JP3499528B2 - シグナルシーケンストラップ法 - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は遺伝子工学の分野に属し、分泌能を有するペ
プチドをコードするDNAを検出し、単離する方法に関す
る。
プチドをコードするDNAを検出し、単離する方法に関す
る。
背景技術
現在までに、ホルモンや成長因子などのタンパク質を
コードする遺伝子が単離され、これを基に製造した多く
の組み換えタンパク質が医薬品などとして商品化されて
いるが、そのほとんどは分泌タンパク質であるといえ
る。従って、新規な分泌タンパク質をコードする遺伝子
を単離することは、新たな医薬品を開発する上で非常に
重要なステップである。このためこれまでに分泌タンパ
ク質をコードする遺伝子を単離する方法についての開発
が行われてきた。その一つとして、本庶らの方法（特開
平6-315380号公報）が挙げられる。この方法では、分泌
タンパク質には細胞内で発現したタンパク質を細胞表面
へ移行させるためのシグナル配列があることに着目し、
分泌タンパク質であるヒトIL-2受容体のα鎖のシグナル
配列を除去して、その部分に標的細胞若しくは標的組織
由来mRNAの5’部分に相当する短いcDNA断片を挿入した
ライブラリーを構築して、これを細胞に導入した。そし
て細胞内に導入されたクローンのうち、シグナル配列が
挿入されたクローンではIL-2受容体が細胞表面に発現す
るが、逆にシグナル配列が挿入されていないクローンで
はIL-2受容体は細胞表面へ移行できないことを利用し
て、シグナル配列の有無を抗IL-2受容体抗体で検出し
た。
コードする遺伝子が単離され、これを基に製造した多く
の組み換えタンパク質が医薬品などとして商品化されて
いるが、そのほとんどは分泌タンパク質であるといえ
る。従って、新規な分泌タンパク質をコードする遺伝子
を単離することは、新たな医薬品を開発する上で非常に
重要なステップである。このためこれまでに分泌タンパ
ク質をコードする遺伝子を単離する方法についての開発
が行われてきた。その一つとして、本庶らの方法（特開
平6-315380号公報）が挙げられる。この方法では、分泌
タンパク質には細胞内で発現したタンパク質を細胞表面
へ移行させるためのシグナル配列があることに着目し、
分泌タンパク質であるヒトIL-2受容体のα鎖のシグナル
配列を除去して、その部分に標的細胞若しくは標的組織
由来mRNAの5’部分に相当する短いcDNA断片を挿入した
ライブラリーを構築して、これを細胞に導入した。そし
て細胞内に導入されたクローンのうち、シグナル配列が
挿入されたクローンではIL-2受容体が細胞表面に発現す
るが、逆にシグナル配列が挿入されていないクローンで
はIL-2受容体は細胞表面へ移行できないことを利用し
て、シグナル配列の有無を抗IL-2受容体抗体で検出し
た。
また、GI社は、酵母の代謝酵素を利用した巧妙なシス
テムを開発した（米国特許第5,536,637号明細書）。代
謝酵素であるインベルターゼは分泌酵素であり培地中の
スクロースをグルコースとフルクトースに分解し、エネ
ルギーへの変換を可能にする。このためこの酵素を分泌
できない変異株は炭素源としてグルコースを含まずスク
ロースのみを含む培地においては生育できない。この方
法は、この事実に着目して、インベルターゼ遺伝子にcD
NAを連結したライブラリーを構築してインベルターゼ欠
損酵母に導入し、スクロース培地で培養して生育するク
ローンを選抜することで、シグナルペプチドを有するク
ローンの単離を行うというものである。
テムを開発した（米国特許第5,536,637号明細書）。代
謝酵素であるインベルターゼは分泌酵素であり培地中の
スクロースをグルコースとフルクトースに分解し、エネ
ルギーへの変換を可能にする。このためこの酵素を分泌
できない変異株は炭素源としてグルコースを含まずスク
ロースのみを含む培地においては生育できない。この方
法は、この事実に着目して、インベルターゼ遺伝子にcD
NAを連結したライブラリーを構築してインベルターゼ欠
損酵母に導入し、スクロース培地で培養して生育するク
ローンを選抜することで、シグナルペプチドを有するク
ローンの単離を行うというものである。
しかしながら、本庶等の方法では抗体を用いて検出す
るため陽性クローンの選抜が煩雑、検出感度が低いなど
の欠点があり、GI社の方法には酵母において分泌効率の
悪いクローンを単離することができないという問題点が
あった。さらにこれらの方法ではあまり大きな蛋白を融
合すると抗原性が失われたり、また酵素活性が失われた
りする可能性があるため、短いcDNAしか検出に利用でき
ないという問題点もあった。加えて、N末端が細胞内
に、C末端が細胞外に存在し、シグナルアンカー配列を
有するII型膜タンパク質を検出できないという問題もあ
った。
るため陽性クローンの選抜が煩雑、検出感度が低いなど
の欠点があり、GI社の方法には酵母において分泌効率の
悪いクローンを単離することができないという問題点が
あった。さらにこれらの方法ではあまり大きな蛋白を融
合すると抗原性が失われたり、また酵素活性が失われた
りする可能性があるため、短いcDNAしか検出に利用でき
ないという問題点もあった。加えて、N末端が細胞内
に、C末端が細胞外に存在し、シグナルアンカー配列を
有するII型膜タンパク質を検出できないという問題もあ
った。
発明の開示
本発明は、被検cDNAが分泌能を有するペプチドをコー
ドするか否かを簡便に検出する方法および分泌能を有す
るペプチドをコードするcDNAを簡便に単離する方法であ
って、長いペプチドコード領域を有するcDNAを利用しう
る方法を提供する。
ドするか否かを簡便に検出する方法および分泌能を有す
るペプチドをコードするcDNAを簡便に単離する方法であ
って、長いペプチドコード領域を有するcDNAを利用しう
る方法を提供する。
サイトカイン受容体などのタンパク質は、細胞表面へ
移行してリガンドとの会合によって二量体化し、細胞増
殖を誘導する。またこれらのタンパク質の細胞表面への
移行能（分泌能）はタンパク質中のシグナル配列に依存
していることが知られている。本発明者等は、これらタ
ンパク質の分泌シグナル（さらには細胞外領域）を除去
し、その代わりに所望のペプチドを融合した融合タンパ
ク質を細胞内で発現させて、この細胞の増殖能を検出す
ることにより、該所望のペプチドが分泌能を有するか否
かを検出することができると考えた。即ち、該所望のペ
プチドが分泌能を有すれば発現させた融合タンパク質が
細胞表面へ移行し、二量体化して細胞増殖を誘導する一
方、該ペプチドに分泌能がなければ融合タンパク質は細
胞表面へ移行できず細胞増殖を誘導できないため、細胞
増殖という簡単な指標により融合したペプチドが分泌能
を有するか否かを検出できると考えた。さらに、細胞増
殖が検出された細胞を選抜することにより、分泌能を有
するペプチドをポジティブ選抜することができると考え
た。そこで、本発明者等は、細胞表面へ移行して二量体
化することにより細胞増殖を誘導するタンパク質とし
て、mpl（トロンボポイエチン受容体）を選択し、これ
を用いた分泌能を有するペプチドの検出、単離方法の構
築を行った。
移行してリガンドとの会合によって二量体化し、細胞増
殖を誘導する。またこれらのタンパク質の細胞表面への
移行能（分泌能）はタンパク質中のシグナル配列に依存
していることが知られている。本発明者等は、これらタ
ンパク質の分泌シグナル（さらには細胞外領域）を除去
し、その代わりに所望のペプチドを融合した融合タンパ
ク質を細胞内で発現させて、この細胞の増殖能を検出す
ることにより、該所望のペプチドが分泌能を有するか否
かを検出することができると考えた。即ち、該所望のペ
プチドが分泌能を有すれば発現させた融合タンパク質が
細胞表面へ移行し、二量体化して細胞増殖を誘導する一
方、該ペプチドに分泌能がなければ融合タンパク質は細
胞表面へ移行できず細胞増殖を誘導できないため、細胞
増殖という簡単な指標により融合したペプチドが分泌能
を有するか否かを検出できると考えた。さらに、細胞増
殖が検出された細胞を選抜することにより、分泌能を有
するペプチドをポジティブ選抜することができると考え
た。そこで、本発明者等は、細胞表面へ移行して二量体
化することにより細胞増殖を誘導するタンパク質とし
て、mpl（トロンボポイエチン受容体）を選択し、これ
を用いた分泌能を有するペプチドの検出、単離方法の構
築を行った。
具体的には、以前本発明者等が見いだした恒常的活性
型mpl（このmplはリガンド非存在下でもシグナルを伝達
することによりIL-3依存性細胞株に自律増殖性を賦与す
るように改変されている；Blood 88,1399-1406,1996）
の分泌シグナルおよび細胞外領域の大部分を除去し分泌
能を失わせたヒトmplをコードするDNAを調製した。そし
て、これに被検cDNAとして、公知の分泌タンパク質をコ
ードするDNA、および該分泌タンパク質から分泌シグナ
ル領域を除去したペプチドをコードするDNAをそれぞれ
連結し、これらキメラ遺伝子をそれぞれ細胞内で発現さ
せて、細胞の増殖能の検討を行った。その結果、本発明
者等は、被検cDNAとして公知の分泌タンパク質をコード
するDNAを用いた場合には、細胞の増殖が検出される一
方、分泌シグナル領域を除去したペプチドをコードする
DNAを用いた場合には細胞の増殖が検出されないことを
見いだした。これにより本発明者等は、構築したシステ
ムが、細胞の増殖を指標として、分泌能を有するペプチ
ドをコードするDNAであって長いペプチドコード領域を
有するDNAを簡便に検出し単離することができることを
見いだした。また、実際にスクリーニングを行い、I型
膜タンパク質やII型膜タンパク質を含む分泌タンパク質
をコードするDNAを検出し、単離することに成功した。
型mpl（このmplはリガンド非存在下でもシグナルを伝達
することによりIL-3依存性細胞株に自律増殖性を賦与す
るように改変されている；Blood 88,1399-1406,1996）
の分泌シグナルおよび細胞外領域の大部分を除去し分泌
能を失わせたヒトmplをコードするDNAを調製した。そし
て、これに被検cDNAとして、公知の分泌タンパク質をコ
ードするDNA、および該分泌タンパク質から分泌シグナ
ル領域を除去したペプチドをコードするDNAをそれぞれ
連結し、これらキメラ遺伝子をそれぞれ細胞内で発現さ
せて、細胞の増殖能の検討を行った。その結果、本発明
者等は、被検cDNAとして公知の分泌タンパク質をコード
するDNAを用いた場合には、細胞の増殖が検出される一
方、分泌シグナル領域を除去したペプチドをコードする
DNAを用いた場合には細胞の増殖が検出されないことを
見いだした。これにより本発明者等は、構築したシステ
ムが、細胞の増殖を指標として、分泌能を有するペプチ
ドをコードするDNAであって長いペプチドコード領域を
有するDNAを簡便に検出し単離することができることを
見いだした。また、実際にスクリーニングを行い、I型
膜タンパク質やII型膜タンパク質を含む分泌タンパク質
をコードするDNAを検出し、単離することに成功した。
即ち、本発明は、
（１） 細胞表面で二量体化することにより細胞の増殖
を誘導する能力を有するペプチドであって分泌能を有し
ないペプチド、 （２） サイトカイン受容体に由来する、（１）に記載
のペプチド、 （３） mplに由来する、（１）に記載のペプチド、 （４） リガンド非依存性である、（２）または（３）
に記載のペプチド。
を誘導する能力を有するペプチドであって分泌能を有し
ないペプチド、 （２） サイトカイン受容体に由来する、（１）に記載
のペプチド、 （３） mplに由来する、（１）に記載のペプチド、 （４） リガンド非依存性である、（２）または（３）
に記載のペプチド。
（５） 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する、
（１）に記載のペプチド、 （６） （１）乃至（５）のいずれかに記載のペプチド
をコードするDNA、 （７） （６）に記載のDNAの５’上流にcDNA挿入部位
を有するベクター、 （８） レトロウイルスに由来する、（７）に記載のベ
クター、 （９） （６）に記載のDNAの５’上流にcDNAが挿入さ
れた（７）または（８）に記載のベクター、 （１０） （９）に記載のベクターを保持する細胞、 （１１） 哺乳動物細胞である、（１０）に記載の細
胞、 （１２） 被検cDNAがコードするペプチドが分泌能を有
するか否かを検出する方法であって、 （ａ） （７）に記載のベクターに被検cDNAを連結す
る工程、 （ｂ） 工程（ａ）により調製したベクターを細胞に
導入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）により調製した形質転換体を培養
し、増殖能を検出する工程、 を含む方法、 （１３） 分泌能を有するペプチドをコードするcDNAを
単離する方法であって、 （ａ） （７）に記載のベクターにcDNAライブラリー
を連結する工程、 （ｂ） 工程（ａ）により調製したベクターを細胞に
導入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）により調製した形質転換体を培養
し、増殖能を検出する工程、 （ｄ） 工程（ｃ）において増殖能を有すると判定さ
れた細胞を選択し、該細胞からcDNAを単離する工程、を
含む方法、 （１４） ベクターがレトロウイルスに由来し、ベクタ
ーの導入される細胞が哺乳動物細胞である、（１２）ま
たは（１３）に記載の方法、 （１５） （１３）に記載の方法により単離される、分
泌能を有するペプチドをコードするcDNA、 （１６） （１５）に記載のcDNAによりコードされるペ
プチド、 に関する。
（１）に記載のペプチド、 （６） （１）乃至（５）のいずれかに記載のペプチド
をコードするDNA、 （７） （６）に記載のDNAの５’上流にcDNA挿入部位
を有するベクター、 （８） レトロウイルスに由来する、（７）に記載のベ
クター、 （９） （６）に記載のDNAの５’上流にcDNAが挿入さ
れた（７）または（８）に記載のベクター、 （１０） （９）に記載のベクターを保持する細胞、 （１１） 哺乳動物細胞である、（１０）に記載の細
胞、 （１２） 被検cDNAがコードするペプチドが分泌能を有
するか否かを検出する方法であって、 （ａ） （７）に記載のベクターに被検cDNAを連結す
る工程、 （ｂ） 工程（ａ）により調製したベクターを細胞に
導入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）により調製した形質転換体を培養
し、増殖能を検出する工程、 を含む方法、 （１３） 分泌能を有するペプチドをコードするcDNAを
単離する方法であって、 （ａ） （７）に記載のベクターにcDNAライブラリー
を連結する工程、 （ｂ） 工程（ａ）により調製したベクターを細胞に
導入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）により調製した形質転換体を培養
し、増殖能を検出する工程、 （ｄ） 工程（ｃ）において増殖能を有すると判定さ
れた細胞を選択し、該細胞からcDNAを単離する工程、を
含む方法、 （１４） ベクターがレトロウイルスに由来し、ベクタ
ーの導入される細胞が哺乳動物細胞である、（１２）ま
たは（１３）に記載の方法、 （１５） （１３）に記載の方法により単離される、分
泌能を有するペプチドをコードするcDNA、 （１６） （１５）に記載のcDNAによりコードされるペ
プチド、 に関する。
本発明は、分泌能を有するペプチドをコードするDNA
を検出する方法に関する。本発明の検出方法においては
分泌能を有するペプチドを検出するために、細胞表面で
二量体化することにより細胞の増殖を誘導する能力を有
するペプチドであって分泌能を有しないペプチドをコー
ドするDNAを用いることを特徴とする。「細胞表面で二
量体化することにより細胞の増殖を誘導する能力を有す
るペプチド」としては、例えば、mpl（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89:5640-5644,1992）、GM-CSFα鎖、GM-C
SFβ鎖（Blood 83:2802,1994）、エリスロポイエチン受
容体（Nature 348:647,1990）、c-kit受容体（Blood 8
5:790,1995）、neu（Nature 339:230,1989）などが挙げ
られるが、これらに制限されない。本発明の方法におい
ては、これらペプチドの分泌能が除去されたペプチドを
コードするcDNAを構築する。ペプチドの分泌能の除去
は、通常、シグナル配列領域の除去により行う。これら
ペプチドのシグナル配列としては、例えば、ヒトmplで
あればタンパク質のアミノ酸配列の1位から25位の領域
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5640-5644,1992)、hGMCSF
βであれば1位から48位(Proc.Natl.Acad.Sci USA 87:96
55-9659,1990)の領域である。好ましくは、さらにペプ
チドの細胞外領域の除去を行う。
を検出する方法に関する。本発明の検出方法においては
分泌能を有するペプチドを検出するために、細胞表面で
二量体化することにより細胞の増殖を誘導する能力を有
するペプチドであって分泌能を有しないペプチドをコー
ドするDNAを用いることを特徴とする。「細胞表面で二
量体化することにより細胞の増殖を誘導する能力を有す
るペプチド」としては、例えば、mpl（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89:5640-5644,1992）、GM-CSFα鎖、GM-C
SFβ鎖（Blood 83:2802,1994）、エリスロポイエチン受
容体（Nature 348:647,1990）、c-kit受容体（Blood 8
5:790,1995）、neu（Nature 339:230,1989）などが挙げ
られるが、これらに制限されない。本発明の方法におい
ては、これらペプチドの分泌能が除去されたペプチドを
コードするcDNAを構築する。ペプチドの分泌能の除去
は、通常、シグナル配列領域の除去により行う。これら
ペプチドのシグナル配列としては、例えば、ヒトmplで
あればタンパク質のアミノ酸配列の1位から25位の領域
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5640-5644,1992)、hGMCSF
βであれば1位から48位(Proc.Natl.Acad.Sci USA 87:96
55-9659,1990)の領域である。好ましくは、さらにペプ
チドの細胞外領域の除去を行う。
構築するcDNAがコードするペプチドは、好ましくはリ
ガンド非依存性である（リガンド依存性の場合には融合
タンパク質を形成することによりリガンド結合能を失い
不活性化する可能性がある）。リガンド非依存性にする
ための方法としては、例えば、ペプチドへの変異の導入
が挙げられる。mplにおいては498位のSerをAsnへ置換す
ることによりリガンドであるトロンボポイエチンに対す
る依存性を消失させることが可能である（Blood 88:139
9-1406,1996）。本発明の方法に適用するmplは、好まし
くは配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる。
ガンド非依存性である（リガンド依存性の場合には融合
タンパク質を形成することによりリガンド結合能を失い
不活性化する可能性がある）。リガンド非依存性にする
ための方法としては、例えば、ペプチドへの変異の導入
が挙げられる。mplにおいては498位のSerをAsnへ置換す
ることによりリガンドであるトロンボポイエチンに対す
る依存性を消失させることが可能である（Blood 88:139
9-1406,1996）。本発明の方法に適用するmplは、好まし
くは配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる。
これにより調製したDNAは、本発明の方法に用いるた
めに適当な発現ベクターに挿入する。発現ベクターとし
ては、特に制限はないが、ウイルス感染を利用して種々
の細胞種に高い効率でベクターの導入ができ、ベクター
に導入したDNAを細胞内で安定的に発現させることがで
きるレトロウイルスベクターが好ましい。レトロウイル
スベクターとしては、例えば、pBabeX (Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 92:9146-9150,1995）、pMX(Exp. Hematol.2
4:324-329,1996)などのcDNAライブラリー作成用に改変
されたレトロベクターが挙げられる。レトロウイルス以
外にもアデノウイルス、EBウイルス、パピローマウイル
スなどのウイルスベクター、pEF-BOS (Nucleic Acids R
esearch, Vol.18,No.17),pcD SRα296(Molecular and C
ellular Biology, Jan. p466-472,1988)等のプラスミド
ベクターなどを用いることも可能である。発現ベクター
は、融合タンパク質を発現させるために、挿入された上
記DNAの5’上流に分泌能を検出するためのcDNAの挿入部
位を有する。cDNAの挿入部位の構築は当業者に公知の方
法で行うことができる。
めに適当な発現ベクターに挿入する。発現ベクターとし
ては、特に制限はないが、ウイルス感染を利用して種々
の細胞種に高い効率でベクターの導入ができ、ベクター
に導入したDNAを細胞内で安定的に発現させることがで
きるレトロウイルスベクターが好ましい。レトロウイル
スベクターとしては、例えば、pBabeX (Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 92:9146-9150,1995）、pMX(Exp. Hematol.2
4:324-329,1996)などのcDNAライブラリー作成用に改変
されたレトロベクターが挙げられる。レトロウイルス以
外にもアデノウイルス、EBウイルス、パピローマウイル
スなどのウイルスベクター、pEF-BOS (Nucleic Acids R
esearch, Vol.18,No.17),pcD SRα296(Molecular and C
ellular Biology, Jan. p466-472,1988)等のプラスミド
ベクターなどを用いることも可能である。発現ベクター
は、融合タンパク質を発現させるために、挿入された上
記DNAの5’上流に分泌能を検出するためのcDNAの挿入部
位を有する。cDNAの挿入部位の構築は当業者に公知の方
法で行うことができる。
本発明の方法においては、次いで、これにより調製し
たベクターに被検cDNAを連結する。被検cDNAは、ベクタ
ーに挿入した「細胞表面で二量体化することにより細胞
の増殖を誘導する能力を有するペプチドをコードするDN
A」の5’上流に連結する。被検cDNAとしては、特に制限
はなく分泌能を有するペプチドであるか否かを検出した
い所望のペプチドをコードするcDNAを用いることが可能
である。ベクターへの被検cDNAの連結は、公知の方法に
より行うことができる。例えば、アダプター・リンカー
などを介してT4リガーゼを用いて連結する方法が知られ
ている（Maniatis T:Molecular Cloning）。
たベクターに被検cDNAを連結する。被検cDNAは、ベクタ
ーに挿入した「細胞表面で二量体化することにより細胞
の増殖を誘導する能力を有するペプチドをコードするDN
A」の5’上流に連結する。被検cDNAとしては、特に制限
はなく分泌能を有するペプチドであるか否かを検出した
い所望のペプチドをコードするcDNAを用いることが可能
である。ベクターへの被検cDNAの連結は、公知の方法に
より行うことができる。例えば、アダプター・リンカー
などを介してT4リガーゼを用いて連結する方法が知られ
ている（Maniatis T:Molecular Cloning）。
本発明の方法においては、次いで、これにより調製し
たベクターを細胞に導入する。ベクターを導入する細胞
としては、例えば、Ba/F3,OTT-1,FDCP-1,TF-1などのサ
イトカイン依存性増殖細胞が挙げられるが、これらに制
限されない。ベクターの細胞への導入は公知の方法、例
えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、DEAE-D
extran法、電気穿孔法等により行うことができる。レト
ロウイルスの感染を利用してベクターの導入を行う場合
には、ベクターをパッケージング細胞に導入して、ベク
ターをウイルス粒子にパッケージングする。ベクターの
パッケージング細胞への導入は、公知の方法、例えば、
リン酸カルシウム法、リポフェクション法などにより行
うことができる。パッケージング細胞としては、例え
ば、BOSC23、Bing (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8392-8
396,1993）、NX-E、NX-A(G.P.Nolan,Immunity 8:461-47
1, 1998)などを利用することが可能である。
たベクターを細胞に導入する。ベクターを導入する細胞
としては、例えば、Ba/F3,OTT-1,FDCP-1,TF-1などのサ
イトカイン依存性増殖細胞が挙げられるが、これらに制
限されない。ベクターの細胞への導入は公知の方法、例
えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、DEAE-D
extran法、電気穿孔法等により行うことができる。レト
ロウイルスの感染を利用してベクターの導入を行う場合
には、ベクターをパッケージング細胞に導入して、ベク
ターをウイルス粒子にパッケージングする。ベクターの
パッケージング細胞への導入は、公知の方法、例えば、
リン酸カルシウム法、リポフェクション法などにより行
うことができる。パッケージング細胞としては、例え
ば、BOSC23、Bing (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8392-8
396,1993）、NX-E、NX-A(G.P.Nolan,Immunity 8:461-47
1, 1998)などを利用することが可能である。
本発明の方法においては、次いで、これにより調製し
た形質転換体を培養し、増殖能を検出する。形質転換体
の培養は、ベクターに挿入したcDNAがコードするタンパ
ク質がリガンド非依存性の活性型サイトカイン受容体と
の融合タンパク質として発現する場合には、本来細胞が
依存するサイトカイン（リガンド）を含まない培地で培
養を行う。その結果、有意な細胞の増殖が検出されれ
ば、被検cDNAは分泌能を有するペプチドをコードしてい
る（陽性クローンである）と判定することができ、有意
な細胞の増殖が検出されなければ、被検cDNAは分泌能を
有しないペプチドをコードしている（陰性クローンであ
る）と判定される。一方、挿入したcDNAがコードするタ
ンパク質がリガンド依存性のサイトカイン受容体との融
合タンパク質として発現する場合には、リガンドの存在
下で培養を行う。リガンド非添加の対照との比較を必要
に応じて行い、有意な細胞の増殖が検出されれば陽性ク
ローンであると判定される。形質転換体の培養のその他
の条件は、当業者であればベクターの導入される細胞や
発現させる融合タンパク質の性質等に応じて適宜選択し
うる。
た形質転換体を培養し、増殖能を検出する。形質転換体
の培養は、ベクターに挿入したcDNAがコードするタンパ
ク質がリガンド非依存性の活性型サイトカイン受容体と
の融合タンパク質として発現する場合には、本来細胞が
依存するサイトカイン（リガンド）を含まない培地で培
養を行う。その結果、有意な細胞の増殖が検出されれ
ば、被検cDNAは分泌能を有するペプチドをコードしてい
る（陽性クローンである）と判定することができ、有意
な細胞の増殖が検出されなければ、被検cDNAは分泌能を
有しないペプチドをコードしている（陰性クローンであ
る）と判定される。一方、挿入したcDNAがコードするタ
ンパク質がリガンド依存性のサイトカイン受容体との融
合タンパク質として発現する場合には、リガンドの存在
下で培養を行う。リガンド非添加の対照との比較を必要
に応じて行い、有意な細胞の増殖が検出されれば陽性ク
ローンであると判定される。形質転換体の培養のその他
の条件は、当業者であればベクターの導入される細胞や
発現させる融合タンパク質の性質等に応じて適宜選択し
うる。
本発明は、また、分泌能を有するペプチドをコードす
るcDNAを単離する方法に関する。本発明の単離方法にお
いては、上記の分泌能を有するペプチドをコードするcD
NAを検出する方法において用いた被検cDNAに代えて、cD
NAライブラリーをベクターに連結する。具体的な一例と
しては、ランダムプライマーで作成したcDNAにBstXIア
ダプターを連結し、これをベクターのBstXIサイトと活
性型mplの細胞外切断部位に挿入したBstXIサイトの間に
挿入を行う。cDNAライブラリーとしては、その起源に特
に制限はない。分泌能を有するペプチドを単離したい所
望の細胞、組織などを起源として用いることが可能であ
る。cDNAライブラリーの構築には多くの公知の方法を用
いることができる。本発明の単離方法においては、cDNA
ライブラリーが導入された細胞の中から、増殖能を有す
ると判定された細胞を選択する。選択された細胞に導入
されたcDNAは分泌能を有するペプチドをコードしている
と考えられる。増殖が検出された細胞からのcDNAの単離
は、例えば、細胞からゲノムDNA又はRNAを抽出し、クロ
ーニングサイトを挟む位置に設定されたプライマーを用
いてPCRで（BNAを用いる場合は逆転写酵素でDNAにした
後に）目的のcDNAを増幅し回収することにより行うこと
ができる。
るcDNAを単離する方法に関する。本発明の単離方法にお
いては、上記の分泌能を有するペプチドをコードするcD
NAを検出する方法において用いた被検cDNAに代えて、cD
NAライブラリーをベクターに連結する。具体的な一例と
しては、ランダムプライマーで作成したcDNAにBstXIア
ダプターを連結し、これをベクターのBstXIサイトと活
性型mplの細胞外切断部位に挿入したBstXIサイトの間に
挿入を行う。cDNAライブラリーとしては、その起源に特
に制限はない。分泌能を有するペプチドを単離したい所
望の細胞、組織などを起源として用いることが可能であ
る。cDNAライブラリーの構築には多くの公知の方法を用
いることができる。本発明の単離方法においては、cDNA
ライブラリーが導入された細胞の中から、増殖能を有す
ると判定された細胞を選択する。選択された細胞に導入
されたcDNAは分泌能を有するペプチドをコードしている
と考えられる。増殖が検出された細胞からのcDNAの単離
は、例えば、細胞からゲノムDNA又はRNAを抽出し、クロ
ーニングサイトを挟む位置に設定されたプライマーを用
いてPCRで（BNAを用いる場合は逆転写酵素でDNAにした
後に）目的のcDNAを増幅し回収することにより行うこと
ができる。
回収されたcDNAが完全長であるのか、あるいはその断
片であるのか、さらには、新規な分泌ペプチドをコード
するcDNAであるのかは、既存のデータベースを用いて、
cDNAの配列を比較することで行うことができる。回収さ
れたcDNAが完全長でない場合には、回収されたcDNAを用
いて、２次cDNAライブラリーをスクリーニングすること
で完全長cDNAを単離することができる。２次cDNAライブ
ラリーは、当業者に周知の方法、例えば、文献「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,
J. Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory
Press (New York, 1989)」に記載の方法により構築す
ることができる。
片であるのか、さらには、新規な分泌ペプチドをコード
するcDNAであるのかは、既存のデータベースを用いて、
cDNAの配列を比較することで行うことができる。回収さ
れたcDNAが完全長でない場合には、回収されたcDNAを用
いて、２次cDNAライブラリーをスクリーニングすること
で完全長cDNAを単離することができる。２次cDNAライブ
ラリーは、当業者に周知の方法、例えば、文献「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,
J. Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory
Press (New York, 1989)」に記載の方法により構築す
ることができる。
本発明の方法により単離される分泌能を有するペプチ
ドをコードするcDNAは、関連する疾患の遺伝子治療や医
薬品として有用な組み換えタンパク質の生産などに利用
される。単離したcDNAからの組み換えタンパク質の生産
は、当業者に公知の方法、例えば、該cDNAを適当な発現
ベクター、例えば、pED (Kaufman, et al., Nucleic Ac
ids Res. 19, 4484-4490 (1991)）、pEF-BOS (Mizushim
a et al., Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)）、pX
M、pJ13、およびpJL4 (Gough et al., EMBO J. 4, 645-
653 (1985)）などに組み込んで宿主細胞に導入し、これ
により得られた形質転換体を培養し、形質転換体に発現
させた組み換えタンパク質を精製することにより行うこ
とができる。
ドをコードするcDNAは、関連する疾患の遺伝子治療や医
薬品として有用な組み換えタンパク質の生産などに利用
される。単離したcDNAからの組み換えタンパク質の生産
は、当業者に公知の方法、例えば、該cDNAを適当な発現
ベクター、例えば、pED (Kaufman, et al., Nucleic Ac
ids Res. 19, 4484-4490 (1991)）、pEF-BOS (Mizushim
a et al., Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)）、pX
M、pJ13、およびpJL4 (Gough et al., EMBO J. 4, 645-
653 (1985)）などに組み込んで宿主細胞に導入し、これ
により得られた形質転換体を培養し、形質転換体に発現
させた組み換えタンパク質を精製することにより行うこ
とができる。
図面の簡単な説明
図１は、本発明において分泌能の検出に利用したペプ
チド、および該ペプチドを発現したBAF/03細胞のサイト
カイン非依存的増殖能を検出した結果を示す。
チド、および該ペプチドを発現したBAF/03細胞のサイト
カイン非依存的増殖能を検出した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが
本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ ベクターの構築
マウス骨髄増殖性白血病ウイルスはenvとマウスmp1の
膜貫通ドメインからN末端側に56アミノ酸残基分の細胞
外ドメインと膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが融合
している。この領域に対応するヒトmplの449番目のロイ
シンから636番目のストップコドンの間をコードするcDN
Aを、下記のGM-CSFとフレームが合うように、Leu449の
直前に（１塩基挿入）NotIサイトを有し、ストップコド
ンの直後にSalIサイトを有する型で得るためにPCRを行
った。鋳型としてヒト活性型mplのcDNAをクローン化し
た「pBabeX MPLM」（Blood 88:1399-1406, 1996）を用
い、プライマーとして下記表１のプライマーを用いた。
膜貫通ドメインからN末端側に56アミノ酸残基分の細胞
外ドメインと膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが融合
している。この領域に対応するヒトmplの449番目のロイ
シンから636番目のストップコドンの間をコードするcDN
Aを、下記のGM-CSFとフレームが合うように、Leu449の
直前に（１塩基挿入）NotIサイトを有し、ストップコド
ンの直後にSalIサイトを有する型で得るためにPCRを行
った。鋳型としてヒト活性型mplのcDNAをクローン化し
た「pBabeX MPLM」（Blood 88:1399-1406, 1996）を用
い、プライマーとして下記表１のプライマーを用いた。
10ｇμ/ml鋳型DNA、1μM各プライマー、KOD DNAポリ
メラーゼ(TOYOBO)50単位/ml、1 mM MgCl2、0.2 mM dNTP
s、120mM Tris-HCl(pH8)、10mM KCl、6mM (NH4)2SO4、
0.1% TritonX-100、10μg/ml BSAを含む反応液をGeneAm
pPCR System (PERKIN ELMER)にて以下の条件のPCRに供
した。98℃で60秒の変性後、98℃で15秒、60℃で10秒、
74℃で30秒のサイクルを25回行った。PCR反応物をアガ
ロース電気泳動にかけ、目的の0.6 kbp断片を含む部分
を切り出し、DNAを抽出した。さらにT4 pol ynucleotid
e kinase (TOYOBO)を用いて5’末端をリン酸化した。こ
のDNA断片と別にSmaI（宝酒造）及びBacterial Alkalin
e Phosphatase (BAP、宝酒造）処理したpBluescript SK
(-)(Stratagene)とT4 DNA ligase (TOYOBO)を作用させ
て連結した。得られたプラスミドに挿入されている活性
型mpl cDNAの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyz
er (PERKIN ELMER)にて確認した。このプラスミドをNot
I（宝酒造）とSalI（宝酒造）処理した後、上記同様ア
ガロース電気泳動にて0.6 kbp断片を精製し、別途Not
I、SalI及びBAP処理してアガロース電気泳動にて精製し
たpMX (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92,9146-91
50, 1995)とT4 DNA ligaseで連結しpMX v-mplMを得た。
このプラスミド内には分泌能を有しない活性型mplをコ
ードするcDNAが挿入されている。挿入されたcDNAの塩基
配列を配列番号:3に、該cDNAがコードするペプチドのア
ミノ酸配列を配列番号:4に示す。
メラーゼ(TOYOBO)50単位/ml、1 mM MgCl2、0.2 mM dNTP
s、120mM Tris-HCl(pH8)、10mM KCl、6mM (NH4)2SO4、
0.1% TritonX-100、10μg/ml BSAを含む反応液をGeneAm
pPCR System (PERKIN ELMER)にて以下の条件のPCRに供
した。98℃で60秒の変性後、98℃で15秒、60℃で10秒、
74℃で30秒のサイクルを25回行った。PCR反応物をアガ
ロース電気泳動にかけ、目的の0.6 kbp断片を含む部分
を切り出し、DNAを抽出した。さらにT4 pol ynucleotid
e kinase (TOYOBO)を用いて5’末端をリン酸化した。こ
のDNA断片と別にSmaI（宝酒造）及びBacterial Alkalin
e Phosphatase (BAP、宝酒造）処理したpBluescript SK
(-)(Stratagene)とT4 DNA ligase (TOYOBO)を作用させ
て連結した。得られたプラスミドに挿入されている活性
型mpl cDNAの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyz
er (PERKIN ELMER)にて確認した。このプラスミドをNot
I（宝酒造）とSalI（宝酒造）処理した後、上記同様ア
ガロース電気泳動にて0.6 kbp断片を精製し、別途Not
I、SalI及びBAP処理してアガロース電気泳動にて精製し
たpMX (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92,9146-91
50, 1995)とT4 DNA ligaseで連結しpMX v-mplMを得た。
このプラスミド内には分泌能を有しない活性型mplをコ
ードするcDNAが挿入されている。挿入されたcDNAの塩基
配列を配列番号:3に、該cDNAがコードするペプチドのア
ミノ酸配列を配列番号:4に示す。
次にヒトGM-CSFのストップコドンをNotIサイトに置き
換えたcDNAを得るために、鋳型としてヒトGM-CSFのcDNA
をクローンpcDSR α 298 hGM-CSF(Proc. Natl. Sci. Ac
ad. USA 82:4360-4364, 1985)を用い、プライマーとし
て下記表２のプライマーを用いてPCRを行った。
換えたcDNAを得るために、鋳型としてヒトGM-CSFのcDNA
をクローンpcDSR α 298 hGM-CSF(Proc. Natl. Sci. Ac
ad. USA 82:4360-4364, 1985)を用い、プライマーとし
て下記表２のプライマーを用いてPCRを行った。
EcoGMは17番目のセリンを翻訳開始コドンATGに置き換
え、EcoGMss、EcoGM共に翻訳開始コドンATGの直前にEco
RIサイト及びKozakのコンセンサス配列(J. Cell Biol 1
08:29,1989)を設定した。シグナル配列を有するGM-CSF
はEcoGMssとGM Notの組み合わせで、シグナル配列を欠
くGM-CSFはEcoGMとGM Notの組み合わせでPCRを行った。
アニールの温度を55℃にした以外は上記と同様にPCRを
行い、得られたPCR断片をpBluescript SK(-)にクローン
化した。得られたプラスミドに挿入されているDNAの塩
基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PERKIN ELM
ER)にて確認した。これらのプラスミドをEcoRI（宝酒
造）とNotI処理した後、それぞれを上記と同様にしてpM
X v-mplMのEcoRI-NotIサイト間に挿入して、シグナル配
列を有するGM-CSFの全長と活性型mplの449番目のロイシ
ン以降のC末端部分の融合蛋白をコードする「pMX GM(+)
v-mplM」とこれのシグナル配列を欠く「pMX GM(-)v-mpl
M」を得た。なお、「pMX GM(+)v-mplM」および「pMX GM
(-)v-mplM」に挿入したcDNAの塩基配列をそれぞれ配列
番号:8および配列番号:10に、該cDNAがコードするタン
パク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:9および配列
番号:11に示した。
え、EcoGMss、EcoGM共に翻訳開始コドンATGの直前にEco
RIサイト及びKozakのコンセンサス配列(J. Cell Biol 1
08:29,1989)を設定した。シグナル配列を有するGM-CSF
はEcoGMssとGM Notの組み合わせで、シグナル配列を欠
くGM-CSFはEcoGMとGM Notの組み合わせでPCRを行った。
アニールの温度を55℃にした以外は上記と同様にPCRを
行い、得られたPCR断片をpBluescript SK(-)にクローン
化した。得られたプラスミドに挿入されているDNAの塩
基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PERKIN ELM
ER)にて確認した。これらのプラスミドをEcoRI（宝酒
造）とNotI処理した後、それぞれを上記と同様にしてpM
X v-mplMのEcoRI-NotIサイト間に挿入して、シグナル配
列を有するGM-CSFの全長と活性型mplの449番目のロイシ
ン以降のC末端部分の融合蛋白をコードする「pMX GM(+)
v-mplM」とこれのシグナル配列を欠く「pMX GM(-)v-mpl
M」を得た。なお、「pMX GM(+)v-mplM」および「pMX GM
(-)v-mplM」に挿入したcDNAの塩基配列をそれぞれ配列
番号:8および配列番号:10に、該cDNAがコードするタン
パク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:9および配列
番号:11に示した。
［実施例２］ 感染実験
パッケージング細胞BOSC23 (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:8392-8396,1993)にLipofectAMINE(LIFE TECHNO
LOGIES)を用いて、上記のプラスミドそれぞれを導入し
た。BOSC23を10%ウシ胎児血清(FCS、JRH BIOSCIENCES)
を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM，日水製薬）
で6cm dish(Corning)に播き込み、6時間後、OPTI-MEM I
減少血清培地(LIFE TECHNOLOGIES)で洗浄し、先に200μ
l OPTI-MEM Iで希釈した18μl LipofectAMINEと200μl
OPTI-MEM Iで希釈したそれぞれのプラスミド3μgを混ぜ
て15分間室温で放置したものに1.6 ml OPTI-MEM Iを混
ぜて細胞に加えた。5時間後、2 mlの20%FCSを含むDMEM
を加え19時間培養した。その後、3 mlの10%FCSを含むDM
EMに置換し、24時間後にその培養上清を回収した。組み
換えウイルスを含む培養上清にマウスインターロイキン
-3（IL-3)及び10μg/mlポリプレン（Hexadimethrine Br
omide, Sigma）を加え、これにBa/F3を懸濁して感染さ
せた。感染させて24時間後、マウスIL-3を含まない10%F
CSを含むRPMI1640（日水製薬）で2回細胞を洗浄し、同
培地にて培養を続けた。
USA 90:8392-8396,1993)にLipofectAMINE(LIFE TECHNO
LOGIES)を用いて、上記のプラスミドそれぞれを導入し
た。BOSC23を10%ウシ胎児血清(FCS、JRH BIOSCIENCES)
を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM，日水製薬）
で6cm dish(Corning)に播き込み、6時間後、OPTI-MEM I
減少血清培地(LIFE TECHNOLOGIES)で洗浄し、先に200μ
l OPTI-MEM Iで希釈した18μl LipofectAMINEと200μl
OPTI-MEM Iで希釈したそれぞれのプラスミド3μgを混ぜ
て15分間室温で放置したものに1.6 ml OPTI-MEM Iを混
ぜて細胞に加えた。5時間後、2 mlの20%FCSを含むDMEM
を加え19時間培養した。その後、3 mlの10%FCSを含むDM
EMに置換し、24時間後にその培養上清を回収した。組み
換えウイルスを含む培養上清にマウスインターロイキン
-3（IL-3)及び10μg/mlポリプレン（Hexadimethrine Br
omide, Sigma）を加え、これにBa/F3を懸濁して感染さ
せた。感染させて24時間後、マウスIL-3を含まない10%F
CSを含むRPMI1640（日水製薬）で2回細胞を洗浄し、同
培地にて培養を続けた。
その結果、シグナル配列を含むGM-CSFの全長との活性
型融合mpl(pMX GM(+)v-mplM由来）では分泌能を除去し
ていない活性型mplと同様IL-3非存在下で増殖を示す細
胞が確認された。一方、シグナル配列を欠いたGM-CSFと
の活性型融合mpl(pMX GM(-)v-mplM)では融合タンパク質
を発現させるためのベクターを導入していない対照のBa
/F3同様増殖を示さなかった（図１）。
型融合mpl(pMX GM(+)v-mplM由来）では分泌能を除去し
ていない活性型mplと同様IL-3非存在下で増殖を示す細
胞が確認された。一方、シグナル配列を欠いたGM-CSFと
の活性型融合mpl(pMX GM(-)v-mplM)では融合タンパク質
を発現させるためのベクターを導入していない対照のBa
/F3同様増殖を示さなかった（図１）。
［実施例３］ スクリーニング
下記（表３）のオリゴヌグレオチドを合成し、T4 pol
ynucleotide kinaseを用いて5’末端をリン酸化した。
これらを混合後95℃で変性し40℃までゆっくり冷やして
アニールさせカセットDNAを調製した。
ynucleotide kinaseを用いて5’末端をリン酸化した。
これらを混合後95℃で変性し40℃までゆっくり冷やして
アニールさせカセットDNAを調製した。
NotI（宝酒造）及びBAP処理したpMX GM(-)v-mplMとこ
のカケットを混合し、T4 DNA ligaseを作用させて連結
した。得られたプラスミドに挿入されているカセットの
向きがBstXI、NotIの順になっていることをその塩基配
列にて確認した（pMX GM(-)v-mplM2）。ラット神経幹細
胞株MNS70よりTRIZOL (GIBCO BRL)を用いてRNAを抽出
し、さらにoligo dTカラム（Pharmacia）に通塔するこ
とによりpolyA(+)RNAを調製した。SuperScript Choice
System (GIBCO BRL）のランダムヘキサマーを用いて二
本鎖cDNAを合成した。cDNAの末端平滑処理後BstXIアダ
プター（Invitrogen）を付加し、SizeSep 400 Spun Col
umn (Pharmacia）を用いてcDNAを分画した。別にBstXI
（宝酒造）及びBAP処理したpMX GM(-)v-mplM2と混合後T
4 DNA ligaseを作用させて連結した。これをGene Pulse
r (BioRad）を用いて電気穿孔法にて大腸菌DH10B (GIBC
O BRL）に導入してcDNAライブラリーを構築した。
のカケットを混合し、T4 DNA ligaseを作用させて連結
した。得られたプラスミドに挿入されているカセットの
向きがBstXI、NotIの順になっていることをその塩基配
列にて確認した（pMX GM(-)v-mplM2）。ラット神経幹細
胞株MNS70よりTRIZOL (GIBCO BRL)を用いてRNAを抽出
し、さらにoligo dTカラム（Pharmacia）に通塔するこ
とによりpolyA(+)RNAを調製した。SuperScript Choice
System (GIBCO BRL）のランダムヘキサマーを用いて二
本鎖cDNAを合成した。cDNAの末端平滑処理後BstXIアダ
プター（Invitrogen）を付加し、SizeSep 400 Spun Col
umn (Pharmacia）を用いてcDNAを分画した。別にBstXI
（宝酒造）及びBAP処理したpMX GM(-)v-mplM2と混合後T
4 DNA ligaseを作用させて連結した。これをGene Pulse
r (BioRad）を用いて電気穿孔法にて大腸菌DH10B (GIBC
O BRL）に導入してcDNAライブラリーを構築した。
ライブラリー組み換え大腸菌から抽出したプラスミド
をJETstarカラム（GENOMED）を用いて精製した。前記と
同様にしてパッケージング細胞BOSC23にLipofect AMINE
を用いてライブラリープラスミドを導入した。組み換え
ウイルスを含む培養上清に10ng/mlマウスIL-3および10
μg/mlポリブレン（Hexadimethrine Bromide, Sigma）
を加え、これにBa/F3を懸濁して感染させた。24時間感
染後細胞をリン酸緩衝液にて2回洗浄し10%FCSを含むRPM
I1640にて培養を続けた。IL-3非存在下で増殖してきた
クローンから染色体DNAを抽出し、cDNA挿入部位を挟む
ように設定したプライマー を用いてPCRを用いcDNA断片を回収した。PCRは500ng染
色体DNA、500pM各プライマー、TakaRa LA Taq（宝酒
造）2.5単位、2.5mM MgCl2、0.3mM dNTPs及び酵素添付
緩衝液を含む反応液50μlについてGeneAmpPCR Syslem24
00で以下の条件にて行った。98℃で60秒の変成後、98℃
で20秒、68℃で120秒のサイクルを30回行った。PCR反応
物をアガロース電気泳動にかけ増幅された断片を含む部
分を切り出し、DNAを精製した。得られた190クローンか
ら精製されたDNA断片の塩基配列を決定したところ、150
クローンが既知の分泌蛋白質あるいは膜蛋白質をコード
するcDNAあるいはその断片であった。また、残りの40ク
ローンは未知の分泌タンパク質であった。得られた既知
の分泌タンパク質のいくつかを表５に示した。表中、
「長さ」は得られたcDNA断片にコードされているORF部
分の長さをアミノ酸残基数で示したものである。得られ
た既知の分泌タンパク質をコードするクローンの平均の
長さは、アミノ酸残基数で273であった。また、「アク
セッション番号」は、GenBankのタンパク質のデータベ
ースのアクセッション番号を示す。尚、本法では、分泌
タンパク質以外のタンパク質をコードするcDNAや、逆向
きに挿入されたcDNAを検出するバックグラウンドは1%以
下であった。
をJETstarカラム（GENOMED）を用いて精製した。前記と
同様にしてパッケージング細胞BOSC23にLipofect AMINE
を用いてライブラリープラスミドを導入した。組み換え
ウイルスを含む培養上清に10ng/mlマウスIL-3および10
μg/mlポリブレン（Hexadimethrine Bromide, Sigma）
を加え、これにBa/F3を懸濁して感染させた。24時間感
染後細胞をリン酸緩衝液にて2回洗浄し10%FCSを含むRPM
I1640にて培養を続けた。IL-3非存在下で増殖してきた
クローンから染色体DNAを抽出し、cDNA挿入部位を挟む
ように設定したプライマー を用いてPCRを用いcDNA断片を回収した。PCRは500ng染
色体DNA、500pM各プライマー、TakaRa LA Taq（宝酒
造）2.5単位、2.5mM MgCl2、0.3mM dNTPs及び酵素添付
緩衝液を含む反応液50μlについてGeneAmpPCR Syslem24
00で以下の条件にて行った。98℃で60秒の変成後、98℃
で20秒、68℃で120秒のサイクルを30回行った。PCR反応
物をアガロース電気泳動にかけ増幅された断片を含む部
分を切り出し、DNAを精製した。得られた190クローンか
ら精製されたDNA断片の塩基配列を決定したところ、150
クローンが既知の分泌蛋白質あるいは膜蛋白質をコード
するcDNAあるいはその断片であった。また、残りの40ク
ローンは未知の分泌タンパク質であった。得られた既知
の分泌タンパク質のいくつかを表５に示した。表中、
「長さ」は得られたcDNA断片にコードされているORF部
分の長さをアミノ酸残基数で示したものである。得られ
た既知の分泌タンパク質をコードするクローンの平均の
長さは、アミノ酸残基数で273であった。また、「アク
セッション番号」は、GenBankのタンパク質のデータベ
ースのアクセッション番号を示す。尚、本法では、分泌
タンパク質以外のタンパク質をコードするcDNAや、逆向
きに挿入されたcDNAを検出するバックグラウンドは1%以
下であった。
産業上の利用の可能性
本発明により、細胞表面で二量体化することにより細
胞の増殖を誘導する能力を有するペプチドであって分泌
能を有しないペプチドを利用した、分泌ペプチドをコー
ドするcDNAの検出および単離方法が提供された。本発明
の方法は、細胞の増殖を指標として検出するため非常に
簡便で検出感度が高い。また、より長いペプチドコード
領域を有するcDNAを検出して単離することができるた
め、短いcDNA断片の検出を行う従来の方法より最初に得
られるクローンからの情報が多い。また、I型膜タンパ
ク質に加え、II型膜タンパク質を含む分泌タンパク質を
検出、単離することができる。
胞の増殖を誘導する能力を有するペプチドであって分泌
能を有しないペプチドを利用した、分泌ペプチドをコー
ドするcDNAの検出および単離方法が提供された。本発明
の方法は、細胞の増殖を指標として検出するため非常に
簡便で検出感度が高い。また、より長いペプチドコード
領域を有するcDNAを検出して単離することができるた
め、短いcDNA断片の検出を行う従来の方法より最初に得
られるクローンからの情報が多い。また、I型膜タンパ
ク質に加え、II型膜タンパク質を含む分泌タンパク質を
検出、単離することができる。
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フロントページの続き
(56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．89，Ｐ．5640−
5644 （1992)
Ｐｒｃｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．87，Ｐ．9655−
9659 （1990)
Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．88，Ｐ．1399−
1406 （1996)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 14/715
C12N 15/12
C12N 5/16
C12Q 1/68
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】 被検cDNAがコードするペプチドが分泌能
を有するか否かを検出する方法であって、 （ａ） 細胞表面で二量体化することにより細胞の増殖
を誘導する能力を有するペプチドであって分泌能を有し
ないペプチドをコードするDNAの５’上流に分泌能を有
するか否かを検出するペプチドをコードする被検cDNAが
連結されたベクターを提供する工程、 （ｂ） 工程（ａ）において調製したベクターを細胞に
導入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）により調製した形質転換体を培養
し、増殖能を検出する工程、 を含む方法。 - 【請求項２】 分泌能を有するペプチドをコードするcD
NAを単離する方法であって、 （ａ） 細胞表面で二量体化することにより細胞の増殖
を誘導する能力を有するペプチドであって分泌能を有し
ないペプチドをコードするDNAの５’上流に分泌能を有
するか否かを検出するペプチドをコードする被検cDNAラ
イブラリーが連結されたベクターを提供する工程、 （ｂ） 工程（ａ）において調製したベクターを細胞に
導入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）により調製した形質転換体を培養
し、増殖能を検出する工程、 （ｄ） 工程（ｃ）において増殖能を有すると判定され
た細胞を選択し、該細胞からcDNAを単離する工程、 を含む方法。 - 【請求項３】 ベクターがレトロウイルスに由来し、ベ
クターの導入される細胞が哺乳動物細胞である、請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の方法に用いるための、
細胞表面で二量体化することにより細胞の増殖を誘導す
る能力を有するペプチドであって分泌能を有しないペプ
チドをコードするDNAの５’上流に分泌能を有するか否
かを検出するペプチドをコードするcDNAの挿入部位を有
するベクター。 - 【請求項５】 レトロウイルスに由来する、請求項４に
記載のベクター。 - 【請求項６】 請求項１に記載の方法に用いるための、
細胞表面で二量体化することにより細胞の増殖を誘導す
る能力を有するペプチドであって分泌能を有しないペプ
チドをコードするDNAの５’上流に分泌能を有するか否
かを検出するペプチドをコードするcDNAが挿入された請
求項４または５に記載のベクター。 - 【請求項７】 請求項１に記載の方法に用いるための、
請求項６に記載のベクターを保持する細胞。 - 【請求項８】 哺乳動物細胞である、請求項７に記載の
細胞。
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| JP9-324912 | 1997-11-26 | ||
| PCT/JP1998/005326 WO1999026978A1 (fr) | 1997-11-26 | 1998-11-26 | Procede de piegeage de signal-sequence |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=18171016
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000522134A Expired - Fee Related JP3499528B2 (ja) | 1997-11-26 | 1998-11-26 | シグナルシーケンストラップ法 |
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| Country | Link |
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| AU (1) | AU1260799A (ja) |
| CA (1) | CA2311678C (ja) |
| HK (1) | HK1032065A1 (ja) |
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| WO (1) | WO1999026978A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011148983A1 (ja) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | 独立行政法人国立がん研究センター | 生体外で自己複製可能な誘導前がん幹細胞又は誘導悪性幹細胞、これらの製造方法、及び、これらの細胞の応用 |
| WO2013081188A1 (ja) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | 独立行政法人国立がん研究センター | 誘導悪性幹細胞 |
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|---|---|---|---|---|
| US7879318B2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-02-01 | Mcw Research Foundation, Inc. | Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2879303B2 (ja) | 1993-01-14 | 1999-04-05 | 佑 本庶 | ｃＤＮＡライブラリーの作製方法、および新規なポリペプチドとそれをコードするＤＮＡ |
| US5536637A (en) * | 1993-04-07 | 1996-07-16 | Genetics Institute, Inc. | Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast |
| US5675062A (en) * | 1994-07-18 | 1997-10-07 | President And Fellows Of Harvard College | Cellular basis of transplant arteriosclerosis in mice |
| WO1996040904A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Zymogenetics, Inc. | Secretion leader trap cloning method |
| JP2002238557A (ja) | 1996-07-23 | 2002-08-27 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | トランスメンブレントラップ法 |
| JPH1132779A (ja) | 1997-07-24 | 1999-02-09 | Fujita Gakuen | 蛋白質の遺伝子クローニング法 |
-
1998
- 1998-11-26 AU AU12607/99A patent/AU1260799A/en not_active Abandoned
- 1998-11-26 EP EP98955942A patent/EP1033374B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-26 KR KR10-2000-7005715A patent/KR100452008B1/ko not_active IP Right Cessation
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- 1998-11-26 RU RU2000116268/13A patent/RU2230751C2/ru not_active IP Right Cessation
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- 1998-11-26 US US09/555,165 patent/US6866998B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-26 WO PCT/JP1998/005326 patent/WO1999026978A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1998-11-26 CN CNB988129698A patent/CN1214041C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-05-23 IL IL136310A patent/IL136310A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-25 NO NO20002670A patent/NO330269B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-05 HK HK01101587.6A patent/HK1032065A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８８，Ｐ．１３９９−１４０６ （１９９６） |
| Ｐｒｃｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８７，Ｐ．９６５５−９６５９ （１９９０） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．８９，Ｐ．５６４０−５６４４ （１９９２） |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011148983A1 (ja) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | 独立行政法人国立がん研究センター | 生体外で自己複製可能な誘導前がん幹細胞又は誘導悪性幹細胞、これらの製造方法、及び、これらの細胞の応用 |
| WO2013081188A1 (ja) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | 独立行政法人国立がん研究センター | 誘導悪性幹細胞 |
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