CN115261301A - 一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法。本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的体外诱导方法，包括如下步骤：1)将多能干细胞的贴壁培养物置于神经外胚层诱导培养基中诱导培养，得到诱导培养后细胞；2)将所述诱导培养后细胞在分化培养基中分化培养，得到分化培养后细胞；3)将所述分化培养后细胞依次在视网膜色素上皮细胞成熟培养基1和视网膜色素上皮细胞成熟培养基2中进行成熟培养，得到视网膜色素上皮细胞；本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞体外诱导方法，操作简单，培养基组分明确，不含动物源材料无血清组分，在不同多能干细胞系间，显示了效率高、稳定性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法。
背景技术
多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)，包括胚胎干细胞(embryonic stemcell,ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)，向视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)的诱导，仍然存在一定的挑战。目前，常用的诱导方法分为二维和三维自发分化法。二维分化法是由Klimanskaya等建立，主要是通过去除培养基中的碱性成纤维生长因子(bFGF)，采取过度生长自由分化的方式，形成色素点，分离该色素点转移至行的培养皿中进一步培养，获得含色素的RPE细胞。Idelson等建立了RPE的三维培养诱导方法，悬浮培养多能干细胞细胞，形成拟胚体(embryonis),进行自发分化，获得类似于光学囊泡的色素结构，进一步手工分离RPE细胞。也有一些研究，在分化过程中，添加有些诱导分子，如烟酰胺和Activin A，促进光学囊泡的色素结构的形成。但这些方法总体上，操作繁琐，有些方法所用的培养基组分不明确，需要含有动物或人源滋养层细胞，分化效率低，诱导稳定性得不到保障。
目前RPE体外诱导分化总体上分为2D和3D方法，2D方法为贴壁后分化，3D主要通过拟胚体的方法进行分化。根据是否添加诱导剂，分化自发分化和诱导分化。自发分化诱导率低，需要进行人工挑去色素灶，操作较为繁琐，不适用于规模化制备。而诱导分化，在诱导后细胞培养基质选择上，还是以Matrigel为主，Matrigel来自小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肿瘤，批次间组分存在差异，为动物源材料。目前诱导步骤多，存在滋养层、动物源材料等风险。
因此，在组分明确的培养基前提下，利用小分子诱导剂调节细胞外信号通路，模拟细胞的发育过程，高效、高纯度、可重复、不同细胞系间稳定的无动物源、体外定向诱导技术及培养方法的建立，是临床级RPE细胞制备并进一步开展临床研究的重要基础。
发明内容
本发明一个目的是提供一种视网膜色素上皮细胞的体外诱导方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将多能干细胞的贴壁培养物置于神经外胚层诱导培养基中诱导培养，得到诱导培养后细胞；
所述多能干细胞的贴壁培养物为所述多能干细胞细胞贴壁培养产物；
所述多能干细胞的贴壁培养物按照如下方法制备：将所述多能干细胞在细胞基础培养基中贴壁培养得到；所述贴壁培养在包被促贴壁培养物的培养容器中进行；
所述神经外胚层诱导培养基包括细胞基础培养基和诱导剂；
2)将所述诱导培养后细胞在分化培养基中分化培养，得到分化培养后细胞；
所述分化培养基包括细胞基础培养基、N-2Supplement、B-27Supplement和分化诱导剂；
3)将所述分化培养后细胞依次在视网膜色素上皮细胞成熟培养基1和视网膜色素上皮细胞成熟培养基2中进行成熟培养，得到视网膜色素上皮细胞；
所述成熟培养在促贴壁培养物包被的培养容器进行；
所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1包括细胞基础培养基、血清替代物和Y-27632；
所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基2包括细胞基础培养基和血清替代物。
上述方法中的培养基均为无饲养层培养基；
所述方法中的培养基均无动物源材料。
上述方法中，在步骤1)前还包括如下步骤:将多能干细胞在无饲养层的细胞基础培养基中培养，且所述培养在覆盖促贴壁培养物的培养容器中进行。
上述多能干细胞培养均为在覆盖簇贴壁培养物的培养容器中培养。
上述方法中，在步骤3)后，还包括如下步骤4)：将所述视网膜色素上皮细胞在冻存培养基中冻存；
所述冻存培养基中无动物源材料；
所述冻存培养基包括细胞基础培养基、血清替代物、二甲基亚砜和Y-27632；
或所述冻存培养基包括冻存液(商业化购买的冻存液)和Y-27632。
上述方法中，在步骤4)后还包括步骤5)：将所述冻存后的细胞在所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1中复苏。
上述方法中，所述促贴壁培养物为Vitronectin或层粘连蛋白或iMatrix-511；
或，所述细胞基础培养基为DMEM/F-12培养基、E6培养基或E8培养基。
上述方法中，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导干细胞；在本发明的实施例中为离体的胚胎干细胞或诱导干细胞。
上述方法中，步骤1)中，所述诱导剂为LDN193189和/或SB431542；
步骤2)中，所述分化诱导剂为人重组蛋白Activin A和/或SU-5042。
上述方法中，步骤1)中，所述LDN193189的使用浓度为300-600μM，所述SB431542的使用浓度为5-15μM；
步骤2)中，所述Activin A的使用浓度为50-200ng/ml，所述SU-5042的使用浓度为0-15μM；
步骤3)中，所述血清替代物的使用浓度为10％-20％(体积百分含量)，所述Y-27632的使用浓度为10μM；
步骤4)中，所述血清替代物的使用浓度为40％、所述二甲基亚砜的使用浓度为10％，所述Y-27632的使用浓度为10μM。
上述步骤1)中，具体方法：多能干细胞培养至80％的汇合度时，0.5mM EDTA消化，以1:2的分流比接种到0.5μg/mLVitronectin包被的培养板中，添加E8培养基培养12小时，更换E8培养基为组分明确的神经外胚层诱导培养基，培养6-8天，每隔2天更换一次新鲜培养基；所述的组分明确的神经外胚层诱导培养基是：基础培养基为组分明确的E6培养基，添加诱导剂LDN193189和SB431542；所述LDN193189的使用浓度为300-600μM，SB431542的使用浓度为5-15μM。
上述步骤2)中，所述视网膜色素上皮细胞的分化方法是：更换神经外胚层诱导培养基为组分明确的视网膜色素上皮细胞分化培养基，培养6-10天，每隔2天更换一次新鲜培养基；
所述的组分明确的视网膜色素上皮细胞分化培养基是：基础培养基为组分明确的E6培养基，添加CTSTM(Cell Therapy Systems)N-2Supplement(GibcoTM)，CTSTMB-27TMSupplement,XenoFree(GibcoTM)，分化诱导剂为人重组蛋白Activin A和SU-5042。所述Activin A的使用浓度为50-200ng/ml，SU-5042的使用浓度为0-15μM。
上述步骤3)中，所述视网膜色素上皮细胞的成熟方法是：TrypLETMSelect Enzyme消化分化的未成熟视网膜色素上皮细胞，形成单细胞悬液，以1×105个细胞/cm2的浓度接种到0.5-1μg/cm2层粘连蛋白覆盖的培养皿中，添加组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1，培养2天；随后更换组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基2为组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基，连续培养30-60天，每隔3-4天更换新鲜培养基，获得成熟的视网膜色素上皮细胞；
所述组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1，基础培养基为组分明确的CTSTMKnockOutTMDMEM/F-12或E6培养基，添加10％-20％的KnockOutTMSR XenoFree CTSTM、10μM的Y-27632；
所述组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基2，基础培养基为组分明确的CTSTMKnockOutTMDMEM/F-12或E6培养基，添加10％-20％的KnockOutTMSR XenoFree CTSTM。
步骤4)中，所述细胞的视网膜色素上皮细胞冻存的方法是：视网膜色素上皮细胞在组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基2培养20-40天左右，TrypLETMSelect Enzyme消化形成单细胞悬液，以2×106细胞/mL的浓度溶于视网膜色素上皮细胞冻存培养基中，1mL/管，分装到2mL的冻存管中，以-1℃/min的降速冻存于-80℃过夜，随后转移至液氮中长期保存；
所述视网膜色素上皮细胞冻存培养基为CTSTMKnockOutTMDMEM/F-12，含40％的KnockOutTMSR XenoFree CTSTM，10％的二甲基亚砜(DMSO)，10μM的Y-27632或商业冻存液CTSTMSynth-a-FreezeTMMedium，添加10μM的Y-27632。
步骤5)中，所述细胞的视网膜色素上皮细胞复苏的方法是，从液氮中取出细胞，37℃快速解冻，加入组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1，培养2天；；随后更换组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1为组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基2，可继续培养30-60天。
由上述方法得到的视网膜色素上皮细胞也是本发明保护的范围，所述成熟的视网膜色素上皮细胞在显微镜下成规则的多边形，表达BEST1、CRALBP、MITF、ZO1基因。
本发明另一个目的是提供一种视网膜色素上皮细胞的体外诱导培养基。
本发明提供的培养基，包括第一个目的方法中的的所述神经外胚层诱导培养基、所述分化培养基、所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1和所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基2。
本发明的有益效果：本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞体外诱导方法，操作简单，培养基组分明确，不含动物源材料无血清组分，在不同多能干细胞系间，显示了效率高、稳定性好的优点。同时，本发明提供的培养方法，冻存后的细胞能够很好的保存了诱导细胞的活性。本发明将根据现有RPE发育和体外诱导技术基础，建立稳定、高效的组分明确无动物源成分的RPE定向诱导技术，操作简单，无需进行纯化分选即可达到高纯度RPE诱导细胞。
附图说明
图1为神经外胚层免疫荧光染色结果。
图2为实施例中H1胚胎干细胞向神经外胚层诱导和视网膜色素上皮细胞分化过程中的形态变化显微观察结果。
图3为实施例中H1分化的视网膜色素上皮细胞的成熟培养后的显微观察结果。
图4为实施例中H1分化的视网膜色素上皮细胞免疫荧光染色结果。
图5为实施例中不同细胞系诱导的视网膜色素上皮细胞ZO1流式分析结果。
图6为实施例中诱导的视网膜色素上皮细胞不同冻存细胞复苏活力检测结果。
图7为实施例中冻存复苏培养视网膜色素上皮细胞显微镜观察结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
Vitronectin(玻连蛋白)、E8培养基购自ThermoFisher Scientific。
LDN193189、SU-5042购买自Sigma。
1×CTSTM(Cell Therapy Systems)N-2Supplement(GibcoTM)，1×CTSTMB-27TMSupplement,XenoFree(GibcoTM)购买自ThermoFisher Scientific。Activin A购买自STEMCELL Technologies。
层粘连蛋白LN521购买自BioLamina。
Activin A；
层粘连蛋白iMatrix-511购买自CLONTECH。
人胚胎干细胞系H1(上海埃泽思生物科技有限公司)、H7、H9(上海埃泽思生物科技有限公司)和诱导多能细胞系201B7，均可商购获得。
实施例1、H1胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞
一、诱导分化
1、H1细胞的培养
离体H1细胞系培养于覆盖0.5μg/mL Vitronectin基质胶的培养皿中，培养基为E8培养基，在37℃5％CO2培养箱中培养，每天更换培养基。
2、诱导培养获得神经外胚层细胞
细胞培养至80％左右的汇合度时，0.5mM EDTA消化，以1:2的分流比接种到0.5μg/cm2 Vitronectin包被的培养板中，添加E8培养基培养12小时，得到贴壁培养物；再更换E8培养基为组分明确的神经外胚层诱导培养基，诱导培养6天，每隔2天更换一次新鲜培养基；得到诱导培养后细胞。
神经外胚层诱导培养基由E6培养基、500μM的LDN193189和10μM的SB431542(美国Selleck生物科技有限公司(上海分公司))组成。
诱导培养后细胞经过免疫荧光染色，抗体为PAX6抗体和SOX1抗体，结果如图1所示，可以看出，诱导培养后细胞表达神经外胚层标记物PAX6和SOX1，为神经外胚层细胞。
3、视网膜色素上皮细胞的分化
将2得到的诱导培养后细胞在组分明确的视网膜色素上皮细胞分化培养基，分化培养6天，每隔2天更换一次新鲜培养基，得到分化后细胞。
将上述2和3中不同培养时间的细胞进行显微镜检测，以诱导培养第1天记作第1天(Day1)，结果如图2所示。
上述视网膜色素上皮细胞分化培养基由E6培养基、1×CTSTM(Cell TherapySystems)N-2Supplement(GibcoTM)，1×CTSTMB-27TMSupplement，XenoFree(GibcoTM)，150ng/ml Activin A和5μM的SU-5042组成。
4、视网膜色素上皮细胞的成熟
1)上述3得到的分化后细胞(即为培养12天的视网膜色素上皮细胞，以诱导培养第1天记作培养第1天)，去除培养基，PBS洗涤2次，加入TrypLETMSelect Enzyme，37℃消化5min，移液器轻轻吸打，形成单细胞悬液，离心，收集细胞重悬于组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1，得到细胞悬液；再将细胞悬液以1×105个细胞/cm2的浓度接种到层粘连蛋白包被的培养皿中，成熟培养2天，得到成熟培养后细胞；
层粘连蛋白包被的培养皿为将人重组层粘连蛋白LN521以0.75μg/cm2的覆盖到培养皿中，4℃冰箱中保存，在使用前提前室温放置30min。
2)再将1)得到的成熟培养后细胞在组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基2，再次成熟培养60天，每隔4天更换一次培养基，得到再次成熟培养后细胞。
上述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1由E6培养基、15％(体积百分含量)的KnockOutTMSR XenoFree CTSTM和10μM的Y-27632组成。
上述视网膜色素上皮细胞成熟培养基2由E6培养基和15％(体积百分含量)的KnockOutTMSR XenoFree CTSTM组成。
再次成熟培养后细胞经过显微镜检测，结果如图3所示，可以看出，所获得的细胞呈多边形，具有明显色素沉淀。
二、鉴定
1、免疫荧光染色
向上述一得到装有再次成熟培养后细胞的细胞培养皿中加入4％的多聚甲醛固定，用OCT4抗体(Anti-Oct4 antibody)、BEST1抗体(Anti-Bestrophin/BEST1 antibody)、CRALBP抗体(Anti-CRALBP antibody[B2])、MITF抗体(Anti-MiTF antibody[D5])对细胞进行染色。
Anti-Oct4 antibody(ab18976)、Anti-Bestrophin/BEST1 antibody(ab14927)、Anti-CRALBP antibody[B2](ab15051)以及Anti-MiTF antibody[D5](ab3201)购买自abcam。
结果如图4所示，可以看出，成熟培养后细胞不表达OCT4，表达BEST1、CRALBP、MITF，符合RPE的分子特征，获得视网膜色素上皮细胞。
2、流式分析
将上述一得到再次成熟培养后细胞进行流式分析，所用抗体为ZO1抗体(Anti-ZO1tight junction protein antibody)。
Anti-ZO1 tight junction protein antibody[mAbcam 61357](FITC)(ab150266)抗体购买自abcam。
结果如图5所示，细胞中ZO1+细胞含量达到95％以上。
实施例2、不同多能干细胞系向视网膜色素上皮细胞的诱导
与实施例1的方法基本形态，不同的是多能干细胞分别为胚胎干细胞系H7、H9和诱导多能细胞系201B7，且在步骤4中，视网膜色素上皮细胞成熟培养基1和视网膜色素上皮细胞成熟培养基2均采用CTSTMKnockOutTMDMEM/F-12作为基础培养基，采用0.75μg/cm2的iMatrix-511进行培养皿的包被，其他不变。
得到源于胚胎干细胞系H7、H9和诱导多能细胞系201B7的再次成熟培养后细胞。
将实施例1得到的胚胎干细胞系H1再次成熟培养后细胞和上述得到各种再次成熟培养后细胞进行流式分析，所用抗体为ZO1抗体(Anti-ZO1 tight junction proteinantibody)。
结果如图5所示，可以看出，流式分析表明这几个细胞系得到的再次成熟培养后细胞中ZO1+细胞数量无明显差异，含量均达到95％以上，细胞获得率均显示了较好的一致性。
实施例3、冻存细胞复苏培养
一、诱导分化
与实施例1中的一基本相同，不同如下：步骤4)中，视网膜色素上皮细胞的成熟培养基2再次成熟培养30天，得到再次成熟培养后细胞。
二、冻存
1、冻存
将上述一得到的再次成熟培养后细胞，TrypLETMSelect Enzyme消化为单细胞悬液，以2×106细胞/mL的浓度分别悬浮于视网膜色素上皮细胞冻存培养基1(CTSTMKnockOutTMDMEM/F-12，含40％的KnockOutTMSR XenoFree CTSTM，10％的二甲基亚砜(DMSO)，10μM的Y-27632)、冻存培养基2(商业冻存液CTSTMSynth-a-FreezeTMMedium，添加10μM的Y-27632)以及常规含血清的冻存培养基(命名为冻存培养基3，CTSTMKnockOutTMDMEM/F-12，含40％的FBS，10％的二甲基亚砜(DMSO)，10μM的Y-27632)中，1mL/管分装到2mL的冻存管中，以-1℃/min的降速冻存于-80℃过夜，随后转移至液氮中保存3个月。
2、检测
从液氮罐中取出上述3种冻存方式冻存3个月的细胞，37℃快速解冻，加入组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1，台盼蓝进行活性染色计数。
结果如图6所示，可以看出，所用组分明确无动物源冻存培养基1和2的冻存效果，和传统的含血清冻存培养基3的冻存方法无显著差异。
三、复苏
将上述冻存3个月的细胞37℃快速解冻，加入组分明确的视网膜色素上皮细胞成熟培养基1，培养2天；再将细胞在视网膜色素上皮细胞成熟培养基2继续培养60天。
显微镜检测，结果如图7所示，可以看出，复苏得到的细胞排列紧密、多边形细胞，为活性视网膜色素上皮细胞。
Claims (10)
1.一种视网膜色素上皮细胞的体外诱导方法，包括如下步骤：
1)将多能干细胞的贴壁培养物置于神经外胚层诱导培养基中诱导培养，得到诱导培养后细胞；
所述多能干细胞的贴壁培养物为所述多能干细胞细胞贴壁培养产物；
所述神经外胚层诱导培养基包括细胞基础培养基和诱导剂；
2)将所述诱导培养后细胞在分化培养基中分化培养，得到分化培养后细胞；
所述分化培养基包括细胞基础培养基、N-2Supplement、B-27Supplement和分化诱导剂；
3)将所述分化培养后细胞依次在视网膜色素上皮细胞成熟培养基1和视网膜色素上皮细胞成熟培养基2中进行成熟培养，得到视网膜色素上皮细胞；
所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1包括细胞基础培养基、血清替代物和Y-27632；
所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基2包括细胞基础培养基和血清替代物；
所述方法中的培养基均无动物源材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述方法中的培养基均为无饲养层培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
在步骤1)前还包括如下步骤:将所述多能干细胞在无饲养层的细胞基础培养基中培养。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
在步骤3)后，还包括如下步骤4)：将所述视网膜色素上皮细胞在冻存培养基中冻存；
所述冻存培养基中无动物源材料；
所述冻存培养基包括细胞基础培养基、血清替代物、二甲基亚砜和Y-27632；
或所述冻存培养基包括冻存液和Y-27632。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
在步骤4)后还包括步骤5)：将所述冻存后的细胞在所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1中复苏。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述促贴壁培养物为Vitronectin或层粘连蛋白或iMatrix-511；
或，所述细胞基础培养基为DMEM/F-12培养基、E6培养基或E8培养基。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导干细胞。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述诱导剂为LDN193189和/或SB431542；
步骤2)中，所述分化诱导剂为人重组蛋白Activin A和/或SU-5042。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述LDN193189的使用浓度为300-600μM，所述SB431542的使用浓度为5-15μM；
步骤2)中，所述Activin A的使用浓度为50-200ng/ml，所述SU-5042的使用浓度为0-15μM；
步骤3)中，所述血清替代物的使用浓度为10％-20％，所述Y-27632的使用浓度为10μM；
步骤4)中，所述血清替代物的使用浓度为40％、所述二甲基亚砜的使用浓度为10％，所述Y-27632的使用浓度为10μM。
10.由权利要求1-9中任一所述方法得到的视网膜色素上皮细胞；
或，一种视网膜色素上皮细胞的体外诱导培养基，包括权利要求1-9中任一所述方法中的所述神经外胚层诱导培养基、所述分化培养基、所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基1和所述视网膜色素上皮细胞成熟培养基2。
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