CN105829526A - 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法 - Google Patents

用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105829526A
CN105829526A CN201480055673.5A CN201480055673A CN105829526A CN 105829526 A CN105829526 A CN 105829526A CN 201480055673 A CN201480055673 A CN 201480055673A CN 105829526 A CN105829526 A CN 105829526A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
retinal pigment
pigment epithelium
laminin
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480055673.5A
Other languages
English (en)
Inventor
泽田昌典
高桥政代
关口清俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HEALIOS K K
Osaka University NUC
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Original Assignee
HEALIOS K K
Osaka University NUC
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52813190&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN105829526(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by HEALIOS K K, Osaka University NUC, RIKEN Institute of Physical and Chemical Research filed Critical HEALIOS K K
Publication of CN105829526A publication Critical patent/CN105829526A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供提高了多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率，并且可以通过简单方便的操作在短时间内提供高纯度的视网膜色素上皮细胞的视网膜色素上皮细胞的生产方法，可稳定地生长和培养细胞的视网膜色素上皮细胞的培养方法，使用可用于移植治疗的视网膜色素上皮细胞的毒性/药效评价方法，以及用于视网膜疾病的治疗药物。本发明涉及视网膜色素上皮细胞的生产方法，包括通过使用包被层粘连蛋白?E8片段的人多能干细胞的粘附培养步骤，视网膜色素上皮细胞的培养方法，包括通过使用包被层粘连蛋白?E8片段的视网膜色素上皮细胞的粘附培养步骤，使用通过所述方法生产或培养获得的视网膜色素上皮细胞的毒性或药效评价方法，以及用于视网膜疾病包含视网膜色素上皮细胞的治疗药物。

Description

用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法
技术领域
本发明涉及从人多能干细胞有效地生产视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，稳定地培养视网膜色素上皮细胞的方法，等。
背景技术
作为用于从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，已知下列方法：包括在无血清培养基中培养作为悬浮聚集物的ES细胞（专利文献1等）的称为SFEB法的方法，包括在包被有弱细胞粘附包被剂等的培养基质上在分化诱导因子的存在下诱导多能干细胞的分化的方法（非专利文献1等）。然而，由于低分化诱导效率，这些方法需要组合粘附培养和悬浮培养的多个步骤以获得视网膜色素上皮细胞的高度浓缩的细胞群体，并具有下列问题，诸如需要存在具有高工作量和长时间的纯化步骤，其中包括在光学显微镜下选择性地挑取色素细胞的集落。此外，这些方法具有在传代培养期间容易细胞损失的问题。因此，已经要求能够通过简单和容易的方法稳定地得到高纯度的视网膜色素上皮细胞的方法。
对于人多能干细胞的维持培养，使用细胞外基质代替饲养细胞的方法已被广泛使用。其中，优选使用层粘连蛋白，并且，例如，非专利文献2报告了人ES细胞在层粘连蛋白-511的长期成功的维持培养。至于称为具有改进的细胞粘附活性的改变的层粘连蛋白的E8片段，例如，专利文献2和非专利文献3公开了人多能干细胞的培养方法，其使用人层粘连蛋白-α5β1γ1的E8片段（层粘连蛋白-511E8，，下文以相同的方式指示）和人层粘连蛋白-322E8。非专利文献4中描述了层粘连蛋白-511E8保持对α6β1整联蛋白的结合活性，其与全长层粘连蛋白-511的结合活性是同样水平，并且专利文献2描述了，通过使用所述层粘连蛋白-511E8，多能干细胞可以稳定地固定化在培养皿中，结果是细胞可以进行维持培养，同时保持分化多能性。然而，除了用于多能干细胞培养例如，多能干细胞的分化诱导等之外，没有报告记载利用这样的层粘连蛋白的E8片段。
另一方面，作为不存在饲养细胞的情况下诱导人多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，已知使用层粘连蛋白的方法。例如，非专利文献5描述了通过多能干细胞在层粘连蛋白-111和基质胶上粘附培养，分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率显著增加。然而，没有报告记载利用层粘连蛋白的E8片段用于将多能干细胞诱导分化成视网膜色素上皮细胞。
[文献列表]
专利文献
专利文献 1: WO 2005/123902
专利文献 2: WO 2011/043405
[非专利文献]
非专利文献 1: PLoS One. 2012; 7(5): e37342.
非专利文献 2: Nature Biotech. June 2010; 28(6): 611-5
非专利文献 3: Nat. Commun. 3:1236 doi: 10.1038/ncomms2231
非专利文献 4: J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009
非专利文献 5: J. Tissue Eng Regen Med 2013; 7: 642-653。
发明概述
本发明要解决的技术问题
本发明的一个目标是提供提高了多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率，并且可以通过简单方便的操作在短时间内提供高纯度的视网膜色素上皮细胞的视网膜色素上皮细胞的生产方法，可稳定地生长和培养细胞的视网膜色素上皮细胞的培养方法，使用可用于移植治疗的视网膜色素上皮细胞的毒性/疗效评价方法，以及用于视网膜疾病的治疗药物。
解决技术问题的方法
本发明人已进行了深入研究以尝试实现上述目的，并且发现，当人多能干细胞在包被有层粘连蛋白-E8的培养基质上培养时，接种的多能干细胞迅速粘附到培养基质，从早期阶段产生了大量的色素细胞，视网膜色素上皮细胞的产率可显著提高，细胞在培养基交换期间不容易损伤，纯化步骤可以简化，并且可以在短时间内获得高纯度的细胞群体。结果是，在诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞中的可操作性和经济效率问题可显著改善，并且目的视网膜色素上皮细胞可以稳定和有效地生产，这导致完成本发明。
也就是说，本发明涉及以下内容。
[1] 视网膜色素上皮细胞的生产方法，其包括使人多能干细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养的步骤。
[2] [1]的方法，其中所述层粘连蛋白-E8片段是层粘连蛋白-511E8片段。
[3] [1]或[2]的方法，其中粘附培养的步骤在存在分化诱导因子的情况下进行。
[4] [1]-[3]任一项的方法，其中所述人多能干细胞是人iPS细胞。
[5] 通过使人多能干细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养生产的视网膜色素上皮细胞。
[6] 通过使人多能干细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养生产的视网膜色素上皮细胞片。
[7] 视网膜色素上皮细胞的扩增方法，其包括使视网膜色素上皮细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养的步骤。
[8] 视网膜色素上皮细胞的纯化方法，其包括使视网膜色素上皮细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养的步骤。
[9] 用于视网膜疾病的治疗药物，其包含通过[1]-[4]任一项的方法生产的视网膜色素上皮细胞，或通过[7]的方法培养的视网膜色素上皮细胞。
发明效果
根据本发明，可以以高产率从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞。此外，分化诱导效率得以提高，并且可以获得包含高浓度视网膜色素上皮细胞的细胞群体，以及可以通过简单和容易的纯化操作生产高纯度的视网膜色素上皮细胞。此外，根据本发明，由于视网膜色素上皮细胞可以稳定地粘附，所以所述细胞在培养基交换期间不容易损失，并且可以稳定传代。
附图简述
图1是显示层粘连蛋白-E8的结构的示意图。
图2显示从人iPS细胞（201B7）诱导的RPE细胞的RPE相关基因的表达。
图3 显示了在比较实施例3中，在开始iPS细胞的分化诱导后第1、2、3天的细胞粘附状态，所述iPS细胞接种在包被层粘连蛋白-511 E8、基质胶或层粘连蛋白-511全长的基质上。
图4 显示了在比较实施例3中，在开始iPS细胞的分化诱导后第15和40天的细胞群体，所述iPS细胞接种在包被层粘连蛋白-511 E8、基质胶或层粘连蛋白-511全长的基质上。
具体实施方案
1. 视网膜色素上皮细胞的生产方法
本发明是视网膜色素上皮细胞的生产方法，所述方法包括通过使用包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质的人多能干细胞的粘附培养的步骤（下文中称为“本发明的生产方法”）。
本发明中的“多能干细胞”是指具有自我复制能力和分化多能性的干细胞，并没有特别的限制。例如，胚胎干细胞（ES细胞），诱导的多能干细胞（iPS细胞）等被广泛利用。优选地，利用人ES细胞或人iPS细胞，并且更优选地，利用人iPS细胞。
本发明中的“iPS细胞”是指通过使核重新编程因子与体细胞（例如，成纤维细胞，皮肤细胞，淋巴细胞等）接触人工获得自我复制能力和分化多能性的细胞。本发明中的iPS细胞的生产方法没有特别的限制。
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”，是指构成视网膜色素上皮的上皮细胞，以及它们的祖细胞。是否是视网膜色素上皮细胞可以通过，例如，细胞标志物的表达（RPE65，CRALBP，MERTK，BEST1等）、细胞形态（胞内黑色素染料沉积，多边形和扁平细胞形态，形成多边形的肌动蛋白束等）等来确认。视网膜色素上皮细胞的祖细胞是指定向诱导分化成视网膜细胞的细胞，并且是否是祖细胞可以通过细胞标志物（MITF，Pax6，Rx，Crx等）等的表达来确认。视网膜色素上皮细胞的功能评价可以使用，例如，细胞因子（VEGF，PEDF等）的分泌能力、吞噬能力等作为指标来确认。这些功能评价和确认操作可以由本领域技术人员通过设置适当的条件进行。
在本发明中“层粘连蛋白”是由α、β、γ链组成的异源三聚体分子，并且是含有具有不同亚基链组成的亚型的胞外基质蛋白。具体地，层粘连蛋白具有约15种亚型，包括5种α链、4种β链和3种γ链的组合的异源三聚体。组合α链（ α1-α5）、β链（β1-β4）和γ链（γ1-γ3）各自的数目以确定层粘连蛋白的名称。例如，由α1链、β1链，γ1链的组合构成的层粘连蛋白命名为层粘连蛋白111，由α5链、β1链、γ1链的组合构成的层粘连蛋白命名为层粘连蛋白-511并且由α5链、β2链，γ1链的组合构成的层粘连蛋白命名为层粘连蛋白-521。作为层粘连蛋白，例如，可以使用衍生自哺乳动物的层粘连蛋白。哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、羊、猪、牛、马、山羊、猴和人。当生产视网膜色素上皮细胞用于移植到人的目的时，优选使用人层粘连蛋白等。在目前阶段，已知人层粘连蛋白包括15种亚型。
层粘连蛋白-E8片段最初是通过用弹性蛋白酶消化小鼠层粘连蛋白-111得到的片段之一，并鉴定为具有强的细胞粘附活性的片段（EMBO J., 3:1463-1468, 1984., J. Cell Biol., 105:589-598, 1987）。当用弹性蛋白酶消化时，假定除了小鼠层粘连蛋白-111之外，层粘连蛋白中还存在对应小鼠层粘连蛋白-111的E8片段的片段。然而，除了小鼠层粘连蛋白-111之外，迄今尚未报道通过用弹性蛋白酶的层粘连蛋白消化的E8片段的分离和鉴定。因此，在本发明中使用的层粘连蛋白-E8片段不需要是每种层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化的产物，但可以是重组的，只要其是具有类似于每种相应层粘连蛋白的细胞粘附活性并具有对应于用弹性蛋白酶消化E8片段的结构的层粘连蛋白片段。也就是说，“层粘连蛋白-E8片段（下文有时表示为”层粘连蛋白-E8“）”在本发明中是指在α链、β链和γ链的每个C-末端区域构成异源三聚体的分子，其保持对整联蛋白的结合活性，以及保持细胞粘附活性。层粘连蛋白-E8显示整联蛋白结合特异性，其对于每种层粘连蛋白亚型是变化的，并且可以发挥对表达相应整联蛋白的细胞的强粘附活性。
当具体说明时，层粘连蛋白-E8在本发明中是具有下列的层粘连蛋白片段，
（1）在功能上，至少相当于全长层粘连蛋白的细胞粘附活性和至少相当的整联蛋白结合活性，和
（2）在结构上，对应于小鼠层粘连蛋白-E8的结构，具体而言，对应于从层粘连蛋白三聚体的卷曲螺旋C-末端区域到第1至第3 G结构域的结构。从（1）的功能方面和（2）的结构方面在以下进行更详细的说明。
（1）层粘连蛋白-E8的功能
本发明的层粘连蛋白-E8的实例包括显示对人多能干细胞/或人视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白中的至少一种的结合特异性的分子，优选显示对人多能干细胞和人视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白以及在人视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白的结合特异性的分子。人多能干细胞的表面上表达的整联蛋白的实例包括α6β1整联蛋白等，并且在人视网膜色素上皮细胞的表面上表达的整联蛋白的实例包括α6β1整联蛋白、α3β1整联蛋白、α7β1整联蛋白等。
在本发明中的层粘连蛋白-E8显示对整联蛋白的结合特异性，至少相当于对每种层粘连蛋白的结合特异性。优选使用显示对整联蛋白的特别强的亲和力的层粘连蛋白-E8。“显示对整联蛋白的特别强的亲和力的层粘连蛋白-E8”是显示显著低的解离常数的层粘连蛋白片段，如通过已知方法测量的，例如通过，例如在The Journal of Biological Chemistry (2009) 284, pp.7820-7831的表1中所示方法测量的解离常数。
作为本发明中的层粘连蛋白-E8，优选使用具有强的细胞粘附活性的层粘连蛋白-E8。“具有强的细胞粘附活性的层粘连蛋白-E8”是在细胞粘附测试中显示显著强的粘附活性的层粘连蛋白-E8，所述测试使用通过已知方法的测量法，并且以不超过10nM的层粘连蛋白-E8的包被浓度显示不小于400个细胞/mm2的粘附细胞数，当例如进行The Journal of Biological Chemistry (2007) 282, pp. 11144-11154中所述的细胞粘附测定时。
在本发明中，作为层粘连蛋白-E8，优选使用显示对α6β1整联蛋白的结合特异性，能够稳定地粘附在分化诱导的初始阶段中的多能干细胞并且能够稳定地粘附在分化诱导的后期阶段中的视网膜色素上皮细胞或其祖细胞的层粘连蛋白-E8。从这样的方面，特别是，层粘连蛋白-511 E8在层粘连蛋白-E8中是高度优选的，因为除了α6β1整联蛋白之外其还具有对α3β1整联蛋白和α7β1整联蛋白的结合特异性，并且可以通过提高对视网膜色素上皮细胞的粘附活性促进多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率的提高，或视网膜色素上皮细胞的维持培养的稳定化。
（2）层粘连蛋白-E8的结构
本发明中的层粘连蛋白-E8，如上所述或如图1所示，结构对应于小鼠层粘连蛋白-111的弹性蛋白酶消化产物中具有细胞粘附活性的片段（E8片段）的层粘连蛋白片段。即，其保持全长层粘连蛋白的结构域II（三链卷曲螺旋结构域）的一部分（在图1中描绘的E8片段没有显示这样的方式，但实际上保持卷曲螺旋结构），并在E8的N末端侧上与β链的对应片段和γ链的对应片段形成短的卷曲螺旋结构。在E8的C-末端侧上，保持α链的G1-G3结构域结构。β链和γ链通过形成经由在每个C末端侧的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。
如上述，本发明中的层粘连蛋白-E8可以是通过用弹性蛋白酶处理天然层粘连蛋白而获得的酶处理的产物，或通过基因重组产生的重组体。当本发明的层粘连蛋白-E8是重组体时，为了纯化目的可以将标签键合到N末端，只要保持相应的全长（天然）层粘连蛋白对整联蛋白的结合活性，并且细胞粘附性不受损。这样的标签没有特别限制，并且可以提及例如，His标签、Flag标签、HA标签等。另外，标签和层粘连蛋白-E8之间的接头区域的序列没有特别的限制，只要保持相应的全长（天然）层粘连蛋白对整联蛋白的结合活性，并且细胞粘附性不受损。
在本发明的层粘连蛋白-E8中，氨基酸序列的一部分可以缺失、添加或取代，只要保持相应的层粘连蛋白对整联蛋白的结合活性，并且其细胞粘附性不受损。
尽管E8片段通常在α链C末端侧缺少两个G结构域（G4和G5），G5、G5结构域可以被部分或全部包含在本发明的层粘连蛋白-E8中，只要保持相应的全长（天然）层粘连蛋白对整联蛋白的结合活性，并且其细胞粘附性不受损。例如，G4、G5结构域可以部分或全部包含在层粘连蛋白-511 E8中，只要保持等效水平的层粘连蛋白-511对整联蛋白α6β1的结合活性，并且细胞粘附活性不受损。
类似于全长层粘连蛋白，层粘连-E8的β链和γ链经由卷曲螺旋部分的C末端侧上的半胱氨酸键合。由于半胱氨酸影响整联蛋白结合活性，所以期望其未被取代或者缺失。此外，由于γ链中所述半胱氨酸之后的C末端侧氨基酸也影响整联蛋白结合活性，所以也期望其至少不缺失（J Biol Chem. 2007 Apr 13; 282(15):11144-54.）。
这种层粘连蛋白-E8的具体实例包括WO2011/043405的实施例（3）中生产的rhLM511E8。在本发明中，所述层粘连蛋白-511E8可以优选作为层粘连蛋白-E8利用。
本发明中所使用的“培养基质”可以通过用本发明中的层粘连蛋白-E8包被培养器的表面来产生。如本文所使用的，“包被”培养器的表面意指层粘连蛋白-E8通过层粘连蛋白-E8与培养器表面之前的一些相互作用对培养器表面的吸附，其中所述层粘连蛋白-E8的取向对于得到本发明的效果不会造成特别的问题。培养器没有特别限制，只要其可以用于细胞培养，并且可以提及例如，皿（也称为培养皿）、有盖培养皿和板（6孔、24孔、48孔、96孔、384孔、9600孔等的微量滴定板、微孔板、深孔板等）、瓶、载玻片、管、细胞工厂、滚瓶、转瓶、中空纤维、微载体、珠等。本发明中的培养基质可以应用适当的表面处理，只要层粘连蛋白-E8的细胞粘附性不受损。
“粘附培养”在本发明中是指以下列状态的培养，目的细胞经由层粘连蛋白-E8粘附到培养器的底部，并且即使当培养期间轻轻摇动培养器时也不在培养基中漂浮。由于本发明中使用的层粘连蛋白-E8可显示非常优异的细胞粘附性，所有细胞接种后的细胞优选通过包括快速颤抖培养器等的方法均匀地分散。目的细胞可以在粘附培养前后，在含有层粘连蛋白-E8的培养器中悬浮培养，只要可以达到本发明的目的。
所述培养基由基础培养基、血清和/或血清替代物，以及其它组分构成。作为基本培养基，可以组合使用通常用于培养哺乳动物细胞的一种或多种合成培养基，和例如，可以获得市售的产品，诸如DMEM、GMEM等。
作为血清，可以使用衍生自哺乳动物诸如牛、人等的血清。血清替代物是用于细胞培养的替换血清诸如胎牛血清等的低蛋白替换物，并且可以获得市售的产品，诸如敲除血清替代物（KSR）、化学成分确定的脂质浓缩物（Gibco制造）、Glutamax（Gibco制造）等，以及用于神经细胞培养的血清替代物N2、B27等。在本发明中，血清替代品是优选的，并且KSR是从目的细胞的质量管理方面特别优选的。
血清或血清替代物的浓度可适当设定在，例如0.5-30％（体积/体积）的范围内。浓度可以是恒定的，或逐渐改变。例如，浓度可在以约1-3天（优选2天）间隔的阶段中降低。例如，血清或血清替代物可以以20％、15％和10％的浓度的3个阶段加入。
作为构成培养基的其它成分，Rho激酶抑制剂诸如Y-27632等可以用于抑制分散在培养基中的人多能干细胞的细胞死亡。Rho激酶抑制剂可以在分化诱导步骤的部分或整个期间的期间加入。例如，未分化成目的细胞的不必要的细胞可以通过使用不含Rho激酶抑制剂的培养基在分化诱导步骤的后期通过细胞死亡去除。
除上述组分之外，培养基还可以包含通常用于培养哺乳动物细胞其它组分。
在本发明的生产方法中使用的人多能干细胞的浓度，没有特别限定，只要多能干细胞可以是均匀地接种并且粘附培养是可能的。例如，当使用10cm皿时，其为每皿1×105-1×108个细胞，优选2×106-5×107个细胞，更优选5×105-9×106个细胞。
在本发明的生产方法中的粘附培养也可以在分化诱导因子的存在下进行。作为分化诱导因子，可以利用已知作为促进分化诱导成目的细胞的因子的因子。由于本发明的生产方法包括分化诱导成视网膜色素上皮细胞，期望使用成视网膜色素上皮细胞的分化诱导因子。成视网膜色素上皮细胞分化诱导因子的实例包括Nodal信号抑制剂、Wnt信号抑制剂、音猬因子(Sonic hedgehog)信号抑制剂和激活素信号启动子等。
Nodal信号抑制剂没有特别的限制，只要其能够抑制由Nodal介导的信号转导，可以使用蛋白、核酸、低分子量化合物等。Nodal信号抑制剂的实例包括蛋白、肽或核酸诸如Lefty-A、可溶性Nodal受体、抗Nodal抗体、Nodal受体抑制剂等；低分子量化合物诸如SB431542等等。具体地，容易获得并显示批次之间较小差异的低分子量化合物诸如SB431542等是优选的。
Wnt信号抑制剂没有特别的限制，只要其能够抑制由Wnt介导的信号转导，可以使用蛋白、核酸、低分子量化合物等。Wnt信号抑制剂的实例包括蛋白、肽或核酸诸如DKK1、Cerberus蛋白、Wnt信号受体抑制剂、可溶性Wnt受体、Wnt抗体、酪蛋白激酶抑制剂、显性失活的Wnt蛋白等；和低分子量化合物诸如CKI-7（N-（2-氨基乙基）-5-氯-异喹啉-8-磺酰胺）、D4476（4-{4-（2,3-二氢苯并[1,4]二噁英-6-基）-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯甲酰胺）、IWR-1-内型（IWR1e）、IWP-2等。具体地，容易获得并显示批次之间较小差异的低分子量化合物是优选的。其中，具有选择性地抑制酪蛋白激酶I活性的低分子量化合物是优选的，并且可以使用，例如，CKI-7，D4476等。
激活素信号启动子的实例包括属于激活素家族、激活素受体、激活素受体激动剂等的蛋白。
这些分化诱导因子的浓度可以根据分化诱导因子的种类适当地选择。具体地，当SB431542用作Nodal信号抑制剂时，浓度为，例如，0.01-50 μM，优选0.1 - 10 μM，更优选5 μM；当CKI-7用作Wnt信号抑制剂时，其以0.01 - 30 μM的浓度添加，优选0.1 - 30 μM，更优选为 3 μM。
在本发明的生产中，优选使用Nodal信号抑制剂（例如，SB431542）和Wnt信号抑制剂（例如，CKI-7）的组合作为分化诱导因子。
根据上述方法的培养诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，从而视网膜色素上皮细胞通常可以在接种多能干细胞的第25-45天生成。视网膜色素上皮细胞的生成可根据上述方法来确认。当视网膜色素上皮细胞的生成被确认时，该培养基与用于视网膜色素上皮细胞维持培养基交换，并且，例如，所述细胞优选进一步培养5 - 10 天，同时以不超过3天一次的频率交换培养基的总量。结果是，可以更清楚地观察到粘附到基底层的黑色素染料沉积的细胞群体和多边形扁平细胞群体。
作为视网膜色素上皮细胞的维持培养基可以使用，例如，描述于下列的那些IOVS, March 2004, Vol. 45, No.3, Masatoshi Haruta, 等, IOVS, November 2011, Vol. 52, No. 12, Okamoto and Takahashi, J. Cell Science 122 (17), Fumitaka Osakada, 等, IOVS, February 2008, Vol. 49, No. 2, Gamm, 等，其由基础培养基、血清和/或血清替代物，和其它组分构成。作为基本培养基，可以组合使用通常用于培养哺乳动物细胞的一种或多种合成培养基，和例如，可以获得市售的产品，诸如DMEM、GMEM等。
作为血清，可以使用衍生自哺乳动物诸如牛、人、猪等的血清。血清替代物是用于细胞培养的替换血清诸如胎牛血清等的低蛋白替换物，并且可以获得市售的产品，诸如敲除血清替代物（KSR）、化学成分确定的脂质浓缩物（Gibco制造）、Glutamax（Gibco制造）等，以及用于神经细胞培养的血清替代物N2、B27等。在本发明中，血清替代品是优选的，并且B27是从目的细胞的质量管理方面特别优选的。
其它组分的实例包括L-谷氨酰胺、青霉素钠、硫酸链霉素等。
本发明的生产方法可以进一步包括通过浓度操作纯化视网膜色素上皮细胞的步骤。由于本发明的生产方法显著地提高了分化诱导效率，可以通过简单和容易的操作在短的生产周期中获得高纯度的视网膜色素上皮细胞。浓缩视网膜色素上皮细胞的方法没有特别限制，只要其是通常已知作为浓缩细胞的方法，并且可以使用例如，诸如过滤、离心、灌注分离、流式细胞术分离、通过固定化抗体的载体的捕集分离等。优选地，可以利用诸如使用尼龙网等的过滤的方法。
根据本发明的生产方法，人多能干细胞可经由在细胞粘附方面优异的层粘连蛋白-E8迅速粘附到培养器，并且以固定化状态的培养显著地改善分化诱导效率，并且此外，可以抑制在培养基交换期间的细胞损失。因此，可以大量获得以高浓度的视网膜色素上皮细胞的细胞群体。此外，可以通过简单和容易的操作进行细胞纯化，纯化步骤所必需的时间可以被缩短，并且可以非常有效地生产视网膜色素上皮细胞。此外，根据本发明的生产方法，视网膜色素上皮细胞可以彼此粘附，以形成片状的结构。因此，通过本发明的生产方法可以生产视网膜色素上皮细胞的片。如下面3中详细描述的，作为细胞群体用作用于视网膜疾病的治疗的细胞移植治疗药，视网膜色素上皮细胞的片是有用的。
2.视网膜色素上皮细胞的扩增方法
本发明还涉及视网膜色素上皮细胞的扩增方法，所述方法包括通过使用包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质的视网膜色素上皮细胞的粘附培养的步骤（下文中称为“本发明的扩增方法”）。根据本发明的扩增方法，可以通过常规方法容易地培养视网膜色素上皮细胞。
作为本发明的扩增方法中的视网膜色素上皮细胞，可以使用衍生自哺乳动物的视网膜色素上皮细胞。哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、羊、猪、牛、马、山羊、猴和人。当生产视网膜色素上皮细胞用于移植到人的目的时，优选使用人视网膜色素上皮细胞等。
本发明的扩增方法中的视网膜色素上皮细胞，是指构成视网膜色素上皮的上皮细胞，以及它们的祖细胞。其实例包括衍生自活生物体的视网膜色素上皮细胞；从未分化细胞（多能干细胞，视网膜色素上皮细胞的前体等）诱导分化的视网膜色素上皮细胞；从分化细胞或视网膜色素上皮细胞之外的细胞的前体等转分化的视网膜色素上皮细胞，优选未分化的细胞诱导分化的视网膜色素上皮细胞，更优选从多能干细胞诱导分化的视网膜色素上皮细胞，其由本发明的上述生产方法获得。
用于本发明的扩增方法的视网膜色素上皮细胞的浓度没有特别限制，只要可以进行视网膜色素上皮细胞的均匀粘附培养。例如，当使用10cm皿时，其为每皿1×105-1×108个细胞，优选2×106-5×107个细胞，更优选5×105-1×107个细胞。
在本发明的扩增方法中的层粘连蛋白-E8片段类似于上述，并且培养基质的包被方法也是类似的。因此，通过在包被层粘连蛋白-E8片段的相同培养器中培养由所述本发明的生产方法获得的视网膜色素上皮细胞，所得到的视网膜色素上皮细胞可直接原位扩增，并且可以大量获得。此外，根据本发明的扩增方法，包含在分化诱导的视网膜色素上皮细胞中可能不被诱导分化的细胞可相对减少。因此，本发明的扩增方法也可用作视网膜色素上皮细胞的纯化方法。
关于在本发明的扩增方法中使用的层粘连蛋白-E8，特别是层粘连蛋白-511 E8在层粘连蛋白-E8中是优选的，因为除了α6β1整联蛋白之外其还对α3β1整联蛋白和α7β1整联蛋白具有结合特异性，并且通过提高对视网膜色素上皮细胞的粘附活性可以促进视网膜色素上皮细胞的维持培养的稳定化和细胞增殖。
根据本发明的扩增方法，由于视网膜色素上皮细胞经由细胞粘附性优异的层粘连蛋白-E8被迅速固定培养器上，可以抑制培养基交换过程中的细胞损失，并且可以抑制由于传代的细胞形态的变形，可以稳定地进行视网膜色素上皮细胞的维持培养和培养物生长。此外，根据本发明的扩增方法，膜状视网膜色素上皮细胞组也可以直接利用或通过从培养基质分离回收后利用，作为用于视网膜疾病的治疗药物，如下所示。
3. 视网膜色素上皮细胞
通过本发明的生产方法或扩增方法获得的视网膜色素上皮细胞在层粘连蛋白-E8，特别是层粘连蛋白-511 E8上培养。因此，它们可以很容易地单独作为细胞或作为片从培养基质分离回收，并具有优越的性能。
4. 用于视网膜疾病的治疗药物
通过本发明的生产方法生产的视网膜色素上皮细胞，以及通过本发明的扩增方法扩增的视网膜色素上皮细胞，可作为细胞移植治疗药使用，以悬浮液或片的形式移植到活生物体用于视网膜疾病的治疗。视网膜疾病是与视网膜相关的眼科疾病，并且还包括与其它疾病，诸如糖尿病等的并发症。
5. 毒性，疗效评价药物
通过本发明的生产方法生产的视网膜色素上皮细胞可以用作正常或疾病模型细胞用于筛选针对视网膜疾病的治疗性药物和针对其它并发症的治疗性药物，诸如疗效评价糖尿病等，或其预防性药物，化学物质的安全性测试等，压力测试，毒性测试，副作用测试，感染/污染测试。另一方面，它们也可以用于视网膜细胞特有的光毒性的毒性研究、毒性测试等，视网膜兴奋性毒性等。其评价方法包括通过刺激、毒性测试诸如细胞凋亡评价等，以及用于对从祖细胞正常分化为视网膜色素上皮细胞和视觉细胞的影响的评价测试（表达的蛋白分析和吞噬能力测试，通过各种基因标志物的RT-PCR，细胞因子的ELISA等），光毒性的毒性测试等，对视觉功能的视网膜电位和跨上皮阻抗，自体免疫反应导致的细胞损伤测试等。作为用于这些测试的细胞，可以使用不仅视网膜色素上皮细胞，还有其祖细胞，并且可以提供例如，细胞通过接种粘附在其上的板、细胞悬浮液、其片或压块（compact）。它们可以用作人和动物测试的外推测试。
在本说明书，包括专利和专利申请中引用的任何出版物中公开的内容，在此以其整体并入作为参考，达到它们已在本文中公开的程度。
本发明在下面通过参考实施例进行更详细地解释，所述实施例不应当被解释为限制性的。
实施例 实施例1 衍生自iPS细胞的RPE细胞的生产
试剂
·分化诱导基本培养基（GMEM培养基（Invitrogen）、KSR（Invitrogen）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（Invitrogen），1 mM 丙酮酸钠（SIGMA）、0.1 M 2-巯基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）、100 U/ml 青霉素-100 μg/ml 链霉素（Invitrogen））
·初级分化诱导培养基（包含20％KSR、10μM Y-27632（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）、5 μM SB431542（SIGMA）、3μM CKI-7（SIGMA）的分化诱导基本培养基）
·二级分化诱导培养基（包含15％KSR、10μM Y-27632（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）、5 μM SB431542（SIGMA）、3μM CKI-7（SIGMA）的分化诱导基本培养基）
·三级分化诱导培养基（包含10％KSR、10μM Y-27632（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）、5 μM SB431542（SIGMA）、3μM CKI-7（SIGMA）的分化诱导基本培养基）
·四级分化诱导培养基（含10％KSR的分化诱导基本培养基）
·RPE维持培养基（67％ DMEM 低葡萄糖（SIGMA）、29％ F12（SIGMA）、1.9 mM L-谷氨酰胺（Invitrogen）、1.9％ B-27添加物（Invitrogen）、96 U/ml 青霉素钠、96 μg/mL链霉素硫酸盐）。
视网膜色素上皮细胞的生产（分化诱导）
衍生自人外周血（单核细胞）的iPS细胞（1120C7，由京都大学提供）以9x106个细胞/9 cm培养皿接种在层粘连蛋白包被的培养皿中（由Sumitomo Bakelite Co., Ltd.制造）。通过用0.5 μg/cm2的层粘连蛋白-511 E8片段的水溶液（蛋白公开于WO 2011043405的实施例（3）中，（由Nippi制造（iMatrix-511，NIP-8920-02））包被9 cm 培养皿（BD FALCON）在37℃不小于1小时，生产层粘连蛋白包被的培养皿。iPS细胞迅速粘附在培养皿上，并且没有确认到悬浮聚集物的形成。
上述分化诱导根据以下时间表进行，并且在本说明书中的实施例和比较实施例中的分化诱导按照此时间表。用培养的第一天作为第0天，从培养开始（第1天）到大约40天（当确认色素细胞时），每天交换培养基的总量。培养基的组合物在如下所示阶段中改变。即，初级分化诱导培养基（20％KSR）用于1-4天，二级分化诱导培养基（15％KSR）用于5-8天，三级分化诱导培养基（10％KSR）用于9-12日并且四级分化诱导培养基（10％KSR）用于从13日到大约40天（当确认色素细胞时）。
大约40天之后，当确认色素细胞时，培养基的总量与RPE维持培养基以不低于每3天一次交换，多达47天。随着培养进行，细胞色素变得更暗，并且在第47天，观察到很多含有暗色素细胞群体。在第47天，回收含有色素细胞的细胞群体。
使用层粘连蛋白-511 E8片段作为包被剂，接种的iPS细胞以高密度迅速粘附到培养皿，并且甚至在在分化诱导培养基中培养期间也稳定地保持粘附状态。因此，即使当培养基的总量反复交换时，细胞损失也可以被抑制得较低。此外，相比当iPS细胞接种在包被胶原蛋白的培养器上时，色素细胞的生成速度显著提高并且分化诱导效率显著提高。
研究实施例2 RPE细胞（其它iPS细胞）的生产
通过类似于实施例1的方法，除了使用衍生自人皮肤（成纤维细胞）的iPS细胞（201B7，京都大学提供）代替衍生自人外周血（单核细胞）的iPS细胞（1120C7，京都大学提供），获得色素细胞。
结果是，像实施例1，相对于接种的iPS细胞，色素细胞的生成速度显著提供并且分化诱导效率显著提高。
实施例3 衍生自iPS细胞的RPE细胞的扩增
在第47天包含色素细胞的细胞群体，其在实施例1和实施例2的培养皿中经历粘附培养，用0.01％胰蛋白酶-0.53 mM EDTA处理，并且细胞聚集物从培养皿分离。然后，细胞间的粘附通过温和吸打分离。在细胞混合物中的蛋白酶液体和其残留杂质与离心上清一起被除去，然后，不必要的细胞通过经过细胞过滤器（DB Falcon Cell Strainer 40 μm Nylon）的过滤分离法进行分离，并回收含有RPE细胞的细胞群体（48天）。
将获得的细胞以9x106个细胞/9 cm培养皿接种在实施例1中所述的RPE维持培养基中，在与实施例1相同的包被层粘连蛋白-511 E8的5个培养皿中，并进行静置培养直到大约50天，当确认视网膜色素上皮细胞集落的粘附时。
从51天到71天，将培养基的总量用RPE维持培养基交换不少于3天一次持续3周，然后使用过滤器进行过滤分离，接种到包被层粘连蛋白-511 E8的相同的5个培养皿的每一个中并类似培养2周。结果是，视网膜色素上皮细胞从实施例1和实施例2的任何细胞群体扩增到25皿（10 cm 皿）的产率。所获得的细胞群体的纯度（n =4）为96.4％、100％、98.6％或99.6％。
作为一个实例，显示了具有98.6％纯度的皿的纯度计算数据。
对于纯度，对于Pax6和Bestrophin进行免疫染色，并且当任一染色时，细胞被认为是RPE细胞。当未观察到荧光时，检验细胞内黑色素的存在或不存在，并且细胞基于色素的确认判断为RPE细胞（因为一些色素抑制荧光观察，所以即使当未观察到荧光时，在色素的存在下细胞也判断为RPE细胞）。通过包括将每个作为阳性细胞添加的方法来确定纯度。
此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞（201B7）时。
比较实施例1
通过类似于实施例1的方法进行分化诱导步骤，除了在实施例1的分化诱导步骤中，使用用MPC（2-甲基丙烯酰磷酸胆碱）处理的非粘附培养皿（Nunc）进行悬浮培养，代替使用包被层粘连蛋白-511 E8（BD FALCON）的培养皿的粘附培养。
结果是，几乎所有的色素细胞在分化诱导步骤中培养基交换过程中丢失，在第47天不能回收色素细胞。
比较实施例2 通过类似于实施例1的方法进行分化诱导，除了在实施例1的分化诱导步骤中，使用包被聚-D赖氨酸和明胶的培养皿，代替包被层粘连蛋白-511 E8的培养皿进行粘附培养。
相比于层粘连蛋白-511 E8包被的培养皿，细胞对多聚-D-赖氨酸/明胶包被的培养皿的粘附性弱，并且在培养基交换过程中细胞容易丢失。因此，通过目视观察色素细胞相对于在培养皿中的总细胞的数目，在培养开始后第47天的色素细胞的比率为不大于实施例1的1/20，并且分化诱导效率也明显较低。
（评价1）RPE细胞标志物的表达
根据Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122 3169-79中描述的方法使用具有下列序列的引物，对在实施例1-3中获得的色素细胞进行RT-PCR分析。结果是，发现RPE细胞特异性基因（RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1）表达，类似于市售人RPE细胞系，从而确认RPE细胞。
此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞（201B7）时。作为代表性实施例，使用RPE65获得的结果显示在图2中。
（评价2）细胞因子分泌能力
根据IOVS. 2006 47 612-3624中描述的方法通过ELISA针对PEDF的产生量，检测在实施例1-3中获得的色素细胞。结果是，确认了它们类似地具有如成人视网膜的RPE细胞的细胞因子分泌能力（表2）。
表2
PEDF分泌量
此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞（201B7）时。
（评价3）吞噬能力
根据J Cell Sci. 1993 104 37-49中描述的方法并且使用FluoSpheres（注册商标）荧光微球（Invitrogen, F13081），针对吞噬能力分析在实施例1-3中获得的色素细胞。结果是，确认了细胞具有与可商购获得的人RPE细胞系相同水平的吞噬能力。此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞（201B7）时。此外，即使当根据The Lancet 2012 379 713-720中所述方法，使用不同系的iPS细胞（201B7）和用于吞噬作用的pHrod Green E. coli BioParticles（注册商标）缀合物（Molecular Probes，P35366）时，也获得了类似的结果。
比较实施例3通过类似于实施例1中的方法并使用以与实施例2中相同的方式衍生自人皮肤（成纤维细胞）的iPS细胞（201B7，由京都大学提供）和包被下列1）-3）任一项的培养皿，进行分化诱导。进行两次测试，所述测试包括同时进行3基质以诱导分化，并对每种基质进行一次补充测试。
1）使用层粘连蛋白-511 E8（分子量150,000）（iMatrix511：由Nippi，NIP-8920-02制造）用于以0.5 μg/cm2包被。
2）使用重组人层粘连蛋白-511全长（分子量776,000）（由VERITAS Corporation销售（由BioLamina生产）/BLA-LN511）以2.59 μg/cm2用于包被。
3）基质胶（由BD制造，354230（总蛋白浓度：9-12mg/ml））（基底层基质，衍生自小鼠Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 肉瘤的可溶性基底层制备物，包含基底层的主要分子，IV型胶原蛋白，巢蛋白，串珠素，层粘连蛋白-111）在4℃溶解过夜，并在冷态下以10 mL/57 cm2 (0.175 ml/cm2)用于包被培养容器。
在从分化诱导的开始后第1天，第2天和第3天的细胞粘附状态显示于图3。在用层粘连蛋白-511 E8包被基质的情况下，从接种的第二天，细胞生长，同时均匀地粘附在培养皿的整个表面，并迅速进入分化诱导过程。在基质胶（层粘连蛋白-111）包被的基质的情况下，细胞粘附不一致，具有部分侵入凝胶，并最终未能形成完整的表面层。在层粘连蛋白全长包被基质的情况下，粘附弱，并且细胞在接种的第二天部分形成集落。细胞用了4 - 5天生长和散布在皿的整个表面。因此，诱导分化过程变得不均匀，留下诱导分化没有进行的部分。
在从分化诱导开始第15天和在细胞的过滤分离步骤之前（约40天），细胞群体的状态显示于图4。在用层粘连蛋白-511 E8包被基质的情况下，细胞约15天散布在整个表面上，分层的细胞积累变厚，并观察到黑色素颜色显色。约40天，细胞均匀分层且厚，并且没有发现基底破裂或脱层。在多层的顶部发现清楚的含有黑色素的细胞聚集物。在基质胶包被基质的情况下，约15天未发现粘附细胞的均匀层，并且将细胞吸入到凝胶的内部。约40天在基底侧没有形成以单层的清楚的细胞膜，并且也未观察到黑色素颜色显色。在层粘连蛋白全长包被基质的情况下，约15天观察到粘附细胞在整个表面上，但分化诱导在许多地方并未进行，并且在其它地方有时发现粘附表面层的破裂或脱层。此外，在上部发现不良分层的细胞，并且黑色素颜色的显色非常弱。分层细胞从约20天逐渐脱落，并且在基底侧的细胞膜大约40天显著破裂。
根据上述，在基质胶包被的基质的情况下观察到生长失败和分化诱导失败，并且明显显示粘附细胞数目降低和分层细胞数目的脆弱性，通过黑色素颜色显色显示的RPE细胞外观的效率，和其分化诱导率速度均显著低，并且在层粘连蛋白全长包被基质的情况下最终获得的RPE细胞的产率是低的。因此，澄清了在本发明中包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质可以非常有效地生产视网膜色素上皮细胞。
工业实用性
根据本发明的生产方法，视网膜色素上皮细胞可有效地，通过使用包被有层粘连蛋白-E8片段的培养基质的简单和容易的方法进行生产。本发明的生产方法在分化诱导效率方面优异，并且可以通过简单和容易的操作纯化视网膜色素上皮细胞，并且可以通过抑制在步骤期间的细胞损失以高产率生产视网膜色素上皮细胞。通过本发明的方法生产的视网膜色素上皮细胞不仅对视网膜疾病的治疗，而且作为正常和疾病模型细胞也是有用的。
本申请是基于在日本提交的专利申请号2013-212345（申请日2013年10月9日），其内容被完整并入本文。
序列表
<110> Healios K.K.
RIKEN
OSAKA UNIVERSITY
<120> 用于生产视网膜色素上皮细胞的方法
<130> 092247
<150> JP 2013-212345
<151> 2013-10-09
<160> 8
<170> PatentIn 版本 3.4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 1
tccccaatac aactgccact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 2
ccttggcatt cagaatcagg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 3
gagggtgcaa gagaaggaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 4
tgcagaagcc attgatttga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 5
tccttggcca tcagaaaaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 6
catttgggtg gctgaagtct 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 7
tagaaccatc agcgccgtc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 8
tgagtgtagt gtgtatgttg g 21

Claims (9)

1. 视网膜色素上皮细胞的生产方法，其包括使人多能干细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养的步骤。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述层粘连蛋白-E8片段是层粘连蛋白-511E8片段。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中粘附培养的步骤在存在分化诱导因子的情况下进行。
4. 根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述人多能干细胞是人iPS细胞。
5. 通过使人多能干细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养生产的视网膜色素上皮细胞。
6. 通过使人多能干细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养生产的视网膜色素上皮细胞片。
7. 视网膜色素上皮细胞的扩增方法，其包括使视网膜色素上皮细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养的步骤。
8. 视网膜色素上皮细胞的纯化方法，其包括使视网膜色素上皮细胞在包被层粘连蛋白-E8片段的培养基质上粘附培养的步骤。
9. 用于视网膜疾病的治疗药物，其包含通过根据权利要求1-4任一项的方法生产的视网膜色素上皮细胞，或通过根据权利要求7的方法培养的视网膜色素上皮细胞。
CN201480055673.5A 2013-10-09 2014-10-09 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法 Pending CN105829526A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-212345 2013-10-09
JP2013212345 2013-10-09
PCT/JP2014/077111 WO2015053375A1 (ja) 2013-10-09 2014-10-09 網膜色素上皮細胞の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105829526A true CN105829526A (zh) 2016-08-03

Family

ID=52813190

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480055588.9A Pending CN105849254A (zh) 2013-10-09 2014-10-09 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法
CN201480055673.5A Pending CN105829526A (zh) 2013-10-09 2014-10-09 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480055588.9A Pending CN105849254A (zh) 2013-10-09 2014-10-09 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20160237403A1 (zh)
EP (2) EP3056564B1 (zh)
JP (4) JP6518878B2 (zh)
KR (2) KR102245015B1 (zh)
CN (2) CN105849254A (zh)
AU (2) AU2014332857B2 (zh)
BR (1) BR112016007833B1 (zh)
CA (2) CA2926912C (zh)
SG (4) SG10201802879PA (zh)
WO (2) WO2015053376A1 (zh)
ZA (2) ZA201603054B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108642014A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 山东兴瑞生物科技有限公司 利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法
CN109312306A (zh) * 2016-04-22 2019-02-05 大日本住友制药株式会社 产生视网膜组织的方法
CN112334574A (zh) * 2018-06-20 2021-02-05 拜奥拉米那公司 用于产生视网膜色素上皮细胞的方法和组合物
US11214771B2 (en) 2014-10-24 2022-01-04 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Production method for nerve tissue
CN115261301A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 深圳华大生命科学研究院 一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法
CN115418343A (zh) * 2022-10-28 2022-12-02 深圳市俊元生物科技有限公司 从人视网膜色素上皮细胞中提取多能干细胞的方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102073730B1 (ko) 2009-11-17 2020-02-05 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 인간 ｒｐｅ 세포의 생산 방법 및 인간 ｒｐｅ 세포의 제약 제제
SG10201802879PA (en) 2013-10-09 2018-05-30 Healios Kk Method for purification of retinal pigment epithelial cells
JP6470286B2 (ja) 2013-11-27 2019-02-13 京都府公立大学法人 ラミニンの角膜内皮細胞培養への応用
US11214772B2 (en) 2014-10-24 2022-01-04 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Production method for retinal tissue
US11633477B2 (en) 2014-10-31 2023-04-25 Kyoto Prefectural Public University Corporation Treatment of cornea using laminin
JP6770435B2 (ja) * 2014-10-31 2020-10-14 京都府公立大学法人 ラミニンによる網膜および神経の新規治療
CN105013010B (zh) * 2015-07-07 2018-01-12 中山大学中山眼科中心 一种辅助iPS‑RPE移植的层粘连蛋白膜
US11649432B2 (en) 2015-09-08 2023-05-16 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method for producing retinal pigment epithelial cells
CN110573610A (zh) 2017-03-08 2019-12-13 大日本住友制药株式会社 视网膜色素上皮细胞的制备方法
JP7150281B2 (ja) * 2017-07-20 2022-10-11 国立研究開発法人理化学研究所 連続的な上皮を含む網膜組織の成熟化方法
KR102604618B1 (ko) 2017-09-08 2023-11-22 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 망막 조직을 포함하는 세포 응집체 및 그의 제조 방법
WO2020204149A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 公立大学法人横浜市立大学 スクリーニング方法および毒性評価法
TWI820330B (zh) 2019-04-26 2023-11-01 國立研究開發法人理化學研究所 包含神經視網膜與視網膜色素上皮細胞與水凝膠之複合體及其製造方法
CN114981417A (zh) * 2019-10-30 2022-08-30 安斯泰来再生医药协会 生产视网膜色素上皮细胞的方法
US20230203445A1 (en) 2020-05-26 2023-06-29 Healios K.K. Hypoimmunogenic cells
JPWO2022054924A1 (zh) 2020-09-11 2022-03-17
TW202302839A (zh) 2021-03-09 2023-01-16 國立研究開發法人理化學研究所 低免疫原性視網膜色素上皮細胞之製造方法
EP4331673A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 Riken Cord-like aggregates of retinal pigment epithelial cells, device and production method for producing same, and therapeutic agent comprising said cord-like aggregates
TW202330906A (zh) 2021-11-19 2023-08-01 國立研究開發法人理化學研究所 片狀視網膜組織之製造方法
CN116769713B (zh) * 2023-08-14 2023-10-27 四川大学华西医院 一种视网膜色素上皮细胞的制备方法
CN117625536B (zh) * 2024-01-26 2024-04-30 中国人民解放军总医院第三医学中心 一种人视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008129554A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Stem cell-derived retinal pigment epithelial cells
US20130196369A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-01 University Of Southern California Methods of Culturing Retinal Pigmented Epithelium Cells, Including Xeno-Free Production, RPE Enrichment, and Cryopreservation
SG192878A1 (en) * 2011-02-25 2013-09-30 Riken Method of producing retinal pigment epithelial cell sheet

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5141016B2 (ja) 2004-06-18 2013-02-13 独立行政法人理化学研究所 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法
JP5117859B2 (ja) 2005-10-21 2013-01-16 株式会社カネカ 幹細胞の分離材および分離方法
EP2128244A4 (en) * 2007-01-18 2012-05-09 Riken INDUCTION / DIFFERENTIATION METHOD IN PHOTORECEPTOR CELL
JP5590646B2 (ja) 2009-10-08 2014-09-17 国立大学法人大阪大学 ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用
JP2012080821A (ja) * 2010-10-12 2012-04-26 Univ Of Tsukuba 血液中の有核細胞成分濃縮方法
JP6169972B2 (ja) * 2011-11-09 2017-07-26 株式会社カネカ 幹細胞分離方法
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
JP2013212345A (ja) 2012-04-03 2013-10-17 Kurashiki Seni Kako Kk カーテン用不織布およびその製造方法
SG10201802879PA (en) 2013-10-09 2018-05-30 Healios Kk Method for purification of retinal pigment epithelial cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008129554A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Stem cell-derived retinal pigment epithelial cells
SG192878A1 (en) * 2011-02-25 2013-09-30 Riken Method of producing retinal pigment epithelial cell sheet
US20130196369A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-01 University Of Southern California Methods of Culturing Retinal Pigmented Epithelium Cells, Including Xeno-Free Production, RPE Enrichment, and Cryopreservation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAKAMICHI MIYAZAKI1，ET AL: "Laminin E8 fragments support efficient", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11214771B2 (en) 2014-10-24 2022-01-04 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Production method for nerve tissue
CN109312306A (zh) * 2016-04-22 2019-02-05 大日本住友制药株式会社 产生视网膜组织的方法
US11371016B2 (en) 2016-04-22 2022-06-28 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method for producing retinal tissue
CN108642014A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 山东兴瑞生物科技有限公司 利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法
CN108642014B (zh) * 2018-05-17 2019-10-08 山东兴瑞生物科技有限公司 利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法
CN112334574A (zh) * 2018-06-20 2021-02-05 拜奥拉米那公司 用于产生视网膜色素上皮细胞的方法和组合物
CN115261301A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 深圳华大生命科学研究院 一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法
CN115418343A (zh) * 2022-10-28 2022-12-02 深圳市俊元生物科技有限公司 从人视网膜色素上皮细胞中提取多能干细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201802879PA (en) 2018-05-30
BR112016007833B1 (pt) 2023-03-28
EP3056564A4 (en) 2017-06-14
EP3056563A1 (en) 2016-08-17
KR20160098178A (ko) 2016-08-18
EP3056564B1 (en) 2021-07-21
US20160237403A1 (en) 2016-08-18
EP3056563B1 (en) 2020-06-24
JP6518878B2 (ja) 2019-05-29
JP6850455B2 (ja) 2021-03-31
SG11201602796QA (en) 2016-05-30
CN105849254A (zh) 2016-08-10
EP3056564A1 (en) 2016-08-17
JP2019107025A (ja) 2019-07-04
EP3056563A4 (en) 2017-06-07
JPWO2015053376A1 (ja) 2017-03-09
AU2014332857A1 (en) 2016-05-26
ZA201603051B (en) 2019-10-30
BR112016007833A2 (pt) 2017-12-05
US20160244721A1 (en) 2016-08-25
WO2015053375A1 (ja) 2015-04-16
CA2926912C (en) 2023-08-22
KR102245015B1 (ko) 2021-04-26
WO2015053376A1 (ja) 2015-04-16
CA2926721A1 (en) 2015-04-16
SG10201802877WA (en) 2018-05-30
KR20160098179A (ko) 2016-08-18
AU2014332857B2 (en) 2020-05-07
CA2926721C (en) 2023-08-29
SG11201602734SA (en) 2016-05-30
US11492593B2 (en) 2022-11-08
CA2926912A1 (en) 2015-04-16
JP6518879B2 (ja) 2019-05-29
BR112016007853A2 (pt) 2017-12-05
AU2014332856B2 (en) 2020-03-05
JP2019107024A (ja) 2019-07-04
ZA201603054B (en) 2019-10-30
KR102253422B1 (ko) 2021-05-17
AU2014332856A1 (en) 2016-05-19
JP6850456B2 (ja) 2021-03-31
JPWO2015053375A1 (ja) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105829526A (zh) 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法
CN101711277B (zh) 心肌细胞的细胞块制备方法和该心肌细胞块的用途
US9249390B2 (en) Method for producing polarized retinal progenitor cells from pluripotent stem cells and their differentiation into retinal pigment epithelium cells
Burridge et al. Multi-cellular interactions sustain long-term contractility of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
CN111269885A (zh) 制备端脑或其前体组织的方法
JP2021192634A (ja) 毛様体周縁部様構造体の製造法
CN106062182A (zh) 用于制备睫状缘干细胞的方法
US11603518B2 (en) Dorsally-derived oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells
EP3945133A1 (en) Mass production of human pluripotent stem cell derived cardiac stromal cell
JPWO2013183774A1 (ja) 毛様体周縁部様構造体の製造方法
AU2017393059A1 (en) Method for producing corneal epithelial cell mass
WO2022254961A1 (ja) 幹細胞を作製するための細胞培養補助剤、及び幹細胞の作製方法
Thanuthanakhun Study on Culture-Driven Epigenetic Memory during
Bettini et al. Injectable biodegradable microcarriers for iPSC expansion and cardiomyocyte differentiation
BR112016007853B1 (pt) Método de produção de células de epitélio pigmentar de retina

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination