ES2604659T3 - Métodos y medios para la diferenciación de las células del ojo - Google Patents
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Abstract
Un método para producir células diferenciadas de los ojos seleccionadas del grupo que consiste en células precursoras epiteliales de la córnea, células epiteliales de la córnea y epitelio estratificado de la córnea, comprendiendo el método: a) cultivar células madre pluripotentes en un medi 5 o de inducción que comprende un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de Wnt y un factor de crecimiento de fibroblastos, produciendo con esto células precursoras del ojo; b) cultivar las células precursoras del ojo obtenidas en la etapa a) en un medio de cultivo cellular que comprende uno o más suplementos seleccionados del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico (EGF), hidrocortisona, insulina, isoproterenol, y tri-yodo-tironina, en donde el medio no contiene ninguno de los siguientes suplementos: un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de Wnt y un factor de crecimiento de fibroblastos, por el que se producen células precursoras epiteliales de la córnea, en donde dichas células precursoras epiteliales de la córnea expresan el marcador epitelial de la córnea p63, siendo dicha expresión preferiblemente cuantificada con tinción inmunofluorescente, y opcionalmente madurando dichas células precursoras epiteliales de la córnea en células epiteliales de la córnea maduras o en el epitelio estratificado de la córnea.
Description
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etapa de maduración sin inducción previa. Se obtuvieron resultados mejorados, por ejemplo, con respecto a una mejor adherencia a sustratos recubiertos con colágeno IV, la morfología de las células epiteliales de la córnea fue uniforme, y una mayor expresión de p63, así como otros marcadores clave (más notablemente citoqueratinas 3, 12 y 15), tanto en el nivel de los genes como en el de las proteínas.
Características generales de los presentes medios
El medio de cultivo se puede considerar que consiste en medio basal y suplementos. En el presente medio de inducción, los tres suplementos esenciales son el inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de Wnt y un factor de crecimiento de fibroblastos. En el presente medio de diferenciación y maduración epitelial corneal, suplementos ejemplares o preferidos adicionales a los suplementos de cultivo celular comunes se seleccionan del grupo que consiste en EGF, hidrocortisona, insulina, isoproterenol, y tri-yodo-tironina. En el presente medio de diferenciación y maduración EPR, los suplementos ejemplares o preferidos adicionales a los suplementos de cultivo celular comunes se seleccionan del grupo que consiste en taurina, hidrocortisona, tri-yodo-tironina, activina A, insulina, transferrina, selenito de sodio, putrescina, y progesterona. Sin embargo, en los medios de cultivo de contexto, otros suplementos comunes en la técnica pueden ser aplicados, a menos que se sepa que la diferenciación va directa hacia tejidos distintos de los del ojo. Cuando se hace referencia a los componentes de un medio, el término incluye tanto los suplementos como los ingredientes para el medio basal.
Cuando está en uso o cuando esté listo para su uso, los presentes medios de cultivo comprenden los suplementos esenciales apropiados indicados anteriormente. Sin embargo, según la práctica común en el campo, los ingredientes para un medio se pueden proporcionar como un concentrado que comprende dichos componentes o un conjunto de viales a partir de los cuales se prepara una combinación adecuada en un laboratorio de acuerdo con las instrucciones proporcionadas.
Como se menciona en este documento, "medio de cultivo" se refiere ampliamente a cualquier formulación líquida o de gel diseñada para apoyar el crecimiento de microorganismos, células o plantas pequeñas. Cuando se hace referencia a la formulación diseñada para el mantenimiento y el crecimiento celular, se utiliza la expresión "medio de cultivo celular". En la técnica, expresiones tales como medio de inducción, medio de crecimiento, medio de diferenciación, medio de maduración, etc. pueden ser consideradas como subespecies respecto al medio general del cultivo de expresión. Cualquier experto en la técnica está familiarizado con los componentes básicos necesarios para mantener y alimentar a los sujetos que viven en el medio de cultivo, y los medios básicos comerciales están ampliamente disponibles. Típicamente, tales componentes básicos se conocen como "medios basales", que contienen los aminoácidos necesarios, minerales, vitaminas y compuestos orgánicos. En general, se pueden obtener de fuentes biológicas, tales como suero o combinarse con ingredientes aislados y puros. Si se desea, el medio basal puede ser suplementado con sustancias que contribuyan a características especiales o funciones del medio de cultivo. Suplementos muy comunes incluyen a los antibióticos, que se utilizan para limitar el crecimiento de contaminantes.
Los ejemplos no limitantes de medios basales adecuados para su uso en el presente medio de cultivo celular de diversas realizaciones incluyen de Medio Eagle Modificado de Dulbecco de KnockOut (KO-DMEM), Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F12, medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de Dulbecco modificado de Iscove y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones preferidas, el medio REgES alterado por la omisión de retinol, bFGF y la activina A (denominado en este documento RegESbasic) se utiliza como el medio basal. En algunas realizaciones más preferidas, se utiliza RegESbasic como medio basal en el presente medio de inducción.
Para una mejor aceptación clínica, todos los medios de cultivo utilizados en el presente documento están preferiblemente sustancialmente exentos de xeno, sustancialmente exentos de suero o definidos, más preferiblemente combinaciones de estos y más preferiblemente o exentos de xeno, exentos de suero y definidos al mismo tiempo. Con sustancialmente se quiere decir en este documento que las trazas no intencionales son irrelevantes y que lo que está bajo las regulaciones clínicas o de laboratorio consideradas y aceptadas como exento de xeno, o exento de suero o definido, es lo que se aplica en este documento también.
Tradicionalmente, el suero, especialmente el suero bovino fetal (FBS) se ha valorado en cultivos de células que proporcionan los componentes de crecimiento y supervivencia esenciales para el cultivo celular in vitro de las células eucariotas. Se produce a partir de sangre recogida en los mataderos comerciales de ganado criado para suministrar la carne destinada al consumo humano. "Exento de suero" indica que el medio de cultivo no contiene suero, ya sea animal o humano. El medio definido se valora cuando hay contradicciones para el uso de los medios indefinidos, por ejemplo, "medio condicionado", que se refiere a los medios gastados recogidos a partir de células cultivadas que contienen metabolitos, factores de crecimiento y proteínas de matriz extracelular secretadas en el medio por las células cultivadas. Los medios indefinidos pueden estar sujetos a diferencias considerables debido a la variación natural en la biología. Los componentes indefinidos en un cultivo celular comprometen la repetibilidad de los experimentos de modelos de células, por ejemplo, en el descubrimiento de fármacos y estudios de toxicología. Por lo tanto, "medio definido" o "medio de cultivo definido" se refiere a una composición, en la que el medio ha conocido cantidades de todos los ingredientes. Típicamente, el suero que normalmente se añade al medio de cultivo para el cultivo celular se sustituye por cantidades conocidas de los componentes del suero, tales como, por ejemplo,
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albúmina, insulina, transferrina y factores de crecimiento posiblemente específicos (es decir, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento transformante o factor de crecimiento derivado de plaquetas).
Un medio químicamente definido es un medio de crecimiento adecuado para el cultivo de células in vitro de células humanas o animales en el que se conocen todos los componentes químicos. Un medio químicamente definido está totalmente libre de componentes derivados por animales y representa el ambiente de cultivo celular más puro y consistente. Por definición, los medios químicamente definidos no pueden contener suero fetal bovino, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano, ya que estos productos son derivados de fuentes bovinas o humanas y contienen mezclas complejas de albúminas y lípidos.
Los medios químicamente definidos difieren de los medios exentos de suero por la albúmina de suero bovino o la albúmina de suero humano, ya sea con una versión químicamente definida recombinante (que carece de los lípidos asociados a la albúmina) o químico sintético, tal como el alcohol de polivinilo polímero que puede reproducir algunas de las funciones de BSA/HSA. El siguiente nivel de los medios definidos, por debajo de los medios químicamente definido es un medio exento de proteínas. Estos medios contienen hidrolizados de proteína animal y son complejos para formular aunque se utilizan comúnmente para el cultivo de insectos o de células CHO.
De acuerdo con algunas realizaciones, el presente medio comprende una formulación de reemplazo de suero exento de xeno. Una formulación de reemplazo de suero exento de xeno definida o composición se pueden usar para complementar cualquier medio basal adecuado para su uso en la derivación, el mantenimiento, la proliferación, o la diferenciación in vitro de células madre. Dicha sustitución de suero se puede utilizar para complementar cualquiera de los medios basales que contienen suero o exentos de suero, o cualesquiera combinaciones de los mismos. Cuando el medio basal exento de xeno se complementa con la presente sustitución de suero exento de xeno, el medio de cultivo final está exento de xeno también. Un ejemplo se describe en Rajala et al. 2010, que se incorpora en este documento como referencia para describir un reemplazo de suero exento de xeno aplicable en el contexto de la presente invención. Otro ejemplo no limitante de un reemplazo de suero definido es el reemplazo de suero KnockOut™ (Ko-SR) comercialmente disponible de Life Technologies.
Cualquier experto en la técnica está familiarizado con las diferentes concentraciones del medio de cultivo. A menudo, el medio de cultivo se diluye y se prepara a la composición final inmediatamente antes de su uso. Por lo tanto, se entiende que cualquier solución madre o kit de preparación adecuado para uso en tal preparación inmediata está incluido en el alcance de la presente invención también. Por ejemplo, para la preparación de un medio de cultivo de acuerdo con la presente descripción, un kit de cultivo celular comprende el inhibidor de TGFbeta, el inhibidor de Wnt y el factor de crecimiento de fibroblastos cada uno en un recipiente separado o cualquiera de sus combinaciones como suplementos, y opcionalmente otros componentes, tales como el medio basal o suministros para su preparación, también.
Parte experimental de referencia
Materiales y métodos
Línea celular y medios de cultivo celular
La línea de células madre pluripotentes indiferenciada se deriva y se caracteriza como se ha descrito previamente (Skottman 2010). La línea celular se cultivó en fibroblastos de prepucio humano inactivados mitóticamente (hFF) de células alimentadoras (CRL-2429, ATCC). Las células madre pluripotentes no diferenciadas se mantuvieron en un medio de cultivo que consistía en medio Eagle modificado de Dulbecco Knock-Out (KO DMEM) suplementado con 20% de reemplazo de suero Knock-Out (KO-SR), Glutamax-l 2 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 mM (todos de Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 50 U/ml de penicilina/estreptomicina (ambos de Lonza Group Ltd) y 8 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos humano básico (bFGF, PeproTech). El medio de cultivo se cambió cinco veces a la semana y las colonias no diferenciadas fueron pasadas enzimáticamente sobre capas de células de alimentación frescas a intervalos de diez días.
Tres medios diferentes se utilizaron para la diferenciación del epitelio corneal: A) medio definido comercialmente disponible y exento de suero de epitelio corneal CNT-30 (CELLnTEC Advanced Cell Systems) suplementado con los suplementos apropiados suministrados con el medio y 50 U/ml de penicilina/estreptomicina. B) medio RegES exento de suero y exento de xeno desarrollados originalmente para el cultivo de células madre indiferenciadas (Rajala et al., 2010). La composición del medio fue alterada por la omisión de retinol, bFGF y activina A, y el medio de diferenciación resultante se denomina como medio RegESbasic. La composición de dicho medio RegESbasic fue como se da en la Tabla 1. C) medio RegESbasic suplementado con inhibidor de TGF-beta 10 μΜ (SB-505124 Sigma), Wnt-inhibidor 10 μΜ (IWP-2 Merck Biosciences) y 50 ng/ml de bFGF y el medio de inducción resultante se refiere como medio RegESinduction.
Tabla 1. Medio RegESbasic que representa un ejemplo de medio de cultivo celular exento de xeno de acuerdo con Rajala et al., 2010.
- Componente
- Concentración (mg/L) Fabricante
- Aminoácidos
- Glicina
- 53 Sigma
- L-histidina
- 183 Sigma
- L-isoleucina
- 615 Sigma
- L-metionina
- 44 Sigma
- L-fenilalanina
- 336 Sigma
- L-prolina
- 600 Sigma
- L-hidroxiprolina
- 15 Sigma
- L-serina
- 162 Sigma
- L-treonina
- 425 Sigma
- L-triptófano
- 82 Sigma
- L-tirosina
- 84 Sigma
- L-valina
- 454 Sigma
- Vitaminas, antioxidantes y oligoelementos
- Ácido ascórbico
- 50 Sigma
- Glutatión
- 1,5 Sigma
- Selenio
- 1 x 10-5 Sigma
- Tiamina
- 9 Sigma
- Oligoelementos B
- 1:1000 Cellgro
- Oligoelementos C
- 1:1000 Cellgro
- Proteínas
- Albúmina de suero humano*
- 10 000 Sigma
- Insulina
- 100 Invitrogen
- Transferrina
- 8 Sigma
- Otros componentes
- AANE (100x)
- 1% Lonza
- Glutamax-I
- 2 mM Invitrogen
- ß-mercaptoetanol
- 0,1 mM Invitrogen
Medio basal: KO-DMEM (Invitrogen)
*Para proporcionar una mejor consistencia y menos variación, HSA puede ser sustituido con HSA recombinante.
Inducción del precursor de los ojos
El diseño experimental se presenta esquemáticamente en la Figura 3. Para iniciar la diferenciación del precursor del ojo de células madre pluripotentes, las colonias no diferenciadas se disecaron manualmente y se transfirieron a un cultivo en suspensión en placas de 6 pocillos (fijación ultra-baja de Corning). Las células se cultivaron como grupos de células tridimensionales de cuatro a siete días, cambiando el medio de cultivo todos los días. Esta etapa de inducción se llevó a cabo en RegESinduction (diferenciación córnea epitelial) y en condiciones de control en
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en suspensión, la expresión de POU5F1 disminuyó en todas las condiciones, mientras que la expresión de PAX6 aumentó. Las diferencias en los niveles de expresión en comparación con las células no diferenciadas fueron significativamente mayores (p <0,05, determinado mediante pruebas de Mann-Whitney U) en las células que se sometieron a la inducción con SB-505124, IWP-2 y bFGF, que en los otros medios de inducción, sugiriendo una mayor grado de diferenciación en estas condiciones.
La inducción de pequeñas moléculas aumenta la eficiencia de la diferenciación epitelial de la córnea y la reproducibilidad
La expresión de proteínas del marcador p63 progenitor epitelial corneal de uso común se analizó a intervalos de diez días por medio de la tinción de inmunofluorescencia. El primero punto de tiempo fue después de seis días en cultivo adherente, un total de diez días en cultivo de diferenciación, dando el tiempo a los grupos de células para adherirse adecuadamente al sustrato de colágeno IV revestido. El siguiente punto del tiempo se obtuvo el día 20, y el último el día 30. La expresión de p63 no se detectó en células cultivadas en condiciones de diferenciación espontánea en RegESbasic durante todo el curso del estudio, lo que sugiere que la diferenciación de células precursoras del epitelio corneal no tiene lugar de forma espontánea. Las células se mantuvieron en p63 expresado en medio CNT-30 en cada punto de tiempo, y los niveles de expresión fueron claramente afectados por el medio de inducción. Con el fin de cuantificar las diferencias entre las condiciones de cultivo, las cantidades de células p63 positivas fueron contadas en cada punto de tiempo. Después de la inducción con CNT-30, la expresión de p63 fue bastante variada entre las réplicas biológicas, enmascarando las diferencias globales entre los puntos de tiempo. Por el contrario, después de la inducción con medio RegESinduction, el número de células p63 positivas aumentó con el tiempo de aproximadamente 50% el día 10, a aproximadamente 90% el día 30, con la variación de menos interreplicado de todas las condiciones estudiadas. La población de células precursoras de la córnea después del cultivo 30 demostró de este modo curiosamente un alto grado de diferenciación. La inducción con medio RegESbasic resultó en los niveles de expresión de p63 más bajos en promedio, 25-50% durante todo el curso del estudio, con bastante alta variación entre las repeticiones.
La maduración en SHEM produjo cantidades comparables de células p63 positivas después de un total de 20 días en cultivo de diferenciación, como se verificó mediante tinción de inmunofluorescencia (Figura 5).
Las células epiteliales de la córnea pueden ser diferenciadas a partir de células madre pluripotentes
Debido a que el medio de inducción afectaba el rendimiento posterior de las células precursoras p63 positivas corneales epiteliales, la expresión de varias proteínas típicas de los precursores de la córnea (p63 y CK15) y el epitelio maduro (CK3 y CK12) se cuantificó también en el punto final del estudio.
Después de un total de 44 días en cultivo de diferenciación, las células se analizaron con inmunofluorescencia, tinción positiva para los marcadores progenitores p63 y CK15, y marcadores específicos del epitelio corneal, CK3 y CK12. Los resultados que muestran los porcentajes de diferenciación se compilan en la Tabla 2, donde se da la relación entre células diferenciadas y el número total de células; las escalas indican que 0% significa que ninguna de las células (de la población estudiada) expresan el marcador de diferenciación, y 100 % significa que todas las células expresan el marcador de diferenciación. Se detectaron los dos marcadores del epitelio corneal maduro especialmente en las regiones estratificadas, lo que sugiere que se requiere una estratificación para la completa maduración del epitelio corneal. La expresión de marcadores progenitores y marcadores maduros fue en su mayor parte mutuamente excluyente.
Tabla 2. Resultados que representan la eficiencia de diferenciación (44 días en cultivo de diferenciación).
- Marcador
- Tipo celular Expresión en el punto final del estudio
- p63
- Células precursoras del epitelio corneal 70% (desv. est. 4%)
- CK15
- 60% (desv. est. 11%)
- CK3
- Células epiteliales de la córnea maduras 35% (desv. est. 25%)
- CK12
- 70% (desv. est. 5%)
A partir de estos resultados, se puede concluir que el presente método para cultivar células precursoras epiteliales de la córnea o células epiteliales de la córnea maduras, que comprende cultivar células madre en un medio de cultivo que comprende un inhibidor de TGF-beta, un Wnt-inhibidor y un factor de crecimiento de fibroblastos como suplementos, ha demostrado un potencial interesante.
De acuerdo con una realización, dicho método se caracteriza por la expresión del marcador p63 corneal epitelial, preferiblemente siendo al menos el 65% y más preferiblemente al menos el 70% de las células de la población positivas con dicho marcador. De acuerdo con otra realización, dicho método se caracteriza por la expresión de marcadores epiteliales de la córnea CK15, preferiblemente siendo al menos el 50% y más preferiblemente al menos el 70% de las células de la población positivas con dicho marcador. De acuerdo con una realización adicional, dicho
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