CN101056973A

CN101056973A - 以细胞内线粒体为指标的心肌细胞的选择方法

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Publication number: CN101056973A
Application number: CNA2005800290003A
Authority: CN
Inventors: 服部文幸; 福田惠一
Original assignee: Keio University; Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: Heart Rehabilitation Corp; Sankyo Co Ltd
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2025-08-26
Also published as: EP1785482A1; CA2577201C; BRPI0514697A; CN101056973B; KR20120088865A; RU2007111141A; AU2005275762B2; KR101318713B1; AU2005275762A1; JP4762146B2; EP1785482B1; US8623649B2; JPWO2006022377A1; IL181429A; IL181429A0; EP1785482A4; US20080090266A1; CA2577201A1; WO2006022377A1; RU2371478C2

Abstract

本发明的课题是开发从完整心脏构成细胞群或者来自干细胞的分化细胞群中，不伴随基因的改变地选出心肌细胞的方法。本发明人等根据上述心肌细胞的多种性质，建立了使用线粒体特异性标记试剂，不伴随基因组的改变地选出心肌细胞的开创性方法。即、本发明人等提供了：从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者根据细胞的相对的线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因改变地选择心肌细胞的方法；从含有心肌细胞的细胞混合物中、不伴随心肌细胞的基因改变地浓缩心肌细胞的方法；不伴随心肌细胞的基因改变地制备心肌细胞的方法；以及对含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞比率进行评价的方法。

Description

以细胞内线粒体为指标的心肌细胞的选择方法

技术领域

本发明涉及完整心脏构成细胞群、或来自干细胞细胞群的心肌细胞的选择方法、和利用该方法的方法。

背景技术

在成熟个体中的心肌细胞丧失了增殖活性，重症性心肌梗塞、心肌症等的疾病必需依赖心脏移植。不过，目前，为了克服心脏捐献不足的问题，找到心脏移植以外的治疗方法成为了当务之急。与此相对，认为在体外制备心肌细胞，用以补充心肌细胞，是救济必需依赖心脏移植的患者的最有希望的方法。

作为心肌细胞的制备方法，正在对使胚胎干细胞分化而使用的方法、以及选取暗示了生物内存在的干细胞(体干细胞)、诱导分化的方法等进行了研究。不过，作为干细胞的性质，由于存在心肌细胞以外的细胞作为副产物而产生的问题、和使未分化的细胞残存的性质的问题，所以至今尚不能将进行了分化、诱导的细胞集团直接用于治疗。所以，为了在人中能够实际应用，必需从进行了分化、诱导的细胞集团中选出心肌细胞。

目前，作为纯化心肌细胞的方法，尚没有有关向干细胞的基因组中导入某些标记基因的方法以外的有效方法的报道(FASEB J.2000；14：2540-2548)。不过，改变基因组由于不仅本身存在伦理上的问题，而且伴随着细胞癌化率的变化等无法预测的重大风险，所以为了在人体实际应用还存在着很大的问题。

已知心脏中氧气消耗量与主要的组织相比较高而且心脏中线粒体的含量比较多(Am J Physiol 1985；248：R415-421)。此外，心肌细胞一旦细胞分化·成熟，分裂能显著消失也是广为人知的。不过，应用上述这样的心肌细胞的性质而对心肌细胞进行选择的尝试在以往的技术领域中完全未知。此外，还没有着眼于线粒体的膜电位，将心肌细胞线粒体的膜电位和其他细胞线粒体的膜电位直接进行比较研究的例子，以线粒体的膜电位作为指标进行心肌细胞的选择研究的例子也尚无报道。

非专利文献1：FASEB J.2000；14：2540-2548

非专利文献2：Am J Physiol 1985；248：R415-421

发明内容

发明所要解决的问题

本发明人等以开发下述内容作为课题：使用与以往直接地选出心肌细胞无关的心肌细胞的多种性质，从完整心脏构成细胞混合物和来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物中，不伴随基因的改变地选出心肌细胞的方法。

用于解决问题的方法

本发明人等根据心肌细胞与其他全部细胞相比较，相对的线粒体含量多的性质以及心肌细胞线粒体与其他全部的细胞线粒体相比较其膜电位高的性质，成功地解决了上述课题，建立了使用线粒体特异性标记试剂，标记含有心肌细胞的细胞混合物，通过测定细胞的相对的线粒体含量以及/或者线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因的改变，选择心肌细胞的开创性方法。

具体而言，在本发明的第一种实施方式中，提供了从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因改变地选出心肌细胞的方法。

即、在本发明的方法的第一种实施方式提供了：

含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量，不伴随心肌细胞的基因改变地选出心肌细胞的方法；

从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因改变地选出心肌细胞的方法；或者

从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量以及膜电位，不伴随心肌细胞的基因改变地选出心肌细胞的方法。

本发明的方法的该实施方式，其特征在于，使用线粒体指示剂，标记含有心肌细胞的细胞混合物，对细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位进行测定。

此处，含有心肌细胞的细胞混合物，其特征在于，是完整心脏(或称为“总心脏”)构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物。

此外，可能分化成肌细胞的细胞，其特征在于，是选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组。

本发明的该具体实施方式中，使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物后，在测定细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位之前，也可以还包括在无线粒体指示剂的存在下培养标记的细胞的步骤。

此外，本发明的该具体实施方式中使用的线粒体指示剂以选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组为特征，在这实施方式中，优选是M7512、T3168、T668或者R302。

在本发明的第二种实施方式中，提供了从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地浓缩心肌细胞的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；以及

(2)根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位，选择心肌细胞的步骤。

在本发明的第二种实施方式中，含有心肌细胞的细胞混合物是以完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物为特征的。

此外，可能分化成心肌细胞的细胞是以选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组为特征的。

本发明的第二种实施方式中，在上述(1)的步骤之后、(2)的步骤之前，也可以还含有在无线粒体指示剂的存在下培养标记的细胞的步骤。

此外，本发明的该具体实施方式中使用的线粒体指示剂是以选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组为特征的，在该种实施方式中，优选是M7512、T3168、T668或者R302。

本发明的第三种实施方式中，提供了不伴随心肌细胞的基因改变地制备心肌细胞的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)从可能分化成心肌细胞的细胞分化、诱导心肌细胞、制备含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；

(2)使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；以及

(3)根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位，选择心肌细胞的步骤。

本发明的方法的第三种实施方式中，可能分化成心肌细胞的细胞，其特征在于，选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组。

此外，在上述(2)的步骤之后、(3)的步骤之前，也可以还包括在无线粒体指示剂的存在下培养标记的细胞的步骤。

另外，本发明的该具体实施方式中使用的线粒体指示剂是以选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组为特征的，在这种实施方式中，优选M7512、T3168、T668或者R302。

本发明的第四种实施方式中，提供了评价含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞比率的方法，其特征在于，该方法包括：

(2)细胞的相对的线粒体含量以及/或者根据细胞的相对的线粒体膜电位，计算测定相对于非心肌细胞的心肌细胞的比率的步骤。

本发明的方法的第四种实施方式中，含有心肌细胞的细胞混合物是以完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞的分化细胞混合物为特征的。

而且，本发明的该具体实施方式中使用的线粒体指示剂，是以选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组选为特征的，这种实施方式中优选M7512、T3168、T668或者R302。

根据上述内容可知，在本发明中涉及在一种实施方式中，提供了从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因改变地选出心肌细胞的方法。

细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位的测定，可以通过使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物进行。

此处，提到“含有心肌细胞的细胞混合物”时候，指的是心肌细胞和此外的细胞所构成的全部细胞的混合物。可以列举例如：完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物。所说的完整心脏构成细胞混合物，指的是从同种或者异种的心脏组织通过多种酶处理最终得到的心肌细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞等的细胞构成的混合物。此外，来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物指的是，将可能分化成心肌细胞的细胞(例如，胚胎干细胞或者体干细胞等的干细胞、前体细胞、以及受精卵细胞或者体细胞克隆等的卵细胞)在使该细胞分化成心肌细胞的条件下进行培养而得到的心肌细胞、非心肌细胞、未分化细胞、神精细胞、上皮细胞等的细胞构成的混合物。

细胞的线粒体含量以及线粒体膜电位能够通过使用线粒体指示剂标记细胞内的线粒体而进行定量化。不过，反映线粒体含量以及线粒体膜电位的来自线粒体指示剂的信号的绝对值，根据解析中使用的心肌细胞的成熟度或者标记试剂的种类、暴露时间等的暴露条件而有所变化。所以，在本发明中重要的不是来自线粒体指示剂的信号量的绝对值，而是来自心肌细胞和非心肌细胞之间的线粒体指示剂的信号量的相对关系。并且，在本发明中，能够将表示相对高的荧光强度的细胞作为心肌细胞选择。实际应用的时候，使用予定的含有心肌细胞的细胞混合物的试样，进行预试验，对与目标一致的心肌细胞集团的限定条件(即，线粒体含量以及/或者线粒体膜电位的高低与心肌细胞的关系)进行校正。具体而言，在预试验中，将线粒体含量以及/或者线粒体膜电位作为指标，划分应该选择的来自细胞线粒体指示剂的信号量的范围，设定回收表示相对高的线粒体含量以及线粒体膜电位的细胞的范围。

在本发明中，所说的“线粒体指示剂”指的是能够对活细胞中的线粒体进行特异性标记并测定其存在量的物质，只要是能够对活细胞中的线粒体进行特异性标记、能够测定线粒体膜电位的物质、或者对活细胞中的线粒体进行特异性标记并且同时测定其存在量和线粒体膜电位的二者的物质，可以是任何物质。可列举例如：(1)具有荧光，与线粒体结构物质(例如：蛋白质、脂类、糖链、核酸或者它们的代谢产物等)结合的物质，(2)具有荧光，根据线粒体的膜电位而被选择性地摄取到线粒体内的物质，(3)通过线粒体结构物质的作用变换成能发出荧光的物质，或者(4)通过线粒体结构物质的作用而不向线粒体外扩散的物质等。

本发明中作为线粒体指示剂的具体例子，能够使用，例如：A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、S7563、T639、T668、T669或者T3168等(化合物产品序号均可购自Molecular Probe公司)，更优选使用M7514、M7510、M7511、M7512、M7513、M22425、M22426、T668、R302、或者T3168，最优选使用T668、R302、M7514或者T3168。也不局限于这些物质。如上所示的能在本发明中使用的线粒体指示剂分别具有下述结构。

【式1】

A1372的结构

分子式：C₂₆H₃₈BrN₃

分子量：472.51

CAS序号：75168-11-5

吖啶，3，6-双(二甲基氨基)-10-壬基-，溴化物

名称：(Acridinium，3，6-bis(dimethylamino)-10-nonyl-，bromide)

【式2】

D273的结构

分子式：C₂₉H₃₇IN₂O₂

分子量：572.53

CAS序号：53213-82-4

苯并唑，3-己基-2-(3-(3-己基-2(3H)-亚苯并唑)-1-丙烯基)-，碘化物

名称：

(Benzoxazolium，3-hexyl-2-(3-(3-hexyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl)-，iodide)

【式3】

D288的结构

分子式：C₁₆H₁₉IN₂

分子量：366.24

CAS序号：959-81-9

吡啶，4-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)-1-甲基，碘化物

名称：(Pyridinium，

4-(2-(4-(dimethylamino)phenyl)ethenyl)-1-methyl，iodide)

【式4】

D308的结构

分子式：C₁₆H₁₉IN₂

分子量：366.24

CAS序号：2156-29-8

吡啶，2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)-1-甲基，碘化物

名称：

(Pyridinium，2-(2-(4-(dimethylamino)phenyl)ethenyl)-1-methyl，iodide)

【式5】

D378的结构

分子式：C₃₁H₄₁N₂O₂I

分子量：600.58

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式6】

D426的结构

分子式：C₁₇H₂₁IN₂

分子量：380.27

CAS序号：3785-01-1

吡啶，2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)-1-乙基，碘化物

名称：(pyridinium，

2-(2-(4-dimethylamino)phenyl)ethenyl)-1-ethyl，iodide)

【式7】

D632的结构

分子式：C₂₁H₁₈N₂O₃

分子量：346.38

CAS序号：109244-58-8

苯甲酸，2-(3，6-二氨基-9H-氧杂蒽-9-基)-，甲基酯

名称：(Benzoic acid，2-(3，6-diamino-9H-xanthene-9-yl)-，methyl ester)

【式8】

D633的结构

分子式：C₂₈H₃₂N₂O₃

分子量：444.57

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式9】

D22421的结构

分子式：C₂₇H₂₁IN₂O₂

分子量：532.38

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式10】

D23806的结构(成分A：二氢罗得明123)

分子式：C₂₁H₁₈N₂O₃

分子量：346.38

CAS序号：109244-58-8

苯甲酸，2-(3，6-二氨基-9H-氧杂蒽-9-基)-，甲基酯

名称：

(Benzoic acid，2-(3，6-diamino-9H-xanthene-9-yl)-，methyl ester)

【式11】

L6868的结构

分子式：C₂₈H₂₂N₄O₆

分子量：510.50

CAS序号：22103-92-0

名称：9，9′-双吖啶，10，10′-二甲基-(9，9′-Biacridinium，10，10′-dimethyl-)

【式12】

M7502的结构

分子式：C₃₄H₃₀Cl₃N₃O

分子量：602.99

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式13】

M7510的结构

分子式：C₂₄H₂₄Cl₂N₂O

分子量：427.37

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式14】

M7511的结构

分子式：C₂₄H₂₅ClN₂O

分子量：392.93

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式15】

M7512的结构

分子式：C₃₂H₃₂Cl₂N₂O

分子量：531.52

CAS序号：167095-09-2

1H，5H，11H，15H-夹氧(杂)蒽基[2，3，4-ij：5，6，7-i′j′]联喹啉-18-，9-[4-(氯甲基)苯基]-2，3，6，7，12，13，16，17-八氢-，氯化物

名称：(1H，5H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij：5，6，7-i′j′]diquinolizin-18-ium，

9-[4-(chloromethyl)phenyl]-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-，chloride)

【式16】

M7513的结构

分子式：C₃₂H₃₃ClN₂O

分子量：497.08

CAS序号：167095-08-1

1H，5H，9H，11H，15H-夹氧(杂)蒽基[2，3，4-ij：5，6，7-i′j′]联喹啉，9-[4-(氯甲基)苯基]-2，3，6，7，12，13，16，17-八氢-

名称：(1H，5H，9H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij：5，6，7-i′j′]diquinolizine，

9-[4-(chloromethyl)phenyl]-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-)

【式17】

M7514的结构

分子式：C₃₄H₂₈Cl₅N₃O

分子量：671.88

CAS序号：201860-17-5

苯并唑，2-[3-[5，6-二氯-1，3-双[[4-(氯甲基)苯基]甲基]-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-基烯]-1-丙烯基]-3-甲基-，氯化物

名称：(Benzoxazolium，2-[3-[5，6-dichloro-1，3-bis[[4-(chloromethyl)phenyl]methyl]-1，3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene]-1-propenyl]-3-methyl-，chloride)

【式18】

M22422的结构

分子式：C₃₅H₃₃ClF₆N₂O

分子量：647.10

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式19】

M22423的结构

分子式：C₂₆H₂₆ClN₃O₅

分子量：495.96

CAS序号：137993-41-0

1H，5H，11H，15H-夹氧(杂)蒽基[2，3，4-ij：5，6，7-i′j′]联喹啉-18-，9-氰基-2，3，6，7，12，13，16，17-八氢-，高氯酸盐

9-cyano-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-，perchlorate)

【式20】

M22425的结构

分子式：C₃₉H₃₆Cl₅N₃

分子量：724.00

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式21】

M22426的结构

分子式：C₃₄H₃₆Cl₂N₂

分子量：543.58

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式22】

R302的结构

分子式：C₂₁H₁₇ClN₂O₃

分子量：380.83

CAS序号：62669-70-9

吨，3，6-二氨基-9-(2-(甲氧基羰基)苯基，氯化物

名称：(Xanthylium，3，6-diamino-9-(2-(methoxycarbonyl)phenyl，chloride)

【式23】

R634的结构

分子式：C₂₈H₃₁ClN₂O₃

分子量：479.02

CAS序号：989-38-8

吨，9-(2-(乙氧基羰基)苯基)-3，6-双(乙基氨基)-2，7-二甲基，氯化物

名称：(Xanthylium，9-(2-(ethoxycarbonyl)phenyl)-3，6-bis(ethylamino)-2，7-dimethyl，chloride)

【式24】

R648的结构

分子式：C₃₄H₄₃ClN₂O₇

分子量：627.18

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式25】

R14060的结构

分子式：C₂₃H₁₉F₅N₂O

分子量：434.41

CAS序号：N/A

名称：N/A

【式26】

R22420的结构

分子式：C₂₁H₁₇ClN₂O₃

分子量：380.83

CAS序号：62669-70-9

吨，3，6-二氨基-9-(2-(甲氧基羰基)苯基，氯化物

名称：(Xanthylium，3，6-diamino-9-(2-(methoxycarbonyl)phenyl，chloride)

【式27】

T639的结构

分子式：C₂₃H₂₃N₂OCl

分子量：378.90

CAS序号：6837-70-3

吨，3，6-双(二甲基氨基)-9-苯基，氯化物

名称：(Xanthylium，3，6-bis(dimethylamino)-9-phenyl，chloride)

【式28】

T668的结构

分子式：C₂₅H₂₅ClN₂O₇

分子量：500.93

CAS序号：115532-50-8

吨，3，6-双(二甲基氨基)-9-(2-(甲氧基羰基)苯基)-，高氯酸盐，

名称：

(Xanthylium，3，6-bis(dimethylamino)-9-(2-(methoxycarbonyl)phenyl)-，perchlorate)

【式29】

T669的结构

分子式：C₂₆H₂₇ClN₂O₇

分子量：514.96

CAS序号：115532-52-0

吨，3，6-双(二甲基氨基)-9-(2-(乙氧基羰基)苯基)-，高氯酸盐，

名称：

(Xanthylium，3，6-bis(dimethylamino)-9-[2-(ethoxycarbonyl)phenyl]-，perchlorate)

【式30】

T3168的结构

分子式：C₂₅H₂₇Cl₄IN₄

分子量：652.23

CAS序号：47729-63-5

1H-苯并咪唑，5，6-二氯-2-[3-(5，6-二氯-1，3-二乙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-基烯)-1-丙烯基]-1，3-二乙基-，碘化物，(E)-

名称：(1H-Benzimidazolium，5，6-dichloro-2-[3-(5，6-dichloro-1，3-diethyl-1，3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene)-1-propenyl]-1，3-diethyl-，iodide，(E)-)

此外，作为线粒体指示剂，也可以使用S7563、S7567以及S7585(化合物产品序号：可购自Molecular Probe公司)。

已知这些线粒体指示剂，各个物质分别具有特有的激发波长，能够发出具有特有的波长的荧光。例如，已知在M7514的情况下，接受490nm的激发波长，发出516nm的荧光，此外，在T3168的情况下，接受535nm的激发波长，发出590nm的荧光。

如前所述，因为心肌细胞和其他细胞相比较，细胞内的线粒体含量多，此外，线粒体膜电位高，所以如果使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物，心肌细胞与其他细胞相比较，表示出更强的荧光强度。在本发明中，首先测定标记了的含有心肌细胞的细胞混合物的各细胞内中线粒体含量以及/或者线粒体膜电位。然后，规定将表示更强的标记强度的细胞作为心肌细胞以外，根据测定的线粒体含量以及/或者线粒体膜电位，分离作为含有相对高的线粒体的细胞集团、具有相对高的膜电位的含有线粒体的细胞集团、或者含有相对高的线粒体的含有细胞且具有相对高的膜电位的含有线粒体的细胞集团的心肌细胞。

如上所述，使用荧光发光性的线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物时，使用细胞分选仪，将心肌细胞(因为线粒体含量相对较多、并且含有具有相对高的膜电位的线粒体，所以表示相对较强的荧光强度)从心肌细胞以外的细胞(因为线粒体含量相对少，或者含有具有相对低的膜电位的线粒体，所以基于通过线粒体指示剂的标记，荧光强度也相对弱)中区分开，其结果能够选择保持活的状态的，且不伴随心肌细胞的基因改变的心肌细胞。在本发明中使用的细胞分选仪，只要能够将荧光标记的细胞保持活的状态进行分选即可，可以是任何的细胞分选仪，作为具体的装置，例如可以使用荧光细胞分选仪(FluorescentActivated Cell Sorter；FACS(注册商标))(BD，Franklin Lakes，NJUSA)，也可以使用其他的装置(Beckman公司、Coulter公司、Cytomation公司等)。

心肌细胞的选择可以在将含有心肌细胞的细胞混合物用线粒体指示剂标记之后进行。不过，在期望从含有心肌细胞的细胞混合物中更确实地进行心肌细胞选择的情况下，用线粒体指示剂标记后，还可以在无线粒体指示剂的存在下再进行培养，然后对心肌细胞进行选择。用线粒体指示剂标记后，如果在无线粒体指示剂的存在下，再进行培养的话，随着细胞的分裂，每个细胞中含有的线粒体指示剂含量降低。所以、增殖性细胞培养的时间越长，细胞内的线粒体指示剂含量越少，荧光强度降低。另一方面，因为心肌细胞丧失了分裂能力或者非常低，所以即使培养的时间很长，每个细胞中的线粒体指示剂含量没有其他的细胞那样减少，能够保持相对强的荧光强度。所以，将含有心肌细胞的细胞混合物用线粒体指示剂标记后，通过再在无线粒体指示剂的存在下培养一定时间，具体而言为数天，能够扩大心肌细胞与其他细胞间的标记强度的差异，能够更确实地选择心肌细胞。

此外，在本发明的第二种实施方式中还提供了从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地浓缩心肌细胞的方法，其特征在于，该方法包括：(1)使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；以及(2)根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位，选择心肌细胞的步骤。

在该实施方式中，含有心肌细胞的细胞混合物可以是完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物中的任何一种。此处，完整心脏构成细胞混合物是心肌细胞和非心肌细胞的混合物，如果直接以此状态进行心脏移植的话，由于存在非心肌细胞，所以存在引起接受者的心脏中严重副作用的风险。所以，为了进行更安全、确实地针对接受者的心肌细胞的移植，优选在移植前，尽可能提高含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞的比率，即，进行浓缩。此外，作为可能分化成心肌细胞的细胞，可以使用例如：干细胞、前体细胞或者卵细胞。

在该方法中，为了更确实地浓缩心肌细胞，也可以在上述(1)的步骤之后、(2)的步骤之前，也可以再包括在无线粒体指示剂的存在下培养标记了的细胞的步骤。通过该步骤，能够使其他细胞的荧光强度降低，使心肌细胞内的相对的荧光强度增强，更确实地浓缩心肌细胞。

在这种实施方式中，作为线粒体指示剂，如前所述，可以使用A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669或者T3168，线粒体指示剂优选使用M7512、T3168、T668或者R302。

此外，在本发明的第三种实施方式中提供了从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地制备心肌细胞的方法，其特征在于，该方法还包括：(1)从可能分化成心肌细胞的细胞分化、诱导心肌细胞、制备含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；(2)使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；以及(3)根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位，选择心肌细胞的步骤。

在这种实施方式中，含有心肌细胞的细胞混合物是完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物中的任何一种。此处，完整心脏构成细胞混合物是心肌细胞和非心肌细胞的混合物，如果以这种状态进行心脏移植的话，由于存在非心肌细胞，所以存在引起接受者的心脏中严重副作用的风险。所以，优选提供为了进行更安全、确实地针对接受者的心肌细胞的移植，在进行移植的时候，含有心肌细胞的细胞混合物中心肌细胞的比率尽可能高的制备物。此外，作为可能分化成心肌细胞的细胞可以使用例如：干细胞、前体细胞或者卵细胞。

在该方法中，为了更确实地进行心肌细胞的制备，也可以在进行上述(1)的步骤之后、(2)的步骤之前，再进行在无线粒体指示剂的存在下培养标记了的细胞的步骤。

在这种实施方式中，作为线粒体指示剂，如前所述可以使用A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669或者T3168，线粒体指示剂优选使用M7512、T3168、T668或者R302。

作为将心肌细胞分化、诱导的方法，从尚未分化的具有多种分化能力的多能性干细胞(pluripotent stem cells)分化、诱导的方法已纪在本技术领域中进行了多个开发。多能性干细胞是指通过体外培养，具有始终保持未分化的状态，能够几乎永久或者长期地进行细胞增殖的、呈现正常的核(染色体)型，在适当的条件下分化成所有三胚层(外胚层、中胚层、以及内胚层)的细胞系的能力的细胞。目前，作为多能性干细胞，最为熟知有从初期胚分离的胚胎干细胞(embryonic stemcells：ES细胞)、从胎儿期的始原生殖细胞分离的胚性生殖细胞(embryonic germ cells：EG细胞)、以及从成熟个体的骨髓分离的成人型多能性干细胞(multipotent adult progenitor cells：MAPC)的3种。

例如，从多能性干细胞中的胚胎干细胞进行心肌细胞的分化、诱导的方法，可以列举：释放凝集培养法、悬滴(Hanging-drop)培养法、与饲养细胞共培养方法、旋转培养法、软琼脂培养法、微载体培养法等。

已知例如使用释放凝集培养法的时候，将作为单个细胞状态(通过实施酶消化等使细胞彼此间没有连接地、各个细胞在液相中分散的状态)的胚胎干细胞在培养基按照几百个细胞/mL的细胞密度进行悬浮，进行使白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor：LIF)等的分化抑制因子不存在的悬浮培养，ES细胞间彼此连结、凝集，形成称为胚样体(embryoid body：EB)的初期胚类似结构体，然后，通过将EB以悬浮状态或粘附状态进行培养，能够分化、诱导出具有自律搏动性的心肌细胞。

此外，已知例如使用悬滴培养法的时候，在培养皿的盖上，制备由20μl的培养液构成的液滴，使该液滴中含有数百个细胞，通过使该培养皿的盖覆盖在培养皿上，静置，细胞在液滴的底面、即，在液滴的先端部分形成细胞块，能够将该细胞块分化、诱导成具有自律搏动性的心肌细胞。

此外，已知例如使用与饲养细胞培养的共培养法的时候，能够通过将具有中胚层系细胞的性质的细胞，优选ST2细胞、OP9细胞、PA6细胞等具有骨髓基质细胞样性质的细胞进行高密度培养，用丝裂霉素C处理、或者通过放射线照射等的方法进行饲养化，此外，将在培养基上接种单个细胞状态的ES细胞后，通过培养，能够分化、诱导具有自律搏动性的心肌细胞。

此外，在本发明的第四种实施方式中，提供了从含有心肌细胞的细胞混合物中对心肌细胞比率进行评价的方法，其特征在于，该方法包括：(1)使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；以及根据(2)细胞的相对的线粒体含量，计算相对非心肌细胞的心肌细胞的比率的步骤以及/或者根据细胞的相对的线粒体膜电位选择心肌细胞的步骤。

在这种实施方式中，含有心肌细胞的细胞混合物可以是完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物中的任何一种。此处，完整心脏构成细胞混合物是心肌细胞和非心肌细胞的混合物，直接以现有的状态进行心脏移植的话，由于存在非心肌细胞，所以存在引起在接受者的心脏中严重副作用的风险性。所以，为了进行更安全、确实的对于接受者的心肌细胞的移植，优选在移植前，尽可能提高含有心肌细胞的细胞混合物中心肌细胞的比率，即优选进行浓缩。此外，作为可能分化成心肌细胞的细胞，可以使用例如干细胞、前体细胞或者卵细胞。

在这种实施方式中，作为线粒体指示剂，如前所述，能够使用A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669或者T3168，线粒体指示剂优选使用M7512、T3168、T668或者R302。

在与心肌细胞的移植相关的领域中，作为将心肌细胞分化、诱导的方法，已经公知几种方法，此外，推测在将来会开发多种将心肌细胞进行分化、诱导的方法。不过，如上所述，如果向心脏移植的细胞中混有非心肌细胞的话，在进行心脏移植的时候，存在引起在接受者的心脏中严重副作用的风险。根据该方法，通过在移植前对推测向心脏移植的心肌细胞制备物中的心肌细胞的比率进行评价，能够预先评价在移植中使用的心肌细胞制备物的确实性。

在现有技术领域中，作为心肌细胞的纯化方法，例如：以流式细胞仪和磁珠、panning法等的抗原-抗体反应为基础的方法(MonoclonalAntibodies：principles and practice，Third Edition(Acad.Press，1993)；Antibody Engineering：APractical Approach(IRL Press atOxford University Press，1996)；作为例子已知有以下方法：作为亲本细胞的ES细胞等的多能性干细胞的基因上添加人工修饰，通过赋予药物耐药性或异位蛋白质的表达能力，回收具有作为心肌细胞的形状性质的细胞的方法；以及通过使用可以很容易地与纯化度低的其他方法组合使用的蔗糖、珀可(percoll)等的载体的密度梯度离心的细胞分级法(Circ Res.200220；91：501-508))等。

发明的效果

通过本发明的方法，能够从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地选择心肌细胞。此外，通过本发明的方法，能够从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地浓缩心肌细胞，并且还能不伴随心肌细胞的基因改变地制备心肌细胞。此外，可以通过各种方法对制备的含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞比率进行评价。

通过本发明中记载的这些方法，能够使含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞的比率提高，能够降低在接受者的心脏移植时，由于担心非心肌细胞的存在而造成的多种副作用。

附图说明

图1表示的是对从新生幼儿大鼠心脏提取的完整心脏构成细胞混合物通过的线粒体指示剂M7512进行标记的显像。

图2表示对来自小鼠胚胎干细胞的来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物，通过线粒体指示剂M7512进行标记的显像。

图3表示的是对从新生幼儿大鼠心脏提取的完整心脏构成细胞混合物用线粒体指示剂M7512进行标记，逐个检测各细胞的荧光量的情况的细胞集团的分布。

图4表示的是对小鼠胚胎干细胞来自的来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物用线粒体指示剂M7512进行标记，逐个检测各细胞的荧光量的情况的细胞集团的分布。

图5表示的是通过针对图3所示的完整心脏构成细胞混合物的、心肌细胞标记物的抗体、抗肌节α-辅肌动蛋白抗体标记进行的显像。

图6表示的是通过针对图4所示的来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物的、心肌细胞标记物的抗体、抗肌节α-辅肌动蛋白抗体标记进行的显像。

图7表示的是对从新生幼儿大鼠心脏提取的完整心脏构成细胞混合物用线粒体指示剂T3168进行标记，通过逐个检测各细胞的荧光量的分布解析和进行针对细胞分选的集团的、心肌细胞标记物的抗体、抗肌节α-辅肌动蛋白抗体标记显像。

图8-1：图8表示对新生幼儿大鼠完整心脏细胞用 T668进行标记，逐个检测荧光量的分布解析和进行细胞分选的集团解析的结果以及、通过针对各细胞群的心肌细胞的标记物的抗体、抗肌节α-辅肌动蛋白抗体标记的显像结果。此处，图8-1表示来自新生幼儿大鼠胎生幼仔心脏的细胞集团根据T668荧光强度分成3个细胞集团的图。

图8-2表示几乎全部T668荧光信号最强的细胞群都是心肌细胞、几乎所有中荧光的细胞集团都不是心肌细胞的图。

图8-3是即使用R302也能够得到与T668相同的细胞的图。

图9-1：图9表示的是通过线粒体指示剂T668对大鼠胎生幼仔完整心脏构成细胞的细胞集团解析、和对分选的细胞的辅肌动蛋白的免疫染色结果。此处，图9-1表示来自出生13天的大鼠胎生幼仔心脏的细胞集团，根据T668的荧光强度分成3个细胞集团的图。

图9-2表示几乎所有的来自T668的荧光信号最强的细胞群的细胞是心肌细胞，几乎全部中荧光细胞集团都不是心肌细胞的图。

图10-1：图10表示用线粒体指示剂T668对胎生幼仔全细胞的染色和心肌细胞的纯化。此处，图10-1表示在来自出生9天的大鼠胎生幼仔的细胞集团中，通过荧光强度在细胞集团中观测到主要的一个细胞集团的图。

图10-2表示的是用作为心肌细胞的标记的辅肌动蛋白进行免疫染色的时候，发现在T668中达到大约95％以上的是心肌细胞的图。

图11表示用线粒体指示剂T668对出生后8天到出生11天的大鼠完整心脏构成细胞的染色和细胞集团解析。

图12表示用线粒体指示剂T668对来自小鼠胚胎干细胞的多种细胞群的染色和对分选的细胞集团的辅肌动蛋白进行免疫染色。

具体实施方式

(1)含有心肌细胞的细胞混合物的制备

首先，将含有心肌细胞的细胞混合物作为完整心脏构成细胞混合物、或者来自干细胞的细胞混合物而获得。

完整心脏构成细胞混合物，首先从流产的胎儿或者新生幼儿的心脏分离出心室，将其用剪刀剪碎后，用胶原酶等酶进行处理，通过去除细胞间的连接，使细胞分散而制备。

来自干细胞的细胞混合物可以将胚胎干细胞或体干细胞等的干细胞通过悬滴培养法(Bader A，et al.，Differentiation，2001 68：p.31-43)进行分化、诱导，由此制备心肌细胞。使用来自干细胞的细胞混合物的时候，期望对于分化、诱导的细胞混合物，进行提高心肌细胞的分化·成熟度的处理(例如添加全反式视黄酸)。

(2)通过细胞的线粒体指示剂进行标记

在本发明中作为优选的线粒体指示剂，使用荧光发光性的M7512、T3168、T668或者R302(全部由Molecular Probe公司制造)。对于完整心脏构成细胞混合物、或者来自干细胞的细胞混合物，通过将M7512、T3168、T668或者R302添加到培养液中，进行温育，对细胞进行M7512、T3168、T668或者R302的标记。

对细胞用线粒体指示剂进行标记后，通过再进行数日的培养，能够进一步加大心肌细胞的标记信号量与其他细胞的标记信号量的差异。

(3)心肌细胞的选择

对于用M7512、T3168、T668或者R302标记了的完整心脏构成细胞混合物、或者来自干细胞的细胞混合物，使用细胞分选仪对各细胞内的线粒体含量进行测定，将具有相对高的线粒体含量的细胞集团作为心肌细胞分离。使用M7512、T3168、T668或者R302作为为了选择心肌细胞而期望的细胞分选仪，使用荧光细胞分选仪(FluorescentActivated Cell Sorter；FACS(注册商标))(BD，Franklin Lakes，NJUSA)。

(4)心肌细胞的确认

通过上述方法，分选标记强度强的细胞，培养该细胞。之后，使用能够将心肌细胞从其他细胞中识别的其他的方法，计算选择后的心肌细胞的含量、含有率，确认本发明的效果。在本发明中，作为能够将心肌细胞从其他细胞中识别的其他的方法，可以通过使用针对心肌细胞特异性的标记物(例如：肌球蛋白重链/轻链或者肌节α-辅肌动蛋白、Troponin I、ANP、GATA-4、Nkx 2.5、MEF-2c)的抗体的检测方法。在本发明中，使用对其中的抗肌节α-辅肌动蛋白抗体(anti-Sarcomericα-Actrinin Antibody)进行标记的方法。

实施例

本发明通过下述的实施例进一步加以详细的说明。不过，下述的实施例是本发明的例示，本意不在于局限本发明。

实施例1：通过线粒体指示剂对从新生幼儿大鼠心脏提取的完整心脏构成细胞混合物进行标记

本实施例，为了确认本发明的方法是否能够用于完整心脏构成细胞混合物中的心肌细胞检测而进行。

将出生后1～3天的新生幼儿大鼠用乙醚麻醉，通过颈椎脱臼处死后，摘取心脏。分离出心室，在未添加血清的D-MEM(高葡萄糖)培养基(Invitrogen公司)中，在0.025％(w/v)的胶原酶(WarthingtonBiomedical Corporation公司制造)的存在下，通过消化分离了的心室，使细胞分散，得到完整心脏构成细胞混合物。

培养液用混合了使胎牛血清(JRH Bioscience公司)的终浓度为10％的D-MEM(高葡萄糖)培养基(Invitrogen公司)取代。对于这样制备的培养细胞，按照线粒体指示剂M7512(Molecular Probe公司制造)的终浓度为100nM向培养液中添加，在37℃温育10分钟。然后，使用培养基洗涤4次后，再在37℃培养24小时。

将这样标记的细胞通过荧光显微镜进行观察。结果如图1所示。

在图1中，在心肌细胞中，通过M7512清楚地观察到荧光，表示心肌细胞在细胞内含有大量的线粒体，框线包围的非心肌细胞表示只含有很少的线粒体。

实施例2：通过线粒体指示剂对来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物进行标记

在本实施例中，为了确认本发明的方法是否能够用于检测来自干细胞的细胞混合物中的心肌细胞检测而进行。

对于未分化的小鼠胚胎干细胞，使用悬滴培养法(Bader A，et al.，Differentiation，200168：p.31-43)，引起了心肌细胞的分化、诱导。具体而言，培养皿的盖上，制备由20μl的培养液构成的液滴，使在该液滴中含有数百个细胞，将该培养皿的盖覆盖在培养皿上，通过静置使细胞在液滴的底面，即，在液滴的先端部分形成细胞块的使心肌细胞分化、诱导的方法。在进行心肌细胞的分化、诱导的时候，作为培养液，使用使胎牛血清(EQUITECH-BIO公司)达到终浓度10％而混合的α-MEM培养基(SIGMA公司)。

分化、诱导后第14天，在培养容器内确认生成了含有自律搏动性细胞的细胞块，此外，为了提高心肌细胞的分化、成熟度，向培养液中添加全反式视黄酸，使终浓度达到10^-8M。

分化、诱导第21天时，使含有自律搏动性的细胞的细胞块分散，分散成单独的细胞。将这样制备的细胞混合物在与实施例1相同的条件下用M7512进行标记，在去除M7512后，再接着连续培养5天后，将在培养条件下形成的含有自律搏动性的细胞的细胞块用荧光显微镜进行观察。结果如图2所示。

在图2中，表示了细胞块经过1次搏动周期(即、松弛期1-收缩期-松弛期2)，细胞块的相差显像(上半部分)以及荧光显像(下半部分)。由该结果可知，全部的自律搏动性心肌细胞与其他细胞相比较，用M7512可以进行强标记。即、表示在自律搏动性的细胞块中，与清楚地看到M7512引起的荧光相对，在自律搏动性的细胞块周围存在的细胞中，几乎看不到M7512引起的荧光。

实施例3：用线粒体指示剂标记的完整心脏构成细胞混合物的细胞分布的解析

在本实施例中以阐明实施例1的完整心脏构成细胞混合物中存在多少心肌细胞为目的进行。

首先，将完整心脏构成细胞混合物按照实施例1记载的方法制备，用M7512进行标记。将进行了该标记的完整心脏构成细胞混合物通过FACS(注册商标)(BD，Franklin Lakes，NJ USA)以供细胞集团存在分布解析。结果如图3所示。

图3中，横轴的FSC-A是表示细胞大小的指标。如图示所示，完整心脏构成细胞混合物能够被分为相对荧光强度强的P5区域存在的细胞、和相对荧光强度弱的P6区域。并且，在本实施例中，将在P5区域中存在的细胞作为心肌细胞进行分选，将P6区域中存在的细胞作为心肌细胞以外的细胞进行分选，加以培养。

实施例4：用线粒体指示剂标记的来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物的细胞分布的解析。

本实施例以阐明在实施例2的来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物中存在多少心肌细胞为目的而进行。

首先，将来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物按照实施例2记载的方法进行制备，用M7512进行标记。将完成了该标记的来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物通过FACS(注册商标)(BD，Franklin Lakes，NJ USA)供给细胞集团存在分布解析。结果如图4所示。

图4中，横轴的FSC-A是表示细胞大小的指标。如图所示，来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物能被分成在相对荧光强度强的P2区域中存在的细胞、和在相对荧光强度弱的其他以外的区域中存在的细胞。并且，在本实施例中将在P2区域中存在的细胞作为心肌细胞进行分选，加以培养。

实施例5：通过心肌细胞标记物对从完整心脏构成细胞混合物选出的细胞进行标记

本实施例的目的是阐明在完整心脏构成细胞混合物中存在的心肌细胞通过实施例3的方法能够浓缩多少而进行的。

将用实施例3记载的方法分选的属于P5区域以及P6区域细胞集团，在培养液添加胎牛血清(EQUITECH-BIO公司)至终浓度为10％而混合的α-MEM培养基(SIGMA公司)中培养12小时后，用低聚甲醛进行固定。

然后，将固定了的细胞用作为心肌细胞标记物的小鼠抗肌节α-辅肌动蛋白抗体(SIGMA公司)进行标记，用绿色荧光物质标记的兔抗小鼠抗体(Molecular Probes公司)，使与细胞结合的小鼠抗肌节α-辅肌动蛋白抗体可视化。结果如图5所示。在图5中，分别将在完整心脏构成细胞混合物中的结果表示在上半部分，在实施例3中从P5区域回收的细胞的结果表示在中间部分，并且，在实施例3中从P6区域回收的细胞的结果表示在下半部分。

结果表明在用发明的方法进行选择前的细胞混合物中，由抗肌节α-辅肌动蛋白抗体所识别的心肌细胞和其他的细胞混合在一起，全部细胞中的心肌细胞的比率为30％。与此相对，从P5区域回收的细胞中99％以上是心肌细胞。此外，从P6区域回收的细胞中残存有很少的心肌细胞，只与通过本发明的方法选择前具有相同的心肌细胞比率。

据此可以明确通过使用本发明的方法，能够从完整心脏构成细胞混合物中以高纯度选择心肌细胞，进行浓缩。

实施例6：通过心肌细胞标记物对选自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物进行标记

本实施例的目的是阐明在来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物中存在的心肌细胞通过实施例4的方法能够浓缩到哪种程度而进行的。

将用实施例4记载的方法分选的属于P2区域的细胞集团以及属于以外区域的细胞集团，在作为培养液的使胎牛血清(EQUITECH-BIO公司)的终浓度达到10％而混合的α-MEM培养基(SIGMA公司)中培养12小时后，用低聚甲醛进行固定。

然后，将固定了的细胞用作为心肌细胞标记物的小鼠抗肌节α-辅肌动蛋白抗体(SIGMA公司)进行标记，用绿色荧光物质标记的兔抗小鼠抗体(Molecular Probes公司)，使与细胞结合的小鼠抗肌节α-辅肌动蛋白抗体可视化。结果如图6所示。在图6中，分别将来自小鼠胚胎干细胞的细胞混合物中的结果表示在上半部分，将在实施例4中从P2区域回收的细胞的结果表示在下半部分。

结果表明，在通过本发明的方法进行选择前的细胞混合物中，用抗肌节α-辅肌动蛋白抗体所识别的心肌细胞和其他以外的细胞混合在一起，在全部细胞中的心肌细胞的比率是10％。与此相对，用M7512标记的情况下，从荧光强度强的P2区域回收的细胞中有80％以上是心肌细胞。

据此可知，使用本发明的方法，从来自小鼠胚胎干细胞细胞混合物中也可以以高纯度对心肌细胞进行选择，进行浓缩。

实施例7：用线粒体指示剂T3168进行标记

本实施例是为了确认用线粒体指示剂T3168进行标记的情况下，也能得到与用M7512得到的结果相同的结果而进行的。

作为线粒体指示剂，除了使用T3168(Molecular Probe公司制造)以外，通过用与实施例1记载的方法相同的方法，制备从用线粒体指示剂标记的新生幼儿大鼠心脏提取的完整心脏构成细胞混合物。

对于这样制备的标记了的完整心脏构成细胞混合物，通过用与实施例3记载的方法相同的方法，用FACS对细胞分布进行解析，并且，将表示相对强的荧光强度的细胞作为心肌细胞进行选择、回收。将这样得到的细胞用与实施例5记载的方法相同的方法，在培养后，用低聚甲醛固定，使用小鼠抗肌节α-辅肌动蛋白抗体(SIGMA公司)进行标记。结果如图7所示。

结果表明，用本发明的方法选择前的细胞混合物中，由抗肌节α-辅肌动蛋白抗体所识别的心肌细胞和其它细胞混合在一起，在全部细胞中心肌细胞的比率是30％。与此相对，表示出相对强的荧光强度的细胞95％以上是心肌细胞。

据此明确了使用本发明的方法，作为线粒体指示剂使用T3168的情况下，也能够个从完整心脏构成细胞混合物中，以高纯度选择心肌细胞，进行浓缩。

实施例8：用线粒体指示剂T668对新生幼儿大鼠完整心脏构成细胞染色和纯化心肌细胞

将新生幼儿大鼠胎生幼仔心脏用0.025％(w/v)胶原酶(SIGMA)和胰酶(GIBCO)进行处理，回收细胞集团。相对于细胞分散的培养液，使用终浓度1μM的线粒体指示剂T668(Molecular Probe公司制造)在37℃下，暴露15分钟，洗涤3次后，直接进行FACS解析。结果，根据T668的荧光强度分成3个细胞集团(图8-1)。分别分选荧光信号最强的高荧光细胞集团和中荧光强度细胞集团，进行培养。

然后，针对培养细胞，对辅肌动蛋白进行免疫染色，鉴定心肌细胞(图8-2)。结果可知，来自T668的荧光信号最强的细胞群中的几乎全部的细胞都是心肌细胞，中荧光细胞集团的几乎全部细胞不是心肌细胞。同样地即使用R302(Molecular Probe公司制造)进行解析也能得到相同的结果(图8-3)。

实施例9：用线粒体指示剂T668和M7514对新生幼儿大鼠完整心脏构成细胞进行染色和对每个单位线粒体的膜电位的比较解析

使用与实施例8相同的材料以及方法，回收细胞集团。并且，用对心肌细胞进行线粒体特异性染色的膜电位非依赖性的线粒体指示剂M7514(Molecular Probe公司制造)、和对心肌细胞进行线粒体特异性染色的膜电位依赖性的线粒体指示剂T668进行染色。之后，立即进行FACS解析。因为T668产生的荧光和M7514产生的荧光波长不相同，所以，可以分别进行检测。用T668荧光作为指标，检测出3个细胞集团。根据实施例8所示的解析可知，表示出最高的荧光的高荧光细胞集团是心肌细胞群，中荧光细胞集团是非心肌细胞。

然后，将来自T668的荧光强度以来自M7514的荧光强度分割的比率将各个细胞群分开。在根据T668的信号而鉴定为心肌细胞的细胞群中，作为M7514与T668的荧光强度比，例如采用150％的情况下，150％以上的细胞占全部的90％，与此相对，根据T668的信号而鉴定为非心肌细胞的细胞中，M7514与T668的荧光强度比150％以上的只占全部的13％。这个差距的意思表示的是，在心肌细胞中，与非心肌细胞相比，不仅线粒体的含量高，而且每个线粒体的膜电位也高。

实施例10：用线粒体指示剂T668对大鼠胎生幼仔完整心脏构成细胞进行染色和纯化心肌细胞

将出生13天的大鼠胎生幼仔心脏用胶原酶和胰酶进行处理，回收细胞集团。对于分散了细胞的培养液，使之维持终浓度1μM的线粒体指示剂T668，在37℃下暴露15分钟，洗涤3次后，立即进行FACS解析。根据T668荧光强度分成3个细胞集团(图9-1)。分别分选荧光信号最强的高荧光细胞集团和中荧光细胞集团进行培养。

针对培养细胞对辅肌动蛋白进行免疫染色，鉴定心肌细胞。结果可知，来自T668的荧光信号最强的细胞群的几乎全部细胞都是心肌细胞，中荧光细胞集团的几乎全部细胞不是心肌细胞(图9-2)。

实施例11：用线粒体指示剂T668和M7512对胎生幼仔全部细胞的染色和纯化心肌细胞

对出生9天的大鼠胎生幼仔用胶原酶和胰酶进行处理，回收细胞集团。对于分散了细胞的培养液，使用终浓度达到1μM的线粒体指示剂T668，在37℃下暴露15分钟，洗涤3次后，立即进行FACS解析。根据荧光强度，观测到在细胞集团中的主要的一个细胞集团，从使用发生后期的完整心脏样品的解析可以知道，作为心肌细胞检测并没有发现预测为高荧光强度区域中明确的细胞集团(图10-1)。不过，因为与主要的细胞集团相比具有高荧光的细胞以很少的比例存在，所以将其作为高荧光细胞集团分离回收。

培养该细胞，用作为心肌细胞标记物的辅肌动蛋白进行免疫染色的时候，发现在T668中有大约95％以上是心肌细胞(图10-2)。在出生9天的胎生幼仔(初期胚)中，因为心肌细胞极其不成熟，所以认为不会充分地引起线粒体的量的变化。结果表明在这样的时期中，通过使用线粒体膜电位这样的指标，能够有效地选择心肌细胞。

实施例12：用线粒体指示剂T668对出生后8天到出生11天的大鼠完整心脏构成细胞进行染色和FACS解析

对出生后8天到出生11天的大鼠心脏用胶原酶和胰酶进行处理、回收细胞集团。对于分散了细胞的培养液，使用终浓度达到1μM的线粒体指示剂T668，在37℃下暴露15分钟，进行3次洗涤后，立即进行FACS解析。根据T668荧光强度分离细胞集团可知，荧光强度最强的高荧光心肌细胞集团，随着发生的进行，量增加，细胞群明确地分开(图11)。该结果表明通过使用本说明书提供的方法，能够推测心肌细胞的成熟度。

实施例13：用线粒体指示剂T668对来自小鼠胚胎干细胞的多种细胞群进行染色和纯化心肌细胞

使用与实施例2相同的方法，使ES细胞分化成含有心肌细胞的细胞群。将该多种细胞块用胶原酶和胰酶进行处理，得到分散的细胞。对于分散了细胞的培养液，使用终浓度达到1μM的线粒体指示剂T668，在37℃下暴露15分钟，进行3次洗涤后，立即进行FACS解析。发现根据荧光强度观测到在细胞集团中主要的一个细胞集团，从使用的发生后期的完整心脏样品的解析中可知，作为心肌细胞检测并没有发现预测为高荧光强度区域中明确的细胞集团(图12)。不过，与主要的细胞集团相比，因为存在显示高荧光的细胞，所以将其作为高荧光细胞集团进行分离回收。

在将该细胞进行大量的培养，以作为心肌细胞标记物的辅肌动蛋白进行免疫染色的时候，可以判断98％以上是心肌细胞。相反，回收主要的细胞集团，培养、进行免疫染色的时候，几乎所有的细胞都不是心肌细胞。

实施例14：用线粒体指示剂S7563对新生幼儿大鼠完整心脏构成细胞进行染色和纯化心肌细胞

对新生幼儿大鼠胎生幼仔心脏用胶原酶和胰酶进行处理，回收细胞集团。对于分散了细胞的培养液，使用终浓度达到1μM的线粒体指示剂 S7563，在37℃下暴露15分钟，进行3次洗涤后，立即进行FACS解析。根据 S7563荧光强度分出3个细胞集团。分选出荧光信号最强的细胞集团进行培养。

针对培养细胞对辅肌动蛋白进行免疫染色，鉴定心肌细胞。结果可知来自 S7563的荧光信号最强的高荧光细胞集团的几乎全部细胞都是心肌细胞，中荧光细胞集团的几乎全部不是心肌细胞。

产业上的可利用性

通过本发明的方法，能够从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地选择心肌细胞。此外，根据本发明的方法，能够从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地浓缩心肌细胞，并且，还可以不伴随心肌细胞的基因改变地制备心肌细胞。此外，可以对通过各种方法制备的含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞比率进行评价。

根据本发明中记载的这些方法，能够提高在含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞的比率，在接受者的心脏移植时能够降低由于非心肌细胞的存在导致产生的各种副作用。

Claims

1.选择心肌细胞的方法，该方法是从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者根据细胞的相对的线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因改变地进行选择。

2.权利要求1记载的方法，其中，从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量，不伴随心肌细胞的基因的改变地选择心肌细胞。

3.权利要求1记载的方法，其中，从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体膜电位，不伴随心肌细胞的基因的改变地选择心肌细胞。

4.权利要求1记载的方法，其中，从含有心肌细胞的细胞混合物中，根据细胞的相对的线粒体含量以及膜电位，不伴随心肌细胞的基因的改变地选择心肌细胞。

5.权利要求1～4记载的方法，其特征在于，使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物，测定细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位。

6.权利要求1～5记载的方法，其中含有心肌细胞的细胞混合物是完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物。

7.权利要求6记载的方法，其中可能分化成心肌细胞的细胞选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组。

8.权利要求5～7任一项记载的方法，其中，在使用线粒体指示剂标记含有心肌细胞的细胞混合物后，在测定细胞的相对的线粒体含量以及/或者细胞的相对的线粒体膜电位之前，还包括在无线粒体指示剂的存在下培养标记了的细胞的步骤。

9.权利要求5～8任一项记载的方法，其中，线粒体指示剂选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组。

10.权利要求9记载的方法，其中，线粒体指示剂是M7512、T3168、T668或者R302。

11.从含有心肌细胞的细胞混合物中不伴随心肌细胞的基因改变地浓缩心肌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

12.权利要求11记载的方法，其中，含有心肌细胞的细胞混合物是完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的细胞混合物。

13.权利要求12记载的方法，其中，可能分化成心肌细胞的细胞选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组。

14.权利要求11～13任一项记载的方法，其中，在上述(1)的步骤之后、(2)的步骤之前，还包括在无线粒体指示剂的存在下培养标记了的细胞的步骤。

15.权利要求11～14任一项记载的方法，其中线粒体指示剂选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组。

16.权利要求15记载的方法，其中，线粒体指示剂是M7512、T3168、T668或者R302。

17.不伴随心肌细胞的基因改变地制备心肌细胞的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)从可能分化成心肌细胞的细胞分化、诱导心肌细胞，制备含有心肌细胞的细胞混合物的步骤；

18.权利要求17记载的方法，其中，可能分化成心肌细胞的细胞选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组。

19.权利要求17或者18记载的方法，其中，在上述(2)的步骤之后、(3)的步骤之前，还包括在无线粒体指示剂的存在下培养标记了的细胞的步骤。

20.权利要求17～19任一项记载的方法，其中线粒体指示剂选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组。

21.权利要求20记载的方法，其中，线粒体指示剂是M7512、T3168、T668或者R302。

22.对含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞的比率进行评价的方法，其特征在于，该方法包括：

(2)根据细胞的相对的线粒体含量以及/或者根据细胞的相对的线粒体膜电位，计算相对非心肌细胞的心肌细胞的比率的步骤。

23.权利要求22记载的方法，其中，含有心肌细胞的细胞混合物是完整心脏构成细胞混合物或者来自可能分化成心肌细胞的分化细胞混合物。

24.权利要求23记载的方法，其中，可能分化成心肌细胞的细胞选自干细胞、前体细胞以及卵细胞构成的组。

25.权利要求22～24任一项记载的方法，其中，线粒体指示剂选自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168构成的组。

26.权利要求25记载的方法，其中，线粒体指示剂是M7512、T3168、T668或者R302。