WO2018074457A1 - 未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法 - Google Patents

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fatty acid
cell
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周吾 遠山
恵一 福田
藤田 淳
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    • C12N2506/45Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to an undifferentiated stem cell removing agent and an undifferentiated stem cell removing method. Moreover, it is related with the culture medium containing the said undifferentiated stem cell removal agent, the manufacturing method of the cell for transplant, and pharmaceutical composition.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-203839 filed in Japan on October 17, 2016, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) has been promoted. Since these cells have pluripotency, it is becoming possible to produce cells that have been differentiated and induced to differentiate into a desired lineage and can be used in transplantation medicine.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Differentiation and induction of embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells are usually performed in vitro.
  • in vitro it is difficult to induce differentiation of a desired lineage for all stem cells, and undifferentiated stem cells may remain in part after differentiation / induction operations.
  • undifferentiated stem cells have proliferative activity and can differentiate into many types of cells, and thus may form teratomas when transplanted in vivo (see, for example, Non-Patent Document 1). .
  • Non-Patent Documents 2 to 4 methods have been reported that can selectively remove undifferentiated stem cells in culture conditions.
  • the research group of the present inventors has also developed a method for selecting cardiomyocytes from non-cardiomyocytes and undifferentiated stem cells (see Patent Documents 1 to 6 and Non-Patent Document 5).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide an undifferentiated stem cell removing agent and an undifferentiated stem cell removing method that enable highly efficient removal of undifferentiated stem cells.
  • the present inventors have cultivated undifferentiated stem cells in the presence of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, or a cholesterol synthesis inhibitor, thereby undifferentiated. It has been found that cell death of stem cells can be induced, and the present invention has been completed.
  • An undifferentiated stem cell removing agent comprising at least one selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor.
  • the fatty acid synthesis inhibitor inhibits fatty acid synthesis targeting at least one factor selected from the group consisting of ATP citrate lyase, fatty acid synthase, acetyl-CoA carboxylase, and malonyl-CoA decarboxylase.
  • the fatty acid utilization inhibitor inhibits fatty acid utilization by targeting carnitine palmitoyltransferase 1;
  • the undifferentiated stem cell removing agent according to [1].
  • the undifferentiated stem cell removing agent according to any one of the above [1] to [5], comprising at least one compound selected from the group consisting of glucose, glutamine, and methionine.
  • An undifferentiated stem cell removing agent comprising one or more selected from the group consisting of orlistat, C75, LY294002, SB204990, etomoxyl, perhexiline, and simvastatin, and salts thereof.
  • a medium containing the agent for removing undifferentiated stem cells according to any one of [1] to [7].
  • a method for producing cells for transplantation comprising the following steps (i) and (ii): (I) a step of inducing a desired differentiated cell from an undifferentiated stem cell; and (ii) a cell mixture obtained by the step (i) is an unrepresented in any one of [1] to [7] A step of culturing in the presence of a differentiation stem cell removing agent.
  • the agent for removing undifferentiated stem cells of the present invention it is possible to remove undifferentiated stem cells with high efficiency.
  • the method for removing undifferentiated stem cells of the present invention it is possible to remove undifferentiated stem cells with high efficiency.
  • Experimental example 1 it is an image which shows the result of a comparison of the expression of FASN of a human iPS cell origin cardiomyocyte and an iPS cell.
  • 4 is an image of an undifferentiated stem cell line cultured in Experimental Example 2.
  • 4 is an image of an undifferentiated stem cell line cultured in Experimental Example 3.
  • 6 is an image of purified purified cardiomyocytes cultured in Experimental Example 4.
  • 10 is an image of fibroblasts cultured in Experimental Example 5.
  • 7 is an image of a cell mixture cultured in Experimental Example 6 and containing human iPS cell-derived cardiomyocytes and human iPS cells.
  • Experimental example 6 it is a graph which shows the result of having compared the number of Oct4 positive colonies in the cell mixture cultured by the culture medium which does not contain the fatty acid synthesis inhibitor and the culture medium. It is a figure explaining the outline of the synthetic
  • Experimental Example 7 it is an image showing the results of comparison of FASN expression between human iPS cell-derived cardiomyocytes and human iPS cells.
  • Experimental example 7 it is the photograph of the western blotting which shows the result of the comparison of the expression of FASN of a human iPS cell origin cardiomyocyte and a human iPS cell.
  • 10 is an image of an undifferentiated stem cell line cultured in Experimental Example 8.
  • undifferentiated stem cells are used as a concept including pluripotent stem cells having differentiation pluripotency, and include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (induced pluripotent cells).
  • stem cells iPS cells
  • the “undifferentiated stem cell” is not particularly limited as long as it is a cell having differentiation pluripotency, and includes an unknown cell having the same properties as the ES cells and iPS cells exemplified above.
  • Whether a cell is an undifferentiated stem cell can be determined from the presence or absence of a property specific to the undifferentiated stem cell, the expression of various markers specific to the undifferentiated stem cell, and the like.
  • a property specific to an undifferentiated stem cell includes a property that has a self-replicating ability and can be differentiated into another type of cell having a property different from that of an undifferentiated stem cell.
  • teratoma formation ability, chimera mouse formation ability, and the like can be mentioned as properties specific to undifferentiated stem cells.
  • undifferentiated stem cell markers are factors that are specifically expressed in undifferentiated stem cells. For example, Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA-1 SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, Lin28, Fbx15, and the like. When expression of at least one of these undifferentiated stem cell markers is observed, the cell can be determined as an undifferentiated stem cell.
  • An undifferentiated stem cell marker may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type.
  • a cell expressing Oct3 / 4 may be determined as an undifferentiated stem cell. The expression of the undifferentiated stem cell marker in the cells can be confirmed using a known method such as RT-PCR or microarray.
  • the undifferentiated stem cell may be a mammalian undifferentiated stem cell, a rodent undifferentiated stem cell, a primate undifferentiated stem cell, or a human undifferentiated stem cell. Good.
  • human-derived undifferentiated stem cells can be mentioned, and more specific examples include human iPS cells and human ES cells.
  • differentiated cells refer to cells that do not have the properties of the “undifferentiated stem cells”.
  • a differentiated cell may be a cell derived or differentiated from an undifferentiated stem cell, but does not have differentiation pluripotency.
  • differentiated cells for example, cells differentiated from ES cells and cells differentiated from iPS cells may be used.
  • differentiated cells include cardiomyocytes, muscle cells, fibroblasts, nerve cells, immune cells such as lymphocytes, ocular cells such as vascular cells and retinal pigment epithelial cells, blood cells such as megakaryocytes and erythrocytes, and other various cells. Examples thereof include tissue cells and their progenitor cells.
  • the present invention provides an agent for removing undifferentiated stem cells.
  • the undifferentiated stem cell removing agent of the present embodiment contains at least one selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol inhibitor.
  • the present inventors have found that cell death can be induced when a fatty acid synthesis inhibitor or a fatty acid degradation inhibitor (a fatty acid utilization inhibitor) is brought into contact with an undifferentiated stem cell. It was. For this reason, the present inventors have found that the fatty acid synthesis pathway is enhanced in human iPS cells (undifferentiated stem cells). Presumably, the fatty acid synthesis pathway and its metabolic pathway are very important for the survival of undifferentiated stem cells. Therefore, it is considered that cell death is induced in undifferentiated stem cells by inhibiting fatty acid synthesis or fatty acid degradation. Furthermore, the present inventors have found that cell death can be induced when a cholesterol synthesis inhibitor is brought into contact with undifferentiated stem cells.
  • Cholesterol is a component of the cell membrane, and the cholesterol synthesis pathway is considered to be very important for the survival of undifferentiated stem cells. Therefore, it is considered that cell death is induced in undifferentiated stem cells by inhibition of cholesterol synthesis. Further, even when a cell population in which undifferentiated stem cells remain is transplanted in vivo, by administering a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor or a cholesterol synthesis inhibitor to the living body, The undifferentiated stem cells can be selectively removed.
  • the “fatty acid utilization inhibitor” has a function of inhibiting a reaction of a metabolic pathway related to synthesis of a substance utilizing a fatty acid and / or a function of inhibiting a reaction of a metabolic pathway related to decomposition of a fatty acid. is there.
  • the “fatty acid utilization inhibitor” includes a “fatty acid degradation inhibitor” that inhibits a reaction of a metabolic pathway related to the degradation of the fatty acid.
  • a metabolic pathway relating to fatty acid degradation a metabolic pathway relating to ⁇ -oxidation is preferred.
  • the fatty acid utilization inhibitor is preferably a “fatty acid metabolism inhibitor related to ⁇ -oxidation”. Examples of fatty acid metabolism related to ⁇ -oxidation include ⁇ -oxidation, synthesis of fatty acid metabolites used for ⁇ -oxidation, and incorporation of fatty acid metabolites used for ⁇ -oxidation into mitochondria.
  • a metabolic pathway relating to the synthesis of a substance using fatty acids a metabolic pathway relating to the synthesis of triglyceride and / or phospholipid is preferable.
  • the fatty acid utilization inhibitor is preferably a “fatty acid metabolism inhibitor related to synthesis of triglycerides and / or phospholipids”.
  • the types of these inhibitors are not particularly limited, and may be any substance having a function of inhibiting fatty acid synthesis, inhibiting fatty acid utilization, or inhibiting cholesterol synthesis, and may be an organic substance or an inorganic substance.
  • an organic substance an organic compound is preferable, and low molecular compounds, nucleic acids, peptides, proteins and the like can be exemplified.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the outline of fatty acid synthesis pathway and fatty acid degradation (fatty acid utilization) pathway in the cytoplasm of natural cells.
  • Acetyl-CoA acetyl-CoA
  • ALY ATP citrate lyase
  • Fatty-CoA fatty acid synthase
  • Fatty acid FA
  • FASN acid synthase
  • ACC Acetyl-CoA carboxylase
  • Malonyl-CoA decarboxylase catalyzes the production of acetyl-CoA from malonyl-CoA.
  • the synthesized fatty acid becomes fatty acid acyl-CoA (FA-CoA) by the action of acyl CoA synthetase (ACS), and then undergoes several reactions, resulting in carnitine palmitoyltransferase 1 (carnitine palmitoyltransferase 1).
  • FA-CoA fatty acid acyl-CoA
  • ACS acyl CoA synthetase
  • -1 transported into mitochondria by CPT1) and used for ⁇ -oxidation.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid synthesis by completely or partially inhibiting any reaction in the fatty acid synthesis pathway shown in FIG.
  • the fatty acid synthesis inhibitor according to the present embodiment targets fatty acid synthesis by targeting at least one factor selected from the group consisting of ATP citrate lyase, fatty acid synthase, acetyl-CoA carboxylase, and malonyl-CoA decarboxylase. It may be.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid synthesis targeting at least one factor selected from the group consisting of ATP citrate lyase, fatty acid synthase, and acetyl-CoA carboxylase.
  • ATP citrate lyase, and fatty acid synthesis may be targeted with at least one factor selected from the group consisting of fatty acid synthase.
  • the fatty acid degradation inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid degradation by completely or partially inhibiting any reaction in the fatty acid degradation pathway related to ⁇ -oxidation shown in FIG.
  • the fatty acid degradation inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid degradation by targeting carnitine palmitoyltransferase 1 as a target.
  • Fatty acids are used for ⁇ -oxidation and also for synthesis of triglycerides and phospholipids.
  • Fatty acyl-CoA is used for the synthesis of lysophosphatidic acid (LPA) by glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT).
  • LPA lysophosphatidic acid
  • GPAT glycerol-3-phosphate acyltransferase
  • fatty acyl-CoA is used for the synthesis of phosphatidic acid (PA) by acylglycerol-3-phosphate acyltransferase (AGPAT).
  • fatty acyl-CoA is used for synthesis of diacylglycerol (DAG, DG) by phosphatidate phosphatase (PAP).
  • fatty acid acyl-CoA is used for synthesis of triglyceride by diacylglycerol acyltransferase (DGAT). Furthermore, fatty acyl-CoA is also decomposed into fatty acid and glycerol by monoacylglycerol lipase (MAGL).
  • the fatty acid utilization inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid utilization by completely or partially inhibiting the reaction of any of these pathways utilizing fatty acids.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining the outline of the cholesterol synthesis pathway.
  • Acetoacetyl-CoA (acetoacetyl-CoA) is synthesized from acetyl-CoA (acetyl-CoA) by acetyl-CoA acetyltransferase (Acetyl-CoA).
  • acetoacetyl-CoA hydroxymethylglutaryl-CoA synthase 1 (hydroxymethylglutaryl-CoA Syntase 1: HMG-CoA Syntase 1) produces hydroxymethylglutaryl-CoA (hydromethylglutaryl-CoA: HMG).
  • Mevalonate is synthesized from HMG-CoA by hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase). After several reactions, cholesterol is synthesized as a result.
  • the cholesterol synthesis inhibitor of this embodiment may inhibit cholesterol synthesis by completely or partially inhibiting any reaction of the cholesterol synthesis pathway shown in FIG.
  • the cholesterol synthesis inhibitor of this embodiment may inhibit cholesterol synthesis by targeting at least one factor selected from the group consisting of acetyl CoA acetyltransferase, HMG-CoA synthase, and HMG-CoA reductase.
  • the cholesterol synthesis inhibitor of the present embodiment may inhibit cholesterol synthesis using HMG-CoA reductase as a target.
  • the fatty acid synthesis inhibitor can be used alone or in combination of two or more.
  • the fatty acid utilization inhibitor can be used alone or in combination of two or more.
  • Cholesterol synthesis inhibitors can be used alone or in combination of two or more.
  • the undifferentiated stem cell removing agent can contain one or more fatty acid synthesis inhibitors in combination.
  • the undifferentiated stem cell removing agent can contain one or more fatty acid utilization inhibitors in combination.
  • the undifferentiated stem cell removing agent can contain one or more cholesterol synthesis inhibitors in combination.
  • the undifferentiated stem cell removing agent can contain one or two or more selected from the group consisting of fatty acid synthesis inhibitors, fatty acid utilization inhibitors, and cholesterol synthesis inhibitors.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid synthesis using a fatty acid synthase as a target.
  • fatty acid synthesis inhibitors that target fatty acid synthetase to inhibit fatty acid synthesis include orlistat, C75, flavonoise, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), and the like, with orlistat and C75 being preferred.
  • Orlistat and C75 commercially available products can be used.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of this embodiment may be a salt or derivative of these compounds as long as it has a function equivalent to orlistat or C75.
  • Orlistat is a compound represented by the following formula (1) (N-formyl-L-leucine- (1S) -1-[[(2S, 3S) -3-hexyl-4-oxo-2-oxyethyl] methyl]. known as dodecyl'ester).
  • C75 is known as a compound represented by the following formula (2) (tetrahydro-4-methylene-2R-octyl-5-oxo-3S-furancarboxylic acid).
  • the fatty acid synthesis inhibitor according to the present embodiment may inhibit fatty acid synthesis using ATP citrate lyase as a target.
  • LY294002 and SB204990 are preferably mentioned as fatty acid synthesis inhibitors that target ATP citrate lyase to inhibit fatty acid synthesis.
  • LY294002 and SB204990 commercially available products can be used.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of this embodiment may be a salt or derivative of these compounds as long as it has a function equivalent to that of LY294002 or SB204990.
  • the fatty acid degradation inhibitor of the present embodiment may be one that inhibits fatty acid degradation by targeting carnitine palmitoyltransferase 1 as a target.
  • Examples of the fatty acid degradation inhibitor that targets carnitine palmitoyltransferase 1 and inhibits fatty acid degradation include etomoxil, perhexiline, and ranolazine, and etomoxyl and perhexiline are preferred. Commercially available etomoxyl and perhexiline can be used.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of the present embodiment may be a salt or derivative of these compounds as long as it has a function equivalent to etomoxyl or perhexiline.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid synthesis using acetyl-CoA carboxylase as a target.
  • fatty acid synthesis inhibitors that inhibit fatty acid synthesis by targeting acetyl-CoA carboxylase include Soraphen A, TOFA, A769662, Metformin, AICAR, and the like, with TOFA and A76962 being preferred.
  • TOFA and A76962 can be used.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of this embodiment may be a salt or derivative of these compounds as long as it has a function equivalent to TOFA or A76962.
  • the fatty acid synthesis inhibitor of the present embodiment may inhibit fatty acid synthesis using acyl CoA synthase as a target.
  • acyl CoA synthase examples include triacsin C (Triascin C), TZDs, and the like.
  • SREBP is known as a transcription factor that controls the expression of the above-mentioned ATP citrate lyase, acetyl-CoA carboxylase, fatty acid synthase, glycerol-3-phosphate acyltransferase, acyl CoA synthase, and the like.
  • the fatty acid synthesis inhibitor and / or fatty acid utilization inhibitor of the embodiment may be one that inhibits the function of SREBP, and examples thereof include fatostatin and FGH110019.
  • the cholesterol synthesis inhibitor of this embodiment may be one that inhibits cholesterol synthesis using HMG-CoA reductase as a target.
  • Cholesterol synthesis inhibitors that target HMG-CoA reductase and inhibit cholesterol synthesis include pravastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, pitavastatin, pitavastatin, rosuvastatin rosvastatin (Cerivastatin), lovastatin (Levastatin), mevastatin (Mevastatin) and the like, and pravastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, pitavastatin, rosuvastatin are preferable, and simvastatin is more preferable.
  • the cholesterol synthesis inhibitor of this embodiment may be a salt or derivative of these compounds as long as it has a function equivalent to pravastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, pitavastatin, and rosuvastatin.
  • the undifferentiated stem cell removing agent of the embodiment may contain one or more selected from the group consisting of orlistat, C75, LY294002, SB204990, etomoxyl, perhexiline, simvastatin, and salts thereof.
  • the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor contained in the application target may be 0.1 to 500 ⁇ M.
  • M as a unit means mol / L.
  • in the application target means in the medium or blood.
  • the concentration of the fatty acid utilization inhibitor contained in the application target of the agent for removing undifferentiated stem cells of the present embodiment may be 0.1 to 500 ⁇ M.
  • the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor contained in the application target of the agent for removing undifferentiated stem cells of this embodiment may be 0.1 to 500 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the fatty acid utilization inhibitor contained in the application target of the undifferentiated stem cell removing agent of the present embodiment may be 0.1 to 500 ⁇ g / mL.
  • the undifferentiated stem cell removing agent of this embodiment may have a concentration of the cholesterol synthesis inhibitor contained in the application target of 0.01 to 50 ⁇ M.
  • the concentration of the cholesterol synthesis inhibitor contained in the application target of the agent for removing undifferentiated stem cells of this embodiment may be 0.01 to 50 ⁇ g / mL.
  • the concentration of orlistat in the application target is preferably 0.1 to 500 ⁇ M, more preferably 1 to 50 ⁇ M, and even more preferably 3 to 15 ⁇ M.
  • the concentration of C75 in the application target is preferably 0.1 to 500 ⁇ g / mL, more preferably 1 to 100 ⁇ g / mL, and further 5 to 50 ⁇ g / mL. preferable.
  • the concentration of SB204990 in the application target is preferably 0.1 to 500 ⁇ M, more preferably 1 to 200 ⁇ M, and even more preferably 20 to 100 ⁇ M.
  • the concentration of LY294002 in the application target is preferably 0.1 to 500 ⁇ M, more preferably 1 to 200 ⁇ M, and further preferably 20 to 100 ⁇ M.
  • the concentration of etomoxyl in the application target is preferably 0.1 to 500 ⁇ M, more preferably 1 to 200 ⁇ M, and further preferably 20 to 100 ⁇ M. preferable.
  • the concentration of perhexiline in the application target is preferably 0.1 to 500 ⁇ M, more preferably 1 to 100 ⁇ M, and further 5 to 50 ⁇ M. preferable.
  • the concentration of simvastatin in the application target is preferably 0.01 to 50 ⁇ M, more preferably 0.1 to 30 ⁇ M, and still more preferably 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the fatty acid synthesis inhibitor according to the present embodiment and the undifferentiated stem cell come into contact, the fatty acid synthesis inhibitor is taken into the cytoplasm of the undifferentiated stem cell, and the reaction in any of the fatty acid synthesis pathways shown in FIG. It will be inhibited.
  • the fatty acid degradation inhibitor according to the present embodiment and the undifferentiated stem cell come into contact with each other, the fatty acid degradation inhibitor is taken into the cytoplasm and / or mitochondria of the undifferentiated stem cell, and any reaction in the fatty acid degradation pathway shown in FIG. Or it will be partially inhibited.
  • the cholesterol synthesis inhibitor according to this embodiment and the undifferentiated stem cells come into contact, the cholesterol synthesis inhibitor is taken into the cytoplasm of the undifferentiated stem cells, and the reaction of any of the cholesterol synthesis pathways shown in FIG. 9 is completely or partially performed. It will be inhibited.
  • the undifferentiated stem cell removal agent of this embodiment should just contain at least 1 type chosen from the group which consists of a fatty-acid synthesis inhibitor, a fatty-acid utilization inhibitor, and a cholesterol-synthesis inhibitor.
  • the undifferentiated stem cell removing agent of the present embodiment may be composed of at least one selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor, and has an ability to remove undifferentiated stem cells. As long as it has, it may contain other arbitrary components.
  • the dosage form of the undifferentiated stem cell removing agent of the present embodiment is not particularly limited, and may be various forms such as a liquid, a powder, a granule, a gel, and a solid.
  • the form of the emulsion which enclosed the fatty acid synthesis inhibitor, the fatty-acid utilization inhibitor, the cholesterol synthesis inhibitor, or these combination in the micelle, and the liposome form enclosed in the liposome may be sufficient.
  • Administration to a patient can be performed, for example, parenterally or orally by methods known to those skilled in the art.
  • parenteral administration methods include intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection and the like, as well as intranasal, transbronchial, intramuscular, or transdermal administration.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • a patient who has undergone transplantation of a differentiated cell tissue derived from undifferentiated stem cells can remove the undifferentiated stem cells remaining in the differentiated cell tissue in vivo by administering the undifferentiated stem cell removing agent of this embodiment. Can do. Thereby, a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells such as canceration of a transplanted tissue can be prevented or treated.
  • the agent for removing undifferentiated stem cells of the present embodiment includes a medium, a method for removing undifferentiated stem cells, a method for producing cells for transplantation, a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells, and It can be used in a method for treating or preventing a disease caused by proliferation of differentiated stem cells.
  • the undifferentiated stem cells to be removed by the undifferentiated stem cell removing agent of the present embodiment are not particularly limited, but are preferably iPS cells or ES cells, and more preferably iPS cells.
  • the present invention provides a culture medium.
  • the culture medium of this embodiment contains the undifferentiated stem cell removal agent of the said embodiment.
  • the medium of this embodiment can be used for cell culture.
  • “culturing” means raising or growing cells outside a living body (individual), and includes handling cells in a so-called in vitro.
  • the “medium” refers to a liquid or solid substance that provides the culture environment to cells.
  • the medium of the present embodiment is, for example, any medium component and at least one selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor (hereinafter referred to as “fatty acid synthesis inhibitor etc.”).
  • a composition comprising
  • the culture medium of this embodiment is a composition containing a medium, a fatty acid synthesis inhibitor, and the like.
  • the medium include water and a buffer solution.
  • the medium may dissolve or disperse a fatty acid synthesis inhibitor or the like.
  • the medium component may contain components effective for cell growth, and examples of such components include various components such as amino acids, vitamins, inorganic salts, sugars, and growth factors.
  • the remaining components excluding the fatty acid synthesis inhibitor and the like from the medium of the present embodiment are general cell culture mediums conventionally used as a medium [for example, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), MEM medium (for example, ⁇ -MEM, MEM [Hank's BSS]), RPMI medium (for example, RPMI 1640), F12 medium, StemPro34, mTeSR1, etc.].
  • the component has the same composition as a general cell culture medium used as an undifferentiated stem cell maintenance medium [for example, StemFit medium, mTeSR (registered trademark) Essential 8 (registered trademark) medium, StemSure (registered trademark) medium, etc.] It is good.
  • the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor or the like in the medium of the present embodiment may be the same as the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor or the like in the application target in the undifferentiated stem cell removing agent described above.
  • the culture medium of this embodiment contains a fatty acid synthesis inhibitor or the like at the above concentration, undifferentiated stem cells can be effectively removed.
  • an undifferentiated stem cell and a differentiated cell coexist, an undifferentiated stem cell can be removed, making the growth of a differentiated cell favorable.
  • the medium of the present embodiment preferably does not contain fatty acids. Moreover, it is preferable not to contain the precursor (refer FIG. 1) of the fatty acid synthesis located downstream of the target of the fatty acid synthesis inhibitor used so that a fatty acid may not be biosynthesized. Moreover, it is preferable not to contain the substance located downstream of the target of the fatty-acid utilization inhibitor used so that a fatty acid may not be utilized. Moreover, it is preferable that the culture medium of this embodiment does not contain cholesterol. Further, it is preferable not to contain a precursor of cholesterol synthesis located downstream of the target of the cholesterol synthesis inhibitor used so that cholesterol is not biosynthesized.
  • the medium of this embodiment may contain at least one compound selected from the group consisting of glucose, glutamine, and methionine. It is said that cell death of undifferentiated stem cells can also be induced by culturing undifferentiated stem cells in a medium not containing these compounds.
  • the medium of the present embodiment contains a fatty acid synthesis inhibitor and the like, even if it contains at least one compound selected from the group consisting of glucose, glutamine, and methionine, it has the ability to remove undifferentiated stem cells. Good performance.
  • it may contain glucose, glutamine, and methionine, it is expected that cell growth will be better than when these components are not contained.
  • the present invention provides at least one use selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor for the production of an undifferentiated stem cell removing agent. To do. *
  • kits comprising the undifferentiated stem cell removing agent of the above embodiment.
  • the kit of this embodiment further comprises reagents for inducing differentiated cells from undifferentiated stem cells, media, cell culture equipment, instructions for use, etc. in addition to the undifferentiated stem cell removing agent of the above embodiment. May be.
  • Reagents for inducing differentiated cells can be appropriately selected according to the differentiated cells to be induced.
  • Reagents for inducing cardiomyocytes include, for example, chromosomal DNA demethylating agents such as demethylase, 5-azacytidine, DMSO; PDGF, fibroblast growth factor 8 (FGF-8), endothelin 1 (ET1), Cytokines such as midkine and bone morphogenetic factor 4 (BMP-4), G-CSF; adhesion molecules such as gelatin, laminin, collagen, fibronectin; vitamins such as retinoic acid; Nkx2.5 / Csx, GATA4, MEF- Transcription factors such as 2A, MEF-2B, MEF-2C, MEF-2D, dHAND, eHAND, TEF-1, TEF-3, TEF-5 and MesP1; cardiomyocyte-derived extracellular matrix; noggin, chodin, fetuin, Follistatin, sclerostin, dan, cerberus, Remurin, there may be mentioned a BMP antagonist such as Dante
  • Examples of the medium include Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), MEM medium ( ⁇ -MEM, MEM [Hank's Bss], etc.), RPMI medium (RPMI 1640, etc.), F12 medium, StemPro34 , MTeSRI, StemFit medium, mTeSR Essential 8 medium, StemSure medium, and the like, but are not limited thereto.
  • examples of the cell culture instrument include a cell culture plate, but are not limited thereto.
  • the kit of the present embodiment can be suitably used for a method for removing undifferentiated stem cells described later, and can further include instructions for explaining the method for removing undifferentiated stem cells.
  • the undifferentiated stem cell removing agent of the above embodiment as a kit with reagents, instructions and the like used for the undifferentiated stem cell removing method, the undifferentiated stem cell removing method can be carried out more easily and in a short time.
  • the present invention provides a method for removing undifferentiated stem cells, comprising culturing a cell mixture containing undifferentiated stem cells and differentiated cells in the presence of an agent for removing undifferentiated stem cells.
  • the undifferentiated stem cell removal agent used for the undifferentiated stem cell removal method of this embodiment is the undifferentiated stem cell removal agent of the said embodiment.
  • the “cell mixture” is a cell population containing two or more types of cells.
  • the “cell mixture” may contain two or more types of cells, medium components, and the like.
  • the “cell mixture containing undifferentiated stem cells and differentiated cells” includes one or more undifferentiated stem cells and one or more differentiated cells, and may optionally include a medium component or the like.
  • the form of the cell mixture containing undifferentiated stem cells and differentiated cells is not particularly limited, and is an aggregated state, a dispersed state, a state adhered to a culture vessel, a state adhered to an adhesion factor such as an extracellular matrix, a sheet, a block, a colony , Embryoid bodies, cell masses, tissues, organs and the like.
  • differentiated cells When differentiation / induction treatment is performed on undifferentiated stem cells, differentiated cells are induced from undifferentiated stem cells. However, in vitro, it is difficult to induce all undifferentiated stem cells into differentiated cells. Normally, undifferentiated stem cells remain and a cell mixture of undifferentiated stem cells and differentiated cells is formed. In the method of this embodiment, only undifferentiated stem cells can be selectively removed from such a cell mixture of undifferentiated stem cells and differentiated cells. In the method of this embodiment, the cell mixture containing undifferentiated stem cells and differentiated cells may be a mixture of undifferentiated stem cells and differentiated cells.
  • the undifferentiated stem cells are not particularly limited, but are preferably iPS cells or ES cells, and more preferably iPS cells.
  • the differentiated cells are not particularly limited, but are preferably those differentiated and induced from undifferentiated stem cells of the same type as the mixed undifferentiated stem cells.
  • Several methods for differentiation / induction from undifferentiated stem cells to differentiated cells have been reported so far, and differentiated cells can be induced using these known methods.
  • the undifferentiated stem cell residual rate represented by x100 is preferably less than 0.1%, more preferably less than 0.01%, and even more preferably less than 0.001%. Note that dead cells are not included in the number of cells. Undifferentiated stem cells remaining in the cell mixture may be detected by determining cells expressing various markers specific to the undifferentiated stem cells as undifferentiated stem cells.
  • the undifferentiated stem cell remaining rate mentioned above shall be determined by determining the cells expressing Oct3 / 4 as undifferentiated stem cells and detecting the undifferentiated stem cells remaining in the cell mixture.
  • a cell showing an expression level comparable to the expression level of Oct3 / 4 in the undifferentiated stem cell of the positive control, using the undifferentiated stem cell cultured in a medium not containing the undifferentiated stem cell removing agent of the above embodiment as a positive control. May be detected as a cell expressing Oct3 / 4.
  • Differentiated cells include cardiomyocytes, myocytes, fibroblasts, neurons, immune cells (eg, lymphocytes), vascular cells, eye cells (eg, retinal pigment epithelial cells), blood cells (eg, megakaryocytes) , Erythrocytes, etc.), other tissue cells, and their progenitor cells.
  • immune cells eg, lymphocytes
  • vascular cells e.g, eye cells (eg, retinal pigment epithelial cells)
  • blood cells eg, megakaryocytes
  • Erythrocytes Erythrocytes, etc.
  • other tissue cells e.g, and their progenitor cells.
  • cardiomyocytes or fibroblasts are preferable, and cardiomyocytes are more preferable.
  • cardiomyocytes In the case of inducing cardiomyocytes from pluripotent stem cells, it is considered that as differentiation into cardiomyocytes progresses, they differentiate into cardiomyocytes via undifferentiated mesoderm and cardiac mesoderm (or planned cardiomyocytes).
  • the undifferentiated mesoderm refers to a stage where expression of Brachyury protein specific to undifferentiated mesoderm is observed.
  • cardiac mesoderm or planned cardiomyocytes refers to the expression of proteins specific to undifferentiated mesoderm such as Brachyury, and the expression of cardiomyocyte-specific proteins such as Nkx2.5 and actinin in the same cell.
  • cardiomyocyte Means a cell that does not require a new substance to be added to the culture solution and has the ability to differentiate into cardiomyocytes exclusively.
  • a cardiomyocyte means a cell that performs autonomous pulsation. Cardiomyocytes express markers such as Nkx2.5, GATA4, and actinin. In the present specification, the term “cardiomyocytes” is used as a concept including cardiomyocytes and cardiac mesoderm (or planned cardiomyocytes).
  • Differentiation / induction from undifferentiated stem cells to cardiomyocytes can be performed using, for example, the methods described in International Publication No. 01/048151, International Publication No. 2005/033298, International Publication No. 2008/150030, and the like.
  • cardiomyocyte differentiation / induction may be performed by adding a substance that induces cardiomyocyte differentiation to a medium in which undifferentiated stem cells are cultured.
  • chromosomal DNA demethylating agents such as demethylase, 5-azacytidine, DMSO; PDGF, fibroblast growth factor 8 (FGF-8), endothelin 1 (ET1), midkine (Midkine) and Bone morphogenetic factor 4 (BMP-4), cytokines such as G-CSF; adhesion molecules such as gelatin, laminin, collagen, fibronectin; vitamins such as retinoic acid; Nkx2.5 / Csx, GATA4, MEF-2A, MEF-2B Transcription factors such as MEF-2C, MEF-2D, dHAND, eHAND, TEF-1, TEF-3, TEF-5 and MesP1; extracellular matrix derived from cardiomyocytes; noggin, chodin, fetuin, follistatin, sclerostin, Dan, Cerberus, Gremlin, Dan Mention may be made of the BMP antagonists, etc., such as
  • Fibroblast means a cell having a fiber-producing ability. Whether the cells are fibroblasts may be determined from the properties specific to fibroblasts, such as fibrosis, and the expression of various markers. As fibroblast markers, markers such as vimentin and ER-TR7 are known, and cells with positive markers can be determined as fibroblasts.
  • the method of the present embodiment includes a step of culturing a cell mixture containing undifferentiated stem cells and differentiated cells in the presence of an undifferentiated stem cell removing agent.
  • This step can be performed by adding an undifferentiated stem cell removing agent to the cell culture medium as described above and culturing the cell mixture.
  • an undifferentiated stem cell removing agent may be added to a medium in which a cell mixture containing undifferentiated stem cells and differentiated cells is cultured.
  • the amount of the undifferentiated stem cell removing agent added to the medium is not particularly limited, but examples of the final concentration when added to the medium include 0.1 to 500 ⁇ M, 1 to 50 ⁇ M, and 3 to 15 ⁇ M. .
  • the culture of the cell mixture in the presence of the undifferentiated stem cell removing agent may be performed at a temperature generally used for cell culture.
  • the culture temperature may be 20 to 40 ° C., preferably 25 to 38 ° C., more preferably 30 to 37 ° C.
  • the culture time of the cell mixture in the presence of the undifferentiated stem cell removing agent is not particularly limited, but is preferably 24 hours or more, more preferably 48 hours or more. If necessary, the cells may be subcultured. Before and after the passage, the composition of the medium may be the same or different as long as it contains the agent for removing undifferentiated stem cells.
  • the cell density of the cell mixture in the presence of the undifferentiated stem cell removing agent is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ 10 to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, more preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 cells / mL. 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cells / mL is more preferable.
  • the cell mixture from which the undifferentiated stem cells have been removed by the method of the present embodiment has a reduced proportion of undifferentiated stem cells and is composed exclusively of differentiated cells. Therefore, according to the method for removing undifferentiated stem cells of the present embodiment, it is possible to obtain a cell mixture that is substantially free of undifferentiated stem cells or has a reduced proportion of undifferentiated stem cells. Therefore, the cell mixture obtained by the method of the present embodiment can be suitably used as a transplant cell to be transplanted into a living body.
  • the present invention provides at least one use selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor for removing undifferentiated stem cells.
  • the present invention provides a method for producing cells for transplantation, comprising the following steps (i) and (ii): (I) a step of inducing desired differentiated cells from undifferentiated stem cells; and (ii) a step of culturing the cell mixture obtained by the step (i) in the presence of an undifferentiated stem cell removing agent.
  • the undifferentiated stem cell removing agent used in the method for producing transplanted cells according to the present embodiment is the undifferentiated stem cell removing agent according to the above embodiment.
  • Step (i) in the method of the present embodiment is a step of inducing desired differentiated cells from undifferentiated stem cells.
  • the undifferentiated stem cells in step (i) are not particularly limited, but are preferably iPS cells or ES cells, and more preferably iPS cells.
  • the type of differentiated cells derived from undifferentiated stem cells is not particularly limited, and may be induced to desired differentiated cells.
  • a method for inducing differentiation cells from undifferentiated stem cells known methods can be appropriately selected and used depending on the desired differentiated cells.
  • Examples of differentiated cells derived from undifferentiated stem cells include, for example, cardiomyocytes, muscle cells, fibroblasts, neurons, immune cells (eg, lymphocytes), vascular cells, eye cells (eg, retinal pigment epithelial cells) Etc.), blood cells (eg, megakaryocytes, erythrocytes, etc.), other tissue cells, and progenitor cells thereof, but are not limited thereto.
  • suitable differentiated cells include cardiomyocytes. Induction from undifferentiated stem cells into cardiomyocytes can be performed by the method exemplified in the above ⁇ Method for removing undifferentiated stem cells >>.
  • the cell mixture obtained in step (i) usually contains undifferentiated stem cells, and undifferentiated stem cells and differentiated cells. And cell mixture.
  • the cell mixture may optionally contain medium components and the like.
  • the form of the cell mixture is not particularly limited, and is an aggregated state, a dispersed state, a state adhered to a culture vessel, a state adhered to an adhesion factor such as an extracellular matrix, a sheet shape, a mass shape, a colony, an embryoid body, a cell mass , Tissue, organ, etc.
  • Step (ii) in the production method of the present embodiment is a step of culturing the cell population obtained by the step (i) in the presence of an undifferentiated stem cell removing agent.
  • the culture in this step (ii) can be performed by the method exemplified in the above ⁇ Method for removing undifferentiated stem cells >>.
  • the manufacturing method of the present embodiment may add other steps in addition to the steps (i) and (ii).
  • steps include a step of purifying differentiated cells and a step of collecting differentiated cells. When these steps are added, these steps are performed between the steps (i) and (ii) or after the step (ii).
  • Differentiated cell purification steps and recovery steps can be appropriately selected according to the type of differentiated cells.
  • the differentiated cells are cardiomyocytes
  • the methods described in International Publication No. 2006/022377, International Publication No. 2007/088874, International Publication No. 2016/010165 may be applied to the purification step. .
  • the differentiated cell ratio represented by differentiated cells / (undifferentiated stem cells + differentiated cells) ⁇ 100 may be, for example, 50% or more, and 70% or more. It may be 80% or more, 90% or more, and 95% or more. Note that dead cells are not included in the number of cells.
  • the transplanted cells produced by the production method of the present embodiment are composed exclusively of differentiated cells because the proportion of undifferentiated stem cells is reduced because undifferentiated stem cells are selectively removed. Therefore, according to the production method of the present embodiment, it is possible to obtain a transplant cell that is substantially free of undifferentiated stem cells or has a reduced proportion of undifferentiated stem cells. Therefore, even when the transplanted cells are transplanted into a living body, the risk of teratoma formation is reduced.
  • the present invention provides at least one use selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor for producing a cell for transplantation.
  • the present invention provides a transplant cell produced by the method for producing a transplant cell, comprising the following steps (i) and (ii): (I) a step of inducing desired differentiated cells from undifferentiated stem cells; and (ii) a step of culturing the cell mixture obtained by the step (i) in the presence of an undifferentiated stem cell removing agent.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells,
  • a pharmaceutical composition comprising a differentiated stem cell removing agent is provided.
  • the undifferentiated stem cell removing agent contained in the pharmaceutical composition of the present embodiment is the same as that described in the above ⁇ Undifferentiated stem cell removing agent >>.
  • the subject to which a differentiated cell derived from an undifferentiated stem cell is transplanted is not particularly limited, and may be a human or a non-human animal that requires transplantation of the differentiated cell. For example, it may be a patient in which the differentiated cells are not functioning normally, or a patient having a defect or a disorder in a tissue containing the differentiated cells. Animals other than humans are not particularly limited, but include mammals. Examples of mammals include primates such as monkeys; rodents such as mice and rats; pet animals such as dogs and cats; livestock such as cows, horses, sheep and pigs.
  • the target to be transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells is preferably the same species as the organism from which the undifferentiated stem cells are derived, and more preferably the same individual as the individual from which the undifferentiated stem cells are derived.
  • a subject to which a differentiated cell derived from an undifferentiated stem cell is transplanted may be a “subject that needs to be transplanted” described in ⁇ Method of treatment, etc. >> described later.
  • the content of the fatty acid synthesis inhibitor and the like in the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited, and examples include those described in the above ⁇ Undifferentiated stem cell removing agent >>.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain other components in addition to the undifferentiated stem cell removing agent.
  • Other components are not particularly limited, and examples include those described in the above ⁇ Undifferentiated stem cell removing agent >>.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain an immunostimulant such as an adjuvant in addition to the above-described ⁇ undifferentiated stem cell removing agent >> as other components.
  • adjuvants include, for example, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, alum, cholera toxin, salmonella toxin, IFA (incomplete Freund's adjuvant), CFA (complete Freund's adjuvant) ISCOMATRIX, GM-CSF, CpG, O / W emulsion Etc., but is not limited to these.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain other drugs having pharmacological activity. Examples of other drugs include anti-inflammatory agents, analgesics, antipyretic agents, compounds that can induce immunity against undifferentiated stem cells, and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited, and may be various dosage forms such as liquids, powders, granules, tablets, powders, suspensions, emulsions, emulsion preparations, liposome preparations and the like. it can.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment is used for treating or preventing a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells.
  • undifferentiated stem cells may remain in differentiated cells prepared as transplant cells.
  • the undifferentiated stem cells proliferate in vivo and may cause diseases such as teratoma.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment is administered to a subject transplanted with the differentiated cells in order to treat or prevent such a disease.
  • the disease caused by the proliferation of undifferentiated stem cells is not particularly limited, and examples thereof include teratomas and cancers.
  • the transplanted differentiated cell is not particularly limited as long as it is a differentiated cell derived from an undifferentiated stem cell.
  • the differentiated cells are preferably those derived from iPS cells or ES cells, more preferably those derived from iPS cells.
  • the differentiated cells are cardiomyocytes derived from iPS cells.
  • the differentiated cells may be transplanted cells produced by the method described in the above ⁇ Method for producing transplanted cells >>.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present embodiment can be appropriately selected according to the type of active ingredient, the form of the preparation, the type of transplanted differentiated cells, the location where the differentiated cells are transplanted, and the like.
  • the same administration method as described in ⁇ Undifferentiated stem cell removing agent >> may be used.
  • the dosage and administration interval of the pharmaceutical composition of the present embodiment include the type of transplanted differentiated cells, the transplantation amount, the transplantation location, etc .; the age, sex, body weight, etc. of the subject receiving the transplantation; the administration method of the pharmaceutical composition, etc. Can be selected as appropriate.
  • Examples of the dosage include 0.001 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.1 mg to 30 mg, 0.1 mg to 10 mg, 0.5 mg to 5 mg, and the like.
  • the administration interval may be 1 to several times a day, once every several days to several months, and the like. For example, administration such as once a day or once a week can be exemplified.
  • undifferentiated stem cells can be selectively removed in vivo even when undifferentiated stem cells remain in cells transplanted in vivo. Therefore, a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells in vivo can be treated or prevented.
  • the present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by proliferation of undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells.
  • at least one use selected from the group consisting of an acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor.
  • the present invention provides a fatty acid synthesis inhibitor for treating or preventing a disease caused by proliferation of the undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells. And at least one use selected from the group consisting of a fatty acid utilization inhibitor and a cholesterol synthesis inhibitor.
  • the present invention relates to fatty acid synthesis for use in treatment or prevention of a disease caused by proliferation of the undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells.
  • a disease caused by proliferation of the undifferentiated stem cells in a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells is provided.
  • the present invention treats a disease caused by proliferation of the undifferentiated stem cells, comprising administering an undifferentiated stem cell removing agent to a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells. To provide a preventive method.
  • the undifferentiated stem cell removing agent administered to the subject is the same as that described in the above ⁇ Undifferentiated stem cell removing agent >>.
  • at least one selected from the group consisting of a fatty acid synthesis inhibitor, a fatty acid utilization inhibitor, and a cholesterol synthesis inhibitor is administered to a subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells. It can also be said that it is a method for treating or preventing a disease caused by proliferation of the undifferentiated stem cells.
  • a subject to which a differentiated cell derived from an undifferentiated stem cell is transplanted is the same as that described in the above “pharmaceutical composition”.
  • the agent for removing undifferentiated stem cells may be administered to a subject in the form of a pharmaceutical composition described in the above ⁇ Pharmaceutical composition >>.
  • the undifferentiated stem cell removing agent may be administered to the subject in combination with other components other than the fatty acid synthesis inhibitor and the like.
  • Other components are not particularly limited, and examples thereof include those described in the above ⁇ Undifferentiated stem cell removing agent >> and ⁇ Pharmaceutical composition >>.
  • the therapeutic agent for the fatty acid synthesis inhibitor and the like is administered to the subject transplanted with differentiated cells derived from undifferentiated stem cells.
  • the therapeutically effective amount of a fatty acid synthesis inhibitor, etc. depends on the type of transplanted differentiated cells, transplant amount, transplant location, etc .; age, sex, body weight, etc. of the subject who received the transplant; administration method of undifferentiated stem cell removal agent, etc.
  • examples of the amount of active ingredients such as fatty acid synthesis inhibitors include 0.001 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.1 mg to 30 mg, 0.1 mg to 10 mg, 0.5 mg to 5 mg, etc. Can do.
  • the subject to be administered and the target disease can be the same as those described in the above ⁇ Pharmaceutical composition>.
  • the administration method can be performed in the same manner as described in the above ⁇ Pharmaceutical composition >>.
  • the present invention provides a method for transplanting cells for transplantation, comprising the following steps (i) to (iii): (I) a step of inducing desired differentiated cells from undifferentiated stem cells; (Ii) culturing the cell mixture obtained in the step (i) in the presence of an undifferentiated stem cell removing agent to obtain cells for transplantation; and (iii) for transplantation obtained in the step (iii). Transplanting cells into a subject in need of transplantation.
  • Steps (i) and (ii) in the transplantation method of the present embodiment can be performed in the same manner as steps (i) and (ii) described in the above ⁇ Method for producing cells for transplantation >>.
  • the undifferentiated stem cell removing agent used in step (ii) of the transplantation method of the present embodiment is the same as that described in the above ⁇ Undifferentiated cell removing agent >>.
  • the step (iii) in the transplantation method of the present embodiment is a step of transplanting the transplant cells obtained in the step (ii) to a subject that needs to be transplanted.
  • the “subject that needs to be transplanted” means that the same type of cells as the transplanted cells obtained in the step (ii) are defective or damaged in the subject's living body, and the transplanted cells are transplanted. Therefore, it is an object that can be expected to improve symptoms caused by defects or damage of the cells. Transplantation can be performed by a general cell transplantation technique.
  • steps may be added in addition to the steps (i) to (iii).
  • steps include a step of purifying differentiated cells and a step of collecting differentiated cells. When these steps are added, these steps are performed between the step (ii) and the step (iii).
  • a purification step and a recovery step can be performed as described in the above ⁇ Method for producing cell for transplantation >>.
  • transplantation method of the present embodiment since cells for transplantation that are substantially free of undifferentiated stem cells or have a reduced proportion of undifferentiated stem cells can be transplanted in vivo, the risk of teratoma formation, etc. Is reduced.
  • step (iv) may be further performed after the step (iii).
  • step (Iv) A step of administering an agent for removing undifferentiated stem cells to the subject transplanted with cells for transplantation in the step (iii)
  • step (iv) can be performed in the same manner as the method for treatment or prevention of the above embodiment.
  • step (iv) even when transplanted with undifferentiated stem cells remaining in the cells for transplantation, the onset of diseases caused by proliferation of the undifferentiated stem cells such as teratomas is prevented. Can do.
  • the cells were cultured in an incubator set at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Human embryonic stem cells were obtained from the H9 strain obtained from the WiCell Research Institute, and human induced pluripotent stem cells were obtained from Prof. Shinya Yamanaka, National University Corporation / iPS Cell Research Institute, Kyoto University. Human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells were subjected to undifferentiated maintenance culture using Matrigel (BD Bioscience cat 354277). As the culture solution, mTeSR1 (STEMCELL Technologies Inc. cat 11875-119) was used.
  • the undifferentiated maintenance culture medium in addition to mTeSR1, Essial 8 (Life Technologies) and TeSR2 (STEMCELL Technologies Inc.) can be used as long as they are commonly used as feeder-free media. .
  • Matrigel there are Vitronectin (Life Technologies) and iMatrix-511 (Takara no. 892001) as matrix, and any matrix that is generally used as a feeder-free matrix can be used. is there.
  • colonies of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells were isolated with CTK solution (Repro CELL) at 37 ° C. for 5 minutes.
  • CTK solution Repro CELL
  • StemPro Accutase Life Technologies no. 1110501
  • TrypLE Express / Select can also be used for cell dispersion treatment.
  • the cardiomyocyte differentiation induction method used in this experiment is as follows. Upon differentiation / induction into cardiomyocytes, when human embryonic stem cells or human induced pluripotent stem cells become 50-90% confluent, RPMI medium (Invitrogen) and B27 (no insulin, Invitrogen) and CHIR99021 (Selleckchem or (Wako) The medium was replaced with 6 ⁇ M added (Day 0). -Day 1 to Day 2 were cultured in RPMI / B27 insulin (-) medium.
  • Day 3 to Day 5 were cultured in a RPMI / B27 insulin (-) medium supplemented with 5 W of IWP2 or 5 W of IWR-1 (Sigma I0161). Furthermore, Day 6 to Day 7 were cultured in RPMI / B27 insulin ( ⁇ ) medium. -After Day 8, the cells were cultured in RPMI / B27 insulin (+) medium (Lian, X., et al., Nat Protocol, 2013, 8, 162-175). At the stage of Day 8 to Day 11, pulsating cardiomyocytes could be confirmed.
  • the fibroblast induction method used in this experiment for differentiation / induction from undifferentiated stem cells to fibroblasts is as follows. When human embryonic stem cells or human induced pluripotent stem cells became 50-90% confluent, the medium was replaced with a culture solution (without bFGF) in which 10% FBS was added to MEM ⁇ medium (Invitrogen). . Vimentin-positive fibroblasts could be obtained in about 10 days by exchanging the culture medium every 2 to 4 days (see Toyama S, Cell Metabolism 2016).
  • Example 2 Culture of various undifferentiated stem cell lines in a medium containing a fatty acid synthesis inhibitor Each final concentration shown in FIG. 3 (2 ⁇ M) in StemFit medium (manufactured by AJINOMOTO) or mTeSR1 (manufactured by Stem Cell Technologies). Orlistat (Sigma, O4139) was added so as to obtain 4 ⁇ M, 6 ⁇ M, 8 ⁇ M, and 10 ⁇ M, thereby obtaining a medium according to one embodiment of the present invention. The following three cell lines were cultured for 72 hours in a medium not containing Orlistat (0 ⁇ M) and each medium containing Orlistat at the above final concentrations.
  • 253G4 human induced pluripotent stem cell (human iPS cell) strain
  • Ffl14 human induced pluripotent stem cell (human iPS cell) strain
  • H9 human embryonic stem cell (human ES cell) strain
  • Example 3 Culture of undifferentiated stem cell line in medium containing various fatty acid synthesis inhibitors or fatty acid utilization inhibitors StemFit medium (AJINOMOTO) or mTeSR1 medium (Stem Cell Technologies) is shown in FIG. The following six types of fatty acid synthesis inhibitors or fatty acid utilization inhibitors were added to obtain the final concentrations shown, respectively, to obtain a medium according to one embodiment of the present invention.
  • -C75 FASN inhibition-LY 294002: ACLY inhibition-SB 204990: ACLY inhibition-Etomoxyer: CPT1 inhibition-Perhexiline: CPT1 inhibition
  • 253G4 cells were treated for 72 hours. Cultured. After culturing for 72 hours, ALP staining was performed, and cells stained in red were confirmed as viable cells. The state of each well is shown in FIG.
  • the cells of undifferentiated stem cells depend on the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor or fatty acid utilization inhibitor depending on the concentration of the fatty acid synthesis inhibitor or fatty acid utilization inhibitor, even when cultured in a medium containing any of the above fatty acid synthesis inhibitors or fatty acid utilization inhibitors It was confirmed that death was induced.
  • Example 5 Culture of fibroblasts in a medium containing a fatty acid synthesis inhibitor A cell mixture containing fibroblasts derived from human iPS cells by the procedure described above and human iPS cells was prepared. The cell mixture was cultured for 9 days in MEM ⁇ + 10% FBS medium (Orlistat (+)) containing Orlistat at a final concentration of 10 ⁇ M. As a control, the cell mixture was similarly cultured in MEM ⁇ + 10% FBS medium (Orlistat ( ⁇ )) not containing Orlistat.
  • FIG. 6 shows the results of Day 9 cardiomyocytes and their Vimentin staining.
  • results shown in FIG. 6 indicate that human iPS cell-derived fibroblasts can be well cultured using the medium according to one embodiment of the present invention.
  • Example 6 Cultivation of a cell mixture containing human iPS cell-derived cardiomyocytes and iPS cells in a medium containing a fatty acid synthesis inhibitor Cardiomyocytes purified and purified after being induced from human iPS cells by the procedure described above A cell mixture in which human iPS cells were mixed was prepared. The cell mixture was immunostained for OCT4. The cell mixture was cultured in StemFit medium (manufactured by AJINOMOTO) containing Orlistat at a final concentration of 10 ⁇ M or mTeSR1 (manufactured by Stem Cell Technologies) (Orlistat (+)) for 72 hours.
  • StemFit medium manufactured by AJINOMOTO
  • Orlistat Orlistat
  • FIG. 8 shows the results of three repeated tests in which the number of colonies of cells expressing Oct4 was quantified from the results.
  • Example 8 Culture of undifferentiated stem cell line in medium containing cholesterol synthesis inhibitor StemFit medium (manufactured by AJINOMOTO) or mTeSR1 medium (manufactured by Stem Cell Technologies) each final concentration (0 Simvastatin (S6196: manufactured by Sigma Aldrich) was added so as to be 125 ⁇ M, 0.25 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M) to obtain a medium according to one embodiment of the present invention. 253G4 cells were cultured for 72 hours in a medium not containing simvastatin (0 ⁇ M) and a medium containing simvastatin at the above final concentrations. After culturing for 72 hours, ALP staining was performed, and cells stained in red were confirmed as viable cells. The state of each well is shown in FIG.
  • each medium supplemented with only carnitine (final concentration 0.5 mM) and BSA (final concentration 8.3 ⁇ M) were prepared.
  • the human iPS cell line (253G4) was cultured for 72 hours in each medium described above. After 72 hours of culture, live cells were detected by LIVE / DEAD Assay (L3224: manufactured by Thermo Fisher Scientific). The state of each well is shown in FIG. Moreover, the result of having quantified the number of living cells from the result is shown in FIG.
  • FIG. 15 shows the results of confirming FASN expression in the FASN KD undifferentiated stem cell line and the N / C undifferentiated stem cell line by Western blotting using an anti-FASN antibody. From the results of FIG.
  • FASN siRNA Applied Biosystems (registered trademark) siRNA ID: s5030 (manufactured by Thermo Fisher Scientific)
  • N / C siRNA Silencer TM Negative Control No. 1 siRNA (AM4611: manufactured by Thermo Fisher Scientific)
  • the FASN KD undifferentiated stem cell line and the N / C undifferentiated stem cell line were cultured in StemFit medium (manufactured by AJINOMOTO) or mTeSR1 (manufactured by Stem Cell Technologies) for 72 hours to confirm cell proliferation. The results are shown in FIG.
  • PA-BSA and N / C undifferentiated stem cell line (N / C w / BSA) cultured in BSA medium showed comparable cell growth.
  • the FASN KD undifferentiated stem cell line cultured in BSA medium cell proliferation was suppressed as compared with the above three lines. From this, it was shown that palmitic acid synthesized by FASN is an essential component for the survival and proliferation of undifferentiated stem cells.
  • an undifferentiated stem cell removing agent and an undifferentiated stem cell removing method that enable highly efficient removal of undifferentiated stem cells can be provided, which can be widely used in the field of regenerative medicine.

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Abstract

脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する未分化幹細胞除去剤。未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、前記未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。以下の(i)及び(ii)の工程を含む、移植用細胞の製造方法。(i)未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程;及び(ii)前記工程(i)により得られた細胞混合物を、前記未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程

Description

未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法
 本発明は、未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法に関する。また、前記未分化幹細胞除去剤を含む培地、移植用細胞の製造方法、及び医薬組成物に関する。
 本願は、2016年10月17日に、日本に出願された特願2016-203839号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
 近年、胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)などの多能性を有する幹細胞についての研究が進められている。これらの細胞は多能性を有することから、分化・誘導して所望の系譜に分化した細胞を作製し、移植医療において使用することが可能になりつつある。
 胚性幹細胞や人工多能性幹細胞の分化・誘導は、通常、in vitroで行われる。
 しかしながら、in vitroでは、全ての幹細胞に対して目的とする系譜の分化を惹起することは難しく、分化・誘導操作後も一部に未分化幹細胞が残存することがある。このような未分化幹細胞は、増殖活性を有し、かつ多種類の細胞に分化できることから、生体内に移植された場合、奇形腫を形成する恐れがある(例えば、非特許文献1を参照)。このような理由から、幹細胞を分化・誘導して作製した細胞集団を、そのまま生体に移植して治療に用いることは困難である。
 したがって、幹細胞から分化・誘導した細胞の生体への移植を安全に実行し、理想的な治療効果を得るために、未分化幹細胞を除去することが必要である。また、未分化幹細胞が残存したまま移植されてしまった場合には、生体内における未分化幹細胞の増殖を抑制する必要がある。
 これまでに、未分化幹細胞を培養条件中で選択的に除去できるとされる方法が報告されている(例えば、非特許文献2~4を参照)。本発明者らの研究グループでも、非心筋細胞や未分化幹細胞から、心筋細胞を選抜する方法を開発してきた(特許文献1~6、非特許文献5を参照)。
国際公開第2006/022377号 国際公開第2007/088874号 国際公開第2009/017254号 国際公開第2010/114136号 国際公開第2011/052801号 国際公開第2016/010165号
Miura et al., (2009) Nature Biotech., 8, 743-745. Ben-David,et al., (2013) Cell Stem Cell, 12, 167-179. Wang,et al., (2009) Science, 325, 435-439. Shiraki,et al., (2014) Cell Metabolism, 19, 780-794. Tohyama,et al., (2016) Cell Metabolism, 23, 663-674.
 しかしながら、未分化幹細胞の残存率を低減させる目的において、未分化幹細胞の除去技術については未だ検討の余地があった。
 本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、未分化幹細胞の高効率な除去を可能とする未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法を提供することを目的とする。
 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、未分化幹細胞を、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、又はコレステロール合成阻害剤の存在下で培養することにより、未分化幹細胞の細胞死を誘導可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
 すなわち、本発明は以下の態様を含む。
[1]脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
[2]前記脂肪酸合成阻害剤が、ATPクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、及びマロニル-CoAデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであり、
 前記脂肪酸利用阻害剤が、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1を標的として脂肪酸利用を阻害するものである、
 前記[1]に記載の未分化幹細胞除去剤。
[3]前記脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の適用対象中の濃度が、0.1~500μMである前記[1]又は[2]に記載の未分化幹細胞除去剤。
[4]前記コレステロール合成阻害剤が、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、HMG-CoA合成酵素、及びHMG-CoAレダクターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものである、前記[1]に記載の未分化幹細胞除去剤。
[5]前記コレステロール合成阻害剤の適用対象中の濃度が、0.01~50μMである、前記[1]又は[4]に記載の未分化幹細胞除去剤。
[6]グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む、前記[1]~[5]のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤。
[7]オルリスタット、C75、LY294002、SB204990、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる1又は2以上を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
[8]前記[1]~[7]のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤を含む培地。
[9]未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、前記[1]~[7]のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。
[10]前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記[9]に記載の未分化幹細胞除去方法。
[11]前記分化細胞が心筋細胞である、前記[9]又は[10]に記載の未分化幹細胞除去方法。
[12] 以下の(i)及び(ii)の工程を含む、移植用細胞の製造方法:
 (i)未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程;及び
 (ii)前記工程(i)により得られた細胞混合物を、前記[1]~[7]のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
[13]前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記[12]に記載の製造方法。
[14]前記分化細胞が心筋細胞である、前記[12]又は[13]に記載の製造方法。
[15]未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、前記[1]~[7]のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物。
[16]前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記[15]に記載の医薬組成物。
[17]前記未分化幹細胞から誘導された分化細胞が心筋細胞である、前記[15]又は[16]に記載の医薬組成物。
 本発明の未分化幹細胞除去剤によれば、未分化幹細胞の高効率な除去が可能である。
 本発明の未分化幹細胞除去方法によれば、未分化幹細胞の高効率な除去が可能である。
細胞内での脂肪酸の合成経路の概略を説明する図である。 実験例1で、ヒトiPS細胞由来心筋細胞とiPS細胞との、FASNの発現の比較の結果を示す画像である。 実験例2で培養した未分化幹細胞株の画像である。 実験例3で培養した未分化幹細胞株の画像である。 実験例4で培養した純化精製心筋細胞の画像である。 実験例5で培養した線維芽細胞の画像である。 実験例6で培養した、ヒトiPS細胞由来心筋細胞とヒトiPS細胞とを含む細胞混合物の画像である。 実験例6で、脂肪酸合成阻害剤を含む培地と含まない培地とで培養された細胞混合物における、Oct4陽性のコロニー数を比較した結果を示すグラフである。 細胞内でのコレステロールの合成経路の概略を説明する図である。 実験例7で、ヒトiPS細胞由来心筋細胞とヒトiPS細胞との、FASNの発現の比較の結果を示す画像である。 実験例7で、ヒトiPS細胞由来心筋細胞とヒトiPS細胞との、FASNの発現の比較の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。 実験例8で培養した未分化幹細胞株の画像である。 実験例9で、脂肪酸合成阻害剤及び脂肪酸を含む培地(PA-BSA)と、脂肪酸合成阻害剤を含み、脂肪酸を含まない培地(BSA)と、で培養されたヒトiPS細胞のウェルの画像である。 実験例9で、脂肪酸合成阻害剤及び脂肪酸を含む培地(PA-BSA)と、脂肪酸合成阻害剤を含み、脂肪酸を含まない培地(BSA)と、で培養されたヒトiPSにおける、生存細胞数を比較した結果を示すグラフである。 実験例10で、FASN siRNAを導入した未分化幹細胞株と、陰性対照siRNA(N/C siRNA)を導入した未分化幹細胞株との、FASNの発現を比較した結果を示すウェスタンブロッティングの写真である。 実験例10で、FASN siRNAを導入した未分化幹細胞株(FASN ND)と、陰性対照siRNAを導入した未分化幹細胞株(N/C)との、細胞増殖を比較した結果を示すグラフである。 実験例11で、脂肪酸合成阻害剤及び脂肪酸を含む培地(PA-BSA)と、脂肪酸合成阻害剤を含み、脂肪酸を含まない培地(BSA)と、で培養された、FASN siRNAを導入した未分化幹細胞株(FASN KD)と、陰性対照siRNAを導入した未分化幹細胞株(N/C)との、細胞増殖を比較した結果を示すグラフである。
≪定義等≫
 本明細書において、「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する多能性幹細胞を包含する概念として用いられ、胚性幹細胞(embryonic stem cells:ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells:iPS細胞)、及びこれらの幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞、並びに各種体性幹細胞を含み得る。「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する細胞であれば特に限定されず、上記例示したES細胞やiPS細胞と同等の性質を有する未知の細胞も包含する。
 細胞が未分化幹細胞であることは、未分化幹細胞に特異的な性質の有無や、未分化幹細胞に特異的な各種マーカーの発現等から判断することができる。例えば、未分化幹細胞に特異的な性質としては、自己複製能を有し、未分化幹細胞とは異なる性質を有する別種の細胞へと分化可能である性質が挙げられる。また、テラトーマ形成能やキメラマウス形成能等も未分化幹細胞に特異的な性質として挙げられる。
 未分化幹細胞に特異的な各種マーカー(以下、「未分化幹細胞マーカー」という。)とは、未分化幹細胞に特異的に発現する因子であり、例えば、Oct3/4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、Lin28、Fbx15等を例示することができる。これら未分化幹細胞マーカーの少なくとも1つの発現が観察された場合には、当該細胞を未分化幹細胞と判断することができる。未分化幹細胞マーカーは、1種を単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施形態として、Oct3/4を発現する細胞を未分化幹細胞と判断してもよい。なお、細胞における未分化幹細胞マーカーの発現は、RT-PCRやマイクロアレイ等の公知の方法を用いて確認することができる。
 未分化幹細胞は、哺乳類の未分化幹細胞であってもよく、げっ歯類の未分化幹細胞であってもよく、霊長類の未分化幹細胞であってもよく、ヒトの未分化幹細胞であってもよい。一例として、ヒト由来の未分化幹細胞を挙げることができ、より具体的な例としては、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞等を挙げることができる。
 本明細書において、「分化細胞」とは、上記「未分化幹細胞」の性質を有しない細胞のことを指す。分化細胞は、未分化幹細胞から誘導・分化された細胞であり得るが、分化多能性を有しない。分化細胞としては、例えば、ES細胞から分化した細胞、iPS細胞から分化した細胞であってよい。分化細胞の例としては、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ球等の免疫細胞、血管細胞、網膜色素上皮細胞等の眼細胞、巨核球や赤血球等の血液細胞、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等が挙げられる。
≪未分化幹細胞除去剤≫
 1実施形態において、本発明は、未分化幹細胞除去剤を提供する。
 本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する。
 以下、実施の形態に基づき、本発明を説明する。
 後述する実施例に示されるように、本発明者らは、脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸分解阻害剤(脂肪酸利用阻害剤)を未分化幹細胞に接触させると、細胞死を誘導可能であることを見出した。この理由として、本発明者らは、ヒトiPS細胞(未分化幹細胞)において、当該脂肪酸合成経路が亢進されていることを見出した。おそらく、当該脂肪酸合成経路及びその代謝経路は未分化幹細胞の生存に非常に重要であるものと考えられる。そのため、係る脂肪酸合成又は脂肪酸分解の阻害により、未分化幹細胞に細胞死が誘導されるものと考えられる。
 さらに、本発明者らは、コレステロール合成阻害剤を未分化幹細胞に接触させると、細胞死を誘導可能であることを見出した。コレステロールは細胞膜の構成成分であり、当該コレステロール合成経路は未分化幹細胞の生存に非常に重要であるものと考えられる。そのため、係るコレステロール合成の阻害により、未分化幹細胞に細胞死が誘導されるものと考えられる。
 また、未分化幹細胞が残存する細胞集団が生体内に移植された場合であっても、当該生体に対して脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤又はコレステロール合成阻害剤を投与することにより、生体内の未分化幹細胞を選択的に除去することができる。
 本明細書において「脂肪酸利用阻害剤」は、脂肪酸を利用した物質の合成に係る代謝経路の反応を阻害する機能、及び/又は脂肪酸の分解に係る代謝経路の反応を阻害する機能を有するものである。本明細書において「脂肪酸利用阻害剤」は、脂肪酸の分解に係る代謝経路の反応を阻害する「脂肪酸分解阻害剤」を包含する。
 脂肪酸の分解に係る代謝経路としては、β酸化に係る代謝経路が好ましい。脂肪酸利用阻害剤は「β酸化に係る脂肪酸代謝阻害剤」であることが好ましい。β酸化に係る脂肪酸代謝としては、β酸化、β酸化に利用される脂肪酸代謝産物の合成、β酸化に利用される脂肪酸代謝産物のミトコンドリアへの取り込み等が挙げられる。
 また、脂肪酸を利用した物質の合成に係る代謝経路としては、トリグリセリド及び/又はリン脂質の合成に係る代謝経路が好ましい。脂肪酸利用阻害剤は「トリグリセリド及び/又はリン脂質の合成に係る脂肪酸代謝阻害剤」であることが好ましい。
 これら阻害剤の種類は特に限定されるものではなく、脂肪酸合成阻害、脂肪酸利用阻害、又はコレステロール合成阻害の機能を有する物質であればよく、有機物であっても無機物であってもよい。有機物としては有機化合物が好ましく、低分子化合物、核酸、ぺプチド、タンパク質等も例示できる。
 図1は、天然の細胞の細胞質における脂肪酸合成経路及び脂肪酸分解(脂肪酸利用)経路の概略を説明する図である。クエン酸(citrate)から、ATPクエン酸リアーゼ(ATP citrate lyase:ACLY)によりアセチル-CoA(acetyl-CoA)が合成され、アセチル-CoA及びマロニル-CoA(malonyl-CoA)から、脂肪酸合成酵素(Fatty acid synthase:FASN)により脂肪酸(Fatty acid:FA)が合成される。
 アセチル-CoAカルボキシラーゼ(acetyl-CoA carboxylase:ACC)は、アセチル-CoAからのマロニル-CoAの生成を触媒する。マロニル-CoAデカルボキシラーゼ(malonyl‐CoA decarboxylase:MCD)は、マロニル-CoAからのアセチル-CoAの生成を触媒する。
 合成された脂肪酸は、アシルCoA合成酵素(acyl-CoA synthetase:ACS)の働きにより、脂肪酸アシル-CoA(FA-CoA)となり、その後いくつかの反応を経て、結果としてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1(carnitine palmitoyltransferase-1:CPT1)によってミトコンドリア内へ輸送され、β酸化に利用される。
 本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、図1に示す脂肪酸合成経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、脂肪酸合成を阻害するものであってよい。本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、ATPクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、及びマロニル-CoAデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。好ましくは、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、ATPクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、及びアセチル-CoAカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよく、ATPクエン酸リアーゼ、及び脂肪酸合成酵素からなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。
 本実施形態の脂肪酸分解阻害剤は、図1に示すβ酸化に係る脂肪酸分解経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、脂肪酸分解を阻害するものであってよい。本実施形態の脂肪酸分解阻害剤は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1を標的として、脂肪酸分解を阻害するものであってよい。
 脂肪酸は、β酸化に利用される他、トリグリセリド及びリン脂質の合成等にも利用される。脂肪酸アシル-CoAは、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ(glycerol-3-phosphate acyltransferase:GPAT)によるリゾホスファチジン酸(lysophosphatidic acid:LPA)の合成に利用される。また、脂肪酸アシル-CoAは、アシルグリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ(acyl-glycerol-3-phosphate acyltransferase:AGPAT)によるホスファチジン酸(Phosphatidic acid:PA)の合成に利用される。また、脂肪酸アシル-CoAは、ホスファチジン酸ホスファターゼ(phosphatidate phosphatase:PAP)によるジアシルグリセロール(diacylglycerol:DAG,DG)の合成に利用される。また、脂肪酸アシル-CoAは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(diacylglycerol acyltransferase:DGAT)によるトリグリセリドの合成に利用される。更には、脂肪酸アシル-CoAは、モノアシルグリセロールリパーゼ(monoacylglycerol lipase:MAGL)によって脂肪酸とグリセロールにも分解される。本実施形態の脂肪酸利用阻害剤は、脂肪酸を利用するこれらの経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、脂肪酸利用を阻害するものであってよい。
  図9は、コレステロール合成経路の概略を説明する図である。アセチル-CoA(acetyl-CoA)から、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(acetyl-CoA acetyltransferase:ACAT2)によりアセトアセチル-CoA(acetoacetyl-CoA)が合成される。アセトアセチル-CoAから、ヒドロキシメチルグルタリル-CoA合成酵素1(hydroxymethylglutaryl-CoA Syntase 1:HMG-CoA Syntase 1)によりヒドロキシメチルグルタリル-CoA(hydroxymethylglutaryl-CoA:HMG-CoA)が合成される。HMG-CoAから、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase:HMG-CoA reductase)によりメバロン酸(mevalonate)が合成される。その後いくつかの反応を経て、結果としてコレステロール(cholesterol)が合成される。
 本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、図9に示すコレステロール合成経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、コレステロール合成を阻害するものであってよい。本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、HMG-CoA合成酵素、及びHMG-CoAレダクターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものであってよい。好ましくは、本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、HMG-CoAレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するものであってよい。
 脂肪酸合成阻害剤は、1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。脂肪酸利用阻害剤は、1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。コレステロール合成阻害剤は、1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。
 未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤を1種又は2種以上を組み合わせて含有することができる。未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸利用阻害剤を1種又は2種以上を組み合わせて含有することができる。未分化幹細胞除去剤は、コレステロール合成阻害剤を1種又は2種以上を組み合わせて含有することができる。未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる1種又は2種以上を組み合わせて含有することができる。
 本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、脂肪酸合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。脂肪酸合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、オルリスタット(Orlistat)、C75、フラボノイズ、Epigallocatechin-3-gallate(EGCG)等が挙げられ、オルリスタット(Orlistat)、C75が好ましい。
 オルリスタット(Orlistat)及びC75は、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、オルリスタット(Orlistat)又はC75と同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。
 オルリスタットは、下記式(1)で表される化合物(N-formyl-L-leucine-(1S)-1-[[(2S,3S)-3-hexyl-4-oxo-2-oxetanyl]methyl]dodecyl ester)として知られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 C75は、下記式(2)で表される化合物(tetrahydro-4-methylene-2R-octyl-5-oxo-3S-furancarboxylic acid)として知られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤は、ATPクエン酸リアーゼを標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。ATPクエン酸リアーゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、LY294002及びSB204990が好ましく挙げられる。LY294002及びSB204990は、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、LY294002又はSB204990と同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。
 本実施形態の脂肪酸分解阻害剤は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1を標的として、脂肪酸分解を阻害するものであってよい。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1を標的として、脂肪酸分解を阻害する脂肪酸分解阻害剤としては、エトモキシル(Etomoxir)、ペルヘキシリン(Perhexiline)、ラノラジン(Ranolazine)等が挙げられ、エトモキシル、ペルヘキシリンが好ましい。エトモキシル及びペルヘキシリンは、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、エトモキシル又はペルヘキシリンと同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。
 本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、アセチル-CoAカルボキシラーゼを標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。アセチル-CoAカルボキシラーゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、ソラフェンA(Soraphen A)、TOFA、A769662、メトホルミン(Metformin)、AICAR等が挙げられ、TOFA、A769662が好ましい。TOFA及びA769662は、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、TOFA又はA769662と同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。
 本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、アシルCoA合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。アシルCoAシンテターゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、トリアクシンC(Triascin C)、TZDs等が挙げられる。
 また、上記のATPクエン酸リアーゼやアセチル-CoAカルボキシラーゼ、脂肪酸合成酵素、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ、アシルCoA合成酵素などの発現を制御する転写因子として、SREBPが知られている。実施形態の脂肪酸合成阻害剤及び/又は脂肪酸利用阻害剤としては、SREBPの機能を阻害するものであってもよく、ファトスタチン(Fatostatin)やFGH110019等が挙げられる。
 本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、HMG-CoAレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するものであってよい。HMG-CoAレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するコレステロール合成阻害剤として、プラバスタチン(Pravastatin)、シンバスタチン(Simvastatin)、フルバスタチン(Fluvastatin)、アトルバスタチン(Atorvastatin)、ピタバスタチン(Pitavastatin)、ロスバスタチン(Rosuvastatin)、セリバスタチン(Cerivastatin)、ロバスタチン(Lovastatin)、メバスタチン(Mevastatin)等が挙げられ、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンが好ましく、シンバスタチンがより好ましい。プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンは、市販のものを使用できる。また、本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンと同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。
 実施形態の未分化幹細胞除去剤は、オルリスタット、C75、LY294002、SB204990、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる1又は2以上を含有してもよい。
 本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸合成阻害剤の濃度が、0.1~500μMであってよい。なお、本明細書中において、単位としての「M」は、mol/Lを意味する。また、本明細書中において、「適用対象中」とは、培地中、又は血中を意味する。
 また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸利用阻害剤の濃度が0.1~500μMであってよい。
 また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸合成阻害剤の濃度が0.1~500μg/mLであってよい。
 また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸利用阻害剤の濃度が0.1~500μg/mLであってよい。
 また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有するコレステロール合成阻害剤の濃度が0.01~50μMであってよい。
 また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有するコレステロール合成阻害剤の濃度が0.01~50μg/mLであってよい。
 本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がオルリスタットである場合、適用対象中のオルリスタットの濃度は、0.1~500μMが好ましく、1~50μMがより好ましく、3~15μMがさらに好ましい。
 本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がC75である場合、適用対象中のC75の濃度は、0.1~500μg/mLが好ましく、1~100μg/mLがより好ましく、5~50μg/mLがさらに好ましい。
 本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がSB204990である場合、適用対象中のSB204990の濃度は、0.1~500μMが好ましく、1~200μMがより好ましく、20~100μMがさらに好ましい。
 本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がLY294002である場合、適用対象中のLY294002の濃度は、0.1~500μMが好ましく、1~200μMがより好ましく、20~100μMがさらに好ましい。
 本実施形態に係る脂肪酸分解阻害剤(脂肪酸利用阻害剤)がエトモキシルである場合、適用対象中のエトモキシルの濃度は、0.1~500μMが好ましく、1~200μMがより好ましく、20~100μMがさらに好ましい。
 本実施形態に係る脂肪酸分解阻害剤(脂肪酸利用阻害剤)がペルヘキシリンである場合、適用対象中のペルヘキシリンの濃度は、0.1~500μMが好ましく、1~100μMがより好ましく、5~50μMがさらに好ましい。
 本実施形態に係るコレステロール合成阻害剤がシンバスタチンである場合、適用対象中のシンバスタチンの濃度は、0.01~50μMが好ましく、0.1~30μMがより好ましく、0.1~10μMがさらに好ましい。
 本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤と未分化幹細胞とが接触すると、脂肪酸合成阻害剤が未分化幹細胞の細胞質に取り込まれ、図1に示す脂肪酸合成経路のいずれかの反応が完全又は部分的に阻害されることとなる。
 本実施形態に係る脂肪酸分解阻害剤と未分化幹細胞とが接触すると、脂肪酸分解阻害剤が未分化幹細胞の細胞質及び/又はミトコンドリアに取り込まれ、図1に示す脂肪酸分解経路のいずれかの反応が完全又は部分的に阻害されることとなる。
 本実施形態に係るコレステロール合成阻害剤と未分化幹細胞とが接触すると、コレステロール合成阻害剤が未分化幹細胞の細胞質に取り込まれ、図9に示すコレステロール合成経路のいずれかの反応が完全又は部分的に阻害されることとなる。
 本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有するものであればよい。本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種のみからなるものであってもよく、未分化幹細胞除去能を有する限りにおいて、その他の任意成分を含有していてもよい。
 他の成分は、特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、トランスフェクション促進剤、緩衝剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、キレート剤等が挙げられる。
 本実施形態の未分化幹細胞除去剤の剤型は、特に限定されず、液状物、粉末状物、顆粒状物、ゲル状物、固形物等の種々の形態であり得る。また、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、コレステロール合成阻害剤、又はこれらの組合せをミセル内に封入したエマルション形態や、リポソーム内に封入したリポソーム形態であってもよい。
 患者への投与は、例えば、非経口的または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。非経口的な投与方法としては、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経皮的投与等が挙げられる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
 例えば、未分化幹細胞から誘導された分化細胞組織の移植を受けた患者は、本実施形態の未分化幹細胞除去剤の投与により、分化細胞組織中に残存する未分化幹細胞を生体内で除去することができる。これにより、移植組織の癌化等の未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を予防又は治療できる。
 本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、後述する培地、未分化幹細胞除去方法、移植用細胞の製造方法、未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物、及び未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法等に使用することができる。
 本実施形態の未分化幹細胞除去剤が、除去の対象とする未分化幹細胞は、特に限定されないが、iPS細胞又はES細胞であることが好ましく、iPS細胞であることがより好ましい。
≪培地≫
 1実施形態において、本発明は、培地を提供する。本実施形態の培地は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を含む。本実施形態の培地は、細胞の培養に使用できる。本明細書において、「培養」とは、生体(個体)外において細胞を飼育又は生育させることを意味し、いわゆるin vitroで細胞を扱うことを含む。「培地」とは、前記培養環境を細胞に提供する液体又は固体の物質のことを指す。
 本実施形態の培地は、例えば、任意の培地成分と、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種(以下、「脂肪酸合成阻害剤等」ということがある。)と、を含む組成物であり得る。本実施形態の培地は、媒体と脂肪酸合成阻害剤等とを含む組成物である。媒体としては、水、緩衝液等が挙げられる。媒体は、脂肪酸合成阻害剤等を溶解させるものであってもよく、分散させるものであってもよい。培地成分は、細胞の生育に有効な成分を含有していてもよく、そのような成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン類、無機塩類、糖類、成長因子等の各種成分が挙げられる。その他、抗生物質、緩衝液、キレート剤、フェノールレッド指示薬等の成分を含有していてもよい。
 本実施形態の培地から脂肪酸合成阻害剤等を除いた残りの成分は、従来培地として用いられている一般的な細胞培養液[例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液(DMEM)、MEM培養液(例えば、α-MEM、MEM[Hank’s BSS])、RPMI培養液(例えば、RPMI 1640など)、F12培養液、StemPro34、mTeSR1など]と同様の組成としてもよい。前記成分は、未分化幹細胞維持培地として用いられている一般的な細胞培養液[例えばStemFit培地、mTeSR(登録商標) Essential 8(登録商標)培地、StemSure(登録商標)培地など]と同様の組成としてもよい。
 本実施形態の培地中の脂肪酸合成阻害剤等の濃度は、前述した未分化幹細胞除去剤中の適用対象中の脂肪酸合成阻害剤等の濃度と同じであってよい。本実施形態の培地が脂肪酸合成阻害剤等を上記濃度で含むことにより、効果的に未分化幹細胞を除去可能である。また、未分化幹細胞と分化細胞とが混在する場合、分化細胞の生育を良好な状態とさせつつ、未分化幹細胞を除去可能である。
 本実施形態の培地は、脂肪酸を含まないことが好ましい。また脂肪酸が生合成されないよう、使用される脂肪酸合成阻害剤の標的の下流に位置する脂肪酸合成の前駆体(図1参照)を含まないことが好ましい。また脂肪酸が利用されないよう、使用される脂肪酸利用阻害剤の標的の下流に位置する物質を含まないことが好ましい。また、本実施形態の培地は、コレステロールを含まないことが好ましい。またコレステロールが生合成されないよう、使用されるコレステロール合成阻害剤の標的の下流に位置するコレステロール合成の前駆体を含まないことが好ましい。
 本実施形態の培地は、グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含んでもよい。これらの化合物を含まない培地で未分化幹細胞を培養することでも、未分化幹細胞の細胞死を誘導可能であるとされる。
 しかし、本実施形態の培地は、脂肪酸合成阻害剤等を含んでいるので、これら、グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含んでいても、未分化幹細胞除去能が良好に発揮される。また、グルコース、グルタミン、及びメチオニンを含んでいてもよいため、これらの成分を含まない場合と比べて、細胞の生育が良好となることが期待される。
 また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞除去剤の製造のための、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。 
<<キット>>
 1実施形態において、本発明は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を備えるキットを提供する。
 本実施形態のキットは、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のほか、未分化幹細胞から分化細胞を誘導するための試薬類、培地類、細胞培養器具、使用説明書等をさらに備えるものであってもよい。分化細胞を誘導するための試薬類は、誘導しようとする分化細胞に応じて、適宜選択することができる。心筋細胞を誘導するための試薬類としては、例えば、デメチラーゼ、5-アザシチジン、DMSOなどの染色体DNA脱メチル化剤;PDGF、繊維芽細胞増殖因子8(FGF-8)、エンドセリン1(ET1)、ミドカイン(Midkine)および骨形成因子4(BMP-4)、G-CSFなどのサイトカイン;ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着分子;レチノイン酸などのビタミン;Nkx2.5/Csx、GATA4、MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D、dHAND、eHAND、TEF-1、TEF-3、TEF-5およびMesP1などの転写因子;心筋細胞由来の細胞外基質;ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、ダンテなどのBMPアンタゴニスト等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、培地類としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液(DMEM)、MEM培養液(α-MEM、MEM[Hank’s Bss]等)、RPMI培養液(RPMI 1640等)、F12培養液、StemPro34、mTeSRI、StemFit培地、mTeSR Essential 8培地、StemSure培地等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、細胞培養器具等としては、細胞培養プレート等を挙げることができるが、これに限定されない。
 本実施形態のキットは、後述の未分化幹細胞除去方法に好適に用いることができ、当該未分化幹細胞除去方法を説明する指示書等をさらに備えることができる。上記実施形態の未分化幹細胞除去剤と共に、未分化幹細胞除去方法に使用する試薬類、指示書等をキット化することにより、より簡便かつ短時間に未分化幹細胞除去方法を実施することができる。
≪未分化幹細胞除去方法≫
 1実施形態において、本発明は、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法を提供する。
 本実施形態の未分化幹細胞除去方法に使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤である。
 本明細書において、「細胞混合物」とは、2種以上の細胞を含む細胞集団である。「細胞混合物」は、2種以上の細胞のほか、培地の成分等を含み得る。「未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物」は、1個以上の未分化幹細胞と1個以上の分化細胞とを含み、任意に培地の成分等を含み得る。未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物の形態は、特に限定されず、集合状態、分散状態、培養容器に接着した状態、細胞外マトリクス等の接着因子へ接着した状態、シート状、塊状、コロニー、胚様体、細胞塊、組織、器官等であり得る。
 未分化幹細胞に、分化・誘導処理を行うと、未分化幹細胞から分化細胞が誘導される。しかしながら、in vitroでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しく、通常、未分化幹細胞が残存し、未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物が形成される。本実施形態の方法では、このような未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物から、未分化幹細胞のみを選択的に除去することができる。なお、本実施形態の方法において、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物は、未分化幹細胞と分化細胞とを混合したものであってもよい。
 本実施形態の方法において、未分化幹細胞は、特に限定されないが、iPS細胞又はES細胞であることが好ましく、iPS細胞であることがより好ましい。
 本実施形態の方法において、分化細胞は、特に限定されないが、混在する未分化幹細胞と同種の未分化幹細胞から分化・誘導されたものであることが好ましい。未分化幹細胞から分化細胞への分化・誘導方法は、これまでに幾つか報告されており、これら公知の方法を用いて分化細胞を誘導することができる。
 前記細胞混合物中の未分化幹細胞を、選択的に除去できる効率は、高いほど好ましい。上記実施形態の未分化幹細胞除去剤の存在下で、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養し、細胞混合物を得た場合、未分化幹細胞数/(未分化幹細胞数+分化細胞数)×100で表される未分化幹細胞残存率は、0.1%未満であることが好ましく、0.01%未満であることがより好ましく、0.001%未満であることがさらに好ましい。なお、死細胞は上記細胞数に含めないものとする。
 前記細胞混合物中に残存する未分化幹細胞は、前記未分化幹細胞に特異的な各種マーカーを発現する細胞を、未分化幹細胞と判断することで検出してよい。ただし、上記に挙げた未分化幹細胞残存率は、Oct3/4を発現する細胞を未分化幹細胞と判断して、前記細胞混合物中に残存する未分化幹細胞を検出したものとする。ここでは、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を含有しない培地で培養した未分化幹細胞を陽性対照として、前記陽性対照の未分化幹細胞におけるOct3/4の発現量と同等程度の発現量を示す細胞を、Oct3/4を発現する細胞として検出すればよい。
 分化細胞としては、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、免疫細胞(例、リンパ球等)、血管細胞、眼細胞(例、網膜色素上皮細胞等)、血液細胞(例、巨核球、赤血球等)、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等であってよい。中でも、心筋細胞又は線維芽細胞が好ましく、心筋細胞がより好ましい。
 多能性を有する幹細胞から心筋細胞を誘導する場合、心筋細胞への分化が進行するにつれて、未分化中胚葉、心臓中胚葉(又は予定心筋細胞)を経て心筋細胞に分化すると考えられている。ここで、未分化中胚葉とは、未分化中胚葉に特異的なBrachyuryタンパク質の発現が認められる段階をいう。一方、心臓中胚葉(又は予定心筋細胞)とは、Brachyury等の未分化中胚葉に特異的なタンパク質の発現が認められ、かつ同一細胞においてNkx2.5やアクチニン等の心筋細胞特異的タンパク質の発現が認められない細胞であって、培養液に対して新たに物質が加えられることを必要とせず、専ら心筋細胞へ分化する能力を有する細胞を意味する。心筋細胞とは、自律拍動を行っている細胞のことを意味する。心筋細胞は、Nkx2.5、GATA4、アクチニン等のマーカーを発現する。本明細書においては、「心筋細胞」という用語は、心筋細胞及び心臓中胚葉(又は予定心筋細胞)を包含する概念として用いられる。
 未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導は、例えば、国際公開第01/048151号、国際公開第2005/033298号、国際公開第2008/150030等に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、未分化幹細胞を培養する培地に、心筋細胞への分化を惹起する物質を添加することにより、心筋細胞への分化・誘導を行ってもよい。
 そのような物質としては、例えば、デメチラーゼ、5-アザシチジン、DMSOなどの染色体DNA脱メチル化剤;PDGF、繊維芽細胞増殖因子8(FGF-8)、エンドセリン1(ET1)、ミドカイン(Midkine)および骨形成因子4(BMP-4)、G-CSFなどのサイトカイン;ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着分子;レチノイン酸などのビタミン;Nkx2.5/Csx、GATA4、MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D、dHAND、eHAND、TEF-1、TEF-3、TEF-5およびMesP1などの転写因子;心筋細胞由来の細胞外基質;ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、ダンテなどのBMPアンタゴニスト等を挙げることができる。
 線維芽細胞とは、線維産生能を有する細胞のことを意味する。細胞が線維芽細胞であることは、線維産生能等の線維芽細胞に特異的な性質や、各種マーカーの発現から判断してもよい。線維芽細胞マーカーとしては、ビメンチン、ER-TR7等のマーカーが知られており、マーカーが陽性である細胞を線維芽細胞であると判断できる。
 本実施形態の方法は、未分化幹細胞除去剤の存在下で、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養する工程を含む。当該工程は、上記のような細胞培養用培地に未分化幹細胞除去剤を添加し、細胞混合物を培養することにより、実施することができる。あるいは、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養している培地中に、未分化幹細胞除去剤を添加してもよい。
 未分化幹細胞除去剤の培地への添加量は、特に限定されないが、培地に添加したときの最終濃度として、例えば、0.1~500μM、1~50μM、3~15μM等を例示することができる。
 未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養は、細胞培養に一般的に用いられる温度で行えばよい。例えば、培養温度として、20~40℃、好ましくは25~38℃、より好ましくは30~37℃を例示することができる。
 未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養時間は、特に限定されないが、好ましくは24時間以上、より好ましくは48時間以上である。必要に応じて、細胞は継代培養されてもよい。継代の前後で、培地の組成は、未分化幹細胞除去剤を含む限りにおいて、同一であってもよく異なっていてもよい。
 未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の細胞密度は、特に限定されないが、1×10~1×10cells/mLが好ましく、1×10~1×10cells/mLがより好ましく、1×10~1×10cells/mLがさらに好ましい。
 本実施形態の方法により、未分化幹細胞を除去した細胞混合物は、未分化幹細胞の割合が低減され、専ら分化細胞により構成される。そのため、本実施形態の未分化幹細胞除去方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された細胞混合物を得ることができる。したがって、本実施形態の方法で得られた細胞混合物は、生体へと移植される移植用細胞として好適に使用することができる。
 また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞を除去するための、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。 
≪移植用細胞の製造方法≫
 1実施形態において、本発明は、以下の(i)及び(ii)の工程を含む、移植用細胞の製造方法、を提供する:
(i)未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程;及び
(ii)前記工程(i)により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
 本実施形態の移植用細胞の製造方法に使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤である。
 本実施形態の方法における工程(i)は、未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程である。工程(i)における未分化幹細胞は、特に限定されないが、iPS細胞又はES細胞であることが好ましく、iPS細胞であることがより好ましい。
 工程(i)において、未分化幹細胞から誘導する分化細胞の種類は、特に限定されず、所望の分化細胞に誘導すればよい。未分化幹細胞から分化細胞への誘導方法は、目的とする分化細胞に応じて、公知の方法を適宜選択して用いることができる。未分化幹細胞から誘導する分化細胞の例としては、例えば、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、免疫細胞(例、リンパ球等)、血管細胞、眼細胞(例、網膜色素上皮細胞等)、血液細胞(例、巨核球、赤血球等)、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な分化細胞の例としては、心筋細胞が挙げられる。未分化幹細胞から心筋細胞への誘導は、上記≪未分化幹細胞除去方法≫で例示したような方法により行うことができる。
 一般的に、in vitroでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しいため、工程(i)で得られる細胞混合物は、通常、未分化幹細胞が残存し、未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物となっている。また、前記細胞混合物は、任意に培地の成分等を含み得る。前記細胞混合物の形態は、特に限定されず、集合状態、分散状態、培養容器に接着した状態、細胞外マトリクス等の接着因子へ接着した状態、シート状、塊状、コロニー、胚様体、細胞塊、組織、器官等であり得る。
 本実施形態の製造方法における工程(ii)は、前記工程(i)により得られた細胞集団を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程である。本工程(ii)における培養は、上記≪未分化幹細胞除去方法≫で例示したような方法により行うことができる。
 本実施形態の製造方法は、上記工程(i)及び(ii)に加えて、他の工程を追加してもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。これらの工程を追加する場合、これらの工程は、上記工程(i)及び(ii)の間、又は上記工程(ii)の後に行われる。
 分化細胞の精製工程や回収工程は、分化細胞の種類に応じて、適宜適切な方法を選択することができる。例えば、分化細胞が心筋細胞である場合には、国際公開第2006/022377号、国際公開第2007/088874号、国際公開2016/010165号に記載の方法等を、精製工程に適用してもよい。また、回収工程としては、遠心分離法等を適用してもよい。
 本実施形態の製造方法において得られる移植用細胞において、分化細胞/(未分化幹細胞+分化細胞)×100で表される分化細胞率は、例えば、50%以上であってよく、70%以上であってよく、80%以上であってよく、90%以上であってよく、95%以上であってよい。なお、死細胞は上記細胞数に含めないものとする。
 本実施形態の製造方法により製造された移植用細胞は、未分化幹細胞が選択的に除去されているため、未分化幹細胞の割合が低減されており、専ら分化細胞により構成される。そのため、本実施形態の製造方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された移植用細胞を得ることができる。そのため、前記移植用細胞を生体に移植した場合でも、奇形腫形成等のリスクが低減される。
 また、他の態様において、本発明は、移植用細胞を製造するための、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。
 さらに、他の態様において、本発明は、以下の(i)及び(ii)の工程を含む、移植用細胞の製造方法によって製造された移植用細胞、を提供する:
(i)未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程;及び
(ii)前記工程(i)により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
≪医薬組成物≫
 1実施形態において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物、を提供する。
 本実施形態の医薬組成物が含む未分化幹細胞除去剤は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。
 未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、特に限定されないが、当該分化細胞の移植を必要とするヒト、又はヒト以外の動物であり得る。例えば、当該分化細胞が正常に機能していない患者、当該分化細胞を含む組織に欠損、障害等を有する患者であってよい。ヒト以外の動物は、特に限定されないが、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、サルなどの霊長類;マウス、ラットなどのげっ歯類;イヌ、ネコなどのペット動物;牛、ウマ、ヒツジ、ブタなどの家畜類等が挙げられる。未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、未分化幹細胞が由来する生物と同種の生物であることが好ましく、未分化幹細胞が由来する個体と同一の個体であることがより好ましい。未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、後述の≪治療方法等≫に記載の「移植が必要な対象」であってもよい。
 治療的有効量である限り、本実施形態の医薬組成物における、脂肪酸合成阻害剤等の含有量は特に制限されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもの等を挙げることができる。
 本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞除去剤に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもの等を挙げることができる。
 また、本実施形態の医薬組成物は、他の成分として、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもののほかに、アジュバント等の免疫賦活剤を含んでいてもよい。アジュバントの例としては、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、IFA(不完全フロイントアジュバント)、CFA(完全フロイントアジュバント)ISCOMATRIX、GM-CSF、CpG、O/Wエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。また、本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞除去剤に加えて、薬理活性を有する他の薬剤を含んでいてもよい。他の薬剤の例としては、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、解熱剤、未分化幹細胞に対して免疫誘導できる化合物等が挙げられる。
 本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に限定されず、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、散剤、懸濁剤、乳剤、エマルション製剤、リポソーム製剤等の種々の剤型とすることができる。
 本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するために使用される。一般に、in vitroでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しいため、移植用細胞として調製された分化細胞中に、未分化幹細胞が残存してしまう場合がある。未分化幹細胞が残存したまま移植された場合、生体内で未分化幹細胞が増殖し、奇形腫等の疾患を生じる恐れがある。本実施形態の医薬組成物は、そのような疾患を治療又は予防するために、当該分化細胞を移植された対象に投与される。なお、未分化幹細胞の増殖に起因する疾患は、特に限定されないが、奇形腫や癌等を挙げることができる。
 本実施形態の医薬組成物の投与対象において、移植される分化細胞は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞であれば、特に限定されない。分化細胞は、好ましくは、iPS細胞又はES細胞から誘導されたものであり、より好ましくはiPS細胞から誘導されたものである。一例として、分化細胞は、iPS細胞から誘導された心筋細胞である。また、分化細胞は、上記≪移植用細胞の製造方法≫で記載した方法により製造された移植用細胞であってもよい。
 本実施形態の医薬組成物の投与経路は、有効成分の種類、製剤の形態、移植された分化細胞の種類、分化細胞が移植された場所等に応じて、適宜選択することができる。例えば、≪未分化幹細胞除去剤≫で述べたものと同様の投与方法であってもよい。
 本実施形態の医薬組成物の投与量及び投与間隔は、移植した分化細胞の種類、移植量、及び移植場所等;移植を受けた対象の年齢、性別、体重等;医薬組成物の投与方法等により、適宜選択することができる。投与量は、例えば、0.001mg~1000mg、0.01mg~100mg、0.1mg~30mg、0.1mg~10mg、0.5mg~5mg等を例示することができる。また、投与間隔は、1日に1~数度、数日~数ヶ月に1度等であってよい。例えば、1日に一度、又は1週間に一度等の投与を例示することができる。
 本実施形態の医薬組成物によれば、生体内に移植された細胞に未分化幹細胞が残存していた場合であっても、生体内で未分化幹細胞を選択的に除去することができる。そのため、生体内で未分化幹細胞が増殖することに起因する疾患を治療又は予防することができる。
 他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。
 また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。
 さらに、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象における、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患の治療又は予防に使用するための、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種、を提供する。
≪治療方法等≫
 1実施態様において、本発明は、未分化幹細胞除去剤を、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に投与することを含む、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法、を提供する。
 本実施形態の方法において、対象に投与される未分化幹細胞除去剤は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。本実施形態の方法は、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に投与することを含む、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法であるともいえる。
 また、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様である。 上記未分化幹細胞除去剤は、上記≪医薬組成物≫に記載の医薬組成物の形態で対象に投与されてもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、上記脂肪酸合成阻害剤等以外の他の成分と組み合わせて、対象に投与されてもよい。他の成分は、特に限定されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫及び≪医薬組成物≫で記載したもの等を挙げることができる。
 上記未分化幹細胞除去剤は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に、脂肪酸合成阻害剤等についての治療的有効量が投与される。脂肪酸合成阻害剤等の治療的有効量は、移植した分化細胞の種類、移植量、及び移植場所等;移植を受けた対象の年齢、性別、体重等;未分化幹細胞除去剤の投与方法等により異なるが、脂肪酸合成阻害剤等の有効成分量として、例えば、0.001mg~1000mg、0.01mg~100mg、0.1mg~30mg、0.1mg~10mg、0.5mg~5mg等を例示することができる。
 投与対象、及び対象疾患は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様のものを対象とすることができる。また、投与方法は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様に行うことができる。
 また、1実施態様において、本発明は、以下の(i)~(iii)の工程を含む、移植用細胞の移植方法を提供する:
(i)未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程;
(ii)前記工程(i)により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養し、移植用細胞を得る工程;及び
(iii)前記工程(iii)で得られた移植用細胞を、移植が必要な対象に移植する工程。
 本実施形態の移植方法における工程(i)及び(ii)は、上記≪移植用細胞の製造方法≫で記載した工程(i)及び(ii)と同様に行うことができる。また、本実施形態の移植方法の工程(ii)で使用する未分化幹細胞除去剤は、上記≪未分化細胞除去剤≫で記載したものと同様である。
 本実施形態の移植方法における工程(iii)は、前記工程(ii)で得られた移植用細胞を、移植が必要な対象に移植する工程である。「移植が必要な対象」とは、当該対象の生体内において、前記工程(ii)で得られた移植用細胞と同種の細胞に欠陥、損傷等が生じており、前記移植用細胞を移植することにより、当該細胞の欠陥、損傷等に起因する症状の改善が見込める対象である。移植は、一般的な細胞移植の手法により行うことができる。
 本実施形態の移植方法は、上記工程(i)~(iii)に加えて、他の工程を追加してもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。これらの工程を追加する場合、これらの工程は、上記工程(ii)と工程(iii)の間に行われる。このような精製工程や回収工程は、前記≪移植用細胞の製造方法≫に記載したように行うことができる。
 本実施形態の移植方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された移植用細胞を生体内に移植することができるため、奇形腫形成等のリスクが低減される。
 また、本実施形態の移植方法は、工程(iii)の後に、さらに以下の工程(iv)を行ってもよい。
(iv)前記工程(iii)で移植用細胞を移植した対象に、未分化幹細胞除去剤を投与する工程
 上記工程(iv)は、上記実施形態の治療又は予防する方法と同様に行うことができる。工程(iv)を行うことにより、たとえ移植用細胞に未分化幹細胞が残存したまま移植された場合であっても、奇形腫等の当該未分化幹細胞の増殖に起因する疾患の発症を予防することができる。
 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
 細胞の培養は、37℃、5%CO条件に設定されたインキュベーター内で行った。
(未分化幹細胞の培養)
 ヒト胚性幹細胞は、WiCell Research Instituteから入手したH9株を使用し、ヒト人工多能性幹細胞は、国立大学法人・京都大学iPS細胞研究所山中伸弥教授から入手した。
 ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞は、マトリゲル(BD Bioscience cat 354277)を用いて未分化維持培養を行った。培養液は、mTeSR1(STEMCELL Technologies Inc.cat 11875-119)を用いた。未分化維持培養液に関しては、mTeSR1の他に、Essential 8(Life Technologies)やTeSR2(STEMCELL Technologies Inc.)など、フィーダーフリー用の培地として一般的に使用されているものであれば使用可能である。またマトリックスとして、マトリゲルの他に、Vitronectin(Life Technologies)やiMatrix-511(Takara no.892001)などがあり、その他のフィーダーフリー用のマトリックスとして一般的に使用されているものであれば使用可能である。 
 植え継ぎに際しては、CTK solution(Repro CELL)、37℃5分にてヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のコロニーを分離した。細胞の分散処理に関しては、CTK solution以外に、StemPro Accutase(Life Technologies no.1110501)やTrypLE Express/Select(Life Technologies)も使用可能である。
(未分化幹細胞からの心筋細胞の誘導)
 未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導にあたり、今回の実験で用いた心筋細胞の分化誘導法は以下の通りである。
・心筋細胞への分化・誘導にあたり、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞が50~90%コンフルエントになったところで、RPMI培地(Invitrogen)にB27(インスリンなし、Invitrogen)およびCHIR99021(Selleckchem又はWako)6μMを添加したものに培地を交換した(Day 0)。
・Day 1~Day 2は、RPMI/B27インスリン(-)培地で培養を行った。
・次いで、Day 3~Day 5は、RPMI/B27インスリン(-)培地に、さらにIWP2 5μM又はIWR-1(Sigma I0161)5μMを添加した培地で培養を行った。
・さらに、Day 6~Day 7は、RPMI/B27インスリン(-)培地で培養を行った。
・そして、Day 8以降は、RPMI/B27インスリン(+)培地で培養を行った(Lian,X.,et al.,Nat Protocol,2013,8,162-175)。Day 8~Day 11の段階で、拍動する心筋細胞を確認することができた。
(未分化幹細胞からの線維芽細胞の誘導)
 未分化幹細胞から線維芽細胞への分化・誘導にあたり、今回の実験で用いた線維芽細胞誘導法は、以下の通りである。
・ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞が50~90%コンフルエントになったところで、MEMα培地(Invitrogen)に10%FBSを添加した培養液(bFGF不含)に交換し、培養を行った。、2~4日おきに培養液を交換して培養することにより、約10日でビメンチン陽性の線維芽細胞を得ることが出来た(Tohyama S, Cell Metabolism 2016参照)。
[実験例1]ヒトiPS細胞由来心筋細胞とiPS細胞とでのFASNの発現の比較
 上記に示す手順によりヒトiPS細胞から誘導した心筋細胞と、ヒトiPS細胞とが混在した状態にある細胞混合物を用意した。OCT4は未分化状態を表すマーカーとして使用した。FASNは、図1に示すとおり、脂肪酸合成に関与する酵素タンパク質である。上記細胞混合物の免疫染色により、OCT4及びFASNを発現する細胞を検出した。結果を図2に示す。また、DAPI染色の結果も併せて示す。
 図2に示される結果から、OCT4及びFASNの発現細胞が重なることが判明した。このことから、OCT4を発現しないヒトiPS細胞由来心筋細胞では、FASNの発現が低い一方で、OCT4を発現する未分化のヒトiPS細胞では、FASNの発現が非常に高いことが明らかとなった。
[実験例2]脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、各種未分化幹細胞株の培養
 StemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1(Stem Cell Technologies社製)に、図3に示す各終濃度(2μM、4μM、6μM、8μM、10μM)となるようOrlistat(Sigma社製、O4139)を添加し、本発明の1実施形態に係る培地を得た。Orlistatを含まない培地(0μM)、及び上記の各終濃度でOrlistatを含む各培地にて、以下の3種の細胞株を72時間培養した。
・253G4:ヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞)株
・Ffl14:ヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞)株
・H9:ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)株
 72時間の培養の後、細胞が有するアルカリホスファターゼ(ALP)の活性を、StemTAG(登録商標)アルカリホスファターゼ染色キット(Sigma 86-R)で発色させてAP染色を行い、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。各ウェルの様子を図3に示す。
 図3に示される結果から、Orlistatを含む培地での培養により、Orlistat濃度依存的に、各未分化幹細胞の細胞死が誘導されることが確認された。
[実験例3]各種脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤を含有する培地での、未分化幹細胞株の培養
 StemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1培地(Stem Cell Technologies社製)に、図4に示す各終濃度となるよう以下の6種の脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤をそれぞれ添加し、本発明の1実施形態に係る培地を得た。
・C75      :FASN阻害
・LY 294002:ACLY阻害
・SB 204990:ACLY阻害
・Etomoxier:CPT1阻害
・Perhexiline:CPT1阻害
 上記の脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤を含む各培地にて、253G4細胞を72時間培養した。
 72時間の培養の後、ALP染色を行い、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。各ウェルの様子を図4に示す。
 図4に示される結果から、上記のいずれの脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤を含む培地での培養によっても、脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の濃度依存的に、未分化幹細胞の細胞死が誘導されることが確認された。
[実験例4]脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、純化精製心筋細胞の培養
 上記に示す手順によりヒトiPS細胞から誘導した心筋細胞と、ヒトiPS細胞とを含む細胞混合物を用意した。文献(Tohyama,et al., (2016) Cell Metabolism, 23, 663-674.)に記載の方法に沿って、グルコース(-)グルタミン(-)乳酸添加培地で5日間ほど上記細胞混合物を培養して心筋細胞以外の細胞を死滅させ、純化精製心筋細胞を得た。次いで、終濃度10μMでOrlistatを含むMEMα+10%FBS培地(Orlistat(+))で、16日間培養した。コントロールとして、Orlistatを含まないMEMα+10%FBS培地(Orlistat(-))でも同様に培養を行った。Day9及びDay16の心筋細胞の様子を図5に示す。
 図5に示される結果から、Day9~Day16にかけて心筋細胞の成熟化(肥大化)が確認され、本実施形態に係る培地を用いて、純化精製心筋細胞を良好に培養可能であることが示された。
[実験例5]脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、線維芽細胞の培養
 上記に示す手順によりヒトiPS細胞から誘導した線維芽細胞と、ヒトiPS細胞とを含む細胞混合物を用意した。前記細胞混合物を、終濃度10μMでOrlistatを含むMEMα+10%FBS培地(Orlistat(+))で、9日間培養した。コントロールとして、Orlistatを含まないMEMα+10%FBS培地(Orlistat(-))でも同様に、前記細胞混合物の培養を行った。Day9の心筋細胞及びそのVimentin染色の結果を図6に示す。
 図6に示される結果から、本発明の1実施形態に係る培地を用いて、ヒトiPS細胞由来線維芽細胞を良好に培養可能であることが示された。
[実験例6]脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、ヒトiPS細胞由来心筋細胞とiPS細胞とを含む細胞混合物の培養
 上記に示す手順によりヒトiPS細胞から誘導した後に純化精製した心筋細胞と、ヒトiPS細胞とが混在した状態にある細胞混合物を用意した。上記細胞混合物の、OCT4に対する免疫染色を実施した。上記細胞混合物を、終濃度10μMでOrlistatを含むStemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1(Stem Cell Technologies社製)(Orlistat(+))で、72時間培養した。コントロールとして、Orlistatを含まないStemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1(Stem Cell Technologies社製)(Orlistat(-))でも同様に培養を行った。72時間の培養の後、免疫染色によりOCT4の発現細胞を検出した。2反復試験分の結果を図7に示す。また、DAPI染色の結果も併せて示す。同結果からOct4を発現する細胞のコロニー数を定量した3反復試験分の結果を図8に示す。
 図7~8に示される結果から、Orlistatを含まない培地(Orlistat(-))で培養を行った場合、OCT4を発現する未分化幹細胞が残存していること確認された。一方、Orlistatを含む培地(Orlistat(+))で培養を行った場合、OCT4を発現する未分化幹細胞の残存は検出されなかった。
 このことから、本発明の1実施形態に係る未分化幹細胞除去剤で、ヒトiPS細胞由来心筋細胞と、ヒトiPS細胞と、が混在した状態にある細胞混合物を培養することにより、当該細胞混合物において、未分化状態の細胞特異的に細胞死を誘導することができることが示された。また、当該細胞混合物から、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を含む分化状態の細胞のみを、選択的に選抜することができることが示された。
 実験例6にて、このようにして得られた細胞混合物からは、未分化幹細胞の性質を有する細胞が除かれており、未分化幹細胞の除去率も非常に高いものであった。当該細胞混合物は、生体への移植等の用途への適用が見込まれ、際立った顕著な有用性が示された。
[実験例7]ヒトiPS細胞由来心筋細胞とiPS細胞とでのFASNの発現の比較
 上記に示す手順によりヒトiPS細胞から誘導した心筋細胞と、ヒトiPS細胞とが混在した状態にある細胞混合物を用意した。トロポニンI(Troponin I:TnI)は心筋細胞のマーカーとして使用した。FASNは、図1に示すとおり、脂肪酸合成に関与する酵素タンパク質である。上記細胞混合物の免疫染色により、TnI及びFASNを発現する細胞を検出した。結果を図10に示す。また、DAPI染色の結果も併せて示す。
 図10に示される結果から、TnI及びFASNの発現細胞は重ならないことが判明した。このことから、TnIを発現するヒトiPS細胞由来心筋細胞では、FASNの発現が低い一方で、TnIを発現しない未分化のヒトiPS細胞では、FASNの発現が非常に高いことが明らかとなった。
 また、抗FASN抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ヒトiPS細胞(253G4)及びヒトiPS細胞から誘導した心筋細胞における、FASNの発現を確認した。陰性対照として、ヒト皮膚繊維芽細胞(HDF)を用いた。結果を図11に示す。
 図11に示される結果から、ヒトiPS細胞由来心筋細胞ではFSANの発現は検出されず、ヒトiPS細胞ではFASNが高発現することが示された。
[実験例8]コレステロール合成阻害剤を含有する培地での、未分化幹細胞株の培養
 StemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1培地(Stem Cell Technologies社製)に、図12に示す各終濃度(0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)となるようSimvastatin(S6196:Sigma Aldrich社製)を添加し、本発明の1実施形態に係る培地を得た。
 Simvastatinを含まない培地(0μM)及び上記各終濃度でSimvastatinを含む培地にて、253G4細胞を72時間培養した。
 72時間の培養の後、ALP染色を行い、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。各ウェルの様子を図12に示す。
 図12に示される結果から、Simvastatinを含む培地での培養によっても、Simvastatinの濃度依存的に、未分化幹細胞の細胞死が誘導されることが確認された。
[実験例9]脂肪酸合成阻害剤及びパルミチン酸を含有する培地での、未分化幹細胞株の培養
 StemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1(Stem Cell Technologies社製)に、図13に示す各終濃度(2μM、6μM、8μM)となるようOrlistat(Sigma社製、O4139)を添加し、本発明の1実施形態に係る培地を得た。Orlistatを含まない培地(0μM)、及び上記の終濃度でOrlistatを含む各培地に、さらに、パルミチン酸(終濃度50μM)、カルニチン(終濃度0.5mM)、及びBSA(終濃度8.3μM)を添加した各培地、並びにカルニチン(終濃度0.5mM)とBSA(終濃度8.3μM)とのみを添加した各培地を用意した。前記の各培地にて、ヒトiPS細胞株(253G4)を72時間培養した。
 72時間の培養の後、生細胞をLIVE/DEAD Assay(L3224:Thermo Fisher Scientific社製)で検出した。各ウェルの様子を図13に示す。また、同結果から、生細胞数を定量した結果を図14に示す。
 図13~14に示される結果から、Orlistatに加えてカルニチンとBSAとのみを添加した培地(BSA)での培養では、Orlistat濃度依存的に、ヒトiPSの細胞死が誘導されることが確認された。一方、Orlistatに加えて、パルミチン酸、カルニチン、及びBSAを添加した培地(PA-BSA)での培養では、ヒトiPS細胞の細胞死が抑制されることが確認された。脂肪酸であるパルミチン酸の添加により、ヒトiPS細胞の細胞死が抑制されたことから、OrlistatによるヒトiPS細胞の細胞死の誘導は、脂肪酸合成の阻害により生じていることが確認された。
[実験例10]FASNをノックダウンした未分化幹細胞株の培養
 ヒトiPS細胞株(253G4)に、FASNに対するsiRNA(FASN siRNA)を導入して、FASNノックダウン未分化幹細胞株(FASN KD未分化幹細胞株)を作製した。また、陰性対照(Negative Control:N/C)のsiRNAを導入した未分化幹細胞株を、陰性対照株(N/C未分化幹細胞株)として作製した。FASN KD未分化幹細胞株、及びN/C未分化幹細胞株におけるFASN発現を、抗FASN抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した結果を図15に示す。図15の結果から、FASN siRNA導入により、FASNの発現がノックダウンできていることを確認した。使用した各siRNAは、以下の通りである。
FASN siRNA:Applied Biosystems(登録商標) siRNA ID:s5030(Thermo Fisher Scientific社製)
N/C siRNA:SilencerTM Negative Control No. 1 siRNA(AM4611:Thermo Fisher Scientific社製)
 上記FASN KD未分化幹細胞株、及びN/C未分化幹細胞株を、StemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1(Stem Cell Technologies社製)で72時間培養し、細胞増殖を確認した。結果を図16に示す。
 図16に示される結果から、FASN KD未分化幹細胞株では、N/C未分化幹細胞株と比較して、細胞増殖が抑制されることが確認された。このことから、FSANは、未分化幹細胞の生存及び増殖に、必須な因子であることが示された。
[実験例11]パルミチン酸を含有する培地での、FASN KD未分化幹細胞株の酸培養
 StemFit培地(AJINOMOTO社製)又はmTeSR1(Stem Cell Technologies社製)に、パルミチン酸(終濃度50μM)、カルニチン(終濃度0.5mM)、及びBSA(終濃度8.3μM)を添加した培地(PA-BSA培地)、並びにカルニチン(終濃度0.5mM)とBSA(終濃度8.3μM)とのみを添加した培地(BSA培地)の各培地を用意した。前記の各培地にて、上記実験例11で作製したFASN KD未分化細胞株及びN/C未分化細胞株を72時間培養し、細胞増殖を確認した。結果を図17に示す。
 図17に示される結果から、PA-BSA培地で培養したFASN KD未分化幹細胞株(FASN KD w/PA-BSA)、BSA―PA培地で培養したN/C未分化幹細胞株(N/C w/PA-BSA)、及びBSA培地で培養したN/C未分化幹細胞株(N/C w/BSA)は、同程度の細胞増殖を示した。一方、BSA培地で培養したFASN KD未分化幹細胞株は、上記3株と比較して、細胞増殖が抑制された。このことから、FASNにより合成されるパルミチン酸は、未分化幹細胞の生存及び増殖に、必須な成分であることが示された。
 本発明によれば、未分化幹細胞の高効率な除去を可能とする未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法等を提供することができ、再生医療分野等に広く利用可能である。

Claims (17)

  1.  脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
  2.  前記脂肪酸合成阻害剤が、ATPクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、及びマロニル-CoAデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであり、
     前記脂肪酸利用阻害剤が、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1を標的として脂肪酸利用を阻害するものである、
     請求項1に記載の未分化幹細胞除去剤。
  3.  前記脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の適用対象中の濃度が、0.1~500μMである、請求項1又は2に記載の未分化幹細胞除去剤。
  4.  前記コレステロール合成阻害剤が、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ、HMG-CoA合成酵素、及びHMG-CoAレダクターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものである、請求項1に記載の未分化幹細胞除去剤。
  5.  前記コレステロール合成阻害剤の適用対象中の濃度が、0.01~50μMである、請求項1又は4に記載の未分化幹細胞除去剤。
  6.  グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤。
  7.  オルリスタット、C75、LY294002、SB204990、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる1又は2以上を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
  8.  請求項1~7のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤を含む培地。
  9.  未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、請求項1~7のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。
  10.  前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項9に記載の未分化幹細胞除去方法。
  11.  前記分化細胞が心筋細胞である、請求項10又は11に記載の未分化幹細胞除去方法。
  12.  以下の(i)及び(ii)の工程を含む、移植用細胞の製造方法:
     (i)未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程;及び
     (ii)前記工程(i)により得られた細胞混合物を、請求項1~7のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
  13.  前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項12に記載の製造方法。
  14.  前記分化細胞が心筋細胞である、請求項12又は13に記載の製造方法。
  15.  未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、
     請求項1~7のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物。
  16.  前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項15に記載の医薬組成物。
  17.  前記未分化幹細胞から誘導された分化細胞が心筋細胞である、請求項15又は16に記載の医薬組成物。
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CA3040637A CA3040637C (en) 2016-10-17 2017-10-17 Undifferentiated stem cell-removing agent, and method for removing undifferentiated stem cells
CN201780063213.0A CN110050060A (zh) 2016-10-17 2017-10-17 未分化干细胞去除剂以及去除未分化干细胞的方法
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SG11201903254PA SG11201903254PA (en) 2016-10-17 2017-10-17 Undifferentiated stem cell-removing agent, and method for removing undifferentiated stem cells
RU2019114023A RU2735247C1 (ru) 2016-10-17 2017-10-17 Удаляющее недифференцированные стволовые клетки средство и способ удаления недифференцированных стволовых клеток
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117951A (zh) * 2018-10-30 2020-05-08 澳门大学 通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用
RU2735247C1 (ru) * 2016-10-17 2020-10-29 Кейо Юниверсити Удаляющее недифференцированные стволовые клетки средство и способ удаления недифференцированных стволовых клеток
EP3902909A4 (en) * 2018-12-26 2022-08-24 Academia Sinica METHODS OF REGULATION OF POTENCY OF PLURIPOTENT STEM CELLS AND APPLICATIONS THEREOF

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102262557B1 (ko) * 2020-01-10 2021-06-09 주식회사 히에라바이오 심장 줄기세포의 기능성을 강화하는 방법
CN111979175A (zh) * 2020-08-28 2020-11-24 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种清除干细胞分化体系中残留的多能干细胞的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006022377A1 (ja) * 2004-08-27 2006-03-02 Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. 細胞内ミトコンドリアを指標とした心筋細胞の選択方法
WO2007088874A1 (ja) * 2006-01-31 2007-08-09 Asubio Pharma Co., Ltd. 幹細胞及び胎児由来の心筋細胞及び予定心筋細胞の精製方法
WO2010114136A1 (ja) * 2009-03-30 2010-10-07 第一三共株式会社 多能性幹細胞及び心筋細胞以外の分化細胞に対する細胞死誘導方法
WO2012057052A1 (ja) * 2010-10-25 2012-05-03 公立大学法人横浜市立大学 幹細胞の安定的維持、複製を制御するためのペプチジルプロリルイソメラーゼPin1の利用
WO2013100080A1 (ja) * 2011-12-27 2013-07-04 国立大学法人大阪大学 iPS細胞の腫瘍化を抑制することが可能な分化誘導方法
WO2016010165A1 (ja) * 2014-07-16 2016-01-21 学校法人慶應義塾 新規未分化幹細胞除去および心筋純化精製培地
JP2016093178A (ja) * 2014-11-11 2016-05-26 協和発酵キリン株式会社 幹細胞由来の分化細胞用培地、幹細胞からの分化細胞の製造及び該分化細胞を含む細胞医薬組成物の製造のための方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001034145A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 The Johns Hopkins University School Of Medicine Treating cancer by increasing intracellular malonyl coa levels
ATE481640T1 (de) * 2000-11-27 2010-10-15 Minerva Biotechnologies Corp Diagnostika, drogenscreening und behandlung für krebs
CA2540135C (en) * 2003-10-03 2012-12-04 Keiichi Fukuda Method of inducing the differentiation of stem cells into cardiomyocytes
RU2467066C2 (ru) 2007-07-31 2012-11-20 Дайити Санкио Комани, Лимитед Способ конструирования массы миокардиальных клеток и применение массы миокардиальных клеток
US20120214193A1 (en) 2009-10-30 2012-08-23 Keio University Method for measurement of fluorescence intensity of voltage-sensitive fluorescent dye
CN104968350A (zh) * 2012-12-19 2015-10-07 安皮奥制药股份有限公司 疾病的治疗方法
LT3119757T (lt) * 2014-03-17 2018-07-10 Pfizer Inc. Diacilglicerolio aciltransferazės 2 inhibitoriai, skirti panaudoti metabolinių ir susijusių ligų gydyme
RU2588666C1 (ru) * 2015-03-23 2016-07-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
JP6811489B2 (ja) * 2016-10-17 2021-01-13 学校法人慶應義塾 未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006022377A1 (ja) * 2004-08-27 2006-03-02 Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. 細胞内ミトコンドリアを指標とした心筋細胞の選択方法
WO2007088874A1 (ja) * 2006-01-31 2007-08-09 Asubio Pharma Co., Ltd. 幹細胞及び胎児由来の心筋細胞及び予定心筋細胞の精製方法
WO2010114136A1 (ja) * 2009-03-30 2010-10-07 第一三共株式会社 多能性幹細胞及び心筋細胞以外の分化細胞に対する細胞死誘導方法
WO2012057052A1 (ja) * 2010-10-25 2012-05-03 公立大学法人横浜市立大学 幹細胞の安定的維持、複製を制御するためのペプチジルプロリルイソメラーゼPin1の利用
WO2013100080A1 (ja) * 2011-12-27 2013-07-04 国立大学法人大阪大学 iPS細胞の腫瘍化を抑制することが可能な分化誘導方法
WO2016010165A1 (ja) * 2014-07-16 2016-01-21 学校法人慶應義塾 新規未分化幹細胞除去および心筋純化精製培地
JP2016093178A (ja) * 2014-11-11 2016-05-26 協和発酵キリン株式会社 幹細胞由来の分化細胞用培地、幹細胞からの分化細胞の製造及び該分化細胞を含む細胞医薬組成物の製造のための方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEN-DAVID, U. ET AL.: "Selective elimination of human pluripotent stem cells by an oleate synthesis inhibitor discovered in a high-throughput screen", CELL STEM CELL, vol. 12, no. 2, 2013, pages 167 - 179, XP055072276 *
BIEBERICH, E. ET AL.: "Selective apoptosis of pluripotent mouse and human stem cells by novel ceramide analogues prevents teratoma formation and enriches for neural precursors in ES cell -derived neural transplants", JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 167, no. 4, 2004, pages 723 - 734, XP002529566 *
HAQUE, A. ET AL.: "An engineered n-cadherin substrate for differentiation, survival, and selection of pluripotent stem cell -derived neural progenitors", PLOS ONE, vol. 10, no. 8, 5 August 2015 (2015-08-05), pages 1 - 19, XP055598695, DOI: 10.1371/journal.pone.0135170 *
See also references of EP3527657A4 *
SHIRAKI, NOBUAKI ET AL.: "Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells", CELL METABOLISM, vol. 19, no. 5, 2014, pages 780 - 794, XP055220770 *
TOHYAMA, SHUGO ET AL.: "Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells", CELL METABOLISM, vol. 23, no. 4, April 2016 (2016-04-01), pages 663 - 674, XP029504671 *
WANG, J. ET AL.: "Dependence of mouse embryonic stem cells on threonine catabolism", SCIENCE, vol. 325, 2009, pages 435 - 439, XP055102216 *
WANG, L. H. ET AL.: "Fatty acid synthesis is critical for stem cell pluripotency via promoting mitochondrial fission", THE EMBO JOURNAL, vol. 36, no. 10, 4 April 2017 (2017-04-04), pages 1330 - 1347, XP055598703, ISSN: 1460-2075, DOI: 10.15252/embj.201695417 *
YU , W. H. ET AL.: "Critical role of phosphoinositide 3-kinase cascade in adipogenesis of human mesenchymal stem cells", MOL CELL BIOCHEM, vol. 310, no. 1-2, 2008, pages 11 - 18, XP019578342 *
ZHANG, L. ET AL.: "Inhibition of stearoyl-coA desaturase selectively eliminates tumorigeneic nanog-positive cells", CELL CYCLE, vol. 13, 2014, pages 762 - 771, XP055478138 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2735247C1 (ru) * 2016-10-17 2020-10-29 Кейо Юниверсити Удаляющее недифференцированные стволовые клетки средство и способ удаления недифференцированных стволовых клеток
CN111117951A (zh) * 2018-10-30 2020-05-08 澳门大学 通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用
EP3902909A4 (en) * 2018-12-26 2022-08-24 Academia Sinica METHODS OF REGULATION OF POTENCY OF PLURIPOTENT STEM CELLS AND APPLICATIONS THEREOF

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