 9인 제제.
제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 mRNA 발현인 제제.
제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 단백질 발현인 제제.
제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 mRNA 및 단백질 발현을 모두 포함하는 것인 제제.
제56항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포가 증가된 알파 인테그린 서브유닛 발현을 보이는 것인 제제.
제79항에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛이 1-6 또는 9인 제제.
제56항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 표 4에 언급된 기준 중 적어도 하나를 충족하는 것인 제제.
제56항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 75% RPE 세포를 포함하는 제제.
제56항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스, 박테리아, 및/또는 진균 오염이 실질적으로 없는 제제.
제56항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체 내에 제형화되는 제제.
제56항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 눈으로의 투여를 위해 제형화되는 제제.
제85항에 있어서, 망막하 공간으로의 투여를 위해 제형화되는 제제.
제56항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 이식시에 망막 내로 통합될 수 있는 기능적 RPE 세포인 제제.
제56항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 및 인간 배아 줄기 세포 (hES)가 실질적으로 없는 제제.
제56항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 우수 의약품 제조 기준 (GMP) 부합성인 제제.
적어도 약 10⁴개의 인간 RPE 세포를 포함하고, 인간 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제이고, 여기서 RPE 세포가 RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 Mit-F를 발현하는 것인, 동결보존된 제제.
제90항에 있어서, 적어도 약 85%의 RPE 세포가 해동 후에 생존력을 보유하는 것인 동결보존된 제제.
RPE 세포가 mRNA 및 단백질 수준에서 RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 Mit-F를 발현하고, 세포가 Oct-4, NANOG, 및 Rex-1의 발현을 실질적으로 결여하는 것인, 인간 만능 줄기 세포로부터 분화된 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제.
제92항에 있어서, RPE 세포가 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포를 포함하고, 적어도 성숙한 분화된 RPE 세포가 mRNA 및 단백질 수준에서, PAX2, pax-6, 및 티로시나제를 추가로 발현하는 것인 제제.
제92항에 있어서, RPE 세포가 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포로부터 분화된 것인 제제.
제92항에 있어서, RPE 세포가 표 4에 언급된 기준 중 적어도 하나를 충족하는 것인 제제.
망막 변성의 치료용 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 RPE 세포의 제약 제제의 용도.
(a) RPE 세포를 배양하고,
(b) 상기 RPE 세포를 수거하고,
(c) 상기 RPE 세포를 원심분리하고,
(d) 상기 RPE 세포를 10% DMSO/90% FBS 용액 내에 재현탁하는 것
을 포함하는, RPE 세포를 동결보존하는 방법.
제97항에 있어서, 상기 RPE 세포가 Ca² ⁺/Mg⁺ DPBS로 세척되는 것인 방법.
제97항에 있어서, 상기 RPE 세포가, 베스트로핀이 세포 막에서 조직화될 때까지 배양된 것인 방법.
제97항에 있어서, 상기 RPE 세포가 중간 색소침착 수준에 도달할 때까지 배양되는 것인 방법.
제97항에 있어서, 상기 (a)가 RPE 세포의 적어도 2개의 배양 용기를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
제101항에 있어서, 상기 RPE 세포가 수거되고 단일 로트로 조합되는 것인 방법.
제102항에 있어서, 상기 RPE 세포가 수거되고, RPE 세포의 조합 동안 FBS 내에 저장되는 것인 방법.
제56항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 RPE 세포를 포함하는 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 망막 변성의 치료 방법.
제104항에 있어서, 망막 변성이 범맥락막위축, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 망막 박리, 색소성 망막염, 또는 스타르가르트병으로 인한 것인 방법.
제104항 또는 제105항에 있어서, 제제가 현탁액, 매트릭스, 겔, 콜로이드, 스캐폴드, 또는 기재 내에 이식되는 것인 방법.
제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 눈의 망막하 공간 내에 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 적어도 약 20,000-200,000개의 RPE 세포인 방법.
제108항에 있어서, 유효량이 적어도 약 20,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 또는 200,000개의 RPE 세포인 방법.
제104항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 망막전위도 반응, 시운동력 역치, 또는 휘도 역치를 측정함으로써 방법의 효능을 모니터링하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제104항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 제제에 바이러스, 박테리아, 또는 진균 오염이 실질적으로 없는 것인 방법.
제104항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 이식시에 망막 내로 통합될 수 있는 기능적 RPE 세포인 방법.
제104항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 이식 후에 시력을 개선하는 것인 방법.
제104항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포 내의 알파 인테그린 서브유닛 발현이 증가되는 것인 방법.
제114항에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛이 알파 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 9인 방법.