WO2006022377A1 - 細胞内ミトコンドリアを指標とした心筋細胞の選択方法 - Google Patents

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WO2006022377A1
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cardiomyocytes
cardiomyocyte
mitochondrial
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Fumiyuki Hattori
Keiichi Fukuda
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Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd.
Keio University
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting cardiomyocytes from a whole heart constituent cell group or a cell group derived from stem cells, and a method using the method.
  • Cardiomyocytes in adults have lost proliferative activity, and have to rely on heart transplantation for diseases such as severe myocardial infarction and cardiomyopathy.
  • diseases such as severe myocardial infarction and cardiomyopathy.
  • the problem of shortage of heart donors has not been overcome, and there is an urgent need to find treatment methods other than heart transplantation.
  • the production of cardiomyocytes outside the body and depletion of cardiomyocytes is expected to be the most promising way to rescue patients who must rely on heart transplantation.
  • the method for producing cardiomyocytes is suggested to be used by differentiating embryonic stem cells and existing in vivo!
  • a method of taking out stem cells (somatic stem cells) and inducing differentiation has been studied.
  • stem cells have the problem of producing cells other than cardiomyocytes as by-products and the problem of remaining undifferentiated cells, until now, It was said that the cell population that had undergone 'differentiation' could not be used for treatment as it was. Therefore, in order to make it practical in humans, it is essential to select cardiomyocytes from the cell population that has undergone differentiation 'induction.
  • Non-Patent Document 1 FASEB J. 2000; 14: 2540-2548
  • Non-Patent Document 2 Am J Physiol 1985; 248: R415-421
  • the present inventors have used various properties of cardiomyocytes that have not been directly linked to the selection of cardiomyocytes in the past, and thus used as a whole heart constituent cell mixture or cardiomyocyte-differentiable cell-derived cell mixture. Therefore, it is an object to develop a method for selecting cardiomyocytes without genetic modification.
  • the inventors of the present invention have the property that cardiomyocytes have a relatively high mitochondrial content compared to all other cells and the membrane potential of cardiomyocyte mitochondria compared to all other cell mitochondria. Based on its high nature, it has succeeded in solving the above-mentioned problems, labeling a cardiomyocyte-containing cell mixture with a mitochondrial-specific labeling reagent, and comparing the relative mitochondrial content of the cells and the Z Or, by measuring mitochondrial membrane potential, we established an epoch-making method of selecting cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes.
  • V A method for selecting cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes is provided.
  • a method for selecting cardiomyocytes from a cardiomyocyte-containing cell mixture based on the relative mitochondrial content and membrane potential of the cells without genetic modification of the cardiomyocytes is provided.
  • a cell mixture containing cardiomyocytes is labeled with a mitochondrial indicator, and the relative mitochondrial content of cells and the relative mitochondrial membrane potential of cells or cells are measured. It is characterized by.
  • the cardiomyocyte-containing cell mixture is a whole heart constituent cell mixture or a cardiomyocyte-sortable cell-derived cell mixture.
  • the cell capable of differentiating myocytes is selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells and egg cells.
  • the mitochondrial indicator used in this embodiment of the present invention is A1372, D27 3, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M75 10, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 and T3168, and in this embodiment, M7512, T3168 , Preferably 668 or R302.
  • a method for concentrating cardiomyocytes from a cardiomyocyte-containing cell mixture without genetic modification of cardiomyocytes :
  • the method is provided.
  • the cardiomyocyte-containing cell mixture is characterized in that it is a whole heart constituent cell mixture or a cardiomyocyte-sortable cell-derived cell mixture.
  • the cardiomyocyte-differentiable cells are selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells and egg cells.
  • the method may further include a step of culturing the labeled cells in the absence of a mitochondrial indicator after the step (1) and before the step (2). Good.
  • the mitochondrial indicator used in this embodiment of the present invention is A1372, D27 3, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M75 10, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 and T3168, and in this embodiment, M7512, T3168 , Preferably 668 or R302.
  • a method for producing cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes comprising:
  • the method is provided.
  • the cardiomyocyte-differentiable cell is selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells, and egg cells.
  • a step of culturing labeled cells in the absence of a mitochondrial indicator may be further included.
  • the mitochondrial indicator used in this embodiment of the present invention is A1372, D27 3, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M75 10, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 and T3168, and in this embodiment, M7512, T3168 , Preferably 668 or R302.
  • a method for evaluating a cardiomyocyte ratio in a cardiomyocyte-containing cell mixture comprising:
  • the method is provided.
  • the cardiomyocyte-containing cell mixture is a whole heart constituent cell mixture or a cardiomyocyte-differentiable cell-derived differentiated cell mixture.
  • the cardiomyocyte-differentiable cells are selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells and egg cells.
  • the mitochondrial indicator used in this embodiment of the present invention is A1372, D27 3, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M75 10, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 and T3168, and in this embodiment, M7512, T3168 , Preferably 668 or R302.
  • the present invention performs gene modification of cardiomyocytes from a cell mixture containing cardiomyocytes based on the relative mitochondrial content of cells and / or the relative mitochondrial membrane potential of cells. It relates to providing a method for selecting cardiomyocytes without it.
  • the relative mitochondrial content of cells and the relative mitochondrial membrane potential of cells or cells can be measured by labeling the cardiomyocyte-containing cell mixture with a mitochondrial indicator.
  • cardiomyocyte-containing cell mixture means all cell mixtures consisting of cardiomyocytes and other cells.
  • a whole heart constituent cell mixture or a cardiomyocyte-differentiable cell-derived cell mixture can be mentioned as an example.
  • a whole heart component cell mixture is obtained from the same or different heart tissue as a result of various enzyme treatments.
  • cardiomyocyte-sortable cell-derived cell mixtures are cells that can differentiate from cardiomyocytes (eg, stem cells such as embryonic stem cells and somatic stem cells, progenitor cells, and egg cells such as fertilized egg cells and somatic cell clones).
  • cardiomyocytes This is a mixture of cells such as cardiomyocytes, non-cardiomyocytes, undifferentiated cells, nerve cells, and epithelial cells obtained as a result of culturing cardiomyocytes from the cells. Furthermore, the case where cardiomyocytes are differentiated from ES cells is also included.
  • the mitochondrial content and mitochondrial membrane potential of a cell can be quantitatively determined by labeling the mitochondrion in the cell with a mitochondrial indicator.
  • the absolute value of the mitochondrial indicator-derived signal reflecting the mitochondrial content and mitochondrial membrane potential varies depending on the maturity of the cardiomyocytes used in the analysis and the exposure conditions such as the type of labeling reagent and the exposure time. Therefore, what is important in the present invention is the relative relationship of the mitochondrial indicator-derived signal amount between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes, which is not the absolute value of the mitochondrial indicator-derived signal amount.
  • cells showing relatively high fluorescence intensity can be selected as cardiomyocytes. Preliminary experiments were conducted with samples of cardiomyocyte-containing cell mixtures that were actually planned for use, and the prescribed conditions (i.e. mitochondrial content and
  • the range of the mitochondrial indicator-derived signal amount of cells to be selected was classified using the mitochondrial content and Z or mitochondrial membrane potential as an index, and the relatively high mitochondrial content and Set to collect cells that show mitochondrial membrane potential.
  • the "mitochondrial indicator” is a substance that can specifically label mitochondria in living cells and measure its abundance, can specifically label mitochondria in living cells, and can control mitochondrial membrane potential. Any substance can be used as long as it can specifically measure mitochondria in living cells and can measure both the abundance and mitochondrial membrane potential.
  • a substance having fluorescence and binding to a mitochondrial structure substance eg, protein, lipid, sugar chain, nucleic acid or metabolite thereof
  • fluorescence A substance that is selectively taken up into mitochondria by the membrane potential of mitochondria,
  • Examples include (3) a substance that is converted into a fluorescent substance by the action of a mitochondrial structure substance, or (4) a substance that cannot be diffused outside the mitochondria by the action of a mitochondrial structure substance.
  • mitochondrial indicators A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, Use M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, Rl 4060, R22420, S7563, T639, T668, T669 or T3168 (compound product numbers: all available from Molecular Probe) More preferably, a force that can use M7514, M7 510, M7511, M7512, M7513, M22425, M22426, T668, R302, or T3168, most preferably T668, R302, M7514 or T3168. It is not limited to these.
  • the mitochondrial indicators that can be used in the present invention exemplified above have the following structures, respectively.
  • mitochondrial indicator S7563, S7567, and S7585 (compound product numbers: available from Molecular Probe) can also be used.
  • These mitochondrial indicators are known to emit fluorescence having a specific wavelength and a specific wavelength for each substance. For example, for M7514, 490 n It is known that it emits 516 nm fluorescence in response to an excitation wavelength of m, and in the case of T3168 it emits 590 fluorescence in response to an excitation wavelength of 535 nm.
  • cardiomyocytes have a higher intracellular mitochondrial content and higher mitochondrial membrane potential than other cells. Therefore, when a cardiomyocyte-containing cell mixture is labeled using a mitochondrial indicator, Cardiomyocytes show stronger fluorescence intensity than other cells.
  • the mitochondrial content and Z or mitochondrial membrane potential in each cell of the labeled cardiomyocyte-containing cell mixture are measured.
  • cells with higher labeling intensity are defined as cardiomyocytes, and based on the measured mitochondrial content and Z or mitochondrial membrane potential, cells with relatively high mitochondrial content, mitochondria with relatively high membrane potential are selected. Isolate cardiomyocytes that are cell populations that contain or are mitochondria-containing cells that are relatively high mitochondrial-containing cells and have a relatively high membrane potential.
  • a cell sorter is used to detect cardiomyocytes (the mitochondrial content is relatively high and relatively high). Contains mitochondria with a higher membrane potential and therefore has a relatively stronger fluorescence intensity) than non-cardiomyocytes (contains mitochondria with a relatively low or low membrane potential) Therefore, the cardiomyocytes can be selected alive and without genetic modification of the cardiomyocytes, because the fluorescence intensity based on the labeling with the mitochondrial indicator is also relatively weak.
  • the cell sorter used in the present invention may be any device as long as it can collect fluorescence-labeled cells in a living state.
  • a fluorescent cell sorter Fluorescent Activated
  • Force that can use Cell Sorter FACS (registered trademark) (BD, Franklin Lakes, NJ USA)
  • FACS registered trademark
  • Other devices Beckman, Coulter, Cytomation, etc.
  • the cardiomyocytes may be selected immediately after the cardiomyocyte-containing cell mixture is labeled with a mitochondrial indicator. However, if it is desired that the cardiomyocyte-containing cell mixture is selected more reliably, it is labeled with a mitochondrial indicator, and then further cultured in the absence of the mitochondrial indicator. You may choose. Mitoko After labeling with a Dodria indicator, further culturing in the absence of a mitochondrial indicator decreases the mitochondrial indicator content per cell as the cells divide. Therefore, in proliferating cells, the longer the culture time, the lower the mitochondrial indicator content in the cells and the lower the fluorescence intensity.
  • cardiomyocytes have lost their ability to divide or are very low, so even if the culture time is long, the content of mitochondrial indicator per cell does not decrease as much as other cells, and it is relatively strong.
  • the fluorescence intensity can be maintained. Therefore, after the cardiomyocyte-containing cell mixture is labeled with a mitochondrial indicator and cultured in the absence of a mitochondrial indicator for a certain period, specifically several days, the cardiomyocyte and other cells are cultured. The difference in labeling intensity between the two increases, and cardiomyocytes can be selected more reliably.
  • the present invention provides a method for concentrating cardiomyocytes from a cardiomyocyte-containing cell mixture without genetic modification of the cardiomyocytes, comprising: (1) a cardiomyocyte-containing cell mixture And (2) selecting cardiomyocytes based on the relative mitochondrial content of the cells and / or the relative mitochondrial membrane potential of the cells; and Also provide.
  • the cardiomyocyte-containing cell mixture is either a whole heart component cell mixture or a cell mixture derived from a cardiomyocyte cell.
  • the whole heart component cell mixture is a mixture of cardiomyocytes and non-cardiomyocytes, and if heart transplantation is carried out as it is, serious non-cardiomyocytes cause serious side effects in the recipient's heart. There is a risk of causing it. Therefore, in order to more safely and surely transplant the cardiomyocytes to the recipient, it is preferable that the ratio of the cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture is kept as high as possible before the transplantation.
  • the cardiomyocyte-differentiable cells for example, stem cells, progenitor cells or egg cells can be used.
  • the labeled cells are cultured in the absence of a mitochondrial indicator after the step (1) and before the step (2). You may do more.
  • the fluorescence intensity of other cells can be reduced to increase the relative fluorescence intensity in the myocardial cells, and the cardiomyocytes can be more reliably concentrated.
  • mitochondrial indicator A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 or T3168 can be used, preferably the mitochondrial indicator is M7512, T3168, ⁇ 668 or R302. use.
  • the present invention provides a method for producing cardiomyocytes from a cardiomyocyte-containing cell mixture without genetic modification of the cardiomyocytes, comprising: (1) a cardiomyocyte-differentiable cell (2) labeling the cardiomyocyte-containing cell mixture with a mitochondrial indicator; and (3) the relative mitochondrial content of the cells and There is also provided a method comprising the step of selecting cardiomyocytes based on the relative mitochondrial membrane potential of the cells or cells.
  • the cardiomyocyte-containing cell mixture is either a whole heart constituent cell mixture or a cell mixture derived from a cardiac muscle cell-sortable cell.
  • the whole heart component cell mixture is a mixture of cardiomyocytes and non-cardiomyocytes, and if heart transplantation is carried out as it is, serious non-cardiomyocytes cause serious side effects in the recipient's heart. There is a risk of causing it. Therefore, in order to safely and surely transplant the cardiomyocytes to the recipient, it is preferable to provide a preparation in which the ratio of cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture is as high as possible.
  • the cardiomyocyte-differentiable cells for example, stem cells, progenitor cells or egg cells can be used.
  • the labeled cells are cultured in the absence of a mitochondrial indicator after the step (1) and before the step (2). You may do more.
  • the mitochondrial indicators include A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 or T3168 can be used, preferably the mitochondrial indicator is M7512, T3168, ⁇ 668 or R302. use.
  • Pluripotent stem cells are capable of almost permanent or long-term cell growth in an undifferentiated state by in vitro culture, exhibit a normal nuclear (chromosomal) type, and can be grown under appropriate conditions.
  • the germ layers ectoderm, mesoderm, and endoderm are defined as cells that have the ability to differentiate into cells of all lineages.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells) isolated from early embryos, embryonic germ cells (embryonic germ cells: EG cells) isolated from embryonic primordial germ cells, Three types of adult pluripotent stem cells (MAPCs) isolated from adult bone marrow are best known!
  • embryonic stem cell force cardiomyocyte differentiation / induction methods include: floating aggregation culture method, hanging drop culture method, co-culture method with feeder cell, swivel culture method, soft Examples thereof include an agar culture method and a microcarrier culture method.
  • embryonic stem cells in a single cell state (a state in which individual cells are dispersed in a liquid phase without adhesion between cells by enzyme digestion or the like) was suspended at a cell density of a few hundred cells ZmL to, leukemia inhibitory factor (leukemia inhibitory fa C tor: LIF )
  • leukemia inhibitory factor leukemia inhibitory fa C tor: LIF
  • Doing suspension culture in the absence of differentiation inhibitors such as, ES cells to each other against wear Aggregates to form an embryonic body (EB) -like structure called embryoid body (EB), and then cultured in a floating or adherent state to form cardiomyocytes with autonomous pulsatility. It is known that differentiation can be induced.
  • a droplet made of 20 ⁇ l of the culture solution is prepared on the lid of the culture plate, and several hundred cells are contained in the droplet.
  • cells form a cell mass at the bottom of the droplet, that is, at the tip of the droplet, and the cell mass differentiates into autonomously pulsatile cardiomyocytes. It is known that it can be guided.
  • cells having the characteristics of mesenchymal cells preferably bone marrow stromal cell-like traits such as ST2 cells, ⁇ 9 cells, ⁇ 6 cells, etc. Feed the cells by high-density culture, mitomycin C treatment, or irradiation, etc., and then inoculate the cells after seeding ES cells in a single cell state in the medium.
  • mesenchymal cells preferably bone marrow stromal cell-like traits such as ST2 cells, ⁇ 9 cells, ⁇ 6 cells, etc.
  • the present invention provides, in the fourth aspect, a method for evaluating a cardiomyocyte ratio in a cardiomyocyte-containing cell mixture, (1) labeling the cardiomyocyte-containing cell mixture with a mitochondrial indicator. And (2) measuring the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes based on the relative mitochondrial content of the cells and the myocardium based on Z or the relative mitochondrial membrane potential of the cells There is also provided a method comprising the step of selecting cells.
  • the cardiomyocyte-containing cell mixture is either a whole heart constituent cell mixture or a cell mixture derived from a cardiomyocyte cell.
  • the whole heart component cell mixture is a mixture of cardiomyocytes and non-cardiomyocytes, and if heart transplantation is carried out as it is, serious non-cardiomyocytes cause serious side effects in the recipient's heart. There is a risk of causing it. Therefore, in order to more safely and surely transplant the cardiomyocytes to the recipient, it is preferable that the ratio of the cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture is kept as high as possible before the transplantation.
  • the cardiomyocyte-differentiable cells for example, stem cells, progenitor cells or egg cells can be used.
  • the mitochondrial indicators include A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 or T3168 can be used, preferably the mitochondrial indicator is M7512, T3168, ⁇ 668 or R302. use.
  • cardiomyocytes can be selected from a cardiomyocyte-containing cell mixture without genetic modification of the cardiomyocytes. Further, by the method of the present invention, it is also possible to concentrate cardiomyocytes in a mixture of cells containing cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes, and to produce cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes. It is possible. Furthermore, the ratio of cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture prepared by various methods can be evaluated.
  • the ratio of cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture can be improved, which may occur due to the presence of non-cardiomyocytes when transplanted into the recipient's heart. Certain various side effects can be reduced.
  • FIG. 1 shows a labeled image of the whole heart constituent cell mixture from which the neonatal rat heart force was also extracted with the mitochondrial indicator M7512.
  • FIG. 2 shows a labeled image of the mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocyte-differentiable cell-derived cell mixture with the mitochondrial indicator M7512.
  • FIG. 3 shows the distribution of a cell population when a whole heart constituent cell mixture from which neonatal rat heart force is also extracted is labeled with the mitochondrial indicator M7512 and the fluorescence amount of each cell is detected individually.
  • Fig. 4 shows the results when the cell mixture derived from mouse embryonic stem cells was labeled with a mitochondrial indicator, M7512, and the fluorescence of each cell was detected individually. The distribution of the cell population is shown.
  • FIG. 5 shows a labeled image of the whole heart constituent cell mixture shown in FIG. 3 with an antibody against a cardiomyocyte marker, an anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody.
  • FIG. 6 shows a labeled image of the cardiomyocyte-differentiable cell-derived cell mixture shown in FIG. 4 with an anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody against myocardial cells.
  • Figure 7 shows the whole heart component cell mixture from which the neonatal rat heart force was also extracted, labeled with a mitochondrial indicator, T3168, and individually detected the fluorescence level of each cell for distribution analysis and cell sorting.
  • the labeled images with an antibody against a cardiomyocyte marker and an anti-sarcoma a-actinin antibody are shown.
  • FIG. 8-1 shows the results of population analysis and labeling of all neonatal rat heart cells with:, fluorescence amount individually detected, distribution analysis and cell sorting, and each cell group Shows a labeled image with an antibody against an anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody.
  • FIG. 8-1 is a diagram showing that the cell population derived from the neonatal rat fetal heart was separated into three cell populations by ⁇ 668 fluorescence intensity.
  • Fig. 8-2 shows that almost all cells in the cell group with the strongest fluorescent signal derived from ⁇ 668 are cardiomyocytes, and almost all of the medium fluorescent cell population is not cardiomyocytes.
  • FIG. 8-3 is a diagram showing that cells can be obtained with R302 as well as ⁇ 668.
  • FIG. 9-1 shows cell population analysis of rat fetal whole heart constituent cells by mitochondrial indicator ⁇ 668 and immunostaining of sorted cells for actinin.
  • FIG. 9-1 is a diagram showing that the cell population force derived from rat fetal heart on day 1 of embryonic day 1 was separated into three cell populations by 668 fluorescence intensity.
  • Figure 9-2 shows that almost all cells in the cell group with the strongest fluorescent signal derived from ⁇ 668 are cardiomyocytes, and almost all of the medium fluorescent cell population is not cardiomyocytes.
  • FIG. 10 shows staining of whole fetal cells and purification of cardiomyocytes with mitochondrial indicator ⁇ 668.
  • Figure 10-1 shows the fluorescence intensity in the cell population derived from the embryonic day 9 rat fetus. It is a figure which shows that one cell population is mainly observed in the cell population by.
  • Fig. 10-2 shows immunostaining with actin, a cardiomyocyte marker.
  • Fig. 11 shows the staining and cell population analysis of all rat heart constituent cells with the mitochondrial indicator T668 until 8 days after birth and embryonic day 11
  • FIG. 12 shows staining of various cell groups derived from mouse embryonic stem cells with mitochondrial indicator T668 and immunostaining for actinin in the sorted cell population.
  • a cardiomyocyte-containing cell mixture is obtained as a whole heart constituent cell mixture or a stem cell-derived cell mixture.
  • the whole heart constituent cell mixture is obtained by first isolating the ventricle from the heart of an aborted fetus or newborn, chopping it with a scissors, and then treating it with an enzyme such as collagenase to remove intercellular junctions.
  • the stem cell-derived cell mixture is obtained by culturing stem cells such as embryonic stem cells and somatic stem cells by using a hanging drop culture method (Bader A, et al., Differentiation, 2001 68: p.31-43). It can be prepared by inducing differentiation.
  • a stem cell-derived cell mixture it is desirable to perform a treatment that increases the differentiation level of cardiomyocytes (eg, addition of aU-trans retinoic acid) to the differentiated 'induced cell mixture! / ,.
  • M7512, T3168, T668 or R302 (all manufactured by Molecular Probe) is used as a preferred mitochondrial indicator.
  • Cells are labeled with ⁇ 7512, ⁇ 3168, ⁇ 668 or R302 by adding M7512, T3168, ⁇ 668 or R302 to the whole heart component cell mixture or stem cell-derived cell mixture in the culture medium and incubating. .
  • the difference between the amount of labeled signal of cardiomyocytes and the amount of labeled signal of other cells can be further amplified.
  • cardiomyocyte specific markers for example, myosin heavy chain / light chain sarcoma ⁇ -actinin, troponin I, ANP, GATA-4, Nkx2. 5.
  • a method of detecting with an antibody against MEF-2c can be used.
  • a method of labeling with an anti-Sarcomeric a-actrinin antibody is used.
  • Example 1 New calf chick rat heart I »strength Labeling of the extracted whole heart constituent fine mixture by mitochondrial indication
  • This example was performed to ascertain whether the method of the present invention could be used to detect cardiomyocytes in the whole heart constituent cell mixture.
  • the culture solution was mixed with fetal bovine serum (JRH Bioscience) at a final concentration of 10%.
  • -Glucose) medium Invitrogen
  • the mitochondrial indicator M7512 manufactured by Molecular Probe was added to the culture cells so prepared to a final concentration of 100 nM and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the plate was washed 4 times with a medium, and further cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • non-myocardial cells surrounded by a force frame indicate that M7512 fluorescence is clearly observed in cardiomyocytes and that the cardiomyocytes contain a large amount of mitochondria in the cells. It was shown that only a few mitochondria were contained.
  • Example 2 Mouse Embryo Itoda a Summary Mitochondria in ku
  • This example was performed to ascertain whether the method of the present invention could be used to detect cardiomyocytes in stem cell derived cell mixtures.
  • the all trans- retinoic acid was added to the culture medium to a final concentration of 10- 8 M.
  • Example 3 Analysis of fine cell distribution in a mixture of whole heart fine cells labeled with a mitochondrial indicator
  • the purpose of this example was to clarify how much cardiomyocytes are present in the whole heart component cell mixture of Example 1.
  • a whole heart component cell mixture was prepared by the method described in Example 1 and labeled with M7512. This labeled whole heart component cell mixture was subjected to cell population distribution analysis by FACS (registered trademark) (BD, Franklin Lakes, NJ USA). The results are shown in Figure 3.
  • FSC-A on the horizontal axis is an indicator of cell size.
  • the whole heart constituent cell mixture can be divided into cells existing in the P5 region having relatively high fluorescence intensity and P6 region having relatively low fluorescence intensity.
  • the cells present in the P5 region were sorted as cardiomyocytes, and the cells present in the P6 region were sorted as cells other than the myocardial cells and cultured.
  • a mouse embryonic stem cell-derived cell mixture was prepared by the method described in Example 2.
  • FSC-A on the horizontal axis is an index indicating the cell size.
  • the mouse embryonic stem cell-derived cell mixture can be divided into cells having relatively high fluorescence intensity and existing in the P2 region, and cells existing in other regions having relatively low fluorescence intensity. it can.
  • cells present in the P2 region were collected as cardiomyocytes and cultured.
  • Example 5 Heart structure
  • ⁇ Summary Kung or ⁇ ⁇ Scaled summary with heart summary marker This example shows how much cardiomyocyte force was present in the whole heart constituent cell mixture by the method of Example 3 The purpose was to clarify the concentrated force.
  • the cell populations belonging to the P5 region and P6 region sorted by the method described in Example 3 were mixed with fetal calf serum (EQUITECH-BIO) at a final concentration of 10% as a culture solution. After culturing in MEM medium (SIGMA) for 12 hours, it was fixed with paraformaldehyde.
  • EQUITECH-BIO fetal calf serum
  • the fixed cells were labeled using a mouse anti-sarcoma ⁇ -actin antibody (Sigma), which is a cardiomyocyte marker, and then a goat anti-mouse antibody (Molecular Probes, Inc.) labeled with a green fluorescent substance. ) was used to visualize mouse anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody bound to the cells.
  • a mouse anti-sarcoma ⁇ -actin antibody Sigma
  • Molecular Probes, Inc. goat anti-mouse antibody
  • cardiomyocytes recognized by the anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody and other cells are mixed, and all cells The proportion of cardiomyocytes was 30%.
  • 99% or more of the cells collected from the 5th region were shown to be cardiomyocytes.
  • cardiomyocytes remained slightly in the cells collected from the 6 region force, but only with the same cardiomyocyte ratio before selection by the method of the present invention.
  • cardiomyocytes can be selected and concentrated with high purity from the whole heart constituent cell mixture using the method of the present invention.
  • Example 6 Mouse Embryo Itoda a Summary Kun ⁇ Tsukiru et al. Measured fate by Itoda Marker
  • the purpose of this example was to clarify how much the cardiomyocytes present in the mouse embryonic stem cell-derived cell mixture were concentrated by the method of Example 4.
  • a cell population belonging to the P2 region sorted by the method described in Example 4 and the others was cultured in ⁇ -MEM medium (SIGMA) mixed with fetal bovine serum (EQUITECH-BIO) at a final concentration of 10% as a culture solution for 12 hours, and then fixed with paraformaldehyde. .
  • SIGMA ⁇ -MEM medium
  • EQUITECH-BIO fetal bovine serum
  • the fixed cells were labeled with a mouse anti-sarcoma ⁇ -actin antibody (Sigma), a cardiomyocyte marker, and a goat anti-mouse antibody (Molecular) labeled with a green fluorescent substance.
  • a mouse anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody bound to the cells was visualized. The result is shown in FIG. In FIG. 6, the results for the mouse embryonic stem cell-derived cell mixture are shown in the upper row, and the results for the cells collected in Example 2 in the region 2 are shown in the lower row.
  • cardiomyocytes recognized by the anti-sarcoma ⁇ -actinin antibody and other cells are mixed, and all cells
  • the proportion of cardiomyocytes was 10%.
  • cardiomyocytes can be selected and concentrated with high purity from a mouse embryonic stem cell-derived cell mixture using the method of the present invention.
  • This example was performed to confirm that the same results as those obtained with M7512 were obtained when labeling with the mitochondrial indicator T3168.
  • Example 8 Staining of new calf rat rat heart cells with mitochondrial indication ⁇ 668
  • Neonatal rat fetal hearts were treated with 0.025% (w / v) collagenase (Sigma) and trypsin (GIBCO), and the cell population was recovered.
  • a mitochondrial indicator ⁇ 668 manufactured by Molecular Probe
  • the cell culture medium is exposed for 15 minutes at 37 ° C, washed three times, and immediately subjected to FACS analysis. It was. As a result, it was separated into three cell populations by T668 fluorescence intensity (Fig. 8-1). The high fluorescent cell population and the medium fluorescent cell population with the strongest fluorescence signal were separated and cultured.
  • FIG. 8-2 Next, immunostaining for actinin was performed on the cultured cells to identify cardiomyocytes (Fig. 8-2). As a result, it was found that almost all cells in the cell group with the strongest fluorescent signal derived from T668 were cardiomyocytes, and almost all of the medium fluorescent cell population was not cardiomyocytes. Similarly, R302 (manufactured by Molecular Probe) was also analyzed and similar results were obtained (Fig. 8-3).
  • Example 9 Mitochondrial indication T668 M7514 New cow calf rat whole heart constituent fine stains Comparison analysis of membrane lightning level per unit mitochondria.
  • a cell population was collected using the same materials and methods as in Example 8. Then, staining was performed with a membrane potential-independent mitochondrial indicator M7514 (manufactured by Molecular Probe) that stains cardiomyocytes specifically with mitochondria and a membrane potential-dependent mitochondrial indicator T668 that stains cardiomyocytes specifically with mitochondria. . Immediately after this, FACS analysis was performed. The fluorescence from T668 and the fluorescence from M7514 have different wavelengths and can be detected separately. Three cell populations were detected using T668 fluorescence as an index. From the analysis shown in Example 8, the highest It is known that the highly fluorescent cell population showing fluorescence is a cardiomyocyte group, and the medium fluorescent cell population is a non-cardiomyocyte.
  • individual cell groups were sorted by a ratio obtained by dividing the fluorescence intensity derived from T668 by the fluorescence intensity derived from M7514.
  • the group of cells identified as cardiomyocytes based on the T668 signal when, for example, 150% was used as the fluorescence intensity ratio of T668 to M7514, more than 150% of the cells were 90% of the total.
  • Cells identified as non-cardiomyocytes had a T668 fluorescence intensity ratio of more than 150% for M7514, but only 13% of the total. This difference means that cardiomyocytes have higher membrane potential per mitochondria than mitochondria compared to non-cardiomyocytes.
  • Embryonic Day 13 rat fetal heart was treated with collagenase and trypsin to collect cell populations.
  • the medium in which the cells were dispersed was exposed to mitochondrial indicator T668 at a final concentration of 1 / z M for 15 minutes at 37 ° C, washed three times, and immediately subjected to FACS analysis. They were separated into three cell populations by T668 fluorescence intensity (Figure 9-1).
  • the fluorescence signal signal with the strongest fluorescence signal was collected from each of the high fluorescence cell population and the medium fluorescence cell population.
  • Embryonic day 9 rat fetuses were treated with collagenase and trypsin and cell populations were collected.
  • the cell suspension was exposed to mitochondrial indicator ⁇ 668 at a final concentration of 1 ⁇ for 15 minutes at 37 ° C, washed three times, and immediately subjected to FACS analysis.
  • One cell population was mainly observed in the fluorescence intensity cell population, and no clear cell population was found in the high fluorescence intensity region, which is expected to be detected as cardiomyocytes. (Figure 10-1).
  • few cells show higher fluorescence than the main cell population. Since it was present at a strong rate, it was separated and recovered as a highly fluorescent cell population.
  • Example 12 Staining of rat whole heart constituent cells from 8 days after birth to 11 days of embryonic day with mitochondrial indicator T668 FACS analysis
  • ES cells were differentiated into cell groups containing cardiomyocytes. This multicellular mass was treated with collagenase and trypsin to obtain discrete cells.
  • the cells in which the cells were dispersed were exposed to mitochondrial indicator ⁇ 668 at a final concentration of 1 ⁇ for 15 minutes at 37 ° C, washed three times, and immediately subjected to FACS analysis.
  • One cell population is mainly observed in the cell population by fluorescence intensity, and the analysis power using whole heart samples in the late development period No clear cell population is found in the high fluorescence intensity region that is expected to be detected as a cardiomyocyte (Fig. 12). However, since there were cells that showed higher fluorescence than the main cell population, they were separated and recovered as a highly fluorescent cell population.
  • cardiomyocyte marker 98% or more were found to be cardiomyocytes. Conversely, collect and cultivate the main cell population When we performed nourishment and immunostaining, most of myocardial cells were strong.
  • Neonatal rat fetal hearts were treated with collagenase and trypsin and cell populations were collected.
  • the medium in which the cells were dispersed was exposed to mitochondrial indicator ⁇ at a final concentration of 1 ⁇ ⁇ for 15 minutes at 37 ° C, washed three times, and immediately subjected to FACS analysis. They were separated into three cell populations by S7563 fluorescence intensity. The cell population with the strongest fluorescence signal was collected and sampled.
  • cardiomyocytes can be selected from a cardiomyocyte-containing cell mixture without genetic modification of cardiomyocytes. Further, by the method of the present invention, it is also possible to concentrate cardiomyocytes in a mixture of cells containing cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes, and to produce cardiomyocytes without genetic modification of cardiomyocytes. It is possible. Furthermore, the ratio of cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture prepared by various methods can be evaluated.
  • the ratio of cardiomyocytes in the cardiomyocyte-containing cell mixture can be improved, which may occur due to the presence of non-cardiomyocytes when transplanted into the recipient's heart. Certain various side effects can be reduced.

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Abstract

　全心臓構成細胞群や幹細胞由来の分化細胞群から、遺伝子の改変を伴わずに心筋細胞を選び出す方法を開発することを課題とする。 　本発明者らは、上述した心筋細胞の諸性質に基づいて、ミトコンドリア特異的標識試薬を用いて、ゲノムの改変を伴わずに、心筋細胞を選び出す画期的な方法を確立した。即ち、本発明者らは、心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法；心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法；心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法；及び心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価する方法；を提供する。

Description

明 細 書
細胞内ミトコンドリアを指標とした心筋細胞の選択方法
技術分野
[0001] 本発明は、全心臓構成細胞群もしくは、幹細胞に由来する細胞群からの心筋細胞 の選択方法と、その方法を利用する方法に関する。
背景技術
[0002] 成体における心筋細胞は増殖活性を喪失しており、重症な心筋梗塞、心筋症など の疾患では心臓移植に頼らざるを得ない。しかし、現状では心臓のドナー不足の問 題を克服するには至っておらず、心臓移植以外の治療方法を見出すことが急務であ る。これに対して、心筋細胞を体外で作製し、心筋細胞の補充に充てることは、心臓 移植に頼らなくてはならない患者を救済する最も有望な方法と予想されている。
[0003] 心筋細胞の作製方法は、胚性幹細胞を分化させて用いる方法、並びに生体内に 存在することが示唆されて！ヽる幹細胞 (体性幹細胞)を取り出し、分化を誘導する方 法などが検討されている。しかし、幹細胞の性質として、心筋細胞以外の細胞を副産 物として産生してしまうという問題点や、未分化な細胞を残存させる性質を有するとい つた問題点が存在するために、これまでは、分化'誘導を行った細胞集団をそのまま 治療に用いることは出来ないとされていた。そのため、ヒトにおいて実用可能にするた めには、分化'誘導を行った細胞集団から心筋細胞を選び出すことが必須である。
[0004] 現在、心筋細胞を精製する方法としては、あら力じめ幹細胞のゲノムに何らかのマ 一力一遺伝子の導入を行う方法以外に有効な方法は報告されていない（FASEB J. 2 000; 14: 2540-2548) oしかしながら、ゲノムを改変することは、それ自体に倫理的な 問題を持つ上、細胞ガン化率の変化等、予測不可能な重大リスクを伴うため、ヒトに おける実用化のためには大きな問題をはらんでいる。
[0005] 心臓にぉ 、て、酸素消費量が主要な組織に比べて高 、こと、及び心臓におけるミト コンドリアの含有量が比較的多いことは、知られている（Am J Physiol 1985; 248: R41 5-421) oまた、心筋細胞が細胞分化'成熟すると、分裂能を著しく消失することは広く 知られている。しかしながら、上述したような心筋細胞の性質を応用して心筋細胞を 選びだそうとする試みは従来の技術分野においては全く知られていない。さらには、 ミトコンドリアの膜電位に着目して心筋細胞ミトコンドリアの膜電位と他の細胞ミトコンド リアの膜電位を直接比較検討した例は無ぐミトコンドリアの膜電位を指標として心筋 細胞の選択を検討した例は報告されて ヽな ヽ。
非特許文献 1 : FASEB J. 2000; 14: 2540-2548
非特許文献 2 : Am J Physiol 1985;248:R415-421
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明者らは、従来は直接的には心筋細胞を選び出すこととは結びついていなか つた心筋細胞の諸性質を用いて、全心臓構成細胞混合物や心筋細胞分化可能細 胞由来細胞混合物から、遺伝子の改変を伴わずに心筋細胞を選び出す方法を開発 することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、心筋細胞が、他の全ての細胞と比較して相対的にミトコンドリア含有 量が多いという性質及び心筋細胞ミトコンドリアが他の全ての細胞ミトコンドリアと比較 してその膜電位が高 、と 、う性質に基づ 、て、上述した課題を解決することに成功し 、ミトコンドリア特異的標識試薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識し、細胞の 相対的ミトコンドリア含有量及び Z又はミトコンドリア膜電位を測定することにより、心 筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞を選択するという、画期的な方法を確立 した。
[0008] 具体的には、本発明の第一の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、細 胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づ
Vヽて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法を提供する。
[0009] すなわち、本発明の方法の第一の態様において、
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量に基づいて、心 筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法；
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心 筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法；または 心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び膜電位に 基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法； を提供する。
[0010] 本発明の方法の当該態様は、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混 合物を標識し、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞の相対的ミトコンド リア膜電位を測定することを特徴とする。
[0011] ここで、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分ィ匕 可能細胞由来細胞混合物であることを特徴とする。
[0012] また、筋細胞分化可能細胞は、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択 されることを特徴とする。
[0013] 本発明の当該態様においては、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混 合物を標識した後、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞の相対的ミト コンドリア膜電位を測定する前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞 を培養する工程を更に含んでもょ 、。
[0014] さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬が、 A1372, D27 3、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M75 10、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R 634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669及び T3168からなる群から選択され ることを特徴とし、この態様においては、 M7512、 T3168、 Τ668又は R302であることが 好ましい。
[0015] 本発明の第二の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝 子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法であって：
(1)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;並びに
(2)細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Ζ又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位 に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法を提供する。
[0016] 本発明の第二の態様にぉ 、て、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混 合物又は心筋細胞分ィ匕可能細胞由来細胞混合物であることを特徴とする。 [0017] また、心筋細胞分化可能細胞は、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選 択されることを特徴とする。
[0018] 本発明の第二の態様において、前記（1)の工程の後、（2)の工程の前に、ミトコンド リア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含んでもよい。
[0019] さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬は、 A1372、 D27 3、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M75 10、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R 634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669及び T3168からなる群から選択され ることを特徴とし、この態様においては、 M7512、 T3168、 Τ668又は R302であることが 好ましい。
[0020] 本発明の第三の態様において、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製 造する方法であって：
(1)心筋細胞分化可能細胞から、心筋細胞を分化 ·誘導し、心筋細胞含有細胞混合 物を調製する工程；
(2)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;並びに
(3)細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Ζ又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位 に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法を提供する。
[0021] 本発明の方法の第三の態様において、心筋細胞分化可能細胞は、幹細胞、前駆 細胞及び卵細胞からなる群から選択されることを特徴とする。
[0022] また、前記 (2)の工程の後、（3)の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下に て標識した細胞を培養する工程を更に含んでもよい。
[0023] さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬は、 A1372、 D27 3、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M75 10、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R 634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669及び T3168からなる群から選択され ることを特徴とし、この態様においては、 M7512、 T3168、 Τ668又は R302であることが 好ましい。 [0024] 本発明の第四の態様において、心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比 率を評価する方法であって：
(1)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;並びに
(2)細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位 に基づいて、非心筋細胞に対する心筋細胞の比率を計測する工程；
を含むことを特徴とする前記方法を提供する。
[0025] 本発明の方法の第四の態様において、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成 細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来分化細胞混合物であることを特徴とす る。
[0026] また、心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選 択されることを特徴とする。
[0027] さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬は、 A1372、 D27 3、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M75 10、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R 634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669及び T3168からなる群から選択され ることを特徴とし、この態様においては、 M7512、 T3168、 Τ668又は R302であることが 好ましい。
[0028] 以上のことから、本発明は、一態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、細胞 の相対的ミトコンドリア含有量及び/又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づい て、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法を提供することに 関する。
[0029] 細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Ζ又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位の 測定は、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識することにより 、行うことができる。
[0030] ここで「心筋細胞含有細胞混合物」 t 、う場合、心筋細胞とそれ以外の細胞とからな る全ての細胞混合物を意味する。例えば、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分 化可能細胞由来細胞混合物を、その例としてあげることができる。全心臓構成細胞 混合物とは、同種若しくは異種の心臓組織から種々の酵素処理の結果として得られ る、心筋細胞、内皮細胞、間質細胞、平滑筋細胞、等の細胞力もなる混合物のことを いう。また、心筋細胞分ィ匕可能細胞由来細胞混合物とは、心筋細胞分化可能細胞（ 例えば、胚性幹細胞や体性幹細胞等の幹細胞、前駆細胞、及び受精卵細胞や体細 胞クローン等の卵細胞)を、当該細胞から心筋細胞を分化させる条件下にて培養し た結果得られる、心筋細胞、非心筋細胞、未分化細胞、神経細胞、上皮細胞等の細 胞カもなる混合物のことをいう。更に、 ES細胞から心筋細胞を分化'誘導した場合も 含まれる。
[0031] 細胞のミトコンドリア含有量及びミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリア指示薬を用い て細胞内のミトコンドリアを標識することにより、定量ィ匕することができる。しかしながら 、ミトコンドリア含有量及びミトコンドリア膜電位を反映するミトコンドリア指示薬由来シ グナルの絶対値は、解析に用いる心筋細胞の成熟度により、また標識試薬の種類、 暴露時間などの暴露条件により変化する。そのため、本発明において重要なのは、ミ トコンドリア指示薬由来シグナル量の絶対値ではなぐ心筋細胞と非心筋細胞との間 におけるミトコンドリア指示薬由来シグナル量の相対関係である。そして、本発明にお いては、相対的に高い蛍光強度を示す細胞を、心筋細胞として選択することができる 。実際に使用を予定している心筋細胞含有細胞混合物の試料を用いて予備的実験 を行い、目的に合致した心筋細胞集団の規定条件 (即ち、ミトコンドリア含有量及び
Z又はミトコンドリア膜電位の程度と心筋細胞との関係）の適正化を行う。具体的には 、予備的実験において、ミトコンドリア含有量及び Z又はミトコンドリア膜電位を指標と して、選択すべき細胞のミトコンドリア指示薬由来シグナル量の範囲を区分けし、相 対的に高いミトコンドリア含有量及び及びミトコンドリア膜電位を示す細胞を回収する ように設定する。
[0032] 本発明において、「ミトコンドリア指示薬」とは、生細胞中のミトコンドリアを特異的に 標識できてその存在量を測定しうる物質、生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識 できてミトコンドリア膜電位を測定しうる物質、又は生細胞中のミトコンドリアを特異的 に標識できてその存在量とミトコンドリア膜電位の両方を測定しうる物質であれば、ど のような物質であってもよい。例えば、（1)蛍光を有し、ミトコンドリア構造物質 (例えば 、タンパク質、脂質、糖鎖、核酸又はこれらの代謝産物等)と結合する物質、（2)蛍光 を有し、ミトコンドリアの膜電位によってミトコンドリア内に選択的に取り込まれる物質、
(3)ミトコンドリア構造物質の作用により蛍光を発する物質に変換される物質、又は (4 )ミトコンドリア構造物質の作用によりミトコンドリア外に拡散できなくなる物質などが例 としてあげられる。
[0033] 本発明にお 、ては、ミトコンドリア指示薬の具体例として、 A1372、 D273、 D288、 D30 8、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M 7512、 M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R634、 R648、 Rl 4060、 R22420, S7563、 T639、 T668、 T669又は T3168等（化合物製品番号：いずれも Molecular Probe社から入手可能）を使用することができ、より好ましくは、 M7514、 M7 510、 M7511、 M7512, M7513、 M22425, M22426, T668、 R302、又は T3168を、最も好 ましくは T668、 R302、 M7514又は T3168を使用することができる力 これらのものに限 定されない。上記に例示した本発明において使用できるミトコンドリア指示薬は、それ ぞれ次の構造を有して 、る。
[0034] [化 1]
A1372の構造
肝式： C26H38BrN3
肝量： 472.51
CAS番号： 75168-11-5
名称： Acridinium, 3,6-bis(dimethylamino)-10-nonyl-, bromide
Figure imgf000008_0001
[0035] [化 2] D273の構造
式： C29H37IN2O2
量： 572.53
CAS番号 53213-82-4
Benzoxazolium, 3-hexyl-2-(3-(3-hex l-2(3H)- 名称： benzoxazolylidene)-l-propenyl)-, iodide
Figure imgf000009_0001
[0036] [化 3]
D288の搆造
式： Ci6HwIN2
»量： 366.24
CAS番号
名称： P ndinium, 4-(2-(4-(aimethylamino phenyl)ethenyl)- 1-methyl, iodide
CH„N >n Π - N(CH }Q
3 、
[0037] [化 4]
D308の構造
： ίΗ1式： Ci6HI9IN2
ίΗ1量： 366.24
CAS番号： 2156-29.8
称： P ridinium, 2-(2-(4-(dimethylamino)phenyl)ethenvI)- 1-methyl, iodide
Figure imgf000010_0001
[0038] [化 5]
D378の構造
式： C31H4iN202I
量： 600.58
CAS番号： N/A
名称： N/A
Figure imgf000010_0002
[0039] [化 6] D426の構造
式： C17H21IN2
量： 380.27
CAS番号： 3785-01-1
称： pyridiniuin, 2-(2-(4-dimethylamino)phenyl)ethenyI)-l- ethvl, iodide
Figure imgf000011_0001
[0040] [化 7]
D632の構造
式： C2iH18N203
^ Λ： 346J8
CAS番号： 109244-58-8
称： Benzoic acid, 2-(3,6-diamino-9H-xanthene-9-vl)-, methyl ester
Figure imgf000011_0002
[0041] [化 8] D633の構造 ίΗ^式： C2gH32N203 ίΗ1量： 444.57 CAS番号： N/A 名称： N/A
Figure imgf000012_0001
[化 9]
D22421 の構
式： C27H21IN202 量： 532J8 CAS番号： N/A 名称： N/A
Figure imgf000012_0002
[化 10] D23806の構造 （成分 A： ジヒドロ口ーダミン 123) 式： C21H18N203
^ Λ.： 346J8
CAS番号： 109244-58-8
称： Benzoic acid, 2-(3,6-diamino-9H-xanthene-9-vl)-, methyl ester
Figure imgf000013_0001
[0044] [化 11]
L6868の構造
^式： C2SH22N4Ofi
iH量： 510.50
CAS番号： 22103-92-0
名称： 9，9'-Biacridiniuin， 10,10 -dimethyl-
Figure imgf000013_0002
[0045] [化 12] M7502の構造
式： C34H30Cl3N3O 量： 602.99
CAS番号： N/A
名称： N/A
C!
=CH -CH=^
Figure imgf000014_0001
M7510の構造
式： C24H24C12N20 量： 427.37 CAS番号： N/A 名称： N/A
Figure imgf000015_0001
[0047] [化 14]
M7511の構造 肝式： C24H25C1N20 量： 392.93
CAS番号： N/A 名称： N/A
Figure imgf000015_0002
[0048] [化 15]
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
-ai iqBiDO-£t'9X4ci 'z ^tZ' [liu3qd([iq uiojom3)-^ .
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M7514の構造
式： C34H28C15N30
量： 671.88
CAS番号： 201860-17-5
Benzoxazotium, 2-[3- [5,6-dichloro-l^-bis [[4- 称： (ch!oromethyl)phenvl]methyl]-l,3- dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene]-l- propenyI]-3-methyI-, chloride
Figure imgf000017_0001
051] [化 18]
[oz^ [esoo]
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V/N ：
V/N ： ^ SVJ
QVLP9 ： ¾^
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CSSSl0/S00Zdf/X3d LY M22425の構造 式： C39H36C1SN3 量： 724.00 CAS番号： N/A 名称： N/A
Figure imgf000019_0001
]
M22426の構造
式： C34H3<iCl2N2
^H1量： 543,58
CAS番号： /A
名称： N/A
Figure imgf000020_0001
[0055] [化 22]
R302の構造
ίΗ1式： C21H"CIN203
ίΗ1量： 380.83
CAS番号： 62669-70-9
称： Xanthvlium, 3,6-diamino-9-(2-(methoxycarbonvl) phenyl, chloride
Figure imgf000020_0002
[0056] [化 23] R634の構造
式： C28H31C1N2。3
量： 479.02
CAS番号： 989-38-8
タ . Xanthylium, 9-(2-(ethox carbonyl)phenyl)-3,6- · bisrethylamino)-2,7-dimethyl, chloride
Figure imgf000021_0001
[0057] [化 24]
R648の構造
式： C34H43C1N207
ίΗ1量： 627.18
CAS番号： Ν/Α
名称： Ν/Α
Figure imgf000021_0002
[0058] [化 25] R14060の構造
式： C23H19F5N20
量： 434.41
CAS番号： N/A
名称： N/A
Figure imgf000022_0001
[0059] [化 26]
R22420の構造
式： C21H17C1N203
^ S.： 380.83
CAS番号： 62669-70-9
称： Xanthylium, 3,6-diamino-9- 2-(methoxycarbony]) phenyl, chloride
Figure imgf000022_0002
[0060] [化 27] T639の構造
5H1式： C Hi^OCl
^H1量： 378.90
CAS番号： 6837-70-3
称： Xanthylium, 3 ,6-bis (aimethylamino) -9-phenyl, chloride
Figure imgf000023_0001
[0061] [化 28]
T668の構造
式： C25H2SCIN2O7
量： 500.93
CAS番号：
Xanthylium, j,6-bis(dimethyIaminoj-9-(2- ^methoxvcarbonyl)phenyl)-. 名称：
perchlorate
Figure imgf000023_0002
[0062] [化 29] T669の構造
肝式： CMH27C1N207
量： 514.96
CAS番号： 115532-52-0
^ . Xanthylium, 3,6-bis(dimethylamino)-9- [2- (ethoxycarbonyl)phenyl] -,
perchlorate
Figure imgf000024_0001
[0063] [化 30]
T3168の構造
ίΗ1式： C2SH27CI4IN4
奸量： 52.23
CAS番号： 47729-63-5
1 H-Benzimidazolium, 5,6-dichloro-2- [3-(5,6-dichloro-1 - 名称： diethyl-l dihydro-2H-benzimidazol-2- ylidene)-! -propenvl] -1,3-diethyl-, iodide, (E、-
Figure imgf000024_0002
[0064] 更に、ミトコンドリア指示薬として、 S7563、 S7567及び S7585 (化合物製品番号: Mole cular Probe社から入手可能)も用いることができる。
[0065] これらのミトコンドリア指示薬は、それぞれの物質に特有の励起波長を有し、特有の 波長を有する蛍光を発光することが知られている。例えば、 M7514の場合には、 490 n mの励起波長を受けて 516 nmの蛍光を発光し、また、 T3168の場合には、 535 nmの 励起波長を受けて 590應の蛍光を発光することが知られて 、る。
[0066] 前述したとおり、心筋細胞は、他の細胞と比較して細胞内のミトコンドリア含有量が 多ぐまたミトコンドリア膜電位が高いため、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含 有細胞混合物を標識すると、心筋細胞は他の細胞と比較して、より強い蛍光強度を 示す。本発明においては、まず、標識した心筋細胞含有細胞混合物の各細胞内に おけるミトコンドリア含有量及び Z又はミトコンドリア膜電位を測定する。次により強い 標識強度を示す細胞を心筋細胞として規定した上で、測定したミトコンドリア含有量 及び Z又はミトコンドリア膜電位に基づいて、相対的高ミトコンドリア含有細胞集団、 相対的に高い膜電位を有するミトコンドリアを含有する細胞集団、又は相対的高ミトコ ンドリア含有細胞であって且つ相対的に高い膜電位を有するミトコンドリア含有細胞 である集団である心筋細胞を分離する。
[0067] 例えば上述した蛍光発光性のミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混 合物を標識する場合、セルソーターを使用して、心筋細胞 (ミトコンドリア含有量が相 対的に多ぐ且つ相対的に高い膜電位を有するミトコンドリアを含有するため、相対 的により強い蛍光強度を示す)を、心筋細胞以外の細胞 (ミトコンドリア含有量が相対 的に少ない、又は相対的に低い膜電位を有するミトコンドリアを含有するため、ミトコ ンドリア指示薬による標識に基づく蛍光強度も相対的に弱い)から区別し、その結果 心筋細胞を、生きたままで、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、選択することができ る。本発明において使用するセルソーターは、蛍光標識された細胞を生きたまま分 取できるものであればどのようなものであってもよぐ具体的な装置としては、例えば 蛍光細胞分取機（Fluorescent Activated Cell Sorter ;FACS (登録商標））（BD, Frank lin Lakes, NJ USA)を使用することができる力 これ以外の装置（Beckman社、 Coulter 社、 Cytomation社など）を使用してもよい。
[0068] 心筋細胞の選択は、心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬により標識し た直後に行ってもよい。し力しながら、心筋細胞含有細胞混合物力もより確実に心筋 細胞を選択することを望む場合には、ミトコンドリア指示薬で標識した後、ミトコンドリア 指示薬の非存在下にてさらに培養を行い、その後心筋細胞を選択してもよい。ミトコ ンドリア指示薬で標識した後、ミトコンドリア指示薬の非存在下でさらに培養を行うと、 細胞が分裂するにつれて、 1細胞あたりに含まれるミトコンドリア指示薬含有量は減少 する。従って、増殖性の細胞では培養時間が長くなればなるほど、細胞内のミトコンド リア指示薬含有量が減少し蛍光強度が低下する。その一方で心筋細胞は分裂能を 失っているか又は非常に低下しているため、培養時間が長くなつても、 1細胞あたりの ミトコンドリア指示薬含有量が他の細胞ほど減少せず、相対的に強い蛍光強度を維 持することができる。従って、心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用い て標識した後、ミトコンドリア指示薬の非存在下にてさらに一定期間、具体的には数 日間、培養することにより、心筋細胞とそれ以外の細胞との間での標識強度の差が拡 大し、より確実に心筋細胞を選択することができる。
[0069] また、本発明は、第二の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞 の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法であって、 (1)心筋細胞含有細 胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;及び (2)細胞の相対的ミトコ ンドリア含有量及び/又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を 選択する工程;を含むことを特徴とする方法もまた、提供する。
[0070] この態様にぉ 、て、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心 筋細胞分ィ匕可能細胞由来細胞混合物のいずれかである。ここで全心臓構成細胞混 合物は、心筋細胞と非心筋細胞との混合物であり、そのままの状態で心臓移植を行 うと、非心筋細胞の存在により、レシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起 こす危険性が存在する。そのため、より安全'確実にレシピエントに対する心筋細胞 の移植を行うため、移植前に、心筋細胞含有細胞混合物における心筋細胞の比率 をできるだけ高くしておぐ即ち濃縮しておくことが好ましい。また、心筋細胞分化可 能細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞または卵細胞を使用することができる。
[0071] この方法において、より確実に心筋細胞を濃縮するためには、前記（1)の工程の後 、（2)の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養するェ 程をさらに行ってもよい。この工程により、他の細胞の蛍光強度を低下させて心筋細 胞内の相対的な蛍光強度を強めることができ、より確実に心筋細胞を濃縮することが できる。 [0072] この態様においても、ミトコンドリア指示薬としては、前述した通り、 A1372、 D273、 D 288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R634 、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669または T3168を使用することができ、好 ましくは、ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302を使用する。
[0073] また、本発明は、第三の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞 の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法であって、 (1)心筋細胞分化可 能細胞から、心筋細胞を分化，誘導し、心筋細胞含有細胞混合物を調製する工程； ( 2)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;及び (3) 細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Ζ又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基 づ ヽて心筋細胞を選択する工程；を含むことを特徴とする方法もまた、提供する。
[0074] この態様にぉ 、て、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心 筋細胞分ィ匕可能細胞由来細胞混合物のいずれかである。ここで全心臓構成細胞混 合物は、心筋細胞と非心筋細胞との混合物であり、そのままの状態で心臓移植を行 うと、非心筋細胞の存在により、レシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起 こす危険性が存在する。そのため、より安全'確実にレシピエントに対する心筋細胞 の移植を行うため、移植に際しては、心筋細胞含有細胞混合物における心筋細胞の 比率をできるだけ高くした調製物を提供することが好ましい。また、心筋細胞分化可 能細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞または卵細胞を使用することができる。
[0075] この方法においては、より確実に心筋細胞を製造するために、前記（1)の工程の後 、（2)の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養するェ 程をさらに行ってもよい。
[0076] この態様においても、ミトコンドリア指示薬としては、前述した通り、 A1372、 D273、 D 288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R634 、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669または T3168を使用することができ、好 ましくは、ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302を使用する。
[0077] 心筋細胞を分化'誘導する方法として、より未分化で多彩な分化能を有している多 能性幹細胞 (pluripotent stem cells)から分化'誘導する方法が、すでに当該技術分 野においていくつか開発されている。多能性幹細胞とは、試験管内培養により未分 化状態を保ったまま、ほぼ永続的又は長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（ 染色体)型を呈し、適当な条件下において三胚葉 (外胚葉、中胚葉、及び内胚葉)す ベての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。現在、多能性幹細胞 としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells： ES細胞）、胎児期 の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells： EG細胞）、そ して成体骨髄から単離される成人型多能性幹細胞（multipotent adult progenitor cell s： MAPC)の 3種が最もよく知られて!/、る。
[0078] 例えば、多能性幹細胞のうちの胚性幹細胞力 心筋細胞を分化'誘導する方法は 、浮遊凝集培養法、ハンギングドロップ培養法、フィーダ一細胞との共培養法、旋回 培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法等を挙げることができる。
[0079] 例えば浮遊凝集培養法の場合、単一細胞状態 (酵素消化等を施すことで細胞同士 の接着がな 、個々の細胞が液相中で分散した状態）とした胚性幹細胞を、培地に数 百細胞 ZmLの細胞密度になるように懸濁し、白血病阻害因子 (leukemia inhibitory f aCtor: LIF)等の分化抑制因子を存在させずに浮遊培養を行うと、 ES細胞同士が接 着、凝集し、胚様体 (embryoid body : EB)とよばれる初期胚類似の構造体を形成し、 その後、 EBを浮遊状態もしくは接着状態で培養することにより、自律拍動性を有した 心筋細胞に分化'誘導できることが知られている。
[0080] また例えば、ハンギングドロップ培養法の場合、培養皿のふたに、 20 μ 1の培養液か らなる液滴を作製し、この液滴中に細胞数百個を含ませ、この培養皿のふたを培養 皿に被せて静置することにより、細胞が液滴の底面、即ち液滴の先端部分において 細胞塊を形成し、この細胞塊を自律拍動性を有した心筋細胞に分化'誘導できること が知られている。
[0081] また例えば、フィーダ一細胞との共培養法を用いる場合、間葉系細胞の性質を有し た細胞、好ましくは ST2細胞、 ΟΡ9細胞、 ΡΑ6細胞等の骨髄ストローマ細胞様の形質 を有する細胞を高密度培養、マイトマイシン C処理、又は放射線照射等の方法により フィーダ一化し、その上に、培地に単一細胞状態の ES細胞を播種後、培養すること により、自律拍動性を有した心筋細胞に分化'誘導できることが知られている。
[0082] また、本発明は、第四の態様において、心筋細胞含有細胞混合物中における心筋 細胞比率を評価する方法であって、 (1)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指 示薬を用いて標識する工程；並びに (2)細胞の相対的ミトコンドリア含有量に基づ!/ヽ て、非心筋細胞に対する心筋細胞の比率を計測する工程及び Z又は細胞の相対的 ミトコンドリア膜電位に基づ ヽて心筋細胞を選択する工程；を含むことを特徴とする方 法もまた、提供する。
[0083] この態様にぉ 、て、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心 筋細胞分ィ匕可能細胞由来細胞混合物のいずれかである。ここで全心臓構成細胞混 合物は、心筋細胞と非心筋細胞との混合物であり、そのままの状態で心臓移植を行 うと、非心筋細胞の存在により、レシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起 こす危険性が存在する。そのため、より安全'確実にレシピエントに対する心筋細胞 の移植を行うため、移植前に、心筋細胞含有細胞混合物における心筋細胞の比率 をできるだけ高くしておぐ即ち濃縮しておくことが好ましい。また、心筋細胞分化可 能細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞または卵細胞を使用することができる。
[0084] この態様においても、ミトコンドリア指示薬としては、前述した通り、 A1372、 D273、 D 288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22421, D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302、 R634 、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669または T3168を使用することができ、好 ましくは、ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302を使用する。
[0085] 心筋細胞の移植に関連する分野においては、心筋細胞を分化'誘導する方法とし て 、くつかの方法が公知であり、また将来的にも心筋細胞を分化 ·誘導する方法は 多数開発されることが予想される。し力しながら、上述したとおり、心臓への移植細胞 中に非心筋細胞が混在して 、ると、心臓移植に際してレシピエントの心臓にぉ 、て 重篤な副作用を引き起こす危険性が存在する。この方法によって、心臓への移植が 予定されている心筋細胞調製物中の心筋細胞の比率を、移植前に評価することによ つて、移植に用いられる心筋細胞調製物の確実性を事前に評価することができる。
[0086] 当該技術分野にぉ 、ては、心筋細胞の精製方法として、例えば、フローサイトメ一 ターや磁気ビーズ、パンユング法等の抗原 抗体反応に準じた方法 (Monoclonal An tioodies: principles and practice, Third Edition (Acad. Press, 1993)； Antibody Engin eering: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press, 199り)；兀となる ES細胞等の多能性幹細胞の遺伝子に前もって人為的な修飾を加え、薬剤耐性もしく は異所性蛋白質の発現能を付与することにより、心筋細胞としての形質を有する細 胞を回収する方法;及び精製度は低いが他の方法と組み合わせて用いることが容易 なショ糖、パーコール等の担体を用いた密度勾配遠心による細胞分画法 (Circ Res. 2002 20;91:501-508) )等力 具体例として知られている。
発明の効果
[0087] 本発明の方法により、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混 合物から心筋細胞を選択することができる。また、本発明の方法により、心筋細胞の 遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋細胞を濃縮すること、 そして心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造することもまた、可能であ る。さらに、種々の方法により調製された心筋細胞含有細胞混合物中における心筋 細胞比率を評価することも可能である。
[0088] 本発明において記載するこれらの方法により、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋 細胞の比率を向上させることができ、レシピエントの心臓に移植した際に非心筋細胞 の存在により発生するおそれのある種々の副作用を低減することができる。
図面の簡単な説明
[0089] [図 1]図 1は、新生仔ラット心臓力も抽出した全心臓構成細胞混合物のミトコンドリア指 示薬 M7512による標識像を示す。
[図 2]図 2は、マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物に対 するミトコンドリア指示薬 M7512による標識像を示す。
[図 3]図 3は、新生仔ラット心臓力も抽出した全心臓構成細胞混合物をミトコンドリア指 示薬 M7512にて標識し、各細胞の蛍光量を個々に検出した場合の細胞集団の分布 を示す。
[図 4]図 4は、マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞分ィ匕可能細胞由来細胞混合物を、ミ トコンドリア指示薬、 M7512にて標識し、各細胞の蛍光量を個々に検出した場合の細 胞集団の分布を示す。
[図 5]図 5は、図 3に示した全心臓構成細胞混合物の、心筋細胞マーカーに対する抗 体、抗サルコメァ α -ァクチニン抗体による標識像を示す。
[図 6]図 6は、図 4に示した心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物の、心筋細胞マ 一力一に対する抗体、抗サルコメァ α -ァクチニン抗体による標識像を示す。
圆 7]図 7は、新生仔ラット心臓力も抽出した全心臓構成細胞混合物に対してミトコン ドリア指示薬、 T3168による標識を行い、各細胞の蛍光量を個々に検出し分布解析と 細胞分取を行った集団の、心筋細胞マーカーに対する抗体、抗サルコメァ a -ァクチ ニン抗体による標識像を示す。
[図 8-1]図 8は新生仔ラット全心臓細胞に対して: による標識を行い、蛍光量を個 々に検出し分布解析と細胞分取を行った集団解析の結果並びに、各細胞群の心筋 細胞マーカーに対する抗体、抗サルコメァ α -ァクチニン抗体による標識像を示す。 ここで、図 8-1は、新生仔ラット胎仔心臓由来の細胞集団が、 Τ668蛍光強度によって 3つの細胞集団に分離されたことを示す図である。
[図 8-2]図 8-2は、 Τ668に由来する蛍光シグナルが最も強力つた細胞群の殆ど全ての 細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことを示す 図である。
[図 8-3]図 8-3は、 R302でも、 Τ668と同様に細胞を得ることができることを示す図であ る。
[図 9-1]図 9は、ミトコンドリア指示薬 Τ668によるラット胎仔全心臓構成細胞の細胞集 団解析と、分取細胞のァクチニンに対する免疫染色を示す。ここで、図 9-1は、胎生 1 3日のラット胎仔心臓由来の細胞集団力 Τ668蛍光強度によって 3つの細胞集団に 分離されたことを示す図である。
[図 9-2]図 9-2は、 Τ668に由来する蛍光シグナルが最も強力つた細胞群の殆ど全ての 細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことを示す 図である。
[図 10-1]図 10は、ミトコンドリア指示薬 Τ668による胎仔全細胞の染色と心筋細胞の精 製を示す。ここで、図 10-1は、胎生 9日のラット胎仔由来の細胞集団では、蛍光強度 による細胞集団では主に 1つの細胞集団が観測されることを示す図である。
[図 10-2]図 10-2は、心筋細胞マーカーであるァクチニンで免疫染色を行ったところ、
T668では粗 95%以上が心筋細胞であることが判明したことを示す図である。
[図 11]図 11は、ミトコンドリア指示薬 T668による生後 8日力も胎生 11日までのラット全 心臓構成細胞の染色と細胞集団解析
[図 12]図 12は、ミトコンドリァ指示薬 T668によるマウス胚性幹細胞由来多種細胞群の 染色と分取した細胞集団のァクチニンに対する免疫染色。
発明の実施の形態
[0090] (1)心筋細胞含有細胞混合物の調製
先ず、心筋細胞含有細胞混合物を、全心臓構成細胞混合物、又は幹細胞由来細 胞混合物として得る。
[0091] 全心臓構成細胞混合物は、まず中絶胎児又は新生仔の心臓から心室を単離し、こ れをノヽサミで細断した後、コラゲナーゼなどの酵素で処理することにより細胞間結合 を除去して細胞を分散させることにより、調製することができる。
[0092] 幹細胞由来細胞混合物は、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を、ハンギン グドロップ培養法（Bader A, et al., Differentiation, 2001 68: p.31-43)により、心筋細 胞を分化'誘導させることにより、調製することができる。幹細胞由来細胞混合物を使 用する場合には、分化'誘導した細胞混合物に対して、心筋細胞の分化'成熟度を 高める処理 (例えば aU-transレチノイン酸の添加）を行うことが望まし!/、。
[0093] (2)細胞のミトコンドリア指示薬による標識
本発明においては、好ましいミトコンドリア指示薬として、蛍光発光性の M7512、 T31 68、 T668又は R302 (全て Molecular Probe社製）を使用する。全心臓構成細胞混合物 、又は幹細胞由来細胞混合物に対して、 M7512, T3168、 Τ668又は R302を、培養液 中に添カ卩しインキュベーションすることにより、細胞を Μ7512、 Τ3168、 Τ668又は R302 にて標識する。
[0094] 細胞をミトコンドリア指示薬で標識後、さらに数日間培養を行うことにより、心筋細胞 の標識シグナル量と他の細胞の標識シグナル量との差をさらに増幅できる。
[0095] (3)心筋細胞の選択 M7512, T3168、 T668又は R302により標識した全心臓構成細胞混合物、又は幹細 胞由来細胞混合物につ 、て、セルソーターを使用して各細胞内におけるミトコンドリ ァ含有量を測定し、相対的に高いミトコンドリア含有量を有する細胞集団を心筋細胞 として分離する。 M7512, Τ3168、 Τ668又は R302を用いて心筋細胞を選択するために 望ましいセルソーターとして、蛍光細胞分取機（Fluorescent Activated Cell Sorter ; F ACS (登録商標）） (BD, Franklin Lakes, NJ USA)を使用する。
[0096] (4)心筋細胞の確認
上述した方法により、標識強度が強い細胞を分取し、その細胞を培養する。その後 、心筋細胞を他の細胞力 識別できる他の方法を用いて、選択後の心筋細胞の含有 量'含有率を算出し、本発明の効果を確認する。本発明においては、心筋細胞を他 の細胞力 識別できる他の方法として、心筋細胞特異的マーカー（例えば、ミオシン 重鎖/軽鎖ゃサルコメァ α -ァクチニン、トロポニン I、 ANP、 GATA- 4、 Nkx2.5、 MEF- 2c)に対する抗体により検出する方法を使用することができる。本発明においてはそ れらのうち、抗サノレコメァ a—ァクチ-ン抗体 (anti-Sarcomeric a— Actrinin Antibody) により標識する方法を使用する。
実施例
[0097] 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例 は、本発明の例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。
[0098] 実施例 1：新牛イ子ラット心 I»力 柚出した全心臓構成細朐混合物のミトコンドリア指 示 による標識
この実施例は、本発明の方法が、全心臓構成細胞混合物中の心筋細胞を検出す るために使用可能力どうかを確認するために行った。
[0099] 生後 1〜3日目の新生仔ラットをエーテル麻酔し、頸椎脱臼により犠死せしめた後、 心臓を摘出した。心室を単離し、血清無添加 D- MEM (High-glucose)培地（Invitroge n社）中、 0.025% (w/v)のコラゲナーゼ（Warthington Biomedical Corporation社製） 存在下にて単離した心室を消化することによって、細胞を分散させ、全心臓構成細 胞混合物を得た。
[0100] 培養液を、牛胎仔血清 (JRH Bioscience社)を終濃度 10%で混合した D-MEM (High -glucose)培地（Invitrogen社）に置換した。このようにして調製した培養細胞に対して 、ミトコンドリア指示薬 M7512 (Molecular Probe社製）を終濃度 100 nMとなるように培 養液中に添加し、 37°Cにて 10分間インキュベートした。その後培地を用いて 4回洗浄 した後、さらに 37°Cにて 24時間培養した。
[0101] このようにして標識した細胞を、蛍光顕微鏡により観察した。結果を図 1に示す。
[0102] 図 1では、心筋細胞においては M7512による蛍光が明瞭に観察され、心筋細胞が 多量のミトコンドリアを細胞内に含有していることが示される力 枠で囲った非心筋細 胞にお 、ては、わずかなミトコンドリアしか含有されて 、な 、ことが示された。
[0103] 実施例 2：マウス胚件 糸田 a 纏 昆 ·に するミトコンドリア , によるネ票
この実施例は、本発明の方法が、幹細胞由来細胞混合物中の心筋細胞を検出す るために使用可能力どうかを確認するために行った。
[0104] 未分化マウス胚性幹細胞に対して、ハンギングドロップ培養法（Bader A, et al.， Diff erentiation, 2001 68: p.31- 43)を用いて、心筋細胞の分化 ·誘導をおこなった。具体 的には、培養皿のふたに、 20 1の培養液からなる液滴を作製し、この液滴中に細胞 数百個を含ませ、この培養皿のふたを培養皿に被せて静置することにより、細胞を液 滴の底面、即ち液滴の先端部分において細胞塊を形成させ心筋細胞を分化'誘導 させる方法である。心筋細胞の分化'誘導に際しては、培養液として、牛胎仔血清 (E QUITECH-BIO社）を終濃度 10%で混合した a -MEM培地（SIGMA社）を使用した。
[0105] 分化'誘導後 14日目に、培養容器内にて、自律拍動性の細胞を含有する細胞隗が 生成されたことを確認し、さらに心筋細胞の分化'成熟度を高めるため、 all trans-レ チノイン酸を終濃度 10— 8 Mとなるように培養液中に添加した。
[0106] 分化'誘導 21日目に自律拍動性の細胞を含有する細胞隗を分散し、個々の細胞に 分散した。このようにして調製した細胞混合物を、実施例 1と同様の条件で M7512によ り標識し、 M7512の除去後さらに接着培養を 5日間継続した後、培養条件下で形成さ れた自律拍動性の細胞を含有する細胞塊を、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図 2〖こ 示す。
[0107] 図 2では、細胞塊の 1回の拍動周期（即ち、弛緩期 1-収縮期-弛緩期 2)にわたつて、 細胞塊の位相差像 (上段)ならびに蛍光像（下段）を示している。この結果、全ての自 律拍動性の心筋細胞が他の細胞に比較して M7512で強く標識されていることがわか つた。即ち、自律拍動性の細胞塊では、 M7512による蛍光が明瞭に見えるのに対し て、自律拍動性の細胞塊周辺に存在する細胞においては、 M7512による蛍光がほと んど見られな ヽことが示された。
[0108] 実施例 3：ミトコンドリア指示薬で標識した全心臓構成細朐混合物の細朐分布の解 近
この実施例は、実施例 1の全心臓構成細胞混合物中に心筋細胞がどの程度存在 するかを明らかにすることを目的として行った。
[0109] まず、全心臓構成細胞混合物を、実施例 1に記載した方法により調製し、 M7512に て標識した。この標識済み全心臓構成細胞混合物を、 FACS (登録商標） (BD, Frank lin Lakes, NJ USA)による細胞集団存在分布解析に供した。結果を図 3に示す。
[0110] 図 3において、横軸の FSC-Aは、細胞の大きさを示す指標である。図示したように、 全心臓構成細胞混合物は、相対的に蛍光強度が強い P5領域に存在する細胞と、相 対的に蛍光強度が弱い P6領域に分けることができる。そして、本実施例においては、 P5領域に存在する細胞を心筋細胞として分取し、 P6領域に存在する細胞を心筋細 胞以外の細胞として分取し、培養を行った。
[0111] ¾施例 4：ミトコンドリア で標識したマウス B不件 細q ^ 糸田!^昆 ·の糸田 H q 分布の解析。
[0112] この実施例は、実施例 2のマウス胚性幹細胞由来細胞混合物中に心筋細胞がどの 程度存在する力を明らかにすることを目的として行った。
[0113] まず、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物を、実施例 2に記載した方法により調製し
、 M7512にて標識した。この標識済みマウス胚性幹細胞由来細胞混合物中を、 FACS
(登録商標） (BD, Franklin Lakes, NJ USA)による細胞集団存在分布解析に供した。 結果を図 4に示す。
[0114] 図 4において、横軸の FSC-Aは、細胞の大きさを示す指標である。図示したように、 マウス胚性幹細胞由来細胞混合物は、相対的に蛍光強度が強 、P2領域に存在する 細胞と、相対的に蛍光強度が弱いそれ以外の領域に存在する細胞とに分けることが できる。そして、本実施例においては、 P2領域に存在する細胞を心筋細胞として分取 し、培養を行った。
[0115] 実施例 5 : 心臓構) ^纏 昆 か¾ ^尺した纏 の、心 纏 マーカーによる この実施例は、全心臓構成細胞混合物中に存在した心筋細胞力 実施例 3の方法 によりどの程度濃縮された力を明らかにすることを目的として行った。
[0116] 実施例 3に記載した方法にて分取した P5領域及び P6領域に属する細胞集団を、培 養液として、牛胎仔血清（EQUITECH-BIO社)を終濃度 10%で混合した a -MEM培 地（SIGMA社）中で 12時間培養した後、パラフオルムアルデヒドにより固定した。
[0117] 次いで、固定した細胞を、心筋細胞マーカーであるマウス抗サルコメァ α -ァクチ- ン抗体 (シグマ社)を用いて標識し、緑色蛍光物質で標識したャギ抗マウス抗体 (Mol ecular Probes社）を用いて、細胞に結合したマウス抗サルコメァ α -ァクチニン抗体を 可視化した。結果を図 5に示す。図 5では、全心臓構成細胞混合物での結果を上段 に、実施例 3で Ρ5領域力 採取した細胞についての結果を中段に、そして実施例 3で Ρ6領域力 採取した細胞にっ 、ての結果を下段に、それぞれ示した。
[0118] その結果、本発明の方法により選択する前の細胞混合物中には、抗サルコメァ α - ァクチニン抗体により認識される心筋細胞とそれ以外の細胞とが混在しており、全細 胞中の心筋細胞の比率は 30%であった。これに対して、 Ρ5領域から採取した細胞は 、 99%以上が心筋細胞であることが示された。また、 Ρ6領域力 採取した細胞の中に も心筋細胞がわずかながら残存していたが、本発明の方法による選択を行う前と同 等の心筋細胞比率でしかな力つた。
[0119] これにより、本発明の方法を用いて、全心臓構成細胞混合物から、高純度で心筋 細胞を選択し、濃縮することができることが明らかになった。
[0120] 実施例 6：マウス胚件 糸田 a 纏 昆 ·力ら 尺した纏 の、心 糸田 マー カーによる f票
この実施例は、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物中に存在した心筋細胞が、実施 例 4の方法によりどの程度濃縮された力を明らかにすることを目的に行った。
[0121] 実施例 4に記載した方法にて分取した P2領域に属する細胞集団及びそれ以外の 領域に属する細胞集団を、培養液として、牛胎仔血清 (EQUITECH-BIO社)を終濃 度 10%で混合した α - MEM培地（SIGMA社）中で 12時間培養した後、パラフオルムァ ルデヒドにより固定した。
[0122] 次 、で、固定した細胞を、心筋細胞マーカーであるマウス抗サルコメァ α -ァクチ- ン抗体 (シグマ社)を用いて標識し、緑色蛍光物質で標識したャギ抗マウス抗体 (Mol ecular Probes社）を用いて、細胞に結合したマウス抗サルコメァ α -ァクチニン抗体を 可視化した。結果を図 6に示す。図 6では、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物での結 果を上段に、実施例 4で Ρ2領域力 採取した細胞についての結果を下段に、それぞ れ示した。
[0123] その結果、本発明の方法により選択する前の細胞混合物中には、抗サルコメァ α - ァクチニン抗体により認識される心筋細胞とそれ以外の細胞とが混在しており、全細 胞中の心筋細胞の比率は 10%であった。これに対して、 M7512で標識した場合の蛍 光強度が強力つた Ρ2領域力 採取した細胞は、 80%以上が心筋細胞であることが示 された。
[0124] これにより、本発明の方法を用いて、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物からも、高 純度で心筋細胞を選択し、濃縮することができることが明らかになった。
[0125] ¾施例 7 :ミトコンドリア指示靠 Τ3168による標識
本実施例は、ミトコンドリア指示薬 T3168によって標識を行った場合にも、 M7512で 得られた結果と同様の結果が得られることを確認するために行った。
[0126] ミトコンドリア指示薬として T3168 (Molecular Probe社製）を使用する以外は、実施例 1に記載した方法と同一の方法により、ミトコンドリア指示薬により標識した新生仔ラッ ト心臓カゝら抽出した全心臓構成細胞混合物を調製した。
[0127] このようにして調製した標識された全心臓構成細胞混合物について、実施例 3に記 載した方法と同一の方法により FACSにより細胞分布を解析し、そして相対的に強い 蛍光強度を示す細胞を心筋細胞として選択 ·採取した。このようにして得られた細胞 を、実施例 5に記載する方法と同一の方法により、培養した後バラフオルムアルデヒド により固定し、マウス抗サルコメァ a -ァクチニン抗体 (シグマ社)を用いて標識した。 結果を図 7に示す。 [0128] その結果、本発明の方法により選択する前の細胞混合物中には、抗サルコメァ α - ァクチニン抗体により認識される心筋細胞とそれ以外の細胞とが混在しており、全細 胞中の心筋細胞の比率は 30%であった。これに対して、相対的に強い蛍光強度を示 す細胞は、 95%以上が心筋細胞であることが示された。
[0129] これにより、本発明の方法を用いて、ミトコンドリア指示薬として T3168を使用した場 合でも、全心臓構成細胞混合物から、高純度で心筋細胞を選択し、濃縮することが できることが明らかになった。
[0130] 実施例 8 :ミトコンドリア指示 Τ668による新牛イ子ラット全心臓構成細胞の染色 心 糸田 の
新生仔ラット胎仔心臓を 0.025% (w/v)コラゲナーゼ (シグマ）とトリプシン (GIBCO) で処理し、細胞集団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度 1 μ Μのミ トコンドリア指示薬 Τ668 (Molecular Probe社製）を用いて 37°Cにて 15分間暴露し、 3回 洗浄した後、直ちに FACS解析を行った。その結果、 T668蛍光強度によって 3つの細 胞集団に分離された (図 8-1)。蛍光シグナルが最も強い高蛍光細胞集団と中蛍光強 度細胞集団をそれぞれ分取し培養した。
[0131] 次いで、培養細胞に対してァクチニンに対する免疫染色を行い、心筋細胞を同定 した（図 8-2)。この結果、 T668に由来する蛍光シグナルが最も強力つた細胞群の殆 ど全ての細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないこ とが分かった。同様に R302 (Molecular Probe社製）でも解析を行い、同様の結果を得 た（図 8-3)。
[0132] 実施例 9 :ミトコンドリア指示 T668 M7514による新牛イ子ラット全心臓構成細朐の染 色 単位ミトコンドリア当たりの膜雷位の比較解析。
[0133] 実施例 8と同様の材料および方法を用いて細胞集団を採取した。そして、心筋細胞 をミトコンドリア特異的に染色する膜電位非依存性ミトコンドリア指示薬 M7514 (Molec ular Probe社製)と、心筋細胞をミトコンドリア特異的に染色する膜電位依存性ミトコン ドリア指示薬 T668で染色を行った。この後直ちに FACS解析を行った。 T668による蛍 光と M7514による蛍光は波長が異なるため、別々に検出することが可能である。 T668 蛍光を指標として三つの細胞集団を検出した。実施例 8に示した解析から、最も高い 蛍光を示す高蛍光細胞集団は、心筋細胞群であり、中蛍光細胞集団は非心筋細胞 であることが分かっている。
[0134] 次に T668由来の蛍光強度を M7514由来の蛍光強度で割った比率で個々の細胞群 を分別した。 T668のシグナルに基づいて心筋細胞と同定された細胞群では、 M7514 に対する T668の蛍光強度比として例えば 150%を採用した場合、 150%以上の細胞 が全体の 90%であったのに対し、 T668でのシグナルに基づ!/、て非心筋細胞と同定さ れた細胞では、 M7514に対する T668蛍光強度比 150%以上は全体の 13%でしかな かった。この差の意味するところは、心筋細胞では、非心筋細胞に比べて、ミトコンド リアの含有量のみならず、ミトコンドリア当たりの膜電位も高いことを示している。
[0135] ¾ 列 10 :ミトコンドリア指示靠 T668によるラット H台仔全心臟構成細qの^^ Γ,、筋 糸田 H qの
胎生 13日のラット胎仔心臓をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収し た。細胞が分散された培養液に対し、終濃度 1 /z Mのミトコンドリア指示薬 T668をもち いて 37°Cにて 15分間暴露し、 3回洗浄した後、直ちに FACS解析を行った。 T668蛍光 強度によって 3つの細胞集団に分離された（図 9-1)。蛍光シグナルが最も強 ヽ高蛍 光細胞集団と中蛍光細胞集団をそれぞれ分取し培養した。
[0136] 培養細胞に対してァクチニンに対する免疫染色を行い、心筋細胞を同定した。この 結果、 T668に由来する蛍光シグナルが最も強かった細胞群の殆ど全ての細胞が心 筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことが分かった（図 9- 2)。
[0137] 実窗列 11 :ミトコンドリア指示 T668 M7512による胎仔全細胞の染色 心筋細朐 の精製
胎生 9日のラット胎仔をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収した。細 胞が分散された培養液に対し、終濃度 1 μ Μのミトコンドリア指示薬 Τ668を用いて 37 °Cにて 15分間暴露し、 3回洗浄した後、直ちに FACS解析を行った。蛍光強度による 細胞集団では主に 1つの細胞集団が観測され、発生後期の全心臓サンプルを用い た解析力 心筋細胞として検出が予測される高蛍光強度領域に明確な細胞集団は 見出されなかった（図 10-1)。しかし、主細胞集団に比べて高蛍光をしめす細胞が僅 力な割合で存在したため、これを高蛍光細胞集団として分離回収した。
[0138] この細胞を培養し、心筋細胞マーカーであるァクチニンで免疫染色を行ったところ 、 T668では粗 95%以上が心筋細胞であることが判明した（図 10-2)。胎生 9日の胎仔 (初期胚)では、心筋細胞も極めて未熟であるため、ミトコンドリアの量的変化は十分 に起こっていないものと考えられている。この結果は、そのような時期においてもミトコ ンドリア膜電位という指標を用いることにより、心筋細胞を効率的に選択することがで さることを示している。
[0139] 実施例 12 :ミトコンドリア指示薬 T668による生後 8日から胎生 11日までのラット全心臓 構成細胞の染色 FACS解析
牛.後 8日カ 胎牛.11日までのラット心臓をコラゲナーゼ トリプシンで処理し細胞奪 団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度 1 /z Mのミトコンドリア指示薬 T668を用いて 37°Cにて 15分間暴露し、 3回洗浄した後、直ちに FACS解析を行った。 T668蛍光強度によって細胞集団は分離された。最も蛍光強度の強い高蛍光心筋細 胞集団は、発生の進行に合わせて量が増え、細胞群に明確に分離されてゆくことが 分かる（図 11)。この結果、本明細書が提供する方法を用いることによって、心筋細胞 の成熟度を推測することが可能であること示された。
[OHO] m ：ミトコンドリア指示靠 τ668によるマウス s不件 細胞由 多 細胞群の 心 糸田 H qの
実施例 2と同様の方法を用いて、 ES細胞を心筋細胞を含む細胞群に分化させた。 この多種細胞塊をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、バラバラの細胞を得た。細胞が 分散された培養液に対し、終濃度 1 μ Μのミトコンドリア指示薬 Τ668を用いて 37°Cに て 15分間暴露し、 3回洗浄した後、直ちに FACS解析を行った。蛍光強度による細胞 集団では主に 1つの細胞集団が観測され、発生後期の全心臓サンプルを用いた解 析力 心筋細胞として検出が予測される高蛍光強度領域に明確な細胞集団は見出 されなかった（図 12)。しかし、主細胞集団に比べて高蛍光をしめす細胞が存在した ため、これを高蛍光細胞集団として分離回収した。
[0141] この細胞を大量に培養し、心筋細胞マーカーであるァクチニンで免疫染色を行つ たところ、 98%以上が心筋細胞であることが判明した。逆に主細胞集団を回収し、培 養、免疫染色を行ったところ、殆どが心筋細胞ではな力つた。
[0142] 実窗列 14 :ミトコンドリア指示蓉 S7563による新牛イ子ラット全心臓構成細胞の染色 心 糸田 の
新生仔ラット胎仔心臓をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収した。 細胞が分散された培養液に対し、終濃度 1 μ Μのミトコンドリア指示薬^ Μを用いて 37°Cにて 15分間暴露し、 3回洗浄した後、直ちに FACS解析を行った。 S7563蛍光強 度によって 3つの細胞集団に分離された。蛍光シグナルが最も強い細胞集団を分取 し口 した。
[0143] 培養細胞に対してァクチニンに対する免疫染色を行い、心筋細胞を同定した。この 結果、 SZ5£2に由来する蛍光シグナルが最も強力つた高蛍光細胞集団の殆ど全ての 細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞ではないことが分 かった。
産業上の利用可能性
[0144] 本発明の方法により、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混 合物から心筋細胞を選択することができる。また、本発明の方法により、心筋細胞の 遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋細胞を濃縮すること、 そして心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造することもまた、可能であ る。さらに、種々の方法により調製された心筋細胞含有細胞混合物中における心筋 細胞比率を評価することも可能である。
[0145] 本発明において記載するこれらの方法により、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋 細胞の比率を向上させることができ、レシピエントの心臓に移植した際に非心筋細胞 の存在により発生するおそれのある種々の副作用を低減することができる。

Claims

請求の範囲
[I] 心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞 の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋 細胞を選択する方法。
[2] 心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量に基づ!、て、心筋 細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する請求項 1に記載の方法。
[3] 心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づ 、て、心筋 細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する請求項 1に記載の方法。
[4] 心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び膜電位に基 づ 、て、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する請求項 1に記載の 方法。
[5] ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識し、細胞の相対的ミト コンドリア含有量及び/又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定することを特徴 とする請求項 1〜4に記載の方法。
[6] 心筋細胞含有細胞混合物が、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞 由来細胞混合物である請求項 1〜5に記載の方法。
[7] 心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される 請求項 6に記載の方法。
[8] ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識した後、細胞の相対的 ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する前に、ミ トコンドリァ指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含む請求項 5 〜7の!、ずれか 1項に記載の方法。
[9] ミトコンドリア指示薬力 A1372, D273、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22 421、 D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M 22423、 M22425, M22426, R302、 R634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669 及び T3168力 なる群力 選択される請求項 5〜8のいずれか 1項に記載の方法。
[10] ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302である請求項 9に記載の方法。
[II] 心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮 する方法であって：
(1)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;並びに
(2)細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Z又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位 に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法。
[12] 心筋細胞含有細胞混合物が、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞 由来細胞混合物である請求項 11に記載の方法。
[13] 心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される 請求項 12に記載の方法。
[14] 前記（1)の工程の後、（2)の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識し た細胞を培養する工程を更に含む請求項 11〜13のいずれか 1項に記載の方法。
[15] ミトコンドリア指示薬力 A1372, D273、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22
421、 D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M
22423、 M22425, M22426, R302、 R634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669 及び T3168力 なる群力 選択される請求項 11〜14のいずれか 1項に記載の方法。
[16] ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302である請求項 15に記載の方法
[17] 心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法であって：
(1)心筋細胞分化可能細胞から、心筋細胞を分化 ·誘導し、心筋細胞含有細胞混合 物を調製する工程；
(2)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;並びに
(3)細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Ζ又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位 に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法。
[18] 心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される 請求項 17に記載の方法。
[19] 前記 (2)の工程の後、（3)の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識し た細胞を培養する工程を更に含む請求項 17又は 18に記載の方法。 [20] ミトコンドリア指示薬力 A1372、 D273、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22 421、 D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M 22423、 M22425, M22426, R302、 R634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669 及び T3168力 なる群力 選択される請求項 17〜19のいずれか 1項に記載の方法。
[21] ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302である請求項 20に記載の方法
[22] 心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価する方法であって：
(1)心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程;並びに
(2)細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び Ζ又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位 に基づいて、非心筋細胞に対する心筋細胞の比率を計測する工程；
を含むことを特徴とする前記方法。
[23] 心筋細胞含有細胞混合物が、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞 由来分化細胞混合物である請求項 22に記載の方法。
[24] 心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される 請求項 23に記載の方法。
[25] ミトコンドリア指示薬力 A1372, D273、 D288、 D308、 D378、 D426、 D632、 D633、 D22 421、 D23806、 L6868、 M7502, M7510、 M7511、 M7512, M7513、 M7514, M22422, M 22423、 M22425, M22426, R302、 R634、 R648、 R14060、 R22420, T639、 T668、 T669 及び T3168力 なる群力 選択される請求項 22〜24のいずれか 1項に記載の方法。
[26] ミトコンドリア指示薬が M7512、 T3168、 Τ668又は R302である請求項 25に記載の方法
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