CN1214041C - 信号序列捕获方法 - Google Patents

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Abstract

一种编码缺乏分泌能力的人体mp1的DNA，它是通过去除稳态活性mp1的分泌信号和其胞外域主要部分制得的。该DNA与测试cDNA、编码已知分泌蛋白的cDNA和另一编码除去了分泌信号区域的相同蛋白的cDNA连接，所得每一种嵌合基因在细胞中表达以检查细胞增殖能力。在含作为测试cDNA的编码已知分泌蛋白的cDNA的细胞中检测到细胞增殖，然而对除去了分泌信号区域的编码相同蛋白的cDNA没有检测到细胞增殖。因此，通过构建cDNA文库并通过上面的方法筛选它，可以检测和分离编码包括I型膜蛋白和II型膜蛋白的分泌蛋白的cDNAs。

Description

信号序列捕获方法
                          技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种检测和分离编码具有分泌能力的肽的DNA的方法。
                          背景技术
至今，已将编码激素或生长因子的基因分离并用于生产许多商业上作为药的重组蛋白。它们中大多数为分泌蛋白。因此，在开发新药中分离编码新型分泌蛋白的基因是一极其重要的步骤。因此，已开发出分离编码分泌蛋白的基因的方法。例如，Honjo等人开发了一种方法(未经实质审查公开的日本专利申请JP-平6-315380)，该方法利用分泌蛋白具有允许胞内表达蛋白转位到细胞表面的信号序列的特征。在该方法中，人体IL-2受体，一种分泌蛋白的α链的信号序列用相应于来自靶细胞或组织的mRNA的5′-末端序列的短cDNA片段替换以构建文库，然后将它导入细胞中。在克隆中，IL-2受体在带有信号序列的克隆的细胞表面上表达，但是不含信号序列的那些克隆却不能。因此，该信号序列的存在可以通过抗-IL-2受体抗体检测。
Genetics Institute，Inc.，(Cambridge，MA)开发了一种利用酵母代谢酶的更复杂的系统(US5536637)。转化酶，一种酵母代谢酶，是一种在培养基中将蔗糖裂解成葡萄糖和果糖以传递能量的分泌酶。不分泌该酶的突变型菌株在没有葡萄糖但含蔗糖作为唯一碳源的培养基中不能生长。在利用该现象的方法中，将转化酶基因与cDNA连接以构建文库，然后将其导入缺乏转化酶基因的突变型酵母菌株中。将含该信号肽的克隆通过选择能在仅含蔗糖作为碳源的培养基中生长的克隆进行分离。
然而，Honjo等人的方法的缺陷在于，由于使用抗体，因此在选择阳性克隆中需要繁复的步骤。而且，检测灵敏度非常低。Genetics Institute，Inc.的方法的问题还在于，不能将酵母中分泌效率差的克隆分离出来。此外，由于当报道基因与大的蛋白融合时抗原性或酶活性可能丧失，因此这些方法仅能检测短DNA。而且，这些方法不能检测N-末端在细胞内而C-末端在细胞外的II型膜蛋白。
                  本发明的公开内容
本发明提供了一种检查所试验的cDNA是否编码具有分泌能力的肽的方法。本发明还提供了一种分离编码具有分泌活性的肽的cDNA的方法，它能够使用编码长肽编码区的cDNA。
如细胞因子受体的蛋白质转位到细胞表面，在结合其配体时，其二聚化并诱导细胞增殖。已知蛋白质转位到细胞表面的能力(分泌能力)依赖于信号序列的存在。本发明人认为，通过从蛋白质中去掉信号序列(或具有附加的胞外区)并用含所需肽的融合蛋白替换它，在细胞中表达融合蛋白，并检测细胞的增殖能力，可以检测所需肽是否具有分泌活性。如果肽具有分泌能力，融合蛋白则转位到细胞表面、二聚化、并诱导细胞增殖。与此相反，如果肽不含分泌活性，融合蛋白则不能转位到细胞表面和诱导细胞增殖。因此，可以通过仅检测细胞增殖作为指标来检测所融合的肽的分泌能力。而且，本发明人认为，可以通过选择增殖的细胞对具有分泌能力的肽进行阳性筛选。因此，本发明人使用mpl(血小板生成素受体)作为通过转位到细胞表面并二聚化以触发细胞增殖的蛋白质，并开发出一种检测和分离具有分泌能力的肽的方法。
特别地，我们通过从mpl的组成活性形式去掉分泌信号和大部分胞外域制备了编码人体mpl但没有分泌能力的DNA，这是本发明人发现的(在没有配体的情况下通过转导信号来改变mpl以给IL-3依赖型细胞系提供自主增殖能力；Blood 88：1399-1406(1996))。然后将该DNA与待检测的cDNA、编码已知分泌蛋白的DNA、或编码分泌信号区被除去的分泌肽的DNA连接。所得嵌合基因在细胞中被表达，并检测细胞的增殖能力。结果显示，编码用作测试cDNA的已知分泌蛋白的DNA诱导细胞增殖，然而对编码分泌信号区被移去的分泌蛋白的DNA来说没有检测到细胞增殖。以这种方式，本发明人发现：可以使用如此开发的系统使用细胞增殖作为指标容易地检测并分离编码具有分泌活性并含长肽编码区的肽的DNA。事实上，他们进行了筛选并成功地检测和分离了编码包括I型膜蛋白和II型膜蛋白的分泌蛋白的DNA。
因此，本发明涉及：
(1)一种肽，其能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖并且缺乏分泌能力；
(2)(1)中所述的肽，其中该肽得自细胞因子受体；
(3)(1)中所述的肽，其中该肽得自mpl；
(4)(2)或(3)中所述的肽，其中该肽为配体非依赖型；
(5)(1)中所述的肽，其中该肽包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(6)编码(1)-(5)中任意一项所述肽的DNA；
(7)含(6)中所述DNA和cDNA在该DNA的5′-上游区的克隆位点的载体；
(8)(7)中所述的载体，其中该载体得自逆转录病毒；
(9)(7)或(8)中所述的载体，其中将cDNA插入(6)的DNA的5′-上游；
(10)携带(9)中所述载体的细胞；
(11)(10)中所述的细胞，其中细胞为哺乳动物的细胞；
(12)一种检测被待测试的cDNA编码的肽是否含有分泌能力的方法，该方法包括：
(a)将测试cDNA与(7)的载体连接，
(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，和
(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力；
(13)一种分离编码具有分泌能力的肽的cDNA的方法，该方法包括：
(a)将cDNA文库与(7)的载体连接，
(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，
(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力，和
(d)选择(c)中经鉴定具有细胞增殖能力的阳性细胞，并从所述细胞中分离该cDNA；
(14)一种(12)或(13)中所述的方法，其中所述载体来自逆转录病毒，并且待导入载体的细胞是哺乳动物的细胞；
(15)用(13)的方法分离编码具有分泌能力的肽的cDNA；和
(16)由(15)中所述的cDNA编码的肽。
本发明涉及一种检测编码具有分泌能力的肽的DNA的方法。该检测方法的特征是使用一种编码能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖并缺乏分泌能力的肽的DNA，来检测具有分泌能力的肽。这里，“能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖的肽”包括mpl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5640-5644(1992))，GM-CSF 受体的α链或β链(Blood 83：2802(1994))，红细胞生成素受体(Nature 348：647(1990))，c-kit受体(Blood 85：790(1995))和neu(Nature 339：230(1989))，但不限于此。在本发明的方法中，构建一cDNA以编码上面去除了分泌能力的肽。通常通过删除含信号序列的区域除去分泌能力。例如，人体mpl的信号序列是相应于蛋白质氨基酸序列中1-25位置的区域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5640-5644(1992))，人体GM-CSF 受 体的β链的信号序列是相应于1-48位置的区域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9655-9659(1990))。优选地，也将胞外域从肽中删除。
经构建的cDNA编码的肽优选为配体非依赖型(如果肽为配体依赖型，它可能丧失配体结合能力并在创建融合蛋白之后失活)。例如，创建配体非依赖型肽的方法应在肽中引入突变。在mpl的情况下，将Ser 498取代为Asn可以去除对配体和血小板生成素的依赖性(Blood 88：1399-1406(1996))。本发明方法中所用的mpl优选包括SEQ ID NO：4中所述的氨基酸序列。
将如上所述制备的DNA插入适宜的表达载体中。对该表达载体没有限制，优选是逆转录病毒载体，能通过病毒感染高效地将其引入各种细胞中，并在细胞中稳定地表达插入载体中的DNA。逆转录病毒载体的例子包括加工为用于cDNA文库构建体的载体，如pBabeX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：9146-9150(1995))或pMX(Exp.Hematol.24：324-329(1996))。同样，可以使用例如腺病毒、EB病毒和乳头瘤病毒的病毒载体，或例如pEF-BOS(NucleicAcid Res.18(17))和pcD SRα 296(Mol.Cell.Biol.Jan.466-472(1988))的质粒载体。该表达载体应在上面DNA插入体的5′-上游具有待测试其分泌能力的cDNA的克隆位点以表达融合蛋白。创建cDNA克隆位点的方法是本领域技术人员已知的。
接下来，将所制备的载体与待测试的cDNA连接。将该测试的cDNA连接到“编码能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖的肽的DNA”的5′-上游中，将其插入载体中。该测试cDNA可以是任意编码具有待试验分泌能力的肽的cDNA。该测试cDNA可以按照标准方法与载体连接。例如，使用T4 DNA连接酶经过衔接子或连接子的连接方法(Maniatis T.，MolecularCloning)。
然后将所制备的载体引入细胞中。对引入载体中的细胞没有限制，包括细胞因子依赖型增殖细胞如Ba/F3、OTT-1、FDCP-1和TF-1细胞。使用标准方法可以将载体引入细胞中，这些标准方法包括脂质体转染法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法和电穿孔法。在逆转录病毒感染-介导的引入法中，将载体引入包装细胞并整合成病毒颗粒。可以使用例如磷酸钙法和脂质体转染法的标准方法引入载体。_例如，_可以使用如BOSC23、Bing(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8392-8396(1993))、NX-E和NX-A细胞(Nolan G.P.Immunity 8：461-471(1998))作为包装细胞。
接下来，将这样制得的转化体培养并检查其增殖能力。当由插入载体中的cDNA所编码的蛋白质被表达成具有配体非依赖型活性细胞因子受体的融合蛋白时，在缺乏细胞所依赖的细胞因子(配体)的培养基中培养该转化体。如果检测到显著细胞增殖，那么判断该测试cDNA为编码含有分泌能力的肽的“阳性克隆”。或者，如果没有检测到显著细胞增殖，判断该cDNA为编码缺乏分泌能力的肽的“阴性克隆”。当由插入的cDNA所编码的蛋白质被表达为具有配体依赖型细胞因子受体的融合蛋白时，在存在配体的情况下培养该转化体。如果必要的话，在与没有配体情况下的阴性对照比较之后，如果检测到显著的细胞增殖，则判断该测试cDNA为“阳性克隆”。本领域技术人员可以根据载体所插入的细胞类型以及待表达的融合蛋白的性质适当选择培养转化体的其它条件。
本发明还涉及一种分离编码含有分泌能力的肽的cDNA的方法。在该方法中，将cDNA文库连接到载体中，而不是上面用于检测编码含分泌能力的肽的cDNA的测试cDNA。在本发明的一个具体实施方案中，将使用随机引物制备的cDNA与BstXI衔接子连接并插在两个BstXI位点之间；一个是载体的，另一个插在活性mpl的胞外切割位点中。cDNA文库的来源不被限制在任意具体的一个上，但可以是能从其中分离出含分泌能力的所需肽的细胞或组织。可以使用许多标准方法来构建cDNA文库。在本方法中，判断能够增殖的细胞选自引入cDNA文库的细胞。在所选细胞中含有的cDNA被假定为编码具有分泌能力的肽。例如，通过提取基因组DNA或RNA、通过PCR使用被设计成包含克隆位点的引物将感兴趣的cDNA扩增(在为RNA的情况下，使用逆转录酶将其转变成DNA之后进行)、以及回收该产物可以从其增殖已被检测的细胞中分离出cDNA。
所回收的cDNA是否为全长还是片段，或者它是否为编码新型分泌肽的cDNA，可以将该cDNA序列与数据库中已知的那些蛋白质进行比较来进行分析。如果该cDNA不是全长，常常筛选二级cDNA文库以分离全长cDNA。可以通过本领域技术人员已知的方法构建该二级cDNA文库，例如文献(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition.Sambrook J.等人，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)中所述的那些。
可以利用通过本发明的方法分离的编码具有分泌能力的肽的cDNA生产用于医药或相关疾病的基因治疗中的重组蛋白。可以通过本领域已知的方法生产来自该分离cDNA的重组蛋白。例如，将该cDNA插入到适宜载体中，这些载体例如有pED(Kaufman等人，Nucleic Acids Res.19：4484-4490(1991))、pEF-BOS(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.18：5322(1990))、pXM、pJ13和pJL4(Gough等人，EMBO J.4：645-653(1985))，将该载体引入宿主细胞，培养所得转化体以使其表达重组蛋白，并纯化该重组蛋白。
                        附图简述
图1图示了用于检测分泌能力的肽和通过表达该肽检测BAF/03细胞的细胞因子非依赖型增殖能力的结果。
下面参照实施例详细描述本发明，但并不应解释为将本发明限制其中。
实施例1.载体构建
在小鼠骨髓增殖白血病病毒中，将env连接到包括由从跨膜结构域到N-末端的56个氨基酸组成的胞外域、跨膜结构域和胞内域的小鼠mpl上。进行PCR以获得编码人体mpl的相应区域的cDNA，该区域从Leu(449)到终止密码子(636)，紧靠在该Leu(499)前面是NotI位点(单个核苷酸插入)以及紧靠在终止密码子之后是SalI位点，以便为如下所示的GM-CSF cDNA框架中。将该″pBabeX MPLM″(Blood 88：1399-1406.(1996))，活性人体mplcDNA在其中克隆，用作模板。所用引物列于表1中。
                        表1
Not v-mpl(SEQ ID NO：1)
(T GCGGCCGCC CTGGAGCTGCGCCCGCGATCCTGCTACCGTTTA)
     NotI             mpl序列
MPL Sal(SEQ ID NO：2)
(GTAT GTCGACTCAAGGCTGCTGCCAATAG)
       SalI
使用GeneAmpPCR系统(Perkin Elmer)在含10μg/ml模板DNA、1μM各种引物、50U/ml KOD DNA聚合酶(TOYOBO)、1mM MgCl2、0.2mMdNTPs、120mM Tris-HCl(pH8)、10mM KCl、6mM (NH4)2SO4、0.1％Triton X-100和10μg/ml BSA的反应混合物中在以下条件下进行PCR：在98℃下变性60秒，接着在98℃下15秒、60℃下10秒和74℃下30秒循环25次。在琼脂糖胶上电泳分析该PCR产物，切除含0.6kb感兴趣的片段凝胶片提取DNA。然后在该DNA的5′-末端用T4多核苷酸激酶(TOYOBO)使其磷酸化，并使用T4 DNA连接酶(TOYOBO)将其与用SmaI(TaKaRaShuzo)和细菌碱性磷酸酶(BAP；TaKaRa Shuzo)预处理过的pBluescript SK(-)载体(Stratagene)连接。用ABI PRISM 310遗传分析仪(Perkin Elmer)证实插在所得质粒中的活性mpl cDNA的核苷酸序列。该质粒用NotI(TaKaRa Shuzo)和SalI(TaKaRa Shuzo)消化并在琼脂糖凝胶上电泳分离，分离出一条0.6kb片段。使用T4 DNA连接酶将该片段与pMX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：9146-9150.(1995))连接以获得pMX v-mplM，其中pMX也用NotI和SalI消化，用BAP处理，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化过。该质粒pMX v-mplM含编码缺乏分泌能力的活性mpl的cDNA。该cDNA插入体的核苷酸序列和由该cDNA编码的肽的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：3和NO：4中。
接下来，为了获得其中终止密码子用NotI位点替换的人体GM-CSFcDNA，使用含人体GM-CSF cDNA的pcDSRα298 hGM-CSF(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4360-4394(1985))作为模板进行PCR。所用引物示于表2中。
                            表2EcoGMss(SEQ ID NO：5)(C GAATTCAAAGTTCTCTGGAGGATG)
                        EcoRIEcoGM(SEQ ID NO：6)(C GAATTCGCCGCCACCATGGCACCCGCCCGCTCGCCC)
                      EcoRIGM Not(SEQ ID NO：7)(A GCGGCCGCCTCCTGGACTGGCTCCCA)
                       NotI
将EcoGM设计成具有翻译起始密码子ATG代替Ser(17)，而且与在EcoGMss和EcoGM中一样，EcoRI位点和Kozak共有序列(J.Cell Biol.108：29.(1989))紧靠在ATG密码子前面。将EcoGMss和GM Not的引物对用于PCR以扩增含信号序列的GM-CSF，将EcoGM和GM Not用于扩增缺乏信号序列的GM-CSF。除了使用55℃作为退火温度外，如上所述进行PCR，将该产物克隆成pBluescript SK(-)。使用ABI PRISM 310遗传分析仪(Perkin Elmer)证实DNA插入体的核苷酸序列。然后用EcoRI(TaKaRa)和NotI消化该质粒并将其插入如上所述的pMX v-mplM的EcoRI-NotI位点，获得″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″。该″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″分别在从Leu(449)开始的活性mpl的C-末端部分和有信号序列或没有信号序列的整个GM-CSF之间编码融合蛋白。其cDNA插入体的核苷酸序列示作SEQ ID NO：8和NO：10，由该cDNAs编码的蛋白质的氨基酸序列示作SEQ ID NO：9和NO：11。
实施例2.病毒感染
使用LipofectAMINE(Life Technologies)将上面各种质粒引入包装细胞系BOSC23(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8392-8396.(1993))。将BOSC23细胞涂布在含10％胎牛血清(FCS；JRH Biosciences)的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM；Nissui Pharmaceutical)的6-cm培养皿(CORNING)中。培养6小时之后，用减少了血清的OPTI-MEM I培养基(Life Technologies)洗涤细胞。分别地，将稀释在200μl OPTI-MEM I中的LipofectAMINE(18μl)与3μg稀释在200μl OPTI-MEM I中的每种质粒样品混合。使所得混合物在室温下静置15分钟，与1.6ml OPTI-MEM I混合，然后添加到细胞中。5小时之后，将含20％FCS的2ml DMEM添加到细胞中，将细胞再培养19小时。然后用含10％FCS的3ml DMEM替换培养基，24小时后回收培养基上清液。将小鼠白细胞介素-3(IL-3)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重组病毒的培养基上清液中，并且Ba/F3细胞也悬浮在其中以感染。感染24小时之后，在含10％FCS但没有小鼠IL-3的RPMI1640(Nissui Pharmaceutical)中将该细胞洗涤两次，在相同培养基中继续培养。
在含信号序列的整个GM-CSF和活性mpl(得自pMX GM(+)v-mplM)之间含有融合蛋白的细胞以及那些含具有分泌能力的活性mpl的细胞在没有IL-3的情况下生长。相反地，在没有信号序列的GM-CSF和活性mpl(pMXGM(-)v-mplM)之间含有融合蛋白的细胞以及其中没有引入融合蛋白表达载体的对照Ba/F3细胞没有生长(图1)。
实施例3.筛选
合成以下的寡核苷酸(表3)，使用T4多核苷酸激酶使其5′-末端磷酸化。混合该寡核苷酸并在95℃下变性，然后通过渐渐将其冷却到40℃退火以制备DNA序列盒。
                    表3
5′-GGCCCCAGCACAGTGGC-3′(SEQ ID NO：12)
3′-GGTCGTGTCACCGCCGG- 5′(SEQ ID NO：13)
用NotI(TaKaRa)消化并用BAP处理的pMX GM(-)v-mplM与该序列盒混合并使用T4 DNA连接酶连接。通过DNA测序证实所得质粒中该序列盒的方向为按BstXI和NotI(pMX GM(-)v-mplM2)的次序。使用TRIZOL试剂(GIBCO BRL)由大鼠成神经细胞系MNS70制备总RNA并通过寡脱氧胸苷酸柱(Pharmacia)以制备polyA(+)RNA。用SuperScript选择系统(GIBCO BRL)中所含的随机六聚体合成双链cDNA。该cDNA为平端，与BstXI衔接子(Invitrogen)相连，使用SizeSep 400旋转柱(Pharmacia)分级分离。然后混合该cDNA并使用T4 DNA连接酶将其与用BstXI(TaKaRa)消化并用BAP处理过的pMX GM(-)v-mplM2连接。使用基因脉冲发生器(BioRad)通过电穿孔将DNA引入DH10B大肠杆菌(GIBCO BRL)中以构建cDNA文库。
从含cDNA文库的重组大肠杆菌中提取质粒并使用JETstar柱(GENOMED)纯化。使用如上所述的LipofectAMINE将文库质粒引入BOSC23包装细胞中。将小鼠IL-3(10ng/ml)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重组病毒的培养物上清液中，并且将Ba/F3细胞悬浮在其中以进行感染。感染24小时之后，用磷酸盐缓冲液将该细胞洗涤两次，再在含10％FCS的RPMI1640中培养。由在没有IL-3情况下生长的克隆制备基因组DNA，使用设计为包含cDNA插入位点的引物进行PCR以回收该cDNA片段。
                  表4
5′-GGGGGTGGACCATCCTCTA-3′(SEQ ID NO：14)
5′-CGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3′(SEQ ID NO：15)
使用GeneAmpPCR系统2400在50μl含500ng基因组DNA、500pM各种引物、2.5U TaKaRa LA Taq(TaKaRa)、2.5mM MgCl2、0.3mM dNTPs和所附缓冲液的反应混合物中在以下条件下进行PCR：在98℃下变性60秒，接着在98℃下20秒和68℃下120秒循环30次。在琼脂糖凝胶上电泳分离该PCR产物，切下含扩增片段的凝胶片，并纯化DNA。确定从所得190个克隆中纯化的DNA片段的核苷酸序列，发现150个克隆是编码已知分泌蛋白或膜蛋白的cDNA，或其部分。发现其它40个克隆编码未知分泌蛋白。将如此获得的已知分泌蛋白的一部分示于表5中，其中“长度”是指以氨基酸残基数计所得cDNA片段ORF的长度。编码已知分泌蛋白的克隆的平均长度为273个氨基酸残基。“登录号”是指在GenBank蛋白质数据库中的登录号。应注明的是，本方法的背景值，如检测编码除分泌蛋白外的蛋白质的cDNA或以反方向插入的cDNA为1％或更少。
长度       登录号        名称
221        1805299       淀粉样前体
288        416630        淀粉样蛋白1
350        468563        淀粉样前体样蛋白2
561        112929        淀粉样A4蛋白同源物前体
161        2494287       O-乙酰GD3神经节苷脂合酶
176        2507439       多配体蛋白聚糖3(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白)
218        118115        Cyr61蛋白(生长因子结合蛋白)
382        3219172       胶原蛋白α1(V)
286        461671        I型胶原蛋白α1
159        1082724       前列环素刺激因子
259        1777354       SHPS-1，BIT
254        205167        120kDa唾液酸糖蛋白(肝溶酶体膜蛋白)
482        1708023       K-磷脂酰肌醇蛋白聚糖
224        1139548       与抽搐有关的基因产物6II型前体
105        135818        G-蛋白偶合凝血酶受体
482        129731        蛋白质二硫键异构酶
322        1172451       基底膜蛋白聚糖(基底膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)
165        1709256       神经蛋白聚糖(蛋白聚糖核心蛋白前体)
264        2367641       神经纤维网-2(semaphorin III受体)
211        126638        赖氨酰氧化酶
308        2627143       神经钙粘着蛋白
459        3123675       Notch
140        1718156       血管内皮细胞生长因子
534        627989        内皮缩血管肽转化酶
89         114393        输送钠/钾的腺苷三磷酸酶β-1链
工业实用性
本发明提供了一种检测和分离编码分泌肽的cDNA的方法，该方法使用了一种能够在细胞表面通过其二聚化引发细胞增殖但缺乏分泌能力的肽。由于该方法利用细胞增殖作为检测指标，因此它特别容易且灵敏。而且，与能够检测短DNA片段的传统方法相比，该方法能够检测和分离含较长肽编码区的cDNA，因此它从一级分离克隆中提供了更多的信息。此外，该方法能够检测和分离包括I型和II型膜蛋白的分泌蛋白。
                               序列表
<110>中外制药株式会社
     北村  俊雄
<120>信号序列捕获方法
<130>C1-902PCT
<150>JP 1997-324912
<151>1997-11-26
<160>15
<210>1
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>1
tgcggccgcc ctggagctgc gcccgcgatc ctgctaccgt tta                      43
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>2
gtatgtcgac tcaaggctgc tgccaatag                                      29
<210>3
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工改造的人体mpl序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(573)
<400>3
gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg      48
Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg      96
Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp
            20                  25                  30
tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc gag acc gcc tgg atc tcc      144
Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser
        35                  40                  45
ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc ctc aac gcc gtc ctg ggc      192
Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly
    50                  55                  60
ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca cac tac agg aga ctg agg      240
Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg
65                   70                 75                  80
cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg cac cgg gtc cta ggc cag      288
His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln
                85                  90                  95
tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg ccc aag gcc aca gtc tca      336
Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser
            100                 105                 110
gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc ctt gaa atc ctc ccc aag      384
Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys
        115                 120                 125
tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt tcc tcc cag gcc cag atg      432
Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met
    130                 135                 140
gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg ggg acc atg ccc ctg tct      480
Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser
145                 150                 155                 160
gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc tgc tgt acc acc cac att      528
Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile
                165                 170                 175
gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat tgg cag cag cct              570
Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro
            180                 185                 190
tgagtcgac                                                            579
<210>4
<211>190
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工改造的人体mpl序列
<400>4
Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser
        35                  40                  45
Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg
65                  70                  75                  80
His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln
                85                  90                  95
Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser
            100                 105                 110
Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys
        115                 120                 125
Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met
    130                 135                 140
Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser
145                 150                 155                 160
Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile
                165                 170                 175
Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro
            180                 185                 190
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>5
cgaattcaaa gttctctgga ggatg                                          25
<210>6
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>6
cgaattcgcc gccaccatgg cacccgcccg ctcgccc                             37
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>7
agcggccgcc tcctggactg gctccca                                        27
<210>8
<211>1032
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的人体GM-CSF-人体mpl融合基因序列
<220>
<221>信号肽
<222>(22)..(72)
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(1026)
<400>8
gaattcaaag ttctctggag g atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc      51
                        Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly
                        1               5                   10
act gtg gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc      99
Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser
                15                  20                  25
acg cag ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc      147
Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu
            30                  35                  40
ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa      195
Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu
        45                  50                  55
gtc atc tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc      243
Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr
    60                  65                  70
cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc      291
Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu
75                  80                  85                  90
aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct      339
Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro
                95                  100                 105
cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt      387
Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser
            110                 115                 120
ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc      435
Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys
        125                 130                 135
tgg gag cca gtc cag gag gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct      483
Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser
    140                 145                 150
cgc tac cgt tta cag ctg cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa      531
Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln
155                 160                 165                 170
ggt ccc tgg agc tcg tgg tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc      579
Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr
                175                 180                 185
gag acc gcc tgg atc tcc ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc      627
Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly
            190                 195                 200
ctc aac gcc gtc ctg ggc ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca      675
Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala
        205                 210                 215
cac tac agg aga ctg agg cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg      723
His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu
    220                 225                 230
cac cgg gtc cta ggc cag tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg      771
His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro
235                 240                 245                 250
ccc aag gcc aca gtc tca gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc      819
Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu
                255                 260                 265
ctt gaa atc ctc ccc aag tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt      867
Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys
            270                 275                 280
tcc tcc cag gcc cag atg gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg      915
Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu
        285                 290                 295
ggg acc atg ccc ctg tct gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc      963
Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser
    300                 305                 310
tgc tgt acc acc cac att gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat      1011
Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr
315                 320                 325                 330
tgg cag cag cct tgagtcgac                                            1032
Trp Gln Gln Pro
<210>9
<211>334
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的人体GM-CSF-人体mpl融合蛋白序列
<400>9
                         Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly
                        1               5                   10
Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser
                15                  20                  25
Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu
            30                  35                  40
Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu
        45                  50                  55
Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr
    60                  65                  70
Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu
75                  80                  85                  90
Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro
                95                  100                 105
Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser
            110                 115                 120
Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys
        125                 130                 135
Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser
    140                 145                 150
Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln
155                 160                 165                 170
Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr
                175                 180                 185
Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly
            190                 195                 200
Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala
        205                 210                 215
His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu
    220                 225                 230
His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro
235                 240                 245                 250
Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu
                255                 260                 265
Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys
            270                 275                 280
Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu
        285                 290                 295
Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser
    300                 305                 310
Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr
315                 320                 325                 330
Trp Gln Gln Pro
<210>10
<211>1032
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的人体GM-CSF-人体mpl融合基因序列
<220>
<221>CDS
<222>(16)..(972)
<400>10
gaattcaaag ttctctggag g atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc      51
                        Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly
                        1               5                   10
act gtg gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc      99
Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser
                15                  20                  25
acg cag ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc      147
Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu
            30                  35                  40
ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa      195
Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu
        45                  50                  55
gtc atc tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc      243
Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr
    60                  65                  70
cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc      291
Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu
75                  80                  85                  90
aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct      339
Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro
                95                  100                 105
cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt      387
Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser
            110                 115                 120
ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc      435
Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys
        125                 130                 135
tgg gag cca gtc cag gag gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct      483
Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser
    140                 145                 150
cgc tac cgt tta cag ctg cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa      531
Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln
155                 160                 165                 170
ggt ccc tgg agc tcg tgg tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc      579
Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr
                175                 180                 185
gag acc gcc tgg atc tcc ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc      627
Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly
            190                 195                 200
ctc aac gcc gtc ctg ggc ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca      675
Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala
        205                 210                 215
cac tac agg aga ctg agg cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg      723
His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu
    220                 225                 230
cac cgg gtc cta ggc cag tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg      771
His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro
235                 240                 245                 250
ccc aag gcc aca gtc tca gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc      819
Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu
                255                 260                 265
ctt gaa atc ctc ccc aag tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt      867
Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys
            270                 275                 280
tcc tcc cag gcc cag atg gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg      915
Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu
        285                 290                 295
ggg acc atg ccc ctg tct gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc      963
Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser
    300                 305                 310
tgc tgt acc acc cac att gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat      1011
Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr
315                 320                 325                 330
tgg cag cag cct tgagtcgac                                            1032
Trp Gln Gln Pro
<210>11
<211>334
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的人体GM-CSF-人体mpl融合蛋白序列
<400>11
                        Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly
                        1               5                   10
Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser
                15                  20                  25
Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu
            30                  35                  40
Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu
        45                  50                  55
Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr
    60                  65                  70
Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu
75                  80                  85                  90
Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro
                95                  100                 105
Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser
            110                 115                 120
Phc Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys
        125                 130                 135
Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser
    140                 145                 150
Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln
155                 160                 165                 170
Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr
                175                 180                 185
Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly
            190                 195                 200
Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala
        205                 210                 215
His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu
    220                 225                 230
His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro
235                 240                 245                 250
Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu
                255                 260                 265
Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys
            270                 275                 280
Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu
        285                 290                 295
Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser
    300                 305                 310
Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr
315                 320                 325                 330
Trp Gln Gln Pro
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列盒
<400>12
ggccccagca cagtggc                                                   17
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列盒
<400>13
ggccgccact gtgctgg                                                   17
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>14
gggggtggac catcctcta                                                 19
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>15
cgcgcagctg taaacggtag                                                20

Claims (5)

1.一种检测待测试的cDNA编码的肽是否具有分泌能力的方法，该方法包括：
(a)将待测试cDNA与一种载体连接，所述载体含有(1)编码如下肽的DNA，所述肽选自缺失分泌信号区的mpl、GM-CSF受体的β链、EPO受体、c-kit受体、neu或FLT-3，和(2)位于该DNA的5’上游区的编码用于确定分泌能力的靶肽的cDNA克隆位点；
(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，和
(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力。
2.一种分离编码具有分泌能力的肽的cDNA的方法，该方法包括：
(a)将cDNA文库与一种载体连接，所述载体含有(1)编码如下肽的DNA，所述肽选自缺失分泌信号区的mpl、GM-CSF受体的β链、EPO受体、c-kit受体、neu或FLT-3，和(2)位于该DNA的5’上游区的编码用于确定分泌能力的靶肽的cDNA克隆位点；
(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，
(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力，和
(d)选择(c)中经鉴定具有细胞增殖能力的阳性细胞，并从所述细胞中分离cDNA。
3.权利要求1或2的方法，其中所述肽由氨基酸序列SEQ ID NO：4组成。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述载体得自逆转录病毒。
5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述载体得自逆转录病毒，并且将被导入载体的细胞是哺乳动物的细胞。
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