CN101711277B

CN101711277B - 心肌细胞的细胞块制备方法和该心肌细胞块的用途

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Publication number: CN101711277B
Application number: CN200880020957.5A
Authority: CN
Inventors: 服部文幸; 福田惠; 福田惠一
Original assignee: Heart Rehabilitation Corp; Sankyo Co Ltd
Current assignee: Heart Rehabilitation Corp; Sankyo Co Ltd
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2028-07-31
Also published as: EP2172542A4; KR20100040276A; EP2172542A1; JPWO2009017254A1; RU2010101091A; AU2008283255A1; RU2467066C2; BRPI0813729A2; AU2008283255B2; CN101711277A; IL203404A; BRPI0813729B1; JP5523830B2; CA2690610A1; US20150366918A1; WO2009017254A1; KR101582483B1; KR20130090423A; US20100189699A1; BRPI0813729B8

Abstract

本发明的课题在于，改善纯化至不含有心肌细胞以外的细胞且不含有来源于其他物种的成分的心肌细胞在移植后的存活率。为了解决上述课题，本发明人等就经纯化的心肌细胞是否能够构筑细胞块进行了研究。其结果明确了：通过提供一种制备来源于多能干细胞的心肌细胞的细胞块的方法，可以解决上述课题。该方法的特征在于，将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由多能干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集状态的细胞块分散并单细胞化，从而得到的经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞。

Description

心肌细胞的细胞块制备方法和该心肌细胞块的用途

技术领域

本发明涉及使单细胞化并经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞聚集而制备细胞块的方法、包括使该心肌细胞块在心脏组织内存活的步骤的心脏病的治疗方法、以及使用该心肌细胞块制备片状细胞块的方法等。

背景技术

成体中的心肌细胞一旦丧失增殖活性，在重症的心肌梗塞、心肌病等心脏病中不得不依赖心脏移植。但是，目前还未能克服心脏供体不足的问题，为此当务之急是找出除心脏移植以外的治疗方法。

对此，在体外制备心肌细胞充当心肌细胞的补充的方法，被预计为救济不得不依赖心脏移植的患者的最有希望的方法。该治疗方针被称为心脏的细胞治疗。为了实现该治疗，进行了各种尝试。例如，对以下方法进行了研究：实验性地从胎儿、新生儿、成体中摘出心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、和骨髓细胞等并使用的方法；使胚胎干细胞分化并使用的方法；以及取出被暗示存在于生物体内的干细胞(体性干细胞(somatic stem cell))并诱导分化的方法等(非专利文献1：中华医学杂志2003，83，1818-22)。

若将这些方法进行分类则主要可以列举出两个方向性。其一为将心肌细胞以细胞的状态移植的方法，即用注射针直接向组织内注入分散为单一细胞的心肌细胞的方法(以下记载为“注入法”。另一为在体外构筑组织或脏器(以下记载为组织工程(Tissueengineering)法)，将该人工组织或人工脏器移植到体内进行治疗的方法。

在该组织工程法中，尝试了：1)将心肌细胞形成为片状并贴付在组织上的方法(非专利文献2：Circulation Research2002，90(3)：e-40)；2)将心肌细胞和非心肌细胞以与心脏组织内相同的比例混合，形成为立体结构并进行组织置换的方法；3)将分散为单一细胞的心肌细胞形成为立体结构，再构筑血管结构，并进行组织置换的方法；或者4)不进行心脏组织置换，为了辅助本来脏器的功能将新的辅助脏器移植到另外的部位并使用的方法(非专利文献3：Circulation Research 2007 2，100：263-272)等。

但是，现阶段还处于面向临床治疗应用而进行各种尝试的阶段，任何方法均不能充分显示出实用的试验数据。为了将心肌细胞移植到心脏中，还存在如下几个问题点，例如，包含心肌细胞以外的细胞、心肌细胞的存活率低、不能排除其他物种来源的成分等问题点。

为了将心肌细胞制成细胞块后用于移植，已知有包含啮齿类胎儿或新生儿心肌细胞的细胞块的构筑方法，在最近的报告中，用来源于胎儿心脏的全部细胞(包含非心肌细胞)构筑细胞块(非专利文献4：Developmental dynamics 235；2200-2209，2006)。并且关于心肌细胞的移植，还报道有将胎儿小鼠心肌细胞移植到成体小鼠的心脏内，并确认了其存活的例子(非专利文献5：Science 1994，264(5155)：98-101)。但是，在该心肌细胞的制备方法中，由于使用了通过胶原酶将胎儿的心脏分散而得的全部细胞，因此，移植后的细胞为混合有心肌细胞和非心肌细胞的细胞群。此外，还已知可以将未纯化的来源于生物体的心肌细胞移植到心脏中(非专利文献5：Science1994，264(5155)：98-101、非专利文献1：中华医学杂志2003，83，1818-22)。

另外，已知如下方法，即在ES细胞的胚状体分化的过程中，用蛋白质分解酶不完全处理胚状体，其结果得到包含富含心肌细胞的细胞块和不富含心肌细胞的细胞块的细胞块群，对该细胞块群采用密度梯度离心法进行分离，从而得到最多含有70％左右心肌细胞的细胞块(专利文献1：US2005-0214938A)。

但是，这些方法均利用了还包含心肌细胞以外细胞的细胞群，若混入心肌细胞以外的细胞，则移植后可能引起关系到患者生命的重大的难以预料的副作用。因此，供于移植治疗时，认为有必要将心肌细胞纯化后再使用。

到目前为止，有报告显示达成了将来源于ES细胞的未纯化的心肌细胞移植到心脏后而存活的情况(非专利文献6：Cardiovasc Res.2007 May17；非专利文献7：StemCells.2007 May 31；非专利文献8：FASEB J.2007 Apr 13)。另一方面，近来有报告显示：将来源于ES细胞的心肌细胞纯化后再注入到心脏，但存活率极低，未能发现存活(即，在被移植后的脏器内长时间存活，并黏附在脏器内而存留下来)的心肌细胞；并且明确了经纯化的来源于ES细胞的心肌细胞即使移植到个体(生物体)上也不能存活(非专利文献9：J ExpMed.2006；203：2315-27.)。

根据这些报告，经纯化的心肌细胞在移植后存活的难度已显而易见了。在相同的报告中，为了解决此类问题，以提高经纯化的来源于ES细胞的心肌细胞在移植后的存活率为目的，发现了一种混合小鼠胎儿成纤维细胞而进行移植的方法(非专利文献9：J ExpMed.2006 Oct2；203(10)：2315-27)。这表示对于经纯化的来源于ES细胞的心肌细胞，以保持此种纯度的状态进行移植并使其存活，通过已知的方法是无法实施的。

另外，以人体的治疗为目的的移植细胞的制备需要排除血清等来源于其他动物的因素。已知在用于移植的心肌细胞的制备方法中，通常进行有血清培养。在已知报告中，并没有报道任何关于不使用血清等来源于其他动物的因子而制备心肌细胞并进行移植的例子。

如此地，必须解决上述那样的将心肌细胞移植到心脏所面临的几个问题点，即包含心肌细胞以外的细胞、心肌细胞的存活性低、不能排除来源于其他物种的成分等问题点。

进而，在向心脏组织移植时，考虑到以所谓“细胞片”的形态进行移植，关于细胞片的制备，已知：在将新生儿心肌细胞制成单层薄片后，可以在体外将多达3层该薄片叠合在一起(非专利文献11：FASEB J.2006 Apr；20(6)：708-10)。然而，记载有：由于氧的透过性存在界限，超过该界限则无血管的新生，不能够达到细胞片厚度；从而无法依据心脏的患部组织的大小制备任意的细胞片。

由上述可见，目前从实用性的观点出发，对于移植使用的心肌细胞的制备或心肌细胞的移植，需要更多的改进。

专利文献1：US2005-0214938A

非专利文献1：中华医学杂志，2003,83,1818-22

非专利文献2：Circulation Research 2002,90(3):e-40

非专利文献3：Circulation Research 2007 2,100:263-272

非专利文献4：Developmental dynamics 235；2200-2209,2006

非专利文献5：Science 1994,264(5155):98-101

非专利文献6：Cardiovasc Res.2007May 17(Flk1(+)cardiac stem/progenitorcells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilatedcardiomyopathy mouse model)

非专利文献7：Stem Cells.2007May 31(Differentiation in vivo of CardiacCommitted Human Embryonic Stem Cells in Post-myocardial Infarcted Rats)

非专利文献8：FASEB J.2007Apr 13(Identification and selection ofcardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation)

非专利文献9：J Exp Med.2006Oct 2；203(10):2315-27

非专利文献11：FASEB J.2006Apr；20(6):708-10

发明内容

发明要解决的问题

为此，本发明人等对用于将培养心肌细胞应用到临床上时目前估计到的至少最低限度的条件进行了研究，明确了如下的课题。

(1)心肌细胞的纯化：从生物体或多能干细胞获得心肌细胞时，由于在未知的细胞混入并存在的状态下不能保障安全性，因此，在任何情况下都需要高度纯化心肌细胞。为了稳定维持该心肌细胞的高度纯化纯度，认为需要将从生物体或多能干细胞得到的心肌细胞分散开(单细胞化)，辨别各个细胞的种类，只选出心肌细胞。

(2)心肌细胞的来源：由于不仅存在免疫排斥的问题或伦理的问题，而且心肌细胞的性质在种间的差异给临床上的安全性和有效性带来了重大的影响，因此，心肌细胞的供体细胞的来源与受体个体为同种是很重要的。

(3)来源于其他物种动物的因素的排除：为了避免免疫原性和混入未知的病原体，需要排除以血清为代表的来源于其他动物因子的混入。

(4)移植心肌细胞的存活：被移植的心肌细胞需要具有与宿主心肌细胞相同的功能，首先需要存活于宿主的心肌细胞中(长时间保持活的状态)。

(5)在下一阶段中，细胞的成熟(成长变大)是必要的。

即，本发明的课题在于，改善纯化至不含有心肌细胞以外的细胞且不含有来源于其他物种的成分的心肌细胞在移植后的存活率，并促使上述心肌细胞移植后成熟。

用于解决问题的方案

本发明人等为了改善纯化至不含有心肌细胞以外的细胞且不含有来源于其他物种的成分的、来源于生物体或来源于多能干细胞的心肌细胞的存活率，就经纯化的心肌细胞是否能够构筑细胞块进行了研究。其结果明确了：通过提供一种制备来源于胚胎干细胞或来源于诱导多能性干细胞的心肌细胞的细胞块的方法，由此可以解决上述课题。该方法的特征在于，将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，并使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由作为多能干细胞的胚胎干细胞(Embryonic Stem cells：ES细胞)或诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells：iPS细胞)分化、诱导出的心肌细胞的细胞块暂时分散并单细胞化，从而得到的经纯化的心肌细胞。

本说明书中的“胚胎干细胞”是指除了来源于人类胚胎的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞以外的胚胎干细胞。

本发明的发明人等首先对使用来源于生物体的心肌细胞是否可以解决上述课题进行了研究。即，就使用纯化至不含有心肌细胞以外的细胞且不含有来源于其他物种的成分的、来源于生物体的心肌细胞是否可以提高该心肌细胞移植后的存活率进行了研究。

具体地，经纯化的来源于生物体的心肌细胞，无论是否在含有10％血清的培养液中，经过24小时后都不会形成细胞块。该结果强有力地暗示了，未经纯化的已知的生物体心肌细胞，其细胞块的形成强烈依赖于非心肌细胞的辅助作用。进而，实验性地对经纯化的来源于生物体的心肌细胞在无血清条件下表示出何种行为进行了研究，其结果，细胞块的构筑自不必说，就连细胞本身都已经死亡。由上述的事实可见，“来源于生物体心脏的未纯化的心肌细胞块的构筑”是无法实现的技术，也自然无法预测无血清状况下纯化后的来源于生物体心脏的心肌细胞的行为。

其次，在已知的心肌细胞聚集块的制备方法中，使用含血清的培养基来进行培养。这是由于根据常识通常血清对不管何种细胞种类均具有很强的保护效果。但是，如前所述，例如在对人体进行治疗的情况下，有必要避免使用其他物种动物来源物(例如血清)。因此，制成无血清培养基，代替血清而使用含有血清代替物的各种添加物，对来源于生物体的心肌细胞的聚集能力进行了研究。但是，来源于生物体的心肌细胞在任意的无血清条件下均不能充分构筑细胞块，并且细胞的存活率也低。

此外，在已知的方法中，有报告显示通过将来源于生物体的心肌细胞制成块进行培养，可以长时间地维持心肌细胞的存活，因此，在无血清条件下进行了将经纯化的来源于生物体的心肌细胞制备成细胞块的尝试。但是，即使在培养5天后，也不能形成细胞块。根据此次得到的实验结果，可以得出如下新见解：在无血清条件下，经纯化的来源于生物体的心肌细胞不能构筑细胞块。

因此，本发明人等考虑到若改变用于获得心肌细胞的供给源，或许可以打破该技术的困难局面。于是，对各种供给源进行了同样的研究，其结果明确了：在经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞中，即使在无血清条件下，也仅在12小时内就可以迅速地相互结合，从而可以有效地构筑立体的心肌细胞块，而且在此刻已经开始了同步的收缩。

这表示来源于胚胎干细胞的心肌细胞可以有效地构筑经纯化的心肌细胞间的细胞黏附，并且还表示经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞在无血清条件下具有高聚集能力。上述见解在就多个物种使用来源于各自物种的胚胎干细胞的各种情况下均得以再现，因此，上述特征被认为是在由胚胎干细胞得到的心肌细胞中共通的性质。基于此种无血清条件下胚胎干细胞特异的性质，本发明人等首次在无血清条件下能够将经纯化的心肌细胞制备成细胞块。

进而，从已知的报告可以预测，移植后的存活能力低的来源于胚胎干细胞的心肌细胞的再聚集能力也低(Transplantatio n70：1310-1317，2000)，另一方面，可预测使经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞聚集本身是困难的，并认为使该细胞聚集是无法实现的。尽管如此，与此种预测相反，本发明人等实现了经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞在无其他细胞辅助下就可以构筑细胞块，并且，通过将该细胞块用于移植中，首次显示出存活率的飞跃性上升。即，成功发现了来源于胚胎干细胞的心肌细胞具有与来源于生物体心脏的心肌细胞完全不同的如下特性：将其单细胞化并纯化后，进一步在无血清条件下也能够构筑细胞块。

进而，本发明人等为了找出制备更适于移植的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块的方法，在来源于胚胎干细胞的心肌细胞在无血清条件下能够更有效地构筑细胞块的条件方面，对添加到培养基中的添加物进行了研究。其结果为，在添加作为添加物的胰岛素、转铁蛋白、硒(ITS)时，可以再现性良好地观察到细胞块自发搏动强于未添加ITS的细胞块。即，表明添加ITS(特别是胰岛素)对于来源于胚胎干细胞的经纯化的心肌细胞是理想的。另外，在ITS中最重要的因素为胰岛素，转铁蛋白和硒起辅助的作用。

其次，在无血清的基础培养基(以下称为基础培养基)中添加ITS，再向其中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或胰岛素样生长因子1(IGF1)时，可知在单独添加bFGF时，细胞块形成后第5天的细胞块的直径显著增大，该细胞受到了保护。这是单独添加bFGF的无血清条件中特有的细胞保护和增殖效果，在含有血清的培养条件下是看不到的。作为bFGF对于添加血清条件下进行平面培养的实验条件下培养的心肌细胞的作用，已知存在细胞保护、细胞增殖促进等(J Mol Cell Cardiol.2007Jan；42(1)：222-33，CardiovascRes.2004；64：516-25.)，在无血清条件下发生心肌细胞的长时间的增殖或保护则是完全未知的。

此外，该效果大于使用添加10％血清的培养基而形成细胞块时的效果，在即使添加bFGF采用平面培养也不会形成细胞块的情况下，其效果小于使用添加10％血清的培养基而形成细胞块时的效果。由上述两个实验结果可见，为了使bFGF的细胞保护和增殖促进效果比用添加10％血清的培养基而形成细胞块时的效果更高，细胞块的构筑是必须的。

因此，本发明人等为了证实在上述效果的发挥中细胞块的构筑为必须要件，将经纯化的来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞进行平面黏附培养，向该培养基中添加bFGF，分析bFGF的影响。

在不能形成细胞块的平面培养中，在基础培养基中添加ITS的环境下，经纯化的心肌细胞几乎不能存活。但是，通过添加bFGF，会出现更多的细胞处在存活黏附的状况。该作用也小于用添加10％血清的培养基形成细胞块时的效果。

在构筑经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块的情况下，长期培养后对无血清+ITS+bFGF的作用和10％血清的作用进行了比较，其结果在含有10％血清的培养基中，细胞块的大小显著缩小，与此相对，在无血清+ITS+bFGF组中，细胞块的大小显著增大。由此可见，本发明人等发现的bFGF的作用是与纯化/无血清/细胞块的所有的要素之间的协同效果。

由上述结果可见，即，本发明通过在无血清培养基中添加ITS和/或bFGF，可以长时间地维持心肌细胞块的状态。根据该见解，与现有的平面培养法中的60～70％相比，心肌细胞的存活率可以飞跃性地上升为90％以上。

由上述可见，现有技术中无法达成的在无血清条件且高度纯化的条件下构筑心肌细胞块，本发明人等通过使用来源于胚胎干细胞的心肌细胞已能够达成，进而在添加ITS和bFGF的条件下，能最有效地构筑心肌细胞块。

即，本发明的一个形态还提供了制备来源于胚胎干细胞的心肌细胞的细胞块的方法，其特征在于，将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，使该细胞再聚集，所述心肌细胞是如下的心肌细胞：使包含由胚胎干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集状态的细胞块分散并单细胞化，从而得到的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞。在用于上述培养的培养基中，优选至少添加ITS中的胰岛素，更优选添加bFGF。此外，在上述方法中，对单细胞化后的细胞块并不按照已知的方法在单一的空间内进行培养，而是分割成多达10,000个的细胞群并在独立的空间中进行培养。

混入增殖性的非心肌细胞时，聚集块的尺寸变得极大，形态也发生了变化。进而，除了该指标，通过使用蓄积于线粒体中的荧光染料进行染色，可以将染料难以蓄积的细胞鉴定为增殖性的细胞。通过在移植治疗等中不使用混入这样的非心肌细胞的细胞块，可以将微量混入的增殖性非心肌细胞从移植细胞中排除。

此外，迄今为止报告有：被分散开(单细胞化)的来源于胚胎干细胞的经纯化的心肌细胞，其即使直接移植到个体(生物体)的心脏组织中也不能存活，本发明人等也得出了同样的结果。在现有技术中，这个问题可以通过将辅助细胞混合到经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞中来解决，由此明确表示出：在生物体内，非心肌细胞的保护作用对心肌细胞的存活而言是必须的。但是，非心肌细胞的混入有可能会引起关乎移植后患者生命的严重的无法预料的副作用，因此，本发明人等认为若能够不混合辅助细胞而是将经纯化的心肌细胞直接以高纯度移植到个体(生物体)内，则更可以提高安全性和治疗效果。

因此，考虑到对由上述方法得到的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块进行利用，通过将该细胞块移植到个体(生物体)的心脏组织中，可以飞跃性地提高移植后的存活性。换言之，使细胞块分散并单细胞化，由此得到经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞，将该心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，使该细胞再聚集而形成细胞块，从而发现可以飞跃性地提高经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞在移植后的存活性。

即，本发明的另一形态涉及一种心脏病的治疗方法，其特征在于，将单细胞化并经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞进行再聚集得到细胞块，将所得到的细胞块移植到个体(生物体)的心脏组织(特别是患部)并使之存活。本申请发明中的“存活”是指在被移植的脏器内长时间生存，黏附在脏器内并存留下来。

进而，如上所述，已知的方法中，已知可以将新生儿心肌细胞的单层薄片层叠达3层，但无法制备出超过该厚度的心肌细胞片。

为了解决上述课题，而考虑到利用通过上述方法得到的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块。通过上述方法构筑该细胞块，将所得到的细胞块回收，以细胞块之间保持接触的状态无间隙地排列并接种在被壁面隔开的细胞非黏附性容器的表面，进行悬浮培养。其结果发现：该细胞块随着时间的推移细胞块之间接合，得到具有50～300μm厚度的片状的细胞块，从而可以在生物体外制备出具有现有技术无法达到的厚度的所谓“细胞片”。由此可知，在实际的应用形态中，使用任意数量的具有任意大小的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块，可以制备出任意大小的细胞片。

即，本发明的又一形态涉及一种片状细胞块(细胞片)的制备方法，其特征在于，将经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块紧密排列在同一平面上，进行悬浮培养，并将该培养进行到细胞块之间接合且具有50～300μm之间的任意厚度。

本发明中明确了：可以将具有上述那样特征的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞的细胞块移植到心脏组织中，并使其存活。这样的细胞块可以用作能够移植到动物的身体中的移植用医疗器械。

即，本发明的另一形态中提供了一种医疗器械，其包含来源于胚胎干细胞的心肌细胞的细胞块，该细胞块如下制备：将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，并使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由胚胎干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集状态的细胞块分散并单细胞化，从而得到的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞。这样的医疗器械以将所包含的细胞块移植到个体的心脏组织中并使之存活为目的，具有能够用于需要心脏移植的患者的显著的效果。

综上所述，本发明人等为了大幅度改善被分散开(单细胞化)并完全被纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞的存活率，而对培养条件进行了深入的研究，结果新发现了如下的特性：即通过使用不含有动物来源的血清条件(即无血清条件)下的培养基，优选使用含有胰岛素的该培养基，更优选使用进一步含有转铁蛋白、硒和/或碱性成纤维细胞生长因子的该培养基进行培养，可以使该细胞聚集形成细胞块。此外，还得出了以下新的见解：将该细胞移植到个体(生物体)的心脏组织中时，可以飞跃性地提高其在该组织中的存活率。进而，使用该细胞时，与公知技术进行比较，首次得出了获得具有超过预期的厚度的片状的细胞块以及包含此种细胞块的医疗器械的见解，从而完成了本发明。

如此通过培养胚胎干细胞而得出的见解，即使代替胚胎干细胞而使用其他的具有多能性的干细胞也得到同样的结果。即，通过使用不含有动物来源的血清条件(即无血清条件)下的培养基，优选使用含有胰岛素的该培养基，更优选使用进一步含有转铁蛋白、硒和/或碱性成纤维细胞生长因子的该培养基，培养被分散开(单细胞化)并完全被纯化的多能干细胞，可以使该细胞聚集形成细胞块，并且可以大幅度地改善心肌细胞的存活率。作为这样的多能干细胞，除了胚胎干细胞外，还可以使用哺乳动物的成体脏器或组织的细胞、骨髓细胞、血液细胞、以及具有与胚胎干细胞类似性状的所有的多能干细胞，例如可以列举出胚胎生殖干细胞(Embryonic Germ cells：EG细胞)、种系干细胞(Germline Stem cells：GS细胞)和诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells：iPS细胞)等。

即，本发明涉及以下的事项。

(1)一种制备来源于多能干细胞的心肌细胞的细胞块的方法，其特征在于，将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，并使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞或诱导多能性干细胞等多能干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集状态的细胞块分散并单细胞化，从而得到的经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞；

(2)根据上述(1)所述的方法，其中，培养基为含有胰岛素的培养基；

(3)根据上述(1)或(2)所述的方法，其中，培养基为含有选自转铁蛋白、硒、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)和内皮素-1(ET-1)所组成的物质组中的至少一种物质的培养基；

(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，培养基中，胰岛素含量为0.1～10mg/L、转铁蛋白含量为0.1～10μg/L、硒含量为0.1～10μg/L、碱性成纤维细胞生长因子含量为1ng/ml～100ng/ml、上皮生长因子含量为1ng/ml～1000ng/ml、血小板源性生长因子含量为1ng/ml～1000ng/ml、内皮素-1(ET-1)含量为1×10^-8～1×10^-6M；

(5)一种心脏病的治疗方法，其特征在于，使单细胞化并经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞聚集得到细胞块，将所得到的细胞块移植到个体的心脏组织中并使其存活；

(6)根据上述(5)所述的方法，其中，心肌细胞块为由上述(1)～(4)中任一项所述的方法而得到的心肌细胞块；

(7)根据上述(5)或(6)所述的方法，其中，移植包括将心肌细胞块注入心脏组织内；

(8)根据上述(5)或(6)所述的方法，其中，移植包括将片状细胞块移植到心脏组织上；

(9)一种片状细胞块的制备方法，其特征在于，将经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞块以细胞块之间保持接触的状态无间隙地排列并接种在被壁面隔开的细胞非黏附性容器的表面，进行悬浮培养，并将该培养进行到细胞块之间接合且具有50～300μm之间的任意厚度；

(10)根据上述(9)所述的方法，其中，心肌细胞块由上述(1)～(4)中任一项所述的方法而得到的心肌细胞块；

(11)一种医疗器械，其用于将下述细胞块移植到个体的心脏组织中并使其存活，该医疗器械包含来源于多能干细胞的心肌细胞的细胞块，该细胞块如下制备：将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，并使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由多能干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集的细胞块分散并单细胞化，从而得到的经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞；

(12)根据上述(11)所述的医疗器械，其中，移植包括将心肌细胞块注入心脏组织内。

(13)根据上述(11)所述的医疗器械，其中，移植包括将片状细胞块移植到心脏组织上。

发明的效果

根据本发明，单细胞化并经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞在无血清条件下进行培养时，可以发现具有聚集能力的特性。根据本发明的方法，通过构筑细胞块，可以得到既维持较高的该心肌细胞的存活率或增殖能力，又可以长时间培养的方法。此外，将该细胞移植到个体(生物体)的心脏组织中时，发现其在该组织中的存活率飞跃性上升，可以使该细胞不与其他细胞混合而长时间在心脏组织内存活。由此，可以使得在心脏的细胞治疗中有希望的治疗方法和包含心肌细胞的细胞块的医疗器械能够实际应用。

附图说明

图1表示使用来源于表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的小鼠胚胎干细胞的经纯化的心肌细胞构筑心肌细胞块的方法，以及使用来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞10000个细胞到313个细胞时的细胞块。

图2表示分注后24小时后(图2的A))或48小时后(图2的B))的、使用来源于狨猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞构筑的心肌细胞块。

图3表示使用来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞，基于其在不同黏附基质中的细胞存活率的比较，对平面培养中最适合的黏附基质进行鉴定(图3的A))以及细胞块和平面培养时心肌细胞的存活率的比较(图3的B)和图3的C))。

图4表示在使用来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞形成细胞块时，找出混合的胚胎干细胞的方法(1)。用红框表示的细胞块中可以看出由细胞增殖而成的巨大的细胞块。

图5表示在使用来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞形成细胞块时，找出混杂的胚胎干细胞的方法(2)。利用非心肌细胞来源于TMRM(对线粒体进行特异性染色的试剂)的荧光信号弱的特点，检测出混入的增殖的非心肌细胞(proliferatee non-cardiomyocytes)，与正常心肌细胞(图5的A))相对比，可以确定在异常心肌细胞块中混入有增殖的非心肌细胞(图5的B))。

图6的A)表示在用细胞非黏附性圆底96孔板(well dish)进行培养时，在来源于新生大鼠心脏的纯化心肌细胞中，即使在24小时后也不能构筑细胞块，图6的B)表示来源于新生大鼠心脏的纯化心肌细胞在无血清条件下5天后未形成细胞块并死亡。

图7表示通过在添加了ITS和bFGF等各种添加物的无血清培养基中，用细胞非黏附性圆底96孔板培养时，明确这些添加物对于细胞块的直径增加具有何种作用，从而可以检测出这些添加物的细胞保护作用和增殖促进活性。

图8表示在用纤连蛋白包被的细胞培养用板上平面黏附培养来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞，其结果为在无血清ITS、ITS+bFGF组中细胞存活率明显较低。

图9表示不使用再聚集法而将分散细胞直接移植到心脏时，使用来源于小鼠胚胎干细胞的经单细胞化的纯化心肌细胞进行移植，测量其在移植后的组织内的细胞存活率的结果。

图10表示采用再聚集法使来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞形成细胞块后，用红色染料(Mitotracker Red)进行标记，在移植到心脏时，心肌细胞高效地存活。

图11的(A)和(B)表示：将再聚集后的来源于表达EGFP小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞的细胞块移植到心脏组织内，测量其在心脏组织内的细胞数，以该结果对细胞的组织内存活率进行分析的结果。图11的(C)和(D)表示小鼠心肌细胞块在移植心脏内长时间存活，并且随着时间的推移能够成熟。

图12表示在无血清(图12的A))、或者无血清并添加KSR(图12的B))或ITS(图12的C))的条件下制备来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞块。

图13表示使用来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞块来制备具有任意厚度的任意大小的心肌细胞片。

图14表示在无血清、或者无血清并添加ITS或KSR的条件下，制备来源于小鼠iPS细胞的纯化心肌细胞块的结果。

具体实施方式

在本发明的实施中，若对于分子生物学或重组DNA技术等基因工程学方法、一般的细胞生物学方法和现有技术无特别的说明，则实施者可以参照本领域的标准性书籍。作为此类书籍，可以列举出例如《Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版》(Sambrook&Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)、《Current Protocols inMolecular biology》(Ausubel et al.编,John Wiley&Sons,1987)、《Methods inEnzymology Series》(Academic Press)、《PCR Protocols：Methods in MolecularBiology》(Bartlett&Striling编,Humana Press,2003)、《Animal Cell Culture：APractical Approach第3版》(Masters编,Oxford University Press,2000)、《Antibodies：A Laboratory Manual》(Harlow et al.&Lane编,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1987)等。此外，本说明书中所提及的用于细胞培养、细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从Sigma公司、Aldrich公司、Invitrogen/GIBCO公司、Clontech公司、Stratagene公司等销售商中获得。

(1)多能干细胞

有关使用多能干细胞的细胞培养以及发育和细胞生物学实验的一般方法，实施者可以参照该领域的标准性书籍。其中包括《Guide to Techniques in Mouse Development》(Wasserman et al.编,Academic Press，1993)、《Embryonic Stem Cell Differentiationin vitro》(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225：900,1993)；《Manipulating the MouseEmbryo：A laboratory manual》(Hogan et al.编,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1994)、《Embryonic Stem Cells》(Turksen编,Humana Press,2002)。本说明书中所提及的用于细胞培养、以及发育和细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从Invitrogen/GIBCO公司或Sigma公司等销售商中获得。

有关小鼠的多能干细胞的制备、传代、保存法，已经建立了标准的规程(protocol)，实施者通过在前面列举的参考书籍的基础上，参照多篇参考文献等，可以使用这些多能干细胞。作为该文献，可以列举出以下的文献等：Matsui et al.,Cel1 70：841,1992；Thomson et al.,美国专利第5,843,780号；Thomson et al.,Science 282：114,1998；Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726,1998；Shamblott et al.,美国专利第6,090,622号；Reubinoff et a1.,Nat.Biotech.18：399，2000；国际公开第00/27995号。此外，有关其他的动物种，还已知关于例如猴(Thomson et al.,美国专利第5,843,780号；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,7844,1996)、大鼠(Iannaccone et al.,Dev.Biol.163：288,1994；Loring et al.,国际公开第99/27076号)、鸡(Pain et al.,Development l22：2339,1996；美国专利第5,340,740号；美国专利第5,656,479号)、猪(Wheeler et al.,Reprod.Fertil.Dev.6：563,1994；Shim et al.,Biol.Reprod.57：1089,1997)等的胚胎干细胞或胚胎干细胞样细胞等多能干细胞的建立方法，根据各自记载的方法，可以制备或使用能够用于本发明的多能干细胞。

本发明的方法对于来源于任意哺乳动物的多能干细胞均可以适用。例如，对于来源于小鼠、牛、山羊、犬、猫、绒猴、猕猴的多能干细胞可以使用，但并不仅限定于来源于这些动物种的多能干细胞。例如，作为能够用于本发明的多能干细胞，可以列举出已经作为培养细胞而广泛使用的来源于小鼠、猴等哺乳动物的胚胎干细胞(ES细胞)。

作为来源于小鼠的胚胎干细胞的具体例，可以列举EB3细胞、E14细胞、D3细胞、CCE细胞、R1细胞、129SV细胞、J1细胞等。本申请发明中所述的来源于小鼠的胚胎干细胞，可以从例如美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)或Chemicon公司、Cell&Molecular Technologies公司等获得。

作为来源于猴的胚胎干细胞，报道了从猕猴(rhesus monkey：Macaca mulatta)(Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995；92：7844)或食蟹猴(cynomolgusmonkey：Macaca fascicularis)(Suemori et al.,Dev.Dyn.2001；222：273-279)、普通绒猴(common marmoset：Callithrix jacchus)(Sasaki et al.,Stem Cells.2005；23：1304-1313)建立胚胎干细胞，可以使用。例如，绒猴胚胎干细胞可以从财团法人实验动物中央研究所获得。

进而，还报道了有关牛(Mitalipova et al.,Cloning 2001；3：59-67，)、鸟(Petitte et al.,Mech.Dev.2004；121：1159-1168)、斑马鱼(Fishman,M.C.,Science2001；294：1290-1291)的胚胎干细胞的建立。

此外，还报道了使单性发育胚发育到与胚泡期同等的阶段，再由此制备胚胎干细胞的尝试(美国专利公开第02/168763号；Vrana K et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：11911-6)，以及，通过使胚胎干细胞与体细胞融合，制备具有体细胞核的遗传信息的胚胎干细胞的方法(国际公开第00/49137号；Tada et al.,Curr.Biol.11：1553,2001)。在本发明中可以使用的胚胎干细胞中，还包括通过基因工程学的方法改变了由此类方法制备的胚胎干细胞或胚胎干细胞的染色体上的基因的胚胎干细胞。

此外，在本发明所述方法中可以使用的多能干细胞中，不只限于胚胎干细胞，还包括哺乳动物的成体脏器或组织的细胞、骨髓细胞、血液细胞、以及具有与胚胎干细胞类似性状的所有多能干细胞。此种情况下，与胚胎干细胞类似的性状可以定义为：具有胚胎干细胞特异的细胞生物学性质，如：存在胚胎干细胞特异的表面(抗原)标记、胚胎干细胞特异性基因的表达、或具有畸胎瘤(teratoma)形成能力或嵌合体小鼠形成能力等。作为其具体例，可以列举出由原始生殖细胞制备的胚胎生殖干细胞(EG细胞)、由精巢的生殖细胞制备的种系干细胞(GS细胞)、和由成纤维细胞等体细胞通过特殊的基因操作而制备的诱导多能性干细胞(iPS细胞)等。作为诱导多能性干细胞，可以列举出能通过在体细胞中引入特定的因子而制备的诱导多能性干细胞，该细胞可以通过京都大学山中伸弥教授的研究小组发表的文献(K.Takahashi,et al.,“Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult HumanFibroblasts by Defined Factors”Ce11 2007 131：861-872)或Wisconsin大学的Thomson的研究小组发表的文献(J.Yu,et al.,“Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derivedfrom Human Somatic Cells”Science 2007 318：1917-1920)中所记载的方法来制备。具体地，对于任意的体细胞，引入Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、LIN28中的至少一种以上的基因，检测多能干细胞特异的基因或蛋白质的表达，并对其进行筛选，由此可以制备诱导多能性干细胞。如此制备的诱导多能性干细胞，与胚胎干细胞同样，可以在失去增殖活性的小鼠成纤维细胞或能代替该细胞的细胞存在下，与碱性成纤维细胞生长因子一起培养，与胚胎干细胞同样地可以用作多能干细胞。

目前已明确了，该诱导多能性干细胞在分化为各种组织的特征和细胞内的基因表达的特征方面，具有与胚胎干细胞相同的性状(Park I.H.et al.,Nature,2008,451,141-147)，诱导胚胎干细胞分化为各种组织的条件可以对诱导多能性干细胞直接适用(高桥和山中,细胞工学，Vol.27,No.3,252-253,2008)。

(2)诱导多能性干细胞分化为心肌细胞的方法

以下，记载了以胚胎干细胞(ES细胞)作为多能干细胞的例子。对于具有分化为心肌细胞能力的胚胎干细胞，若进行适当的心肌细胞分化诱导处理，则可以分化为心肌细胞。即，例如通过悬滴(hanging drop)法可以诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞，所述悬滴法为：通过从培养液中除去白血病抑制因子(LIF)使小鼠胚胎干细胞进行悬浮培养，使其形成细胞块(胚状体)。或者使用绒猴胚胎干细胞，同样也可以诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞。作为诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，可以使用公知的方法，并无特别限定。例如，使用在抑制BMP信号传递的物质的存在下进行分化诱导的方法(WO2005/033298)，或在促进经典Wnt信号途径的活化的物质的存在下进行分化诱导的方法(作为PCT/JP2007/59242、WO2007/126077而公开)，可以诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞。

(3)心肌细胞的纯化

作为对采用上述(2)的方法诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞后进行纯化(选择)的方法，只要是通过酶的作用将心肌细胞分散开(单细胞化)，可以纯化成单个心肌细胞的方法，则并无特别限定。例如，可以使用以心肌细胞内的线粒体作为指标进行选择的方法(WO2006/022377)、对在低营养条件下可以存活的细胞进行筛选的方法(作为PCT/JP2007/051563、WO2007/088874而公开)，仅对心肌细胞进行纯化(选择)。

(4)心肌细胞块的制备

采用上述(3)的方法单细胞化而得到经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞，将其在无血清条件下进行培养，可以使该细胞聚集，从而制备出来源于胚胎干细胞的心肌细胞块。理想的是优选在用于该培养的培养基中含有选自由胰岛素(0.1～10mg/L)、转铁蛋白(0.1～10μg/L)、硒(0.1～10μg/L)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；1ng/ml～100ng/ml)、上皮生长因子(lng/m1～1000ng/ml)、血小板源性生长因子(1ng/ml～1000ng/ml)、和内皮素-1(ET-1)(1×10^-8～l×10^-6M)所组成的物质组中的至少一种物质。

此外，在通过上述方法得到的经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块中检测出了微量混杂的增殖性细胞，通过将其从移植用细胞中排除，可以确保更好的安全性。目前，作为纯化心肌细胞的方法，已知有预先在干细胞的基因组中引入某些标记基因的方法(FASEB J.2000；14：2540-2548)。但是，在所有这些方法中即使可以提供99％纯度，也无法保证100±0％的纯度。例如，为了治疗心肌梗塞，假如需要10¹¹个心肌细胞，那么在纯度99％时，其含义为混入10⁹个非心肌细胞。如此地，若从已知的技术水平来看已称得上是接近于完全纯化的方法，但也无法实现心肌细胞的完全纯化，因此，与进一步的纯化方法的结合或其他保证安全性的方法的应用是必要的。

因此，对于上述的方法，有意地尝试了混入未分化胚胎干细胞。如此一来，增殖能力比心肌细胞高的未分化胚胎干细胞在心肌细胞块的外侧构筑成大的另外的细胞块。通过判断细胞块整体的大小，可以自动地判断出存在该混入的胚胎干细胞的心肌细胞块。进而，对该细胞块添加线粒体指示剂(例如TMRM)时，可以发现：富含线粒体的心肌细胞明亮，不富含线粒体的胚胎干细胞或其他的增殖性的细胞发暗。关于除去这样的细胞块内的荧光强度差异大的细胞块，可以通过利用Arrayscan(Cellomics)、Incell 1000(GE/AmershamBiosciences,Cardiff,UK)、Scanalyzer(Scanalyzer LemnaTec,Aachen Germany)和“ImageXpress MICRO”(Molecular Devices，Union City，USA)、“Pathway HT”(BectonDickinson Biosciences)、“Scan^R”(O1ympus Soft Imaging Solutions,Germany)等而自动地进行。如此地，上述方法可以简单且自动地识别未分化胚胎干细胞的混入。即，以细胞块的大小或形状作为指标，进而在该指标的基础上通过线粒体指示剂进行染色，以荧光强度和细胞块内的荧光强度分布等作为指标，可以识别在无血清条件下培养并聚集的来源于胚胎干细胞的经纯化的心肌细胞块中微量混杂的增殖性细胞。如此地，通过将混入了心肌细胞以外细胞的细胞块从移植用细胞中排除，可以提高安全性。

(5)心肌细胞块向心脏组织中的移植和存活

使用由上述方法聚集而得到的细胞块，即，使用经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞块，可以仅将心肌细胞移植到个体(生物体)的心脏组织中。例如，还可以通过注射将心肌细胞直接注入到心脏组织中，此种情况下，还可以使用29、30号(gage)这样的细的低侵袭性的注射针进行注入。与已知的方法相比，通过该方法进行移植后的心肌细胞的存活率飞跃性上升。这里所谓的“存活”是指在被移植后的脏器内长时间生存，黏附到脏器内而存留下来。

(6)心肌细胞块的移植用薄片

已知的方法中使用新生儿心肌细胞的情况下，也不能一次制备出具有3个细胞以上的厚度的心肌细胞片。但是，本发明中，在构筑经纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞的细胞块之后，回收所得到的细胞块，细胞块之间以保持接触的状态无间隙地排列并接种在被壁面隔开的细胞非黏附性容器的表面，进行悬浮培养，由此，在该悬浮培养中，心肌细胞块随着时间的推移而细胞块之间接合，可以形成具有50～300μm厚度的片状的细胞块(细胞片)。因此，可以进行培养至形成任意的厚度。由此，在实际的应用形态中，可以使用任意数量的具有任意大小的来源于纯化胚胎干细胞的心肌细胞块，构筑出任意大小的细胞片。

实施例

通过以下的实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1：来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞的制备和使用线粒体法纯化心肌细胞

本实施例中，是以研究能否由小鼠胚胎干细胞制备心肌细胞、以及使用线粒体指示剂能否纯化心肌细胞为目的而进行的。

作为胚胎干细胞，使用EB3细胞株(Niwa H,et al.,Nat Genet 2000；24：372-376)，在EB3株中用质粒引入EGFP表达单元，在该细胞中取得表达EGFP的细胞并建立细胞株。将如此取得的EGFP表达-胚胎干细胞(EB3细胞)用加入了最终浓度10％的灭活(55℃、30分钟)胎牛血清的α-MEM培养液(Sigma公司制造)稀释，使浓度达到胚胎干细胞数为75个/35μL。接着，在市售品细胞培养用384孔板(Greiner公司制造、型号788161；开口部内径3.0mm)中分注上述制备的小鼠胚胎干细胞，按照以下的方法制备胚状体。

所使用的384孔板中公称的溶液容许量为每孔25μL，为了升高液面，每孔分注35μL。由此，每孔分注75个胚胎干细胞。此时，到达开口部水平面所需要的溶液量为28μL，升高所需要的溶液量为7μL。在分注中，使用Theremo Labsystems公司制造的多道移液器(multi-channel pipette)(产品编号4610070)、或BioTech Co.,Ltd.制造的分注器(型号LD-01)。

分注包含胚胎干细胞的培养液，将培养液升高状态的板翻过来，制成培养液在下侧开口端突出的状态。保持该状态，盖上盖子，在培养箱内、37℃、5％CO₂条件下进行培养，在前述下端侧开口端的突出部分中使胚胎干细胞增殖。培养开始后1天后，用清洁的镊子等保持板为突出的培养液面向下的状态，在另外的大型容器中充满加入最终浓度10％的灭活(55℃、30分钟)胎牛血清的α-MEM培养液(sigma公司)，使培养液的突出部分与该大型容器的培养液的表面接触，通过使细胞块因自身重力向大型容器中的培养液内沉降，回收来源于胚胎干细胞的细胞块即胚状体。

将回收后的胚状体使用非细胞黏附板(Asahi Techno Glass：灭菌板#SH90-15、或荣研器材株式会社：灭菌方形板2型)进一步培养胚状体2天～3天。用离心管回收该胚状体，将溶液变换为无血清培养基(α-MEM(SIGMA公司，在#M0644中加入ITS溶液(GIBCO#41400-045)而进行1/100稀释(这里，在本发明中使用的ITS溶液中，分别含有胰岛素1g/L、转铁蛋白0.55g/L、氯化硒0.67mg/L))，同时在细胞黏附性的灭菌培养板(FALCON#353003)中进行培养。

在到从分化培养开始起的第15天之前，每隔一天更换培养基。对第15天的样品加入终浓度10nM的线粒体指示剂TMRM(Invitrogen#T668)，培养2小时后，使用分别加入终浓度为0.1％的胶原酶(Wortington Type3)、终浓度为0.1％的胰蛋白酶(DI FCO#215240)的生理缓冲液(116mM NaCl、20mM Hepes、12.5mM NaH₂PO₄、5.6mM葡萄糖、5.4mM KCl、0.8mMMgSO₄、pH7.35)，一边用搅拌器搅拌溶液，一边对细胞进行单细胞化。将上述单细胞化后的样品供于荧光激活细胞分选仪(Fluorescent Activated Cell Sorter；FACS)，回收高荧光细胞群(WO2006/022377)。用血细胞计数器测量经纯化的细胞的活细胞数和死细胞数。其结果为，活细胞的比例为约75％。

实施例2：使用来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞制备细胞块

本实施例是为了明确使用实施例1中制备出的来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞其后能否制备细胞块而进行的。

将实施例1中制备出的来源于胚胎干细胞的纯化心肌细胞进行分注，使得细胞非黏附性圆底96孔板(SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.；CELLFECTIGHT SPHEROID)的1孔中存在10000、5000、2500、1250、625和313个细胞。培养基为含10％胎牛血清的α-MEM。对分注后的细胞进行经时观察时，在10小时后形成细胞块，并同步地自发搏动。在24小时后，形成几乎完整的球形，在10天后，表现出有节奏的同步的自发搏动(图1)。

由上述结果可见，对来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞进行单细胞化后，心肌细胞发生再聚集，具有形成细胞块的能力。

实施例3：使用来源于绒猴胚胎干细胞的心肌细胞制备细胞块

本实施例是为了明确使用根据实施例1的方法制备出的来源于绒猴胚胎干细胞的心肌细胞其后能否制备细胞块而进行的。

绒猴胚胎干细胞从实验动物中央研究所获得(Sasaki E,et a1.,StemCells.2005；23(9)：1304-13)。将该绒猴胚胎干细胞使用通过丝裂霉素C处理而失去增殖活性的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast；MEF)进行未分化维持培养。使用培养液[KO-DMEM(GIBCO)、20％KO-SERUM(GIBCO)、1.6mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.2mMβ-巯基乙醇(2-ME；Sigma)、100IU/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、和8ng/ml重组人白血病抑制因子(LIF；Chemicon)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Peprotech)]。在继代培养时，用0.1％III型胶原酶(Wortington)，以37℃、10分钟分离胚胎干细胞群落。

接着，为了分离MEF和胚胎干细胞，收集通过孔径100μm的筛而得到的通过液，使该通过液通过孔径40μm的筛，收集未通过的细胞块。该细胞块即为纯的胚胎干细胞块。分化时，在细胞非黏附性菌板(Asahi Techno Glass：灭菌板)上以每个EB为50～1000个胚胎干细胞块作为胚状体共计培养15～30天，使之分化为含有心肌细胞的胚状体。此时使用的培养液为从本实施例的上述培养液中除去bFGF的培养液[KO-DMEM(GIBCO)、20％KO-SERUM(GIBCO)、1.6mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.2mMβ-巯基乙醇(2-ME；Sigma)、100IU/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、和8ng/ml重组人白血病抑制因子(LIF；Chemicon)]。

使用胚状体制备后经过1～2个月的胚状体，用WO2006/022377中记载的方法对心肌细胞进行纯化。即，用胶原酶和胰蛋白酶处理胚状体，得到分散的单细胞。对分散有细胞的培养液加入终浓度10nM的线粒体指示剂TMRM(Invitrogen#T66)，在37℃暴露15分钟，清洗3次后，立即进行FACS分析。对与主细胞群相比显示高荧光的细胞(心肌细胞)进行分离回收。

对上述分离后的心肌细胞用与实施例2同样的方法制备心肌细胞块。即，进行分注，使2000个来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞存在于细胞非黏附性圆底96孔板(SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.；CELLFECTIGHT SPHEROID)的1孔中。经时观察分注后的细胞，结果，24小时后(图2的A))形成细胞块，同步地自发搏动。48小时后(图2的B))形成几乎完整的球形，10天后显示出有节奏的同步的自发搏动(图2)。

由上述结果可见，对来源于绒猴胚胎干细胞的心肌细胞进行单细胞化后，心肌细胞发生再聚集，具有形成细胞块的能力。

实施例4：使用来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞形成细胞块时的细胞存活率的测定以及与黏附法的比较

在本实施例中，在平面培养条件下，以保护作用的强度作为指标来研究黏附基质，并对平面黏附培养与细胞块培养时来源于胚胎干细胞的纯化心肌细胞的存活率进行比较。这样做是为了：对使用细胞保护作用强的血清的平面黏附条件和、有血清条件及无血清条件下的细胞存活率进行了比较研究，结果为无血清条件下的细胞块培养方法表现出优异的细胞保护作用。

本实施例中，按照实施例1，对来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞进行了纯化。

将经纯化的心肌细胞在有血清条件下接种到(1)用明胶、(2)用纤连蛋白包被的塑料制培养皿(BD公司)中(图3的A))。同时，为了形成细胞块，按照实施例2在(3)细胞非黏附性圆底96孔板中每孔分注1,000个细胞，在120g下进行5分钟离心操作。此外，(4)细胞块构筑中除去使用无血清条件这点，按照实施例2在细胞非黏附性圆底96孔板上每孔分注1,000个细胞，在120g下进行5分钟离心操作。(1)～(4)在同一培养箱内培养12小时和4天。4天后，测量黏附到各板上的细胞数(活细胞数)和未黏附而悬浮的细胞数(死细胞数)。其结果如图所示(有关(1)和(2)参照图3的A)，有关(3)和(4)分别参照图3的B)和图3的C))。

其结果可见，细胞块无血清培养条件下的细胞存活率与平面黏附含有血清的条件下的最大细胞存活率((2)的情况下为约60％的存活率)相比，明显更高((3)的情况下为99.2％的存活率，(4)的情况下为90.4％的存活率)。

实施例5：使用经纯化的来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞的细胞块的制备和混杂的胚胎干细胞的检测

本实施例是以检测出使用经纯化的来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞制得的细胞块中混杂的非心肌细胞为目的而进行的。

使用实施例1、2的方法制备经纯化的心肌细胞块。但是，在最终接种到96孔板的前阶段时，在心肌细胞悬浮液中加入2％的未分化胚胎干细胞。细胞块用无血清+1mg/ml的胰岛素、和包含10nM TMRM的α-MEM溶液进行培养，14天后取得所有的孔的荧光像和相位差图图像。

其结果可知，在占约2％的孔即2孔中，观察到大型(正常细胞块的2倍以上的大小)的细胞块(图4)，该非球形细胞块的一部分为具有弱的来源于TMRM的荧光信号的细胞群(即非心肌细胞)，其为异常心肌细胞(图5的B))。另外，对于正常的心肌细胞块，其细胞块整体发出来源于TMRM的荧光信号(图5的A))。

由此可见，本实施例中提供的方法可以高灵敏度地识别出非心肌细胞的混入。

实施例6：使用来源于新生大鼠心脏的纯化心肌细胞制备细胞块

本实施例是以明确使用来源于新生大鼠的心脏的经纯化的心肌细胞能否制备细胞块为目的而进行的。

用乙醚麻醉出生后0～2天的新生大鼠。摘出心脏，用0.1％胶原酶(wortington)将细胞分散开。对其用10nM TMRM进行染色后，用FACS对心肌细胞进行纯化。

测量经纯化的心肌细胞的细胞数，每3000个细胞用细胞非黏附性96孔板(SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)进行培养。培养基使用含有10％FBS(JRH)的DMEM-高葡萄糖(Invitrogen)。

24小时后的细胞的状态如图所示。来源于新生大鼠的纯化心肌细胞不形成细胞块，而是沿着圆底存在(图6的A))。培养第5天的来源于新生大鼠心脏的纯化心肌细胞在无血清条件下(仅为基础培养基α-MEM(图6的B)左)、或α-MEM+ITS(图6的B)右))细胞几乎全死亡(图6的B))。

实施例7：使用来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞形成细胞块时最适的培养基组成

本实施例中，分析了新生大鼠原代心肌细胞、和来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞的诸多性质，目的在于发现对于来源于胚胎干细胞的心肌细胞最适的培养基。

来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞和新生大鼠纯化心肌细胞通过前述的方法来制备。对它们使用仅α-MEM、α-MEM+ITS、α-MEM+ITS+50ng/ml bFGF(peprotech)、α-MEM+ITS+50ng/ml IGF-1(Wako)、α-MEM+ITS+50ng/ml bFGF+50ng/ml IGF-1、α-MEM+5％KSR(Knockout血清替代品：Invitrogen)(Invitrogen)、α-MEM+10％KSR(Knockout血清替代品：Invitrogen)、α-MEM+1％FBS(Equitech Bio)、α-MEM+5％FBS、α-MEM+10％FBS共10种培养基进行了分析。

其结果为，在细胞非黏附性圆底96孔板中培养来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞时，仅用12小时所有的培养基中均形成了细胞块(图7的A))。但是，新生大鼠心肌细胞在24小时后所有的培养条件下均未能形成细胞块。以含有10％血清的培养基进行例示。4天后，新生大鼠心肌细胞仅在含有5％FBS和含有10％FBS的培养基中形成了心肌细胞块。

另一方面，对用细胞非黏附性圆底96孔板培养6天后的来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞块进行了观察(图7的B))，其结果，与形成细胞块时相比，仅在α-MEM+ITS+50ng/ml bFGF中看到显著的细胞块直径增加(图7的C))、参照附有＊的柱)。即使在含有血清的培养基中，细胞块的直径也变为初期的1/2左右(图7的C))。

由此可见，在无血清条件下，添加了ITS和bFGF的培养基具有非常强的细胞保护作用，并且发挥出诱导心肌细胞增殖的特异的性质。

实施例8：使用来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞形成细胞块时最适的培养基组成

实施例7中明确了：在无血清条件下，添加了ITS和bFGF的培养基具有非常强的细胞保护作用，并且发挥出诱导心肌细胞增殖的特异的性质。因此，本实施例是以明确构成bFGF或ITS溶液的成分之一的胰岛素对于细胞块的直径增加具有何种作用为目的而进行的。

基本地，除了作为培养基使用仅α-MEM、α-MEM+50ng/ml bFGF、α-MEM+10μg/ml胰岛素+5ng/ml bFGF、α-MEM+1μg/ml胰岛素+l ng/ml bFGF以外，与实施例7同样地进行实验。

其结果可见，对6天后的来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞块进行观察时，与仅α-MEM的情况下的细胞块相比，在α-MEM+50ng/ml bFGF、α-MEM+10μg/ml胰岛素+5ng/ml bFGF、α-MEM+1μg/ml胰岛素+1ng/ml bFGF任一者中均可以看到显著的细胞块的直径增加(图7的B))。此外，心肌细胞的收缩活性也强，发现与实施例7中添加了ITS的情况相同的对于收缩活性的效果。

由此可见，在无血清条件下，添加了bFGF、或胰岛素+bFGF的培养基具有非常强的细胞保护作用，并且可以发挥出诱导心肌细胞增殖的特异的性质。

实施例9：平面黏附培养体系中，无血清和bFGF对来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞的作用

按照实施例1，对来源于小鼠胚胎干细胞的心肌细胞进行纯化。将经纯化的心肌细胞在用纤连蛋白包被的细胞培养用板中接种相同数量的细胞，用各种培养基进行平面黏附培养。所谓的各种培养基是指，全部使用α-MEM作为基础培养基、并添加了10％FBS、10％FBS+50ng/ml bFGF、10％KSR(Knockout血清替代品：Invitrogen)、ITS、ITS+50ng/ml bFGF的培养基。对在这些条件下接种的细胞培养共计5天后，分别进行拍照(图8的A))。其结果为，在无血清ITS、ITS+bFGF组中，与10％FBS添加组或10％KSR添加组相比，细胞存活率显著低(图8的B))。

实施例10：来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞向免疫缺陷小鼠心肌组织内的移植和存活率的测量

首先，为了测量不适用再聚集法时的来源于小鼠胚胎干细胞的纯化心肌细胞的存活率，进行了以下实验。

将共计2×10⁵个细胞移植到免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)的左心室游离壁内。对小鼠用乙醚进行麻醉诱导，将含有2％异氟烷(Forane)的空气通过人工呼吸器对小鼠进行持续地处理。使小鼠在深度麻醉下切开胸廓(第3肋间)，用镊子弄破心包，露出心脏。用带有30G针的注射器吸入含有心肌细胞块的生理盐水30μl。将注射针自心尖部沿心脏游离壁内向心底部推进3mm左右并进行注入。移植后迅速闭合胸廓，待自发搏动恢复后，放回笼中。

移植3周后，灌流固定心脏，供于冰冻切片。用抗肌节辅肌动蛋白抗体对切片进行免疫染色，得到荧光显微镜像(图9的A))。其结果为，几乎无法发现存活的移植细胞，勉强发现了作为示踪剂的红色染料的反应(图9的A)、图9的D))。

其次，将在实施例7中记载的无血清条件下构筑的由2000个细胞组成的心肌细胞块、共计2×10⁵个细胞移植到免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)的左心室游离壁内。与上述实验同样地实施移植，移植3周后，灌流固定心脏，供于冰冻切片。用抗肌节辅肌动蛋白抗体对切片进行免疫染色，得到荧光显微镜像(图10)。通过荧光显微镜像，计算出1个细胞块中所含有在宿主心脏组织中存活的细胞数。

其结果可知，移植后的细胞块为恰好由2000个心肌细胞组成时，有92.05±11.1％的心肌细胞存活(n＝4)(图11的(A)和(B))。与此相对，直接注入被分散开的纯化细胞时，未能发现存活细胞。该结果表示获得了移植后存活率从0％至92％急剧升高的结果。

进而为了确认长期移植中的心肌细胞变化，在移植后3周、8周时进行了心脏的免疫染色的调查。其结果，与移植前的心肌细胞(图11的(C)的“前”)相比，在移植后3周、8周时，心肌细胞细胞质体积显著增加，并且，移植心肌细胞与宿主的心肌细胞排列并存在于同一方向(图11的(C)和(D))。这表示移植后的心肌细胞块在被移植后的心脏组织内成熟。

实施例11：使用来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞制备细胞块

本实施例是以在无血清、或无血清并添加了ITS或KSR的条件下制备来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞块为目的而进行的。

即，除了使用无血清培养基(图12的A))、或者无血清培养基中添加了10％KSR(图12的B))或ITS(图12的C))外，按照实施例3，制备来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞块。培养开始后12小时或3天后所构筑的细胞块如图12所示。

实施例12：使用来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞块构建具有厚度的细胞片

将实施例11中制备的来源于绒猴胚胎干细胞的纯化心肌细胞块成同一平面状地进行悬浮培养。该悬浮培养后的心肌细胞块在0～12小时内随着时间的推移细胞块之间接合，恰好构成具有厚度的细胞片。该实施例为为了验证方法而进行的模型实验，在实际的应用形态中，使用任意数量的具有任意大小的来源于纯化胚胎干细胞的心肌细胞块，可以构筑任意大小的细胞片(图13)。此外，若改变所使用的细胞块的大小，则可以形成任意厚度的细胞片。

实施例14：使用来源于小鼠诱导多能性干细胞(iPS)细胞的纯化心肌细胞制备细胞块

本实施例是以在无血清条件下、或者在无血清条件下添加了ITS或KSR的条件下制备来源于小鼠iPS细胞的纯化心肌细胞块为目的而进行的。

小鼠iPS细胞由京都大学再生医科学研究所转让。小鼠iPS细胞的心肌细胞分化与实施例1同样地进行。此时，构成1个胚状体的初期细胞数以1000个最适宜。

图14的(A)表示以纯化为目的用线粒体指示剂TMRM进行FACS分析的结果。图中的方形表示心肌细胞的区域。对如此纯化后的心肌细胞进行黏附培养，并进行免疫染色(辅肌动蛋白、Nkx2.5)，结果如图14的(B)所示。由此显示形成了小鼠iPS-诱导心肌细胞的聚集块，因此，由FACS筛分出的细胞级分中含有几乎100％的心肌细胞。此外，在图14的(C)中，表示了将经纯化的心肌细胞接种到细胞非黏附性的96孔培养板中24小时后的状态。此种情况下使用无血清培养基。其结果可知，即使是来源于小鼠iPS细胞的纯化心肌细胞，也可以通过本方法构筑细胞块。

产业上的可利用性

根据本发明可以发现如下特性：通过单细胞化而纯化的来源于胚胎干细胞的心肌细胞，在无血清条件下进行培养时，具有聚集的能力。通过采用本发明的方法来构筑细胞块，可以得到维持较高的该心肌细胞的存活率或增殖能力，同时又可以长时间培养的方法。进而发现，将该细胞移植到个体(生物体)的心脏组织时，在心脏组织中的存活率飞跃性升高，无需将心肌细胞与非心肌细胞混合就可以使其在心脏组织内长时间存活。即，根据本发明，能以高的可能性提供移植用的心肌细胞；以及提供心脏移植以外的心脏疾病的细胞治疗方法，即利用移植体外制得的心肌细胞而治疗心脏病；以及提供包含心肌细胞的细胞块的医疗器械。

Claims

1.一种制备实质上由来源于多能干细胞的心肌细胞形成的细胞块的方法，其特征在于，将心肌细胞用无血清条件下的培养基在细胞非黏附性圆底孔中进行培养，并使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由除了来源于人类胚胎的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞以外的多能干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集状态的细胞块分散并单细胞化，从单细胞化的细胞中纯化心肌细胞从而得到的来源于多能干细胞的经纯化的心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，多能干细胞选自除了来源于人类胚胎的干细胞的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞和诱导多能性干细胞所组成的组。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，培养基中含有胰岛素。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，培养基中含有选自转铁蛋白、硒、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)和内皮素-1(ET-1)所组成的物质组中的至少一种物质。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，培养基中，胰岛素含量为0.1～10mg/L、转铁蛋白含量为0.1～10μg/L、硒含量为0.1～10μg/L、碱性成纤维细胞生长因子含量为1ng/ml～100ng/ml、上皮生长因子含量为1ng/ml～1000ng/ml、血小板源性生长因子含量为1ng/ml～1000ng/ml、内皮素-1(ET-1)含量为1×10^-8～1×10^-6M。

6.根据权利要求1所述的方法制备的心肌细胞的细胞块在制备心脏病治疗药物中的用途，其特征在于，使单细胞化并经纯化的来源于多能干细胞的心肌细胞聚集得到细胞块，将所得到的细胞块移植到个体的心脏组织中并使其存活。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，多能干细胞选自除了来源于人类胚胎的干细胞的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞和诱导多能性干细胞所组成的组。

8.根据权利要求6所述的用途，其中，心肌细胞块由权利要求1～5中任一项所述的方法而得到。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的用途，其中，移植包括将心肌细胞块注入心脏组织内。

10.根据权利要求6～8中任一项所述的用途，其中，移植包括将片状细胞块移植到心脏组织上。

11.一种片状细胞块的制备方法，其特征在于，将根据权利要求1所述方法制备的心肌细胞块，以细胞块之间保持接触的状态无间隙地排列并接种在被壁面隔开的细胞非黏附性容器的表面，进行悬浮培养，并将该培养进行到细胞块之间接合且具有50～300μm之间的任意厚度。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，多能干细胞选自除了来源于人类胚胎的干细胞的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞和诱导多能性干细胞所组成的组。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，心肌细胞块由权利要求1～5中任一项所述的方法而得到。

14.将根据权利要求1或11所述的方法制备的细胞块用于医疗器械的用途，其特征在于，所述医疗器械用于将下述细胞块移植到个体的心脏组织中并使其存活，该医疗器械包含来源于多能干细胞的心肌细胞的细胞块，该细胞块如下制备：将心肌细胞用无血清条件下的培养基进行培养，并使该细胞聚集，所述心肌细胞为如下的心肌细胞：使包含由除了来源于人类胚胎的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞以外的多能干细胞分化、诱导出的心肌细胞的、聚集状态的细胞块分散并单细胞化，从单细胞化的细胞中纯化心肌细胞从而得到的来源于多能干细胞的经纯化的心肌细胞。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，多能干细胞选自除了来源于人类胚胎的干细胞的胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、种系干细胞和诱导多能性干细胞所组成的组。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中，移植包括将心肌细胞块注入心脏组织内。

17.根据权利要求14或15所述的用途，其中，移植包括将片状细胞块移植到心脏组织上。