JPH10248583A - Ｄｎａポリメラーゼ及びこれをコードするｄｎａポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新たなＤＮＡポリメラーゼを特定及び製造する
ことにより、遺伝子工学及び診断医学等の分野の進歩に
寄与すること。 【解決手段】マイコバクテリウム（Mycobacterium ）属
に属する細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びこれを
コードする遺伝子を特定することにより、遺伝子工学
においてこれを応用することが可能であり、マイコバ
クテリウム属に属する細菌のタイピングやこの細菌に起
因する疾病の診断において応用することが可能であり、
新たな優れた性質を有するＤＮＡポリメラーゼの創出
するステップとすることが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡポリメラー
ゼ及びこのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する技術分野
に属する発明である。より具体的には、マイコバクテリ
ウム（Mycobacterium ）属に属する細菌に由来するＤＮ
Ａポリメラーゼ及びこのＤＮＡポリメラーゼの遺伝子に
関する技術分野に属する発明である。

【０００２】

【従来の技術】細菌のみならず、高等生物でもＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子は、ＤＮＡ障害の修復，あるいはＤＮ
Ａの複製に重要な役割を果たしている。また、このＤＮ
Ａポリメラーゼは、遺伝子工学の道具として極めて有用
であり、色々利用されている。例えば、ＰＣＲ（Polyme
rase chain reaction ）法や、ニックトランスレーショ
ン（nick translation）法や、ランダムプライムラベリ
ング（randum prime labeling ）法や、ＲＮＡを基質と
した逆転写（reverse transcriptation ）等に各種のＤ
ＮＡポリメラーゼが用いられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このようなＤＮＡポリ
メラーゼは、「多くの生物において、ほぼ普遍的に認め
られる酵素」の一つであり、同時に各々の生物種に応じ
て種々の特徴を有すると考えられる酵素の一つである
（例えば、上記ＰＣＲ法において用いられる「耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ」は耐熱性菌に由来するＤＮＡポリメ
ラーゼである）から、様々な特徴を有する生物のＤＮＡ
ポリメラーゼをスクリーニングすることにより、特徴あ
るＤＮＡポリメラーゼを獲得することは、産業上極めて
有用なことである。

【０００４】また、各々の生物種のＤＮＡポリメラーゼ
を構成するアミノ酸配列や、これをコードする塩基配列
のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定して、その種独特の
配列部分と多くの生物間で高度に保存されている配列を
特定することによって、その特定の生物種のスクリーニ
ングを行うことも可能である。すなわち、本発明が解決
すべき課題は、新たなＤＮＡポリメラーゼを特定及び製
造することにより、遺伝子工学及び診断医学等の分野の
進歩に寄与することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決のために鋭意検討を行った。その結果、フクシン，
クリスタルバイオレット等で固定染色した場合に塩酸酸
性アルコールによる脱色に抵抗性を示す「抗酸菌」とし
て知られるマイコバクテリウム（Mycobacterium ）属に
属する細菌のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がＧＣ含量が多
い特徴的な塩基配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼと
して広く知られる大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと共通す
る配列部分を有することを見出し本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明者は、以下の発明を本願
において提供する。請求項１において、マイコバクテリ
ウム（Mycobacterium ）属に属する細菌に由来するＤＮ
Ａポリメラーゼを提供する。

【０００７】請求項２において、配列番号４で表される
アミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼを提供する。

【０００８】請求項３において、請求項２記載のＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸配列の一部を欠失，変更及び／
又は付加することにより改変してなり、かつそのＤＮＡ
ポリメラーゼとしての機能が請求項２記載のＤＮＡポリ
メラーゼと同等であるＤＮＡポリメラーゼを提供する。

【０００９】請求項４において、マイコバクテリウム
（Mycobacterium ）属に属する細菌に由来するＤＮＡポ
リメラーゼをコードするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を提
供する。

【００１０】請求項５において、配列番号４で表される
アミノ酸配列のＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配
列を含んでなるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を提供する。

【００１１】請求項６において、配列番号３で表される
塩基配列を含んでなるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を提供
する。

【００１２】請求項７において、請求項４乃至請求項６
のいずれかの請求項記載のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
塩基配列の一部を欠失，変更及び／又は付加することに
より改変してなり、かつその改変した遺伝子がコードす
るＤＮＡポリメラーゼの機能が、この改変の対象となっ
たＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がコードするＤＮＡポリメ
ラーゼと同等であるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を提供す
る。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態につ
いて説明する。本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの
供給源となるマイコバクテリウム（Mycobacterium ）属
に属する細菌は、グラム陽性の桿菌で、フクシン，クリ
スタルバイオレット等で固定染色した場合に塩酸酸性ア
ルコールによる脱色に抵抗性を示す「抗酸菌」として知
られる細菌であり、例えばMycobacterium （以下、Ｍと
略記する）abscessus,M.avium, M.marinum, M.bovis,
M.fortuitum, M.intracelluare, M.kansasii, M.lepra
e, M.lepraemurium, M.marianum, M.microti, M.paratu
berculosis, M.phlei, M.platypoecilus, M.scrofulace
um, M.smegmatis, M.thamnopheos, M.tuberculosis, M.
ulcerans, M.xenopi等を例示することができる。

【００１４】これらの細菌は、例えば結核菌，らい菌，
恥垢菌等として知られている。これらのマイコバクテリ
ウム属に属する細菌のうち、本発明ＤＮＡポリメラーゼ
及び同遺伝子の供給源となる菌の種名は特に限定される
ものではない。

【００１５】上記した供給源から、本発明ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の入手は、通常行われる遺伝子工学的手法
を、本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の特性に応じて適
用することにより行うことができる。すなわち、所望す
る遺伝子を有する供給源、すなわちマイコバクテリウム
属に属する細菌の遺伝子ライブラリーを作成し、この遺
伝子ライブラリーから所望する遺伝子を有するクローン
をスクリーニングすることにより、本発明ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を入手することができる。

【００１６】まず、この本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子を入手する過程について逐次説明する。 １．遺伝子ライブラリーの調製 所望する遺伝子ライブラリーの調製は、通常公知の方法
に従い行うことができる。すなわち、所望するＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を保有するマイコバクテリウム属に属
する細菌から、通常公知の方法、例えば菌体を穏やかな
条件下で破壊後，この破壊物にショ糖密度勾配遠心や塩
化セシウム密度勾配遠心を施すことによりゲノムＤＮＡ
を分離し、このゲノムＤＮＡを適当なII型制限酵素で処
理して、生じたＤＮＡ断片を、その断片の末端配列に応
じた遺伝子導入用ベクターに組み込み、これをそのベク
ターに応じた宿主に導入することにより、所望する遺伝
子ライブラリーを調製することができる。なお、この遺
伝子導入用ベクターにＤＮＡ断片が組み込まれたか否か
は、このベクターが保有するlac Ｚ遺伝子活性によるカ
ラーセレクション等によって確認することができる。

【００１７】ここで用いる導入用ベクターは、特に限定
されず、例えばプラスミドとしては、pBluescript ，ｐ
ＵＣ１８，ｐＢＲ３２２，ｐＢＧＰ１２０，ｐＰＣφ
１，ｐＰＣφ２，ｐＰＣφ３，ｐＭＣ１４０３，ｐＬＧ
２００，ｐＬＧ３００，ｐＬＧ４００等を；λファージ
としては、λｇｔ１０，λＺＡＰII等を挙げることがで
きる。なお、この遺伝子ライブラリーの調製工程を市販
の遺伝子ライブラリー調製用キットを用いて行うことも
可能である。

【００１８】２．本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の単
離 上記のように調製した遺伝子ライブラリーから、直接Ｄ
ＮＡを抽出して、それらのうちいくつかの塩基配列を決
定して、それらの塩基配列から本発明ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を有するクローンを選別することも可能である
が、予めさらに遺伝子ライブラリーを構成するクローン
を選別して、本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する
クローンをある程度特定することが好ましい。

【００１９】かかる選別方法としては、通常公知の方法
を用いることができる。例えば、既知のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子同士で塩基配列が共通している部分を特定し
て、その配列に基づくＤＮＡフラグメントを合成し、こ
れに標識を施した標識プローブを用いて所望するクロー
ン群を選別することも可能である。また、この標識プロ
ーブを調製する際に合成したＤＮＡフラグメントをプラ
イマーとして、所望する遺伝子を有するゲノムＤＮＡ
に、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅手段を施し、この増幅産物
に標識を施したものを用いて、所望するクローン群を選
別することも可能である。

【００２０】大量に、かつより所望する塩基配列に近似
したプローブを容易に調製することが可能であるという
点から、後者の遺伝子増幅手段を用いてプローブを調製
することが好ましい。

【００２１】なお、既知の遺伝子配列から共通する部分
の遺伝子部分を特定して、これを合成してプローブ乃至
プライマーとして用いる場合に、その共通部分に余り共
通しない塩基が混在していたり、共通するか否かが不明
な塩基部分がある場合には、その部分を可能な限り多く
の種類と塩基対を形成し得る塩基、例えばイノシンとす
ることで、あり得る塩基の種類を想定した数多くのＤＮ
Ａ断片を調製する必要を回避し得るという点において好
ましい。

【００２２】上記のようにして調製した標識プローブ
を、上記遺伝子ライブラリーのレプリカとハイブリダイ
ズさせて、上記標識プローブとハイブリダイズするクロ
ーンを選別して、このクローンを本発明ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を保有するクローンとして、後述する本発明
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を決定する対象と
することができる。

【００２３】このようにして、調製したクローンにおけ
る本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列の決定手
段は通常公知の決定手段のうちから選択することができ
る。

【００２４】例えば、マキサム−ギルバート法（Maxam,
A.M.,and Gilbelt,W.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,74,
560(1977))，ゲノミック・シークエンス法（Church,G.
M. and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,81,19
91(1984))，マルチプレックス法（Church,G.M. and Kie
ffer-Higgins,S.,Science,240,185(1988)) ，サイクル
ーシークエンス法（Murray,V.,Nucleic Acids Res.,17,
8889(1989)) ，ジデオキシ法（Sanger,F.,et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci. U.S.A.,74,5463(1977))等の手段を用い
て、所望する本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基排
列を決定することができる。なお、これらの原理を応用
した塩基配列自動解析装置を用いて、この塩基配列を決
定することも勿論可能である。

【００２５】上記のごとくして決定された本発明ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を基にして、この本発明
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子そのものを入手することがで
きる。すなわち、上記と同様に調製した本発明ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子の出所となるマイコバクテリウム属に
属する細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のごとく決
定された本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’末端側
と３’末端側の配列を含むＤＮＡ断片をプライマーとし
て、ＰＣＲ法に代表される遺伝子増幅法により、本発明
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を大量に増幅させて入手する
こともできる。

【００２６】また、上記のごとく塩基配列が決定された
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子断片そのものをプローブとし
て、マイコバクテリウム属に属する細菌のゲノムＤＮＡ
から作出した遺伝子ライブラリーから本発明ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を有するクローンを選別して、本発明Ｄ
ＮＡポエイメラーゼの全長を入手する伝統的な手法を用
いることも可能である。

【００２７】さらに、ホスファイト−トリエステル法
（Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,81,
5956(1984)) 等の通常公知の方法を用いて本発明ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子を化学合成することも可能であり、
これらの化学合成法を応用したＤＮＡシンセサイザーを
用いて本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を合成すること
も可能である。

【００２８】なお、このようにして製造する本発明ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を改変（例え
ば、塩基の欠失，変更及び／又は付加）して、本発明Ｄ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子と変わらぬ効果（この効果につ
いては後述する）をもたらす改変遺伝子の存在を本発明
者は認識し、このような改変遺伝子にも本発明の技術的
範囲は及ぶものである。

【００２９】この遺伝子改変法として、通常公知の方
法、例えばいわゆるサイト−スペシフィックミュータジ
ェネシス（Site-Specific Mutagenesis ）（Mark,D.F.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,81,5662(1984))
や、前述の化学合成法等を用いて、所望の改変された遺
伝子を得ることができる。なお、このような改変遺伝子
がコードする、改変ＤＮＡポリメラーゼ（上記の本発明
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がコードするＤＮＡポリメラ
ーゼと変わらぬ効果（後述）を有する）についても、本
発明者はその存在を認識し、このような改変ＤＮＡポリ
メラーゼにも本発明の技術的範囲は及ぶものである。

【００３０】３．本発明ＤＮＡポリメラーゼの製造：さ
らに、このようにして入手した、本発明ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を用いて、組換えＤＮＡポリメラーゼを製造
することができる。この本発明ＤＮＡポリメラーゼは、
上記本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を利用して、通常
公知の一般的な遺伝子組換え技術に従って製造すること
ができる。

【００３１】より具体的には、本発明ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子が発現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに本
発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込み、この遺伝子
発現用ベクターの性質に応じた宿主に、この組換えベク
ターを導入して形質転換し、この形質転換体を培養等す
ることにより、所望する本発明ＤＮＡポリメラーゼを製
造することができる。

【００３２】ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通
常発現しようとする遺伝子の上流域に、プロモーター，
エンハンサー及び下流域に転写終了配列等を保有するも
のを用いるのが好適である。また、本発明ＤＮＡポリメ
ラーゼの発現は、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子，グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ遺伝子や、チオレドキシン遺伝子を利用した融合
タンパク質発現系とすることもできる。

【００３３】遺伝子発現用ベクターとしては、例えば宿
主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥＸ，ｐ
Ｔ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，ｐＮＴ
２６ＣII等を例示することができる。また、宿主を枯草
菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ３，ｐＳ
Ｍ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができる。

【００３４】また、宿主を酵母とするものとしては、ｐ
ＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，Ｙ
Ｅｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示することがで
きる。

【００３５】また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞と
するものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ一，
ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡ１等を例示す
ることができる。

【００３６】これらの遺伝子発現ベクターは、本発明Ｄ
ＮＡポリメラーゼを発現させる目的に応じて選択するこ
とができる。例えば、大量に本発明ＤＮＡポリメラーゼ
を発現させることを企図する場合には、宿主として、大
腸菌，枯草菌又は酵母等を選択し得る遺伝子発現ベクタ
ーを選択するのが好ましい。

【００３７】なお、例えば意図的にＤＮＡポリメラーゼ
に関連する遺伝子を欠失等により失っている宿主に、本
発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ遺伝子発現
ベクターを導入して、その宿主の生育の状況を検討し
て、本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の機能を検討する
こともできる。

【００３８】また、上記のように、既存の遺伝子発現ベ
クターを選択することも可能であるが、目的に応じて適
宜遺伝子発現ベクターを作出して、これを用いることも
勿論可能である。本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を組
み込んだ上記遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入
及びこれによる形質転換法は、一般的な方法、例えば宿
主細胞が大腸菌や枯草菌である場合には、塩化カルシウ
ム法やエレクトロポレーション法等を；宿主が哺乳動物
細胞や昆虫細胞の場合は、リン酸カルシウム法，エレク
トロポレーション法又はリポソーム法等の手段により行
うことができる。

【００３９】このようにして得られる形質転換体を常法
に従い培養することにより、所望する本発明ＤＮＡポリ
メラーゼが蓄積される。かかる培養に用いられる培地
は、宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、
例えば宿主が大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培
地等が、宿主が哺乳動物の場合には、ＲＰＭＩ１６４０
培地等を適宜用いることができる。

【００４０】この培養により得られる培養物からの本発
明ＤＮＡポリメラーゼの単離及び精製は、常法に従って
行うことが可能であり、例えば培養物を、本発明ＤＮＡ
ポリメラーゼの物理的及び／又は化学的性質を利用した
各種の処理操作を用いて精製することが可能である。

【００４１】具体的には、例えばタンパク質沈澱剤によ
る処理，限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフ
ィー，遠心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニ
ティクロマトグラフィー，透析法等を単独又はこれらの
方法を組み合わせて用いることができる。このようにし
て、本発明ＤＮＡポリメラーゼを単離、精製することが
可能である。

【００４２】上記のようにして入手した本発明ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子及び本発明ＤＮＡポリメラーゼは、以
下のような用途に有用である。 遺伝子工学分野における応用 本発明ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼとして
の機能を直接利用して、例えばニックトランスレーショ
ン（nick translation）法や、ランダムプライムラベリ
ング（randum prime labeling ）法や、ＲＮＡを基質と
した逆転写（reverse transcriptation ）等に本発明Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いることができる。

【００４３】診断，治療分野における応用 ａ）本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を、例
えば各種のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較
して、各種間で高度に保存されている部分の配列と本発
明ＤＮＡポリメラーゼに特異的な配列とを峻別して、特
異的な配列部分をマイコバクテリウム属に属する細菌の
種名の同定、さらにはタイピングに用いて、疾病の治療
に役立てることができる。

【００４４】この同定等の手段としては、例えば特定の
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子領域の塩基配列を有するフラ
グンメントをプローブとし、このプローブと対象となる
遺伝子とをハイブリダイズする方法や、保存領域の塩基
配列と非保存領域の塩基配列のセンス又はアンチセンス
プライマーを調製して、これをＰＣＲ法に代表される遺
伝子増幅手段の増幅用プライマーとして用いて、その増
幅産物により所望する同定等を行う方法等を例示するこ
とができる。

【００４５】ｂ）本発明ＤＮＡポリメラーゼを抗原とす
る抗体を製造し、これをマイコバクテリウム属に属する
細菌に起因する疾患の診断，治療に応用することが可能
である。具体的には、例えば本発明ＤＮＡポリメラーゼ
を抗原とするポリクローナル抗体を、マイコバクテリウ
ム属に属する細菌に起因する疾患、例えば結核等の治療
手段として用いることが可能である。

【００４６】また、本発明ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子
の可変部の転写産物をエピトープとしたモノクローナル
抗体を、マイコバクテリウム属に属する細菌に起因する
疾患の特定に用いることが可能である。

【００４７】新たな優れた性質を有するＤＮＡポリメ
ラーゼの創出 本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、他のＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子に比べるとＧＣ含量が多く（これについて
は後述する）、既知の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと共通
する要素を有している。よって、例えば本発明ＤＮＡポ
リメラーゼに、突然変異を誘発することで、耐熱性を有
し、かつ読み間違えの少ない等の優れた性質を有するＤ
ＮＡポリメラーゼを創出することが可能であると考えら
れる。

【００４８】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明をより具体的に
説明する。しかしながら、この実施例により、本発明の
技術的範囲が限定的に解釈されるべきものではない。 〔実施例１〕本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の製造等 （１）遺伝子ライブラリーの調製 Mycobacterium Kansasii NIHJ1619 株（慶応大学医学部
微生物学教室より分与、本教室又は国立予防衛生研究所
から必要に応じて分譲可能）を１％小川培地（厚生省監
修「結核菌検査指針」１９７９年版に基づき調製し
た。）で３７℃で４週間培養した後、生育した菌を採
り、ＴＥ（１０mM Tris-HCl pH8.0 ,1mM EDTA）に懸濁
し、使用時まで−２０℃で保存した。これを使用時に溶
解後、終濃度が５００μg/mlになるように卵白リゾチー
ム（生化学工業製）を加え、３７℃で処理した。次に、
プロテアーゼＫを終濃度１００μg/mlに，ＳＤＳを終濃
度０．１％になるように加え、４０℃で１時間、次いで
６０℃で１時間処理して溶菌した。

【００４９】この溶菌液に等量のフェノール液を加え、
ロータリーシェイカーで３７℃で３０分間穏やかに混和
した。１５０００rpm ，１５分の遠心操作をした後、Ｄ
ＮＡが含まれる水層を可能な限りＤＮＡに機械的剪断力
が加わらないように留意して集めた。この水層にフェノ
ール−クロロホルム液を加え、同じくロータリーシェイ
カーを用いて３０分間穏やかに混和し、続いて上記と同
じ条件で遠心を行った後、同じく水層を集め、これにク
ロロホルム液を加えて前記と同じく混和した。また、混
和後に前記と同じ条件で遠心操作を行い、水層を集め
た。

【００５０】集めた水層液に１／１０量の３M の酢酸カ
リウム及び２倍量のエタノールを添加して混和し、生じ
た繊維状のＤＮＡを集め、７０％エタノールでＤＮＡを
洗浄した後にこのエタノールを除き、得られたＤＮＡを
適当量のＴＥに溶解して、所望するゲノムＤＮＡを得
た。このゲノムＤＮＡ３０μg に、制限酵素Ｓａｕ３Ａ
（宝酒造製）を３７℃において作用させて部分消化を行
った。

【００５１】この部分消化物を、アガロース電気泳動装
置を用いて分画（電気泳動後、近紫外線照射下で、６〜
９ｋｂｐサイズの位置を確かめてそのブロックを切出
し、この切り出したブロックを適当量の泳動用緩衝液と
共に透析チューブに入れ、電気泳動してＤＮＡをゲルか
ら透析チューブ内の緩衝液に移動させ、この緩衝液から
常法であるフェノール法を用いてＤＮＡを精製した）し
て、フラグメントサイズが６〜１０ｋｂｐのＤＮＡ断片
を、市販の遺伝子ライブラリー作成用キットである「la
mbda ZAP EXPRESS BamHI(Stratagen社製）」を用いて、
Mycobacterium Kansasii NIHJ1619 株のゲノムＤＮＡの
遺伝子ライブラリーを調製した。

【００５２】（２）クローニング用プローブの調製 本実施例においては、上記のMycobacterium Kansasii N
IHJ1619 株のゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物をクローニング
用のプローブとして用いた。ＰＣＲプライマーは、セン
ス（sense)プライマーとして、 ５’ＣＩＧＡＩＣＣＩＡＡＣＩＴＧＣＡＩＡＡＣＡＴＩ
ＣＣ ３’ （配列番号１：Ｉはイノシンを表す、以下同様。）を用
い、アンチセンス（anti sense) プライマーとして、 ５’ＡＩＩＡＩＩＡＧＩＴＣＩＴＣＩＴＧＩＡＣＣＴＧ
ＣＡ ３’ （配列番号２）を用いた。

【００５３】なお、これらのプライマーは、既知のE.co
li，Thermus aquatlcus 及び Bacillus caldotenaxのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ遺伝子配列同士で高度に保存されて
いる領域の配列を選び用いた。なお、この３者間で保存
されていない選択した領域内の部位にはイノシン（上記
の配列において，Ｉで表す）を導入して、作業の効率化
を図った。

【００５４】ＰＣＲ反応は、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとし
て、上記のMycobacterium Kansasii NIHJ1619 株のゲノ
ムＤＮＡを１μg ，上記の各プライマーを１μM ，１０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.3) ，５０mM ＫＣｌ，２mM
ＭｇＣｌ₂ ，ｄＮＴＰを各２００μM 及びＴａｑポリ
メラーゼ（ロシュ社製）を２．５ユニット含む１００μ
l の系で、熱サイクル（９４℃・１分→４２℃・２分→
７２℃・１．５分）を４０サイクル繰り返した。

【００５５】その結果、約２μg の約６２０塩基対のＰ
ＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物は、前記３者のＤＮＡ
ポリメラーゼＩの遺伝子と極めて相同性が高かった。よ
って、このＰＣＲ産物をランダムプライミング法を用い
た市販の³²Ｐ標識用キット（宝酒造製）を用いて標識
し、これらを放射性プローブとした。

【００５６】（３）本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
塩基配列決定 上記（１）で得たＤＮＡライブラリーを宿主菌である大
腸菌と共に播き、生じたプラークについて、レプリカフ
ィルターを作成した。このレプリカフィルターに対し
て、上記の放射性プローブをハイブリダイズさせ、０．
１×ＳＳＣで洗浄後、オートラジオグラフィーでプロー
ブと相同なＤＮＡを含む大腸菌プラークを同定した。

【００５７】この方法で、２×１０⁴ 個の独立クローン
をスクリーニングした結果、陽性クローンを７個認め
た。これらの陽性クローンのうち、４ＰＢ-1-1と名付け
たクローンは、長さ約８Kbのインサートを有しており、
そのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む領域の制限酵素地
図を第１図に示す。

【００５８】このうち、ＤＮＡポリメラーゼ領域（第２
図）の塩基配列を、ジデオキシ法を用いた塩基配列解読
用キット「Sequenase ver.2.0 （United States Bioche
mical 社製）」を用いて解読した。その塩基配列を第３
図−１，２及び配列番号３に表す。

【００５９】この塩基配列におけるＧＣ含量は、６７．
７％であり、他の一般的なＤＮＡポリメラーゼにおける
ＧＣ％と比較すると高値であった。この領域には、一つ
の大きなオープンリーディングフレームが認められ、一
番目のＡＴＧからストップコドンまで、２６６４塩基対
であった。これから推測されるアミノ酸配列は、８８７
アミノ酸残基からなる（第３図及び配列番号４）もので
あった。

【００６０】なお、マイコバクテリウム属に属する細菌
の遺伝子においては、開始コドンがＧＴＧとなっている
場合が多いとの報告がある（Rajagopalan,M.,M-H.Qin,
D.R.Nash＆M.V.V.S.Madiraju, J.Bacteriol.,177,6527
(1995))。そこで、念のためにこの遺伝子において、こ
の可能性を検討したところ、この遺伝子における開始コ
ドンがＧＴＧであると仮定すると、アミノ酸配列がＮ末
端側に１３アミノ酸残基分延びることになるが、このＧ
ＴＧの近傍には本来存在するはずのリボゾーム結合配列
に相当する塩基配列が存在しない。

【００６１】これに対して上記したＡＴＧの上流には、
リボゾーム結合配列に相当する塩基配列が存在するの
で、このＡＴＧが真の開始コドンであると推測した。ま
た、上記の通り推測したオープンリーディングフレーム
における塩基配列を既知のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と
の相同性を検討したところ〔Genetyx homology researc
h program ver.2.2(SDC 社製) による〕、E.coliとは５
０．１％，Thermus aquatlcus とは５２．４％であり、
Mycobacterium tuberculosisとは８６．１％であり、マ
イコバクテリウム属に属する細菌同士のＤＮＡポリメラ
ーゼの配列は、他の属に属する細菌と比べて極めて相同
性が高いことが判明した。

【００６２】さらに、細かく確かめられた塩基配列を検
討すると、E.coliのＤＮＡポリメラーゼ領域の中で、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの機能を発揮するのに必須であるとい
われているアミノ酸残基である〔Ｍｅｔ−５１２，Ａｒ
ｇ−６８２，Ａｒｇ−６９０，Ｌｙｓ−７５８，Ｔｙｒ
−７６６，Ａｒｇ−８４１，Ｇｌｙ−８５０及びＨｉｓ
−８８１（Thermus aquatlcus でもＭｅｔ−５１２に相
当するアミノ酸残基を除いて保存されている）〕は、上
記の推測したオープンリーディングフレーム中において
「Ａｒｇ−５４５，Ａｒｇ−５３３，Ｌｙｓ−６２２，
Ｔｙｒ−６３０，Ａｒｇ−７０５，Ｇｌｙ−７１４及び
Ｈｉｓ−７４５」と、上記Ｍｅｔ−５１２に相当するア
ミノ酸残基を除いてすべて保存されていた。

【００６３】また、E.coliにおいて、５’−３’エキソ
ヌクレアーゼの機能を発揮するのに必須であるといわれ
ているアミノ酸残基である〔Ａｓｐ−１３，Ａｓｐ−６
３，Ｇｌｕ−７２，Ｇｌｕ−１１３，Ａｓｐ−１１５，
Ａｓｐ−１１６，Ａｓｐ−１３８，Ａｓｐ−１４０，Ａ
ｓｐ−１８５，Ａｓｐ−１８８〕も、上記の推測したオ
ープンリーディングフレーム中において「Ａｓｐ−４，
Ａｓｐ−５６，Ｇｌｕ−６５，Ｇｌｕ−１０６，Ａｓｐ
−１０８，Ａｓｐ−１０９，Ａｓｐ−１３１，Ａｓｐ−
１３３，Ａｓｐ−１８２及びＡｓｐ−１８５」と、すべ
て保存されていた。

【００６４】これに対して、E.coliにおいて３’−５’
エキソヌクレアーゼの機能を発揮するのに必須であると
いわれているアミノ酸残基である〔Ａｓｐ−３５５，Ｇ
ｌｕ−３５７，Ａｓｐ−４２４及びＡｓｐ−５０１〕
は、上記の推測したオープンリーディングフレーム中に
おいては、いずれも保存されていなかった。

【００６５】これらの結果より、本発明ＤＮＡポリメラ
ーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩに認められる、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性，５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のうち、前
２者のみの活性を有するものであることが強く推測され
る。

【００６６】〔実施例２〕 本発明ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子の発現 （１）本発明ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドの構築 最も５’側の領域は、ＡＴＧの前にBamHI 制限酵素の切
断配列を入れたセンスプライマー〔プライマー１：ＣＡ
Ｇ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧＧＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＣＧ（配列番号５）〕及びアンチセ
ンスプライマー〔プライマー２：ＣＧＡ ＴＣＴ ＧＧ
Ｃ ＣＧＴ ＣＧＣ ＧＧＡ ＡＴＴＣＧＴ（配列番号
６）〕の両プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、その
増幅産物をプラスミドｐＴ７blueプラスミド（Novagen
社）にクローニングした。各クローンの塩基配列を調
べ、正しい塩基配列（既知のＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする遺伝子の配列とある程度の相関がある塩基配列）
を有するクローンを選択し、そのプラスミドＤＮＡから
BamHI −EcoRI 切断断片をＤＮＡから切り出して、所望
する発現プラスミドｐＫＭ８８７の構築に用いた。

【００６７】中央部のEcoRI サイトからSphIサイトまで
は、遺伝子ライブラリーから得たクローン４ＰＢ１−１
から両制限酵素の切断断片を切り出して使用した。３’
側の領域は、センスプライマーとして〔プライマー３：
ＧＧＣ ＴＧＧＣＧＴ ＣＧＣ ＧＣＡ ＴＧＣ（配列
番号７）〕を及びアンチセンスプライマーとして〔プラ
イマー４：ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＣＧ ＣＣＴ
ＧＴＣＡＧＴ ＧＡＧ ＣＣＧ（配列番号８）〕を用い
てSphIサイトから停止コドンの後のプライマーに導入し
たHindIII までを、前記の５’側と同様にＰＣＲ産物を
pT7 blueプラスミドにクローニングした後、その塩基配
列を解析し、プラスミドからSphI−HindIII 切断断片を
切り出した。

【００６８】本発明遺伝子発現プラスミドであるｐＭＫ
８８７プラスミドの構築は、先ずSphI−HindIII 切断断
片のプラスミドｐＱＥ３０のSphI−HindIII 部位への導
入を行った。次いで、この構築したプラスミドのBamHI
−SphI部位に、前記のBamHI −EcoRI 切断断片とEcoRI
−SphI断片とを同時に導入して構築した。このｐＭＫ８
８７プラスミドの構築図を第４図に示す。

【００６９】（２）本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
発現−１ 上記のように構築した発現プラスミドｐＫＭ８８７を、
コンピテントな状態にしたＤＮＡポリメラーゼＩ機能を
持たないE.coli P3478株（De Lucia,P.,＆J.Caims,Natu
re,224,1164(1969) ：ＡＴＣＣ ２５９４７）に塩化カ
ルシウム法で導入して形質転換体を得た。この形質転換
体は、アンピシリンに対して感受性であり、アンピシリ
ン耐性遺伝子を有するベクターが導入されない限りアン
ピシリンを含んだ培地では増殖してコロニーを形成する
ことができない。よって、形質転換を行った系をＩＰＴ
Ｇとアンピシリンとを含んだ培地に播き、生じたコロニ
ーを形成するE.coli P3478株を形質転換体とした（この
菌株では、導入した発現プラスミドｐＫＭ８８７が複製
され、このプラスミドに組み込まれている遺伝子が発現
していることは明らかである）。この形質転換体は、受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０８０として，工業技術院生
命工学技術研究所に「Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＫＰ８８７」の
名称で寄託されている。

【００７０】また、上記において生じたコロニーの菌株
を上記と同じ培地で増殖させてプラスミドＤＮＡを分離
精製して、このプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で切
断し、そのサイズを元の発現プラスミドｐＫＭ８８７と
比較したところ、両者のプラスミドＤＮＡは全く同一で
あった。この事実は、上記のようにE.coli P3478株中で
発現プラスミドｐＫＭ８８７が確かに発現していること
を明確に示すものである。

【００７１】プラスミドｐＱＥ３０のレプリコンはｐＭ
ＢＩ由来であり、このプラスミドｐＱＥ３０は、そのＤ
ＮＡの複製に宿主大腸菌のｐｏｌＡ遺伝子の産物である
ＤＮＡポリメラーゼＩを必要とする（Kingsbury,D.T.＆
D.R.Helinski,Biochem.Biophys.Res.Commun.,41,1538(1
971)) 。加えてインビトロの複製において、ＤＮＡポリ
メラーゼのドメイン以外にも、５’−３’エキソヌクレ
アーゼドメインも、その複製に必要とであることが明ら
かにされている（Itoh,T. ＆ J.Tomizawa,ColdSpring H
arbor Symp.Quant.Biol.,43,409(1978)) 。

【００７２】すなわち、本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子の全長を持ったｐＫＭ８８７がＤＮＡポリメラーゼＩ
機能を持たないE.coli P3478株で複製され得るというこ
とは、本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が、ＤＮＡポリ
メラーゼドメインと、５’−３’エキソヌクレアーゼド
メインとを併せ持つと同時に、S.neumonaeのＤＮＡポリ
メラーゼＡやヒトのＤＮＡポリメラーゼβと同様に、大
腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを代用できることを意味す
る（Lopez,p.,S.Martinez,A.Diaz＆M.Espinosa,J.Bacte
riol.,169,4869(1987)；Sweazy,J.B.,M.Chen＆L.A.Loe
b,J.Bacteriol.,177,2923(1995)）。

【００７３】すなわち、この実施例は、本発明ＤＮＡポ
リメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ活性と５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性を併せ持ち、上のように解析した
本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の構造を裏付ける構造
を有することを示すものである。

【００７４】また、現在遺伝子工学の分野で汎用されて
いる大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを本発明ＤＮＡポリ
メラーゼで代用することが可能であり、本発明ＤＮＡポ
リメラーゼの産業上の有用性を示すものである。

【００７５】（３）本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
発現−２ さらに、本発明ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において，Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を司る部分を解析するために、様
々な鎖長の上記（２）において発現させた本発明ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の断片を組み込んだ遺伝子発現プラ
スミドを構築して、これらを大腸菌に導入して、その形
質発現の有無を検討した。

【００７６】発現プラスミドｐＱＥ３０（Qiagen社（米
国）製）に、上記により得た本発明ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子のオープンリーディングフレームに相当する部分
の全長（８８７アミノ酸残基），このアミノ酸配列の全
長のＣ末端から，それぞれ８０８残基（ｐＭＫ８０
８），６９７残基（ｐＭＫ６９７），５３５残基（ｐＭ
Ｋ５３５）に相当する塩基配列を導入して、組換えプラ
スミドを構築した。

【００７７】すなわち、プラスミドｐＭＫ８０８は、上
述のプラスミドｐＭＫ８８７のEcoRI 開裂部位からHind
III 開裂部位までの断片をBamHI −EcoRI リンカーを介
してプラスミドｐＱＥ３０のBamHI −HindIII 部位に導
入して構築した。またプラスミドｐＭＫ６９７は、５’
側のSmaI開裂部位からKpnI開裂部位までの断片とKpnI開
裂部位からHindIII 開裂部位までの断片の両者をｐＱＥ
３２のSmaI−HindIII 部位に導入して構築した。

【００７８】さらにプラスミドｐＭＫ５３５は、KpnI開
裂部位からHindIII 開裂部位までの断片の両者をｐＱＥ
３０のKpnI−HindIII 部位に導入して構築した。これら
の組換えプラスミドを、塩化カルシウム法でコンピテン
トな状態にしたE.coliに導入した。

【００７９】これらの形質転換体を、ＩＰＴＧにより誘
導し、菌体を集め、超音波で菌体を破壊し、その遠心上
清を集めた。この遠心上清にＮｉ−樹脂〔Qiagen社（米
国）製：アガロースゲルにＮＴＡ（nitrilo-tri-acetic
acid ）を結合させ、ＮＴＡ分子の他端にニッケルを結
合させたもの。ニッケルはアミノ酸配列中のヒスチジン
の連続した配列に結合し易い性質があり、一方ｐＱＥ３
０は、発現されるポリペプチドやタンパク質のＮ末端に
６個のヒスチジンの配列が入るべく設計されたベクター
である。よって、Ｎｉ−樹脂には、ｐＱＥ３０の発現産
物が特異的に結合する。〕を加え、Ｎ末端に６個のヒス
チジン（Ｈｉｓ）残基を有する発現産物を、このＮｉ−
樹脂に結合させ、洗浄して発現産物の粗精製を行っ
た）。次に、ＥＤＴＡを含んだ緩衝液で樹脂から発現産
物を分離した。

【００８０】分離した各粗精製液（各１２．５μl ）と
反応溶液〔１×random primer labeling solution （宝
酒造製）、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（各２１μM
）、非標識ｄＣＴＰ（１μM ）及び³⁵ＳｄＣＴＰ（１
０mCi/ml, １０００mCi/mol ：アマシャム社製）〕（６
２．５μl ）を３７℃で反応後、反応液のうち２５μl
を取り、３mlの氷冷１０％ＴＣＡ〔ピロリン酸（５０m
M）及び活性化サケ精子ＤＮＡ（２０μg/ml）〕に入
れ、３０分間静置した。静置後、反応物をWhatman GF/C
フィルターで濾過の後、５ml氷冷１０％ＴＣＡで３回、
５ml氷冷エタノールで２回洗浄した後、フィルターを風
乾した。そして、標識ｄＣＴＰの酸不溶分画における標
識量を測定することにより、各々の系のＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を測定した〔放射能のカウントは、Beckman li
qiudscintiration counter（ＬＳ５０００ＴＤ）で測定
した。〕。

【００８１】その結果、上記した系のうち、Ｃ末端から
５３５残基に相当する塩基配列を導入した系を除いてＤ
ＮＡポリメラーゼ活性が認められた。すなわち、確かに
本発明ＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼ活
性が認められるが、その活性を司る部分は、Ｃ末端から
６９７アミノ酸残基以内に存在し、本発明遺伝子におけ
るＤＮＡポリメラーゼの活性ドメインも、そのアミノ酸
配列に対応する部分に存在することが推測された。

【００８２】

【発明の効果】本発明により、遺伝子工学分野及び診
断，治療分野に有用な、マイコバクテリウム（Mycobact
erium ）属に属する細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼ
及びこのＤＮＡポリメラーゼの遺伝子が提供される。

【配列表】

【００８３】配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CNGANCCNAA CNTGCANAAC ATNCC 25

【００８４】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ANNANNAGNT CNTCNTGNAC CTGCA 25

【００８５】配列番号：３ 配列の長さ：２６６４ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 Mycobacterium Kansasii 配列 ATGTTGCTGG ATGGCAACTC GCTGGCGTTT CGGGCGTTTT ATGCGCTGCC GGCGGAGAAC 60 TTCAAGACCC GCGGCGGGCT GACCACCAAC GCGGTCTACG GCTTCACCGC CATGCTGATC 120 AACCTGCTGC GTGACGAAGC CCCGACGCAC ATCGCCGCGG CCTTCGACGT GTCCCGGCAG 180 ACCTTTCGCT CCGAGCGTTA CCCCGAGTAC AAGGCCAACC GATCATCGAC GCCCGACGAA 240 TTCCACGGCC AGATCGACAT CACCAAGGAG GTCCTGGGCG CGCTGGGCAT CACGGTGCTC 300 GCCGAACCGG GATTCGAGGC CGACGACATC ATCGCGACGC TGGCCACCCA GGCCGAGAAG 360 GAGGGCTATC GGGTCCTGCT GTACCCGCGC AAGGGGGTCA GCGAACTCAC CCGCTTCACC 420 CCCGAGGCCG TCGTCGTCAC CGGCGACCGC GACTCACTGC AGCTGGTCAG TGACGACGTG 480 ACGGTCGTCG AGAAGTACGG GCTCACCCCC GCGCAATACC CGGACTTCGC CGCGCTGCGC 540 GGGGACCCCA GCGACAACCT GCCCGGCATT CCCGGGGTGG GCGAGAAGAC CGCCACCAAG 600 TGGATCGCCG AGTACGGCTC GCTGCAGGAG CTGGTCGACC ATGTCGACTC GGTTCGCGGC 660 AAAGTCGGCG ACGCGCTTCG GGCGCACGTG GCCAACGTGG TGCGCAACCG CGAACTCACC 720 GAGCTGGTGC GTGATGTGCC GCTGGCCCAA ACCCCGGACA CGCTGCGGCT GCAGCCCTGG 780 GACCGCGACC ACATCCACCG GCTCTTCGAC GACCTGGAGT TCCGGGTGTT GCGAGACCGG 840 TTATTCGACA CGCTGGCCGC GGTCGAGCCC GAGGTCGACG AGGGGTTCGA CGTGCGCGGC 900 GGGACGCTGC AGCCCGGCAC GGTGGCGCAG TGGCTGGCCG CACACGCCGG CGACGGGCGC 960 CGCTGCGGCC TGACGGTCGT GGGCACCCAT CTGCCGCACG GCGGTGACAC CACCGCGCTG 1020 GCAATCGCGG CCGCCGACGG CGACGGCGGC TACATCGGTA CCGCCACGGT GACACCCGAG 1080 GACGACGCCG CGCTGGCGGC CTGGTTGGCC GACCCGGCCA AACCCAAGGC ACTGCATGAG 1140 GCCAAGCTCG CCATCCATGA CCTCGGGGGC CGCGGCTGGA CCCTGGACGG CGTCACCTCC 1200 GACACCGCAC TGGCCGCCTA CCTGGTGCGG CCGGGCCAGC GCAGCTTCAC CCTCGACGAT 1260 CTCTCGCTGC GCTACCTGCT CCGCGAGCTG CGCGCGGAAA CGCCTGAACA GCAACAACTT 1320 TCATTGCTCG ACGATATGGA AGGAGTGGAC GACCAAGCCG TCCAAACCGC GATCCTGCGG 1380 GCCAGGGCGG TGGCGGACCT GGCCGAAGCG CTGGACGCCG AACTGGCCCG CATCGATTCC 1440 ACGGCCTTGC TGGCCGACAT GGAACTGCCC GTGCAGCGGG TGCTGGCCGA CATGGAGCGC 1500 GCCGGCATCG CCGTCGACCT GCGACTGCTG GCCGAGCTGC AAAGCCAGTT CGCCGACCAG 1560 ATCCGCGACG CCGCCGAGGC CGCATACGCC GTCATCGGCA AGCAGATCAA CCTCGGCTCG 1620 CCCAAGCAGC TGCAGGTCGT GCTGTTCGAC GACCTCGGGA TGCCGAAGAC CAAGCGGACC 1680 AAGACCGGCT ACACCACCGA CGCCGACGCT GTGCACGGCC TTTTTGAAAA GACCGGGCAC 1740 CCGTTCCTGC AGCATCTGCT GGCGCACCGC GACGTCACCC GGCTCAAGGT CACCGTCGAC 1800 GGGCTGCTGA ACTCGGTGGC CGCCGACGGC CGGATTCATA CCACGTTCAA CCAGACCATC 1860 GCGGCCACGG GCAGGCTGTC GTCGACGGAG CCCAACTTGC AGAACATCCC GATCCGCACC 1920 GACGCCGGCC GGCAGATCCG CGACGCGTTC GTCGTCGGCG CCGGTTATAG CGAGCTGATG 1980 ACCGCCGATT ACAGCCAGAT CGAGATGCGG ATCATGGCGC ACCTGTCGGG CGACGAAGGT 2040 CTCATCGAAG CCTTCAATAC CGGCGAGGAC CTGCACTCGT TCGTCGCGTC CCGGGCTTTC 2100 GGTGTGCCCA TCGACGAGGT GACCGGCGAG TTCGGCCGCC GGGTCAAGGC GATGTCGTAC 2160 GGGCTGGCCT ACGGGTTGAG TGCCTATGGG CTGTCCACGC AGCTGAAGAT CTCCACCGAA 2220 GAGGCGAAGG TTCAGATGGA CCAATACTTC GCGCGCTTCG GCGGCGTGCG CGACTACCTG 2280 ATGGCCGTGG TCGAGCAGGC CCGCAAGGAC GGATACACCT CAACCGTGTT GGGGCGCCGG 2340 CGCTACCTTC CCGAGCTGGA CAGCAGCAAT CGGCAGGTGC GTGAGGCTGC CGAGCGGGCG 2400 GCGCTCAACG CGCCGATCCA GGGCAGTGCG GCCGACATCA TCAAGGTGGC GATGATCGAG 2460 GTCGACAAGG CGCTCACCGA GGCCGGGCTG GCGTCGCGCA TGCTGCTGCA GGTCCACGAC 2520 GAATTGCTGT TCGAAATCGC GCCCGGAGAA CGCGAACGGG TCGAGGCGCT GGTGCGCGAG 2580 AAAATGGGCG GCGCCTACCC GTTGGACGTT CCGCTGGAAG TGTCGGTGGG CTTCGGGCGC 2640 TCTTGGGACG CGGCGGCTCA CTGA 2664

【００８６】配列番号：４ 配列の長さ：８８７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：蛋白質 起源 Mycobacterium Kansasii 配列 Met Leu Leu Asp Gly Asn Ser Leu Ala Phe Arg Ala Phe Tyr Ala Leu 16 Pro Ala Glu Asn Phe Lys Thr Arg Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala Val 32 Tyr Gly Phe Thr Ala Met Leu Ile Asn Leu Leu Arg Asp Glu Ala Pro 48 Thr His Ile Ala Ala Ala Phe Asp Val Ser Arg Gln Thr Phe Arg Ser 64 Glu Arg Tyr Pro Glu Tyr Lys Ala Asn Arg Ser Ser Thr Pro Asp Glu 80 Phe His Gly Gln Ile Asp Ile Thr Lys Glu Val Leu Gly Ala Leu Gly 96 Ile Thr Val Leu Ala Glu Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Ile Ile Ala 112 Thr Leu Ala Thr Gln Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Arg Val Leu Val Val 128 Thr Gly Asp Arg Asp Ser Leu Gln Leu Val Ser Asp Asp Val Thr Val 144 Leu Tyr Pro Arg Lys Gly Val Ser Glu Leu Thr Arg Phe Thr Pro Glu 160 Ala Val Val Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Ala Gln Tyr Pro Asp Phe 176 Ala Ala Leu Arg Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly Ile Pro Gly 192 Val Gly Glu Lys Thr Ala Thr Lys Trp Ile Ala Glu Tyr Gly Ser Leu 208 Gln Glu Leu Val Asp His Val Asp Ser Val Arg Gly Lys Val Gly Asp 224 Ala Leu Arg Ala His Val Ala Asn Val Val Arg Asn Arg Glu Leu Thr 240 Glu Leu Val Arg Asp Val Pro Leu Ala Gln Thr Pro Asp Thr Leu Arg 256 Leu Gln Pro Trp Asp Arg Asp His Ile His Arg Leu Phe Asp Asp Leu 272 Glu Phe Arg Val Leu Arg Asp Arg Leu Phe Asp Thr Leu Ala Ala Val 288 Glu Pro Glu Val Asp Glu Gly Phe Asp Val Arg Gly Gly Thr Leu Gln 304 Pro Gly Thr Val Ala Gln Trp Leu Ala Ala His Ala Gly Asp Gly Arg 320 Arg Cys Gly Leu Thr Val Val Gly Thr His Leu Pro His Gly Gly Asp 336 Thr Thr Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Asp Gly Asp Gly Gly Tyr Ile 352 Gly Thr Ala Thr Val Thr Pro Glu Asp Asp Ala Ala Leu Ala Ala Trp 368 Leu Ala Asp Pro Ala Lys Pro Lys Ala Leu His Glu Ala Lys Leu Ala 384 Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Gly Trp Thr Leu Asp Gly Val Thr Ser 400 Asp Thr Ala Leu Ala Ala Tyr Leu Val Arg Pro Gly Gln Arg Ser Phe 416 Thr Leu Asp Asp Leu Ser Leu Arg Tyr Leu Leu Arg Glu Leu Arg Ala 432 Glu Thr Pro Glu Gln Gln Gln Leu Ser Leu Leu Asp Asp Met Glu Gly 448 Val Asp Asp Gln Ala Val Gln Thr Ala Ile Leu Arg Ala Arg Ala Val 464 Ala Asp Leu Ala Glu Ala Leu Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ile Asp Ser 480 Thr Ala Leu Leu Ala Asp Met Glu Leu Pro Val Gln Arg Val Leu Ala 496 Asp Met Glu Arg Ala Gly Ile Ala Val Asp Leu Arg Leu Leu Ala Glu 512 Leu Gln Ser Gln Phe Ala Asp Gln Ile Arg Asp Ala Ala Glu Ala Ala 528 Tyr Ala Val Ile Gly Lys Gln Ile Asn Leu Gly Ser Pro Lys Gln Leu 544 Gln Val Val Leu Phe Asp Asp Leu Gly Met Pro Lys Thr Lys Arg Thr 560 Lys Thr Gly Tyr Thr Thr Asp Ala Asp Ala Val His Gly Leu Phe Glu 576 Lys Thr Gly His Pro Phe Leu Gln His Leu Leu Ala His Arg Asp Val 592 Thr Arg Leu Lys Val Thr Val Asp Gly Leu Leu Asn Ser Val Ala Ala 608 Asp Gly Arg Ile His Thr Thr Phe Asn Gln Thr Ile Ala Ala Thr Gly 624 Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr 640 Asp Ala Gly Arg Gln Ile Arg Asp Ala Phe Val Val Gly Ala Gly Tyr 656 Ser Glu Leu Met Thr Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Met Arg Ile Met 672 Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Gly Leu Ile Glu Ala Phe Asn Thr Gly 688 Glu Asp Leu His Ser Phe Val Ala Ser Arg Ala Phe Gly Val Pro Ile 704 Asp Glu Val Thr Gly Glu Phe Gly Arg Arg Val Lys Ala Met Ser Tyr 720 Gly Leu Ala Tyr Gly Leu Ser Ala Tyr Gly Leu Ser Thr Gln Leu Lys 736 Ile Ser Thr Glu Glu Ala Lys Val Gln Met Asp Gln Tyr Phe Ala Arg 752 Phe Gly Gly Val Arg Asp Tyr Leu Met Ala Val Val Glu Gln Ala Arg 768 Lys Asp Gly Tyr Thr Ser Thr Val Leu Gly Arg Arg Arg Tyr Leu Pro 784 Glu Leu Asp Ser Ser Asn Arg Gln Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala 800 Ala Leu Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Val 816 Ala Met Ile Glu Val Asp Lys Ala Leu Thr Glu Ala Gly Leu Ala Ser 832 Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Leu Phe Glu Ile Ala Pro 848 Gly Glu Arg Glu Arg Val Glu Ala Leu Val Arg Glu Lys Met Gly Gly 864 Ala Tyr Pro Leu Asp Val Pro Leu Glu Val Ser Val Gly Phe Gly Arg 880 Ser Trp Asp Ala Ala Ala His 887

【００８７】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGGATCCA TGTTGCTGGA TGGCAACTCG 30

【００８８】配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGATCTGGCC GTCGCGGAAT TCGT 24

【００８９】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCTGGCGTC GCGCATGC 18

【００９０】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAGCTTGAT CGCCTGTCAG TGAGCCG 27

【図面の簡単な説明】

【図１】陽性クローンである，４ＰＢ-1-1の全長の制限
酵素切断地図である。

【図２】４ＰＢ-1-1のＤＮＡポリメラーゼ領域の制限酵
素切断地図である。

【図３】４ＰＢ-1-1のＤＮＡポリメラーゼ領域の塩基配
列及びこの塩基配列から推定されアミノ酸配列の前半部
を示した図面である。

【図４】４ＰＢ-1-1のＤＮＡポリメラーゼ領域の塩基配
列及びこの塩基配列から推定されアミノ酸配列の後半部
を示した図面である。

【図５】ｐＭＫ８８７プラスミドの構築図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 星野 文則 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 栗原 千枝 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マイコバクテリウム（Mycobacterium ）属
   に属する細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼ。
2. 【請求項２】配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む
   ＤＮＡポリメラーゼ。
3. 【請求項３】請求項２記載のＤＮＡポリメラーゼのアミ
   ノ酸配列の一部を欠失，変更及び／又は付加することに
   より改変してなり、かつそのＤＮＡポリメラーゼとして
   の機能が請求項２記載のＤＮＡポリメラーゼと同等であ
   るＤＮＡポリメラーゼ。
4. 【請求項４】マイコバクテリウム（Mycobacterium ）属
   に属する細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼをコードす
   るＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
5. 【請求項５】配列番号４で表されるアミノ酸配列のＤＮ
   Ａポリメラーゼをコードする塩基配列を含んでなるＤＮ
   Ａポリメラーゼ遺伝子。
6. 【請求項６】配列番号３で表される塩基配列を含んでな
   るＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
7. 【請求項７】請求項４乃至請求項６のいずれかの請求項
   記載のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を欠
   失，変更及び／又は付加することにより改変してなり、
   かつその改変した遺伝子がコードするＤＮＡポリメラー
   ゼの機能が、この改変の対象となったＤＮＡポリメラー
   ゼ遺伝子がコードするＤＮＡポリメラーゼと同等である
   ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。