JPH09131181A

JPH09131181A - 変異型ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH09131181A
Application number: JP7317017A
Authority: JP
Inventors: Yoshizumi Ishino; 良純石野; Asako Fujii; 麻子藤井; Takashi Uemori; 隆司上森; Mitsuo Imamura; 光雄今村; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1997-05-20
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: JP3688367B2

Abstract

(57)【要約】【課題】野生型のＤＮＡポリメラーゼと同じ構造を保
持し、５' →３' エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変
異型ＤＮＡポリメラーゼ、及びその遺伝子と遺伝子工学
的製造方法を提供する。【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列（８
７７）のうち、１８４番目及び／又は１９２番目のグリ
シンがそれ以外のアミノ酸に置換されている５'→３'
エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメ
ラーゼ。それをコードする変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子。該遺伝子を含有させた形質転換体の培養による上
記酵素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学用試薬
として有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失
した変異型ＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコードする遺
伝子、及び該遺伝子を用いたＤＮＡポリメラーゼの遺伝
子工学的な製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に使用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ
４ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来
ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス由来耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（Taq ）ポリメラー
ゼ〕等がある。これらの酵素は、それらが有する性質に
応じて、特定のＤＮＡの標識化やＤＮＡ塩基配列の決定
などにそれぞれ利用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般にＤＮＡポリメラ
ーゼはその起源によって異なった特性を有しており、そ
の特性を生かした利用法がある。例えばバチルス・カル
ドテナクス（Bacillus caldotenax ）は生育至適温度が
約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＤＮ
Ａポリメラーゼは高温においても高い安定性を示すこと
から、遺伝子工学用研究試薬として使用されている。ま
た、該酵素はＤＮＡポリメラーゼ活性のほか、５’→
３’、及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有して
いるが、その用途のほとんどにおいて５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性の存在は望ましくなく、この活性を失
った変異型酵素が使用されている。しかしながらこの変
異型酵素は、該酵素をコードする遺伝子より５’→３’
エキソヌクレアーゼ活性情報部分を欠失させることによ
って生産されるため、野生型の酵素とはそのタンパク質
としての構造が異なっている。本発明の目的は、野生型
のＤＮＡポリメラーゼと同じ構造を保持しながら、望ま
しくない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した
変異型ＤＮＡポリメラーゼ、及びその遺伝子と遺伝子工
学的製造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼに関する発明であ
って、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列中、
１８４番目のグリシン及び／又は１９２番目のグリシン
がそれ以外のアミノ酸に置換されていることを特徴と
し、とりわけ配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配
列中の１８４番目のグリシンがアスパラギン酸で置換さ
れているか、あるいは配列表の配列番号１で表されるア
ミノ酸配列中の１９２番目のグリシンがアスパラギン酸
で置換されていることを特徴とする。また、本発明の第
２の発明は変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する発
明であって、該遺伝子が第１の発明の変異型ＤＮＡポリ
メラーゼをコードすることを特徴とし、とりわけ配列表
の配列番号２、あるいは配列表の配列番号３で表される
塩基配列を有することを特徴とする。また、本発明の第
３の発明は変異型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関す
る発明であって、第２の発明の変異型ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、該培養物か
ら第１の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを採取するこ
とを特徴とする。

【０００５】部位特異的変異導入法を用いて活性に必須
のアミノ酸残基を他のものに置換することにより、酵素
タンパクの全体の構造を損なうことなくその活性を欠失
させることは可能と考えられる。しかしながらバチルス
・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’
エキソヌクレアーゼ活性に関しては活性に必須のアミノ
酸残基が確認されていないため、該方法を直接適用する
ことはできない。本発明者らは鋭意研究の結果、該酵素
のＮ−末端より１８４番目のグリシン、又は１９２番目
のグリシンが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に必須
であることを見出し、更に上記のグリシンが他のアミノ
酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼを作製し、本
発明を完成させた。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼ
を生産する菌株であれば何でもよく、例としてバチルス
・カルドテナクスＹＴ−Ｇ株〔ドイッチェザムルンク
フォンミクロオルガニスメン（Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen ）の保存菌株：ＤＳＭ４０６〕が
ある。バチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子は既に石野らによって単離されている〔ジャ
ーナルオブバイオケミストリー（J. Biochem. ）、
第１１３巻、第４０１〜４１０頁（１９９３）〕。ま
た、該遺伝子を含有するプラスミドｐＵＩ１０１で形質
転換された大腸菌ＨＢ１０１は Escherichia coli ＨＢ
１０１／ｐＵＩ１０１と命名、表示され、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７２１として寄託されている。該ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、また該
アミノ酸配列をコードするプラスミドｐＵＩ１０１中の
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番
号４に示す。既知の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を欠く変異型ＤＮＡポリメラーゼとしては、野生型のバ
チルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのＮ末
端より２８４番目のアミノ酸までの領域を欠失した変異
型ＤＮＡポリメラーゼが知られている〔ジャーナルオ
ブバイオケミストリー、第１１３巻、第４０１〜４１
０頁（１９９３）〕。したがって、バチルス・カルドテ
ナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性に重要なアミノ酸残基は該変異型酵素に欠
失した領域に存在することが予想される。そこで、配列
表の配列番号１に示した野生型のバチルス・カルドテナ
クス由来ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、アミノ
酸番号１番から２８４番までの領域に存在するアミノ酸
残基のあるものをそれ以外のアミノ酸残基に置換するこ
とにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失った
変異型ＤＮＡポリメラーゼを得ることが期待される。

【０００７】タンパク質にアミノ酸置換を導入する方法
としてはいくつかの部位特異的変異導入法が知られてお
り、例えばクンケル（Kunkel,T.A. ）の方法が利用でき
る〔メソッズインエンザイモロジー（Methods in E
nzymology ）、第１５４巻、第３６７〜３８９頁（１９
８７）〕。該方法は合成オリゴヌクレオチドを使用して
タンパク質をコードする遺伝子上に変異を導入する方法
である。表１に本発明で導入を試みたアミノ酸置換とそ
れに用いた合成オリゴヌクレオチド、及びその塩基配列
を示す。

【０００８】

【表１】表１ ───────────────────────────────── アミノ酸置換塩基配列（合成オリゴヌクレオチド） ───────────────────────────────── Ｄ５９Ａ 5'-GTCGCGTTTGCCGCCGGGAAA-3' Ｙ７３Ａ 5'-GCGTTTCAAGAGGCTAAAGGTGGGCGC-3' Ｙ７３Ｆ 5'-GCGTTTCAAGAGTTTAAAGGTGGGCGC-3' Ｇ１８４Ｄ 5'-AAAGGATTGATGGACGACAAATCGGAC-3' Ｄ１８５Ａ 5'-TTGATGGGCGCCAAATCGGAC-3' Ｄ１８８Ａ 5'-GACAAATCGGCCAACATTCCC-3' Ｇ１９２Ｄ 5'-GACAACATTCCCGACGTGCCGGGCATC-3' Ｅ１９８Ａ 5'-GGCATCGGGGCAAAGACGGCG-3' ─────────────────────────────────

【０００９】また、配列表の配列番号５〜１２にそれぞ
れ合成オリゴヌクレオチドＤ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３
Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８５Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２
Ｄ、及びＥ１９８Ａの塩基配列を示す。各合成オリゴヌ
クレオチドの名称はそれによって導入されるアミノ酸置
換を示しており、例えばＤ５９Ａは５９番目のアスパラ
ギン酸をアラニンに置換するための合成オリゴヌクレオ
チドである。

【００１０】変異導入に使用する鋳型ＤＮＡは、上記プ
ラスミドｐＵＩ１０１に組込まれた野生型のバチルス・
カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を適当なベクターにサブクローニングした上、
ｄＵ（デオキシウリジン）を含む一本鎖ＤＮＡを調製し
て作製することができる。次に該鋳型ＤＮＡと上記の合
成オリゴヌクレオチドとを用いて該遺伝子上にアミノ酸
置換を導入することができる。変異導入に当ってはミュ
ータンＫキット（宝酒造社製）が使用できる。しかしな
がらオリゴヌクレオチドの設計によっては変異導入効率
が悪く、目的の変異が得られない場合がある。また、変
異が導入された場合でも、導入されたアミノ酸置換の種
類によっては発現された変異型タンパク質が宿主に対し
て負荷となって形質転換体が得られなかったり、酵素タ
ンパク質全体の構造が破壊されてＤＮＡポリメラーゼ活
性まで失われてしまう可能性もある。本発明に使用した
合成オリゴヌクレオチドのうち、Ｄ１８５Ａを除く７つ
を使用した場合については変異が導入された遺伝子を得
ることができる。これらの遺伝子については通常の方
法、例えばジデオキシ法を用いてその塩基配列を調べ、
目的とする変異が導入できたかどうかを確認することが
できる。

【００１１】次に、得られた変異導入遺伝子を組込んだ
プラスミドで形質転換した適当な微生物を培養し、該培
養物中に発現されるＤＮＡポリメラーゼ活性を調べるこ
とにより、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現可能な変異導
入遺伝子を得ることができる。更に、ＤＮＡポリメラー
ゼ活性が認められたものについては酵素を精製した上で
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を調べ、目的とする
変異型ＤＮＡポリメラーゼを発現する変異導入遺伝子を
得ることができる。ただし導入された変異の種類によっ
ては発現された変異型ＤＮＡポリメラーゼの安定性が低
下しているために酵素の精製が困難な場合があり、例え
ば合成オリゴヌクレオチドＤ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３
Ｆを用いて作製された変異導入遺伝子によって発現され
る変異型ＤＮＡポリメラーゼについては精製酵素標品が
得られない。一方、合成オリゴヌクレオチドＧ１８４
Ｄ、Ｇ１９２Ｄ、Ｅ１９８Ａを用いたものでは精製され
た酵素標品を用いて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を調べることができる。この結果、Ｅ１９８Ａを用いた
ものでは野生型酵素の約７０％の５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性が残存しているのに対し、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ
１９２Ｄでは活性が全く認められない。このように、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を保持し、かつ５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼ
を発現する２種の変異導入遺伝子を得ることができる。
こうして得られた変異導入遺伝子を組込んだプラスミド
のうち、合成オリゴヌクレオチドＧ１８４Ｄを用いて作
製された、野生型ＤＮＡポリメラーゼの１８４番目に存
在するグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型Ｄ
ＮＡポリメラーゼをコードする変異導入遺伝子を組込ん
だプラスミドはプラスミドｐＵＩＴ１０４と命名され、
該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Esc
herichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０４と命名され
ている。また、合成オリゴヌクレオチドＧ１９２Ｄを用
いて作製された、野生型ＤＮＡポリメラーゼの１９２番
目に存在するグリシンがアスパラギン酸に置換された変
異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異導入遺伝子を
組込んだプラスミドはプラスミドｐＵＩＴ１０６と命名
され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９
は Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０６と命
名されている。プラスミドｐＵＩＴ１０４、及びプラス
ミドｐＵＩＴ１０６に組込まれた変異型ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号
２、及び配列番号３に示す。

【００１２】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失
した変異型ＤＮＡポリメラーゼは上記の変異導入遺伝子
を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体、例え
ば Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０４、あ
るいは Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０６
を通常の培地、例えば１００μg/mlのアンピシリンを含
むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス
５ｇ／リットル、ＮａＣｌ５ｇ／リットル、ｐＨ７．
２）中、３７℃で培養することにより、その菌体内に発
現させることができる。次に、得られた培養菌体に適当
な精製操作を施すことによって精製された変異型ＤＮＡ
ポリメラーゼ標品を得ることができる。こうして得られ
た変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、野生
型ＤＮＡポリメラーゼと同じ約１０万の分子量を示す。
また、該標品について各種酵素活性を測定することによ
り、該変異型酵素がＤＮＡポリメラーゼ活性、３’→
５’エキソヌクレアーゼ活性を保持しているが、５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性は失っていることを確かめ
ることができる。

【００１３】以上のようにバチルス・カルドテナクス由
来ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、１８４番目の
グリシン、あるいは１９２番目のグリシンをそれ以外の
アミノ酸残基に変換することにより、該酵素の５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性を選択的に欠失させた変異
型ＤＮＡポリメラーゼが得られることが明らかとなっ
た。上記の２種類のアミノ酸残基は５’→３’エキソヌ
クレアーゼ活性には必須であるが、ＤＮＡポリメラーゼ
活性、及び酵素タンパクの安定性に関しては重要な役割
を果たしてはいない。したがって変異型酵素の作製に当
ってはこれらのアミノ酸残基の位置に導入されるアミノ
酸には特に制限はなく、置換の結果５’→３’エキソヌ
クレアーゼ活性が選択的に欠失されるものであればよ
い。該変異型酵素は野生型酵素の構造を保持し、かつ望
ましくない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し
ており、遺伝子工学研究用試薬として有用である。更
に、該変異型酵素をコードする遺伝子が得られたことに
より該変異型酵素の遺伝子工学的生産が可能となった。

【００１４】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

【００１５】実施例１鋳型ＤＮＡの作成 Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１（ＦＥＲ
ＭＢＰ−３７２１）を培養し、培養菌体よりバチルス
・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含
有するプラスミドｐＵＩ１０１を調製した。得られたプ
ラスミドをＮｃｏＩで消化した後、アガロースゲル電気
泳動を行い、分離された約３．３KbのＤＮＡ断片を単離
した。このＤＮＡ断片の末端をＤＮＡブランティングキ
ット（宝酒造社製）を用いて平滑化し、先にＨｉｎｃII
（宝酒造社製）で消化しておいたプラスミドベクターｐ
ＴＶ１１８Ｎと混合してライゲーションを行った。ライ
ゲーション反応液の一部を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換して得られる形質転換体よりプラスミドを調製
し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’−側がプラスミド
ベクター上のｌａｃプロモーター下流に位置しているも
のを選び、これをプラスミドｐＵＩ１０２と命名した。
次に、プラスミドｐＵＩ１０２をＮｃｏＩで部分消化
し、ＤＮＡブランティングキットを用いて末端を平滑化
した後、セルフライゲーション反応を行って大腸菌ＪＭ
１０９を形質転換した。得られた形質転換体よりプラス
ミドを調製し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’−末端
側のＮｃｏＩサイトのみが失われたものを選び、これを
プラスミドｐＵＩ１０３と命名した。プラスミドｐＵＩ
１０３の構築の工程を図１に示す。変異導入の鋳型とな
るｄＵ（デオキシウリジン）を含む一本鎖ＤＮＡは以下
のようにして調製した。プラスミドｐＵＩ１０３で大腸
菌ＣＪ２３６（宝酒造社製）を形質転換し、得られた形
質転換体を１５０μg/mlのアンピシリンと３０μg/mlの
クロラムフェニコールを含む２×ＴＹ培地（トリプトン
１６ｇ／リットル、酵母エキス１０ｇ／リットル、Ｎａ
Ｃl ５ｇ／リットル、ｐＨ７．６）中で培養した。培養
中の適当な時期にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒
造社製）を感染させた後、更に７０μg/mlとなるようカ
ナマイシンを添加して培養を継続し、培養終了後の培養
液上清よりファージ粒子を回収した。得られたファージ
粒子についてフェノール、及びフェノール−クロロホル
ムを用いた除タンパク処理を行い、更にエタノール沈殿
を行ってＤＮＡを回収し、これを変異導入実験の鋳型と
した。

【００１６】実施例２変異導入遺伝子の作成ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上の変異導入位置として７箇
所のアミノ酸残基を選び、８種類のアミノ酸置換の導入
を計画した。この変異導入に使用する８種類のオリゴヌ
クレオチド、Ｄ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８
Ｄ、Ｄ１８５Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、およびＥ１
９８Ａを化学的に合成した。これらの合成オリゴヌクレ
オチドの塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号５〜１
２に示す。実施例１で得られた鋳型ＤＮＡ、及び上記の
変異導入用合成オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子上へのアミノ酸置換の導入を行った。変
異導入にはミュータンＫキット（宝酒造社製）を用い、
キット添付の使用説明書に従って実験操作を行った。変
異導入操作後に得られたプラスミドについてジデオキシ
法による塩基配列の確認を行い、ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子上に目的のアミノ酸置換が導入されていることを確
かめた。この結果、Ｄ１８５Ａ以外の合成オリゴヌクレ
オチドを使用したものでは目的通りのアミノ酸置換が起
こった変異導入遺伝子を含むプラスミドが得られた。合
成オリゴヌクレオチド、Ｄ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３
Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、及びＥ１９
８Ａを用いて得られた変異導入遺伝子を含むプラスミド
を、それぞれｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩ
Ｔ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０５、ｐＵＩＴ
１０６、及びｐＵＩＴ１０７と命名した。

【００１７】実施例３形質転換体の培養及び粗抽出
液の調製上記の変異導入ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換え
プラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩ
Ｔ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０５、ｐＵＩＴ
１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を、それぞれ１００μg/mlのアンピシリンを含
むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス
５ｇ／リットル、ＮａＣｌ５ｇ／リットル、ｐＨ７．
２）中、３７℃で培養した。培養液の濁度（Ａ₆₀₀）が
０．６の時に誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１５
時間培養を行った。培養液１mlより菌体を集め、５０mM
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５％スクロース溶液
で洗浄した。同じ溶液に菌体を再懸濁した後、同量のリ
シス溶液〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５
％スクロース、６０mMスペルミジン・一塩酸、２０mM
ＮａＣｌ、１２mM ＤＴＴ〕を加え、４℃で４５分間静
置した。更に５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００（Trit
on Ｘ−１００）２０μl を加え、３７℃で５分間静置
した後、遠心分離により上清を回収し、６０℃、２０分
間静置した後再度遠心分離して上清を回収し、粗抽出液
とした。

【００１８】実施例４ＤＮＡポリメラーゼ活性測定反応溶液として６７mMリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、
６．７mM ＭｇＣｌ₂、１mM２−メルカプトエタノー
ル、２０μg/ml 活性化ＤＮＡ、３３μM ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、６０nM〔³Ｈ〕ｄＴＴＰ
を用意し、この溶液１５０μｌに対して適当量の粗抽出
液を加え、６０℃、５分間反応させた後、５０mMピロリ
ン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ml加えて反応を停止さ
せた。氷中で５分間静置した後、反応液全量をガラスフ
ィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％トリクロロ酢
酸で数回洗浄した後、７０％エタノールで洗浄し、フィ
ルターを乾燥させて液体シンチレーションカウンターを
用いてフィルター上の放射活性を測定した。組換えプラ
スミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１
０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ
１０７で形質転換された大腸菌より得られた粗抽出液に
はＤＮＡポリメラーゼ活性が確認された。

【００１９】実施例５精製酵素標品の調製上記の変異導入ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換え
プラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩ
Ｔ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵ
ＩＴ１０７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、それ
ぞれ１００μg/mlのアンピシリンを含む１２５mlのＬＢ
培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／
リットル、ＮａＣｌ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）
中、３７℃で１５時間培養した。菌体を集めて２０mlの
緩衝液Ａ〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２mM
２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、４μM
ＰＭＳＦ〕に懸濁した後、超音波処理を行って菌体を破
砕し、遠心分離して上清を集めた。次いで６０℃、３０
分間の熱処理を行った後、再度遠心分離を行って上清を
集め、これを粗酵素液とした。この粗酵素液についてＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析を行ったところ、プラスミドｐＵ
ＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形
質転換された大腸菌より得られたものでのみ野生型ＤＮ
Ａポリメラーゼと同じ分子量のタンパクが発現されてい
るのが確認された。野生型ＤＮＡポリメラーゼに対する
抗体を用いてウエスタンブロッティングによる分析を行
うと、上記の３種のプラスミド以外で形質転換された大
腸菌由来の粗酵素液では野生型ＤＮＡポリメラーゼに比
べて低分子量のタンパクにシグナルが認められており、
これらの形質転換体では発現された変異型ＤＮＡポリメ
ラーゼの安定性が低下しているために培養中、あるいは
精製操作の初期段階に酵素タンパクの分解が起こってい
ることが示された。このため、以降の精製操作は上記の
３種類の形質転換体由来の粗酵素液についてのみ実施し
た。粗酵素液に３０％飽和となるよう硫安を加え、遠心
分離を行って上清を集めた後、更に８０％飽和となるよ
うに硫安を加えた。遠心分離を行って集めた沈殿を緩衝
液Ｂ〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２mM２−
メルカプトエタノール、１０％グリセリン、４μM ＰＭ
ＳＦ〕に溶かし、同緩衝液に対して透析を行った後、透
析後の試料をＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を
用いたモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑカラム（ファルマシア社製）
クロマトグラフィーに供した。カラムは緩衝液Ｂで平衡
化しておき、０−３００mMのＮａＣｌ濃度勾配により溶
出を行うとＤＮＡポリメラーゼ活性は約１７０ｍＭＮ
ａＣｌに相当する画分に回収された。得られたＤＮＡポ
リメラーゼ活性画分を１０mMリン酸カリウム（ｐＨ６．
８）、７mM２−メルカプトエタノール、５０μM ＣａＣ
ｌ₂ 、１０％グリセリンで平衡化したハイドロキシルア
パタイトカラム（ＫＢカラム、高研社製）にアプライし
た。吸着した酵素活性は１０−８００mMリン酸カリウム
の濃度勾配によって溶出し、約４２０mMリン酸カリウム
に相当する画分に溶出したＤＮＡポリメラーゼ活性を回
収し、これを精製酵素標品とした。このようにして３種
の形質転換体より得られた精製酵素標品は、どれもＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ上で分子量約１０万の単一のバンドを示し
た。

【００２０】実施例６５’→３’エキソヌクレアー
ゼ活性の測定基質としてλ−ＢｓｔＰＩ消化物（宝酒造社製）を［γ
−³²Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）で末端標識したものを準備した。６７mMリン酸
カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM
２−メルカプトエタノールを含む溶液中に実施例５で得
られた精製酵素標品と上記基質を混合し、６０℃で２、
５、１０、３０分間反応させた後、エタノールを加えて
基質ＤＮＡを沈殿させた。この沈殿中に存在する放射活
性を液体シンチレーションカウンターで測定することに
より、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解反
応後にＤＮＡの末端に残存する³²Ｐの量を求めた。ま
た、野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリ
メラーゼ、及び野生型のバチルス・カルドテナクス由来
ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端より２８４番目のアミノ酸
までの領域を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼである
ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を
それぞれ上記酵素標品の代りに加えたものについても同
様の測定を行い、これを対照とした。測定の結果を図２
に示す。図中横軸は反応時間（分）を、縦軸はＤＮＡの
末端に残存する放射活性（ｃｐｍ）を示す。また、図中
白三角、白四角、黒四角はそれぞれプラスミドｐＵＩＴ
１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転
換された大腸菌より得られた精製酵素標品について得ら
れた結果を、更に図中白丸、黒丸はそれぞれ野生型のバ
チルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ、及び
ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼについて得られた
結果を示す。図２に示されるように、プラスミドｐＵＩ
Ｔ１０７で形質転換された大腸菌より得られた精製酵素
標品では野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡ
ポリメラーゼの約７０％の５’→３’エキソヌクレアー
ゼ活性が認められるのに対し、プラスミドｐＵＩＴ１０
４、及びｐＵＩＴ１０６由来のものではＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼと同様に５’→３’エキソヌクレ
アーゼ活性が失われていることが示された。配列表の配
列番号２、及び配列番号３にそれぞれプラスミドｐＵＩ
Ｔ１０４、及びｐＵＩＴ１０６に含まれる変異型ＤＮＡ
ポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。

【００２１】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失った新規変異
型ＤＮＡポリメラーゼ、及び遺伝子工学的な該酵素の製
造方法が提供される。該酵素は遺伝子工学研究用試薬と
して有用である。

【００２２】

【配列表】

【００２３】配列番号：1 配列の長さ：877 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile 20 25 30 His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Glu Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Lys Thr Thr Phe Arg His Glu Ala Phe Gln Glu Tyr Lys Gly 65 70 75 Gly Arg Gln Gln Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu 80 85 90 Leu Arg Glu Leu Leu Arg Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu 95 100 105 Glu Asn Tyr Glu Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ala Ala Arg 110 115 120 Ala Glu Gln Glu Gly Phe Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg 125 130 135 Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro His Val Thr Val Asp Ile Thr 140 145 150 Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Pro Tyr Thr Pro Glu Ala Val 155 160 165 Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile Val Asp Leu Lys 170 175 180 Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Gly 185 190 195 Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gly Thr 200 205 210 Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu Lys 215 220 225 Leu Lys Glu Thr Leu Arg Gln His Arg Glu Met Ala Leu Leu Ser 230 235 240 Lys Lys Leu Ala Ala Ile Arg Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Ser 245 250 255 Leu Asp Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val 260 265 270 Ala Leu Phe Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Glu Lys Met 275 280 285 Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala 290 295 300 Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys 305 310 315 Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala 320 325 330 Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe 335 340 345 Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp 350 355 360 Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg 365 370 375 Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val 380 385 390 Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln 395 400 405 Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu 410 415 420 Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg 425 430 435 Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys 440 445 450 Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu 455 460 465 Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro 470 475 480 Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val 485 490 495 Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu Gln 500 505 510 Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu 515 520 525 Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu 530 535 540 Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr Ser 545 550 555 Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile 560 565 570 Val Glu Asn Ile Leu Gln His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln 575 580 585 Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr 590 595 600 Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly 605 610 615 Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg 620 625 630 Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu 635 640 645 Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu 650 655 660 Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala 665 670 675 Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile 680 685 690 Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln 695 700 705 Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr 710 715 720 Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu 725 730 735 Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr 740 745 750 Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr 755 760 765 Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg 770 775 780 Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr 785 790 795 Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile 800 805 810 Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu 815 820 825 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu 830 835 840 Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln 845 850 855 Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly 860 865 870 Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 875

【００２４】配列番号：2 配列の長さ：2631 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： TTGAAAAAAA AGCTTGTTTT AATCGACGGC AGCAGCGTGG CGTACCGCGC CTTTTTCGCC 60 TTGCCGCTTT TGCATAACGA CAAAGGCATC CATACGAACG CCGTCTACGG GTTTACGATG 120 ATGTTGAATA AAATTTTGGC GGAAGAAGAG CCAACTCATA TGCTTGTCGC GTTTGACGCC 180 GGGAAAACGA CGTTCCGGCA TGAAGCGTTT CAAGAGTATA AAGGTGGGCG CCAGCAGACG 240 CCACCGGAGC TGTCGGAGCA GTTTCCGCTG TTGCGCGAGC TGCTGAGGGC GTATCGCATC 300 CCCGCCTATG AACTCGAGAA CTACGAAGCG GACGATATTA TCGGAACGCT TGCCGCCCGC 360 GCTGAGCAGG AAGGGTTTGA GGTGAAAGTC ATTTCCGGCG ACCGCGATCT GACCCAGCTC 420 GCCTCCCCCC ATGTGACGGT GGACATTACG AAAAAAGGGA TTACCGATAT CGAACCGTAC 480 ACGCCGGAGG CGGTCCGCGA AAAATACGGC TTAACTCCGG AACAAATCGT TGATTTGAAA 540 GGATTGATGG ACGACAAATC GGACAACATT CCCGGAGTGC CGGGCATCGG GGAAAAGACG 600 GCGGTCAAGC TGCTCAGGCA ATTCGGCACG GTCGAAAACG TGCTTGCCTC CATTGACGAG 660 ATCAAAGGCG AAAAGTTGAA AGAAACGCTG CGCCAACACC GGGAGATGGC GCTGTTAAGC 720 AAAAAGCTCG CCGCCATTCG CCGCGACGCC CCGGTCGAGC TCTCGCTTGA TGACATCGCC 780 TATCAAGGGG AAGACCGGGA GAAAGTGGTC GCTTTATTTA AAGAGCTTGG GTTTCAATCG 840 TTTTTAGAGA AAATGGAATC GCCGTCATCA GAAGAGGAAA AACCGCTTGC CAAGATGGCA 900 TTTACGCTTG CTGACCGCGT GACGGAGGAG ATGCTTGCCG ACAAGGCGGC GCTTGTCGTT 960 GAAGTGGTCG AGGAAAATTA TCATGATGCG CCGATCGTCG GCATCGCTGT GGTCAACGAA 1020 CATGGACGGT TTTTCCTGCG CCCGGAGACG GCGCTTGCCG ATCCGCAGTT TGTCGCCTGG 1080 CTTGGTGATG AAACGAAGAA AAAAAGCATG TTTGACTCAA AGCGCGCGGC AGTCGCCTTG 1140 AAATGGAAAG GAATTGAGCT ATGCGGCGTT TCCTTTGATT TATTGCTGGC CGCCTATTTG 1200 CTTGATCCGG CGCAAGGTGT TGATGATGTG GCTGCCGCAG CAAAAATGAA GCAATACGAA 1260 GCGGTGCGCC CGGATGAAGC GGTGTATGGC AAAGGGGCGA AGCGGGCCGT GCCGGATGAG 1320 CCAGTGCTCG CCGAGCATTT GGTCCGCAAG GCGGCGGCGA TTTGGGCGCT CGAACGGCCG 1380 TTTTTGGATG AGCTGCGCCG CAACGAACAA GATCGGTTGC TCGTCGAGCT CGAGCAGCCG 1440 TTGTCTTCGA TTTTGGCGGA AATGGAATTT GCCGGAGTGA AAGTGGATAC GAAGCGGCTC 1500 GAACAGATGG GCGAAGAGCT CGCCGAGCAG CTGCGCACGG TCGAGCAGCG CATTTATGAG 1560 CTCGCCGGCC AAGAATTCAA CATCAATTCA CCGAAACAGC TCGGCGTCAT TTTATTTGAA 1620 AAACTGCAGC TGCCCGTCTT GAAAAAAAGC AAAACCGGCT ACTCCACTTC GGCGGATGTG 1680 CTTGAAAAAC TTGCGCCTTA TCACGAGATC GTGGAAAACA TTTTGCAACA TTACCGCCAG 1740 CTTGGCAAGT TGCAGTCGAC GTATATTGAA GGATTGCTGA AAGTCGTGCG ACCCGATACA 1800 AAGAAGGTGC ATACGATTTT CAATCAGGCG TTGACGCAAA CCGGACGGCT CAGCTCGACG 1860 GAGCCGAACT TGCAAAACAT TCCGATTCGG CTTGAGGAAG GACGGAAAAT CCGCCAAGCG 1920 TTCGTGCCGT CGGAGTCTGA TTGGCTCATT TTCGCTGCCG ACTACTCGCA AATTGAGTTG 1980 CGCGTCCTCG CCCATATTGC GGAAGATGAC AATTTAATGG AAGCGTTCCG CCGCGATTTG 2040 GATATCCATA CGAAAACAGC GATGGACATT TTCCAAGTGA GCGAGGACGA AGTGACGCCC 2100 AACATGCGCC GTCAGGCGAA GGCGGTCAAC TTTGGGATCG TTTACGGGAT CAGTGATTAC 2160 GGCTTGGCGC AAAACTTAAA TATTTCACGC AAAGAGGCCG CTGAATTCAT CGAGCGCTAC 2220 TTCGAAAGCT TCCCTGGCGT GAAGCGGTAT ATGGAAAACA TTGTGCAAGA AGCAAAACAG 2280 AAAGGGTATG TGACGACGCT GCTGCATCGG CGCCGCTATT TGCCGGATAT TACGAGCCGC 2340 AACTTCAACG TCCGCAGCTT TGCTGAACGG ATGGCGATGA ACACGCCGAT TCAAGGGAGC 2400 GCCGCTGACA TTATTAAAAA GGCGATGATC GATCTGAACG CCAGACTGAA GGAAGAGCGG 2460 CTGCAAGCGC GCCTTTTGCT GCAGGTGCAT GACGAGCTCA TTTTGGAGGC GCCGAAAGAA 2520 GAGATGGAGC GGCTGTGCCG GCTCGTTCCG GAAGTGATGG AGCAAGCGGT CACACTTCGC 2580 GTGCCGCTCA AAGTCGATTA CCATTACGGC TCGACATGGT ATGACGCGAA A 2631

【００２５】配列番号：3 配列の長さ：2631 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： TTGAAAAAAA AGCTTGTTTT AATCGACGGC AGCAGCGTGG CGTACCGCGC CTTTTTCGCC 60 TTGCCGCTTT TGCATAACGA CAAAGGCATC CATACGAACG CCGTCTACGG GTTTACGATG 120 ATGTTGAATA AAATTTTGGC GGAAGAAGAG CCAACTCATA TGCTTGTCGC GTTTGACGCC 180 GGGAAAACGA CGTTCCGGCA TGAAGCGTTT CAAGAGTATA AAGGTGGGCG CCAGCAGACG 240 CCACCGGAGC TGTCGGAGCA GTTTCCGCTG TTGCGCGAGC TGCTGAGGGC GTATCGCATC 300 CCCGCCTATG AACTCGAGAA CTACGAAGCG GACGATATTA TCGGAACGCT TGCCGCCCGC 360 GCTGAGCAGG AAGGGTTTGA GGTGAAAGTC ATTTCCGGCG ACCGCGATCT GACCCAGCTC 420 GCCTCCCCCC ATGTGACGGT GGACATTACG AAAAAAGGGA TTACCGATAT CGAACCGTAC 480 ACGCCGGAGG CGGTCCGCGA AAAATACGGC TTAACTCCGG AACAAATCGT TGATTTGAAA 540 GGATTGATGG GCGACAAATC GGACAACATT CCCGACGTGC CGGGCATCGG GGAAAAGACG 600 GCGGTCAAGC TGCTCAGGCA ATTCGGCACG GTCGAAAACG TGCTTGCCTC CATTGACGAG 660 ATCAAAGGCG AAAAGTTGAA AGAAACGCTG CGCCAACACC GGGAGATGGC GCTGTTAAGC 720 AAAAAGCTCG CCGCCATTCG CCGCGACGCC CCGGTCGAGC TCTCGCTTGA TGACATCGCC 780 TATCAAGGGG AAGACCGGGA GAAAGTGGTC GCTTTATTTA AAGAGCTTGG GTTTCAATCG 840 TTTTTAGAGA AAATGGAATC GCCGTCATCA GAAGAGGAAA AACCGCTTGC CAAGATGGCA 900 TTTACGCTTG CTGACCGCGT GACGGAGGAG ATGCTTGCCG ACAAGGCGGC GCTTGTCGTT 960 GAAGTGGTCG AGGAAAATTA TCATGATGCG CCGATCGTCG GCATCGCTGT GGTCAACGAA 1020 CATGGACGGT TTTTCCTGCG CCCGGAGACG GCGCTTGCCG ATCCGCAGTT TGTCGCCTGG 1080 CTTGGTGATG AAACGAAGAA AAAAAGCATG TTTGACTCAA AGCGCGCGGC AGTCGCCTTG 1140 AAATGGAAAG GAATTGAGCT ATGCGGCGTT TCCTTTGATT TATTGCTGGC CGCCTATTTG 1200 CTTGATCCGG CGCAAGGTGT TGATGATGTG GCTGCCGCAG CAAAAATGAA GCAATACGAA 1260 GCGGTGCGCC CGGATGAAGC GGTGTATGGC AAAGGGGCGA AGCGGGCCGT GCCGGATGAG 1320 CCAGTGCTCG CCGAGCATTT GGTCCGCAAG GCGGCGGCGA TTTGGGCGCT CGAACGGCCG 1380 TTTTTGGATG AGCTGCGCCG CAACGAACAA GATCGGTTGC TCGTCGAGCT CGAGCAGCCG 1440 TTGTCTTCGA TTTTGGCGGA AATGGAATTT GCCGGAGTGA AAGTGGATAC GAAGCGGCTC 1500 GAACAGATGG GCGAAGAGCT CGCCGAGCAG CTGCGCACGG TCGAGCAGCG CATTTATGAG 1560 CTCGCCGGCC AAGAATTCAA CATCAATTCA CCGAAACAGC TCGGCGTCAT TTTATTTGAA 1620 AAACTGCAGC TGCCCGTCTT GAAAAAAAGC AAAACCGGCT ACTCCACTTC GGCGGATGTG 1680 CTTGAAAAAC TTGCGCCTTA TCACGAGATC GTGGAAAACA TTTTGCAACA TTACCGCCAG 1740 CTTGGCAAGT TGCAGTCGAC GTATATTGAA GGATTGCTGA AAGTCGTGCG ACCCGATACA 1800 AAGAAGGTGC ATACGATTTT CAATCAGGCG TTGACGCAAA CCGGACGGCT CAGCTCGACG 1860 GAGCCGAACT TGCAAAACAT TCCGATTCGG CTTGAGGAAG GACGGAAAAT CCGCCAAGCG 1920 TTCGTGCCGT CGGAGTCTGA TTGGCTCATT TTCGCTGCCG ACTACTCGCA AATTGAGTTG 1980 CGCGTCCTCG CCCATATTGC GGAAGATGAC AATTTAATGG AAGCGTTCCG CCGCGATTTG 2040 GATATCCATA CGAAAACAGC GATGGACATT TTCCAAGTGA GCGAGGACGA AGTGACGCCC 2100 AACATGCGCC GTCAGGCGAA GGCGGTCAAC TTTGGGATCG TTTACGGGAT CAGTGATTAC 2160 GGCTTGGCGC AAAACTTAAA TATTTCACGC AAAGAGGCCG CTGAATTCAT CGAGCGCTAC 2220 TTCGAAAGCT TCCCTGGCGT GAAGCGGTAT ATGGAAAACA TTGTGCAAGA AGCAAAACAG 2280 AAAGGGTATG TGACGACGCT GCTGCATCGG CGCCGCTATT TGCCGGATAT TACGAGCCGC 2340 AACTTCAACG TCCGCAGCTT TGCTGAACGG ATGGCGATGA ACACGCCGAT TCAAGGGAGC 2400 GCCGCTGACA TTATTAAAAA GGCGATGATC GATCTGAACG CCAGACTGAA GGAAGAGCGG 2460 CTGCAAGCGC GCCTTTTGCT GCAGGTGCAT GACGAGCTCA TTTTGGAGGC GCCGAAAGAA 2520 GAGATGGAGC GGCTGTGCCG GCTCGTTCCG GAAGTGATGG AGCAAGCGGT CACACTTCGC 2580 GTGCCGCTCA AAGTCGATTA CCATTACGGC TCGACATGGT ATGACGCGAA A 2631

【００２６】配列番号：4 配列の長さ：2631 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源：生物名：バチルスカルドテナクス(Bacillus caldotenax) 株名：YT-G(DSM406) 配列： TTGAAAAAAA AGCTTGTTTT AATCGACGGC AGCAGCGTGG CGTACCGCGC CTTTTTCGCC 60 TTGCCGCTTT TGCATAACGA CAAAGGCATC CATACGAACG CCGTCTACGG GTTTACGATG 120 ATGTTGAATA AAATTTTGGC GGAAGAAGAG CCAACTCATA TGCTTGTCGC GTTTGACGCC 180 GGGAAAACGA CGTTCCGGCA TGAAGCGTTT CAAGAGTATA AAGGTGGGCG CCAGCAGACG 240 CCACCGGAGC TGTCGGAGCA GTTTCCGCTG TTGCGCGAGC TGCTGAGGGC GTATCGCATC 300 CCCGCCTATG AACTCGAGAA CTACGAAGCG GACGATATTA TCGGAACGCT TGCCGCCCGC 360 GCTGAGCAGG AAGGGTTTGA GGTGAAAGTC ATTTCCGGCG ACCGCGATCT GACCCAGCTC 420 GCCTCCCCCC ATGTGACGGT GGACATTACG AAAAAAGGGA TTACCGATAT CGAACCGTAC 480 ACGCCGGAGG CGGTCCGCGA AAAATACGGC TTAACTCCGG AACAAATCGT TGATTTGAAA 540 GGATTGATGG GCGACAAATC GGACAACATT CCCGGAGTGC CGGGCATCGG GGAAAAGACG 600 GCGGTCAAGC TGCTCAGGCA ATTCGGCACG GTCGAAAACG TGCTTGCCTC CATTGACGAG 660 ATCAAAGGCG AAAAGTTGAA AGAAACGCTG CGCCAACACC GGGAGATGGC GCTGTTAAGC 720 AAAAAGCTCG CCGCCATTCG CCGCGACGCC CCGGTCGAGC TCTCGCTTGA TGACATCGCC 780 TATCAAGGGG AAGACCGGGA GAAAGTGGTC GCTTTATTTA AAGAGCTTGG GTTTCAATCG 840 TTTTTAGAGA AAATGGAATC GCCGTCATCA GAAGAGGAAA AACCGCTTGC CAAGATGGCA 900 TTTACGCTTG CTGACCGCGT GACGGAGGAG ATGCTTGCCG ACAAGGCGGC GCTTGTCGTT 960 GAAGTGGTCG AGGAAAATTA TCATGATGCG CCGATCGTCG GCATCGCTGT GGTCAACGAA 1020 CATGGACGGT TTTTCCTGCG CCCGGAGACG GCGCTTGCCG ATCCGCAGTT TGTCGCCTGG 1080 CTTGGTGATG AAACGAAGAA AAAAAGCATG TTTGACTCAA AGCGCGCGGC AGTCGCCTTG 1140 AAATGGAAAG GAATTGAGCT ATGCGGCGTT TCCTTTGATT TATTGCTGGC CGCCTATTTG 1200 CTTGATCCGG CGCAAGGTGT TGATGATGTG GCTGCCGCAG CAAAAATGAA GCAATACGAA 1260 GCGGTGCGCC CGGATGAAGC GGTGTATGGC AAAGGGGCGA AGCGGGCCGT GCCGGATGAG 1320 CCAGTGCTCG CCGAGCATTT GGTCCGCAAG GCGGCGGCGA TTTGGGCGCT CGAACGGCCG 1380 TTTTTGGATG AGCTGCGCCG CAACGAACAA GATCGGTTGC TCGTCGAGCT CGAGCAGCCG 1440 TTGTCTTCGA TTTTGGCGGA AATGGAATTT GCCGGAGTGA AAGTGGATAC GAAGCGGCTC 1500 GAACAGATGG GCGAAGAGCT CGCCGAGCAG CTGCGCACGG TCGAGCAGCG CATTTATGAG 1560 CTCGCCGGCC AAGAATTCAA CATCAATTCA CCGAAACAGC TCGGCGTCAT TTTATTTGAA 1620 AAACTGCAGC TGCCCGTCTT GAAAAAAAGC AAAACCGGCT ACTCCACTTC GGCGGATGTG 1680 CTTGAAAAAC TTGCGCCTTA TCACGAGATC GTGGAAAACA TTTTGCAACA TTACCGCCAG 1740 CTTGGCAAGT TGCAGTCGAC GTATATTGAA GGATTGCTGA AAGTCGTGCG ACCCGATACA 1800 AAGAAGGTGC ATACGATTTT CAATCAGGCG TTGACGCAAA CCGGACGGCT CAGCTCGACG 1860 GAGCCGAACT TGCAAAACAT TCCGATTCGG CTTGAGGAAG GACGGAAAAT CCGCCAAGCG 1920 TTCGTGCCGT CGGAGTCTGA TTGGCTCATT TTCGCTGCCG ACTACTCGCA AATTGAGTTG 1980 CGCGTCCTCG CCCATATTGC GGAAGATGAC AATTTAATGG AAGCGTTCCG CCGCGATTTG 2040 GATATCCATA CGAAAACAGC GATGGACATT TTCCAAGTGA GCGAGGACGA AGTGACGCCC 2100 AACATGCGCC GTCAGGCGAA GGCGGTCAAC TTTGGGATCG TTTACGGGAT CAGTGATTAC 2160 GGCTTGGCGC AAAACTTAAA TATTTCACGC AAAGAGGCCG CTGAATTCAT CGAGCGCTAC 2220 TTCGAAAGCT TCCCTGGCGT GAAGCGGTAT ATGGAAAACA TTGTGCAAGA AGCAAAACAG 2280 AAAGGGTATG TGACGACGCT GCTGCATCGG CGCCGCTATT TGCCGGATAT TACGAGCCGC 2340 AACTTCAACG TCCGCAGCTT TGCTGAACGG ATGGCGATGA ACACGCCGAT TCAAGGGAGC 2400 GCCGCTGACA TTATTAAAAA GGCGATGATC GATCTGAACG CCAGACTGAA GGAAGAGCGG 2460 CTGCAAGCGC GCCTTTTGCT GCAGGTGCAT GACGAGCTCA TTTTGGAGGC GCCGAAAGAA 2520 GAGATGGAGC GGCTGTGCCG GCTCGTTCCG GAAGTGATGG AGCAAGCGGT CACACTTCGC 2580 GTGCCGCTCA AAGTCGATTA CCATTACGGC TCGACATGGT ATGACGCGAA A 2631

【００２７】配列番号：5 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCGCGTTTG CCGCCGGGAA A 21

【００２８】配列番号：6 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GCGTTTCAAG AGGCTAAAGG TGGGCGC 27

【００２９】配列番号：7 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GCGTTTCAAG AGTTTAAAGG TGGGCGC 27

【００３０】配列番号：8 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AAAGGATTGA TGGACGACAA ATCGGAC 27

【００３１】配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TTGATGGGCG CCAAATCGGA C 21

【００３２】配列番号：10 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GACAAATCGG CCAACATTCC C 21

【００３３】配列番号：11 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GACAACATTC CCGACGTGCC GGGCATC 27

【００３４】配列番号：12 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGCATCGGGG CAAAGACGGC G 21

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＵＩ１０３の構築を示す工程図で
ある。

【図２】変異型ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (72)発明者今村光雄滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示されるアミノ酸配列のう
ち、１８４番目のグリシン及び／又は１９２番目のグリ
シンがそれ以外のアミノ酸に置換されていることを特徴
とする５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変
異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】配列番号１に示されるアミノ酸配列のう
ち、１８４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され
ていることを特徴とする請求項１に記載の変異型ＤＮＡ
ポリメラーゼ。
【請求項３】配列番号１に示されるアミノ酸配列のう
ち、１９２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され
ていることを特徴とする請求項１に記載の変異型ＤＮＡ
ポリメラーゼ。
【請求項４】請求項１に記載の変異型ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードすることを特徴とする変異型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子。
【請求項５】請求項２に記載の変異型ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードすることを特徴とする請求項４に記載の変
異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
【請求項６】配列番号２に示される塩基配列を有する
ことを特徴とする請求項５に記載の変異型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子。
【請求項７】請求項３に記載の変異型ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードすることを特徴とする請求項４に記載の変
異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
【請求項８】配列番号３に示される塩基配列を有する
ことを特徴とする請求項７に記載の変異型ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子。
【請求項９】請求項４に記載の変異型ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、該培養物
から請求項１に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼを採取
することを特徴とする変異型ＤＮＡポリメラーゼの製造
方法。