JP3507373B2 - プラスミドベクター - Google Patents
プラスミドベクターInfo
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Description
安定に存在し、高発現が可能なプラスミドベクターに関
する。
遺伝子工学の研究が盛んに行われており、遺伝子組換え
体微生物を用いて、有用タンパク質を大量に生産させる
例が報告されている。特に、遺伝子組換えバチルス属細
菌は有用タンパク質を菌体外に分泌できる特徴を有する
ことから、この性質を利用した宿主ベクター系の開発が
種々行われ、これまでに、多くの種類のバチルス属細菌
由来のプラスミドDNAが検出され、報告されている
(LovettとBramucci;J. Bact. 120, 488-494(1974)、Ta
nakaら;J. Bact. 129,1487-1494(1977)、Le Hegaratと
Anagnostopoulos;Molec. gen. Genet.157,167-174(197
7)等)。
NAの安定性の問題から、バチルス属細菌に実用的に用
いられているベクターDNAは、プラスミド複製開始配
列において高い相同性を有するエンテロコッカスフェー
カリス(Enterococcus faecalis)由来のプラスミドp
AMα1、スタフィロコッカスアウレウス(Staphyloco
ccus aureus)由来のプラスミドpUB110等その種
類は限られている。
転換を行う宿主菌によって異なることが知られており、
プラスミドの安定性を決定する要因はプラスミド複製開
始領域配列と宿主菌との相性に帰する例が多く、プラス
ミドの安定性が悪いと組換え微生物による目的の有用タ
ンパクの高生産は非常に困難である。
つ高発現が可能なプラスミドベクターを提供することを
目的とする。
製開始領域をもつDNA断片を含有するプラスミドベク
ターが、取り扱い容易なバチルス属細菌中で安定であ
り、且つ目的タンパク質の生産性を増大できることを見
出し、本発明を完成した。
基配列からなるDNA断片を含有するプラスミドベクタ
ー又は該塩基配列に1個若しくは複数個の塩基が欠失、
置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片を含
有し、バチルス属細菌中で安定で、且つ高発現が可能な
プラスミドベクターを提供するものである。
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA断片を
含有するプラスミドベクター又は該アミノ酸配列に1個
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加し
たアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA断
片を含有し、バチルス属細菌中で安定で、且つ高発現が
可能なプラスミドベクターを提供するものである。
む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含有する組
換え微生物、及び該組換え微生物を用いたタンパク質又
はペプチドの製造法を提供するものである。
けるDNA断片は、結合した異種遺伝子産物をコードす
る遺伝子を増幅し該遺伝子産物の大量生産を可能にする
ものである。斯かるDNA断片は、例えばバチルス属細
菌由来のプラスミドに由来するものであり、より具体的
にはバチルスエスピーKSM−KP43株(FERM BP-65
32)由来のプラスミドであり、配列番号1に示した塩基
配列を有する。
配列番号1で示される塩基配列又は該塩基配列に1個若
しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基
配列からなるDNA断片、或いは配列番号2で示される
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列に1個若しくは複数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列
をコードする塩基配列からなるDNA断片も包含され
る。ここで、変異の程度は配列番号2中のアミノ酸番号
1〜432のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有
し、且つ当該DNA断片を含有したプラスミドベクター
が、バチルス属細菌中で安定で、且つ高発現が可能であ
るものが特に好ましい。
Aは、例えばバチルスエスピーKSM−KP43株(FER
M BP-6532)からアルカリ抽出法(Birnboim and Doly 19
79 Nucleic Acids Res.,7:1513-1523)等の一般的なプ
ラスミド回収法及び適当なプライマーを合成してのPC
R法を用いることによって単離、取得することができ
る。
開始領域を含むDNA断片と目的とする異種遺伝子産物
をコードする遺伝子を連結することにより、タンパク質
等の目的遺伝子産物を大量に生産させ得る組換えプラス
ミドが構築できる。
DNA断片に結合する異種遺伝子としては、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナー
ゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシゲナー
ゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリン、人成長ホルモ
ン、インターフェロン、カルシトニン、インターロイキ
ン等の生理活性ペプチドをコードする遺伝子が挙げられ
るが、遺伝子の種類は特に限定されるものではない。
配列番号1のDNA断片の他に他のプラスミドの一部の
DNA領域を含んでいてもよく、例えば、薬剤耐性遺伝
子や複製起点を含むDNA領域を連結させることができ
る。
えプラスミドの好ましい具体例として、バチルス エス
ピー KSM−64株(FERM BP-2886)のセルラーゼ遺伝
子を含む3.3kbの断片とバチルスエスピーKSM−
KP43株由来プラスミドDNAの複製開始領域を含む
DNA断片2.2kbとプラスミドpAMα1由来テト
ラサイクリン耐性遺伝子1.6kbを連結して構築した
組換えプラスミドpTCEL64(第1図)等が挙げら
れる。
においては、さらに異種のプラスミド複製開始配列を有
するベクター、例えばエンテロコッカスフェーカリス
(Enterococcus faecalis)由来のプラスミドpAMα
1等を、同時に同一宿主内に導入し形質転換させること
が可能である。これにより2種或いは3種以上の有用タ
ンパクを同時に生産できること、及び同種遺伝子同士を
各々のベクターで導入することによる遺伝子増加効果に
よって、また目的タンパク遺伝子と該遺伝子発現を正に
制御する遺伝子との組み合わせを実現することによって
有用タンパクの高生産化も可能である。
主微生物、たとえば、バチルス属細菌を形質転換すれ
ば、本発明組換え微生物を得られ、この組換え微生物を
培養し、該培養物から目的タンパクを採取すれば目的タ
ンパク質が大量に生産できる。
え微生物が生育し、当該酵素を生産することのできるも
のであれば特に限定されるものではない。また培地に
は、窒素源と炭素源を適当な濃度で組み合わせ、この他
に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加したものが用
いられ、培地のpH及び温度は、用いる組換え微生物が
生育し得る範囲内のpH及び温度であれば特に限定され
ない。
は常法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化
できる。
する。尚、セルラーゼ(CMCアーゼ)活性は以下のよ
うに測定した。
ース(CMC; 山陽国策パルプ社製サンローズA01M
C)0.4mL、0.5Mグリシン緩衝液(pH9.
0)0.2mL、及び脱イオン水0.3mLからなる基
質溶液に酵素液0.1mLを加え、40℃で20分間反
応した後、これによって生成した還元糖を3,5−ジニ
トロサリチル酸法(G. L. Millerら、Anal. Biochem.,
2, 127-132 (1960))によって定量した。酵素力価は、上
記の条件で一分間に1μmolのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を1単位(U)とした。蛋白量
はバイオ・ラッド プロテイン アッセイ キット(バ
イオ・ラッド社製)を用いて行い、牛血清アルブミンを
標準蛋白として算出した。
NAの複製開始領域を含むDNA断片は以下の様に取得
した。即ち、バチルスエスピーKSM−KP43株を
0.5%ポリペプトン(日本製薬社製)、0.5% 酵
母エキス(ディフコ社製)、0.1%KH2PO4 、
0.02%MgSO4・7H2O、及び0.5%Na2C
O3 からなる培地100mLで30℃で12時間振盪培
養した。遠心分離によって集めた菌体から、Birnboimと
Dolyの方法(Nucl. Acids. Res, 7, 1513-1523(1979))
に従ってプラスミドDNAを取得した。該プラスミド約
10ng、PCRバッファー(ベーリンガー Pwo
DNAポリメラーゼ添付)10μL、2種類のオリゴヌ
クレオチド(プライマー3;5’−GAATTCCTGCAAGAAAAC
GATTGTG−3’(配列番号3))、(プライマー4;
5’−AAGATGAGCTATAAGTCTTGTTAC−3’(配列番号
4))20pmol、及び4種類のヌクレオチド(A,
T,G, C)各20pmolを加え脱イオン水で100μL
に調製した。94℃ 2分間の処理後、94℃ 1分、
55℃ 1分、72℃ 2分の反応を1サイクルとして
30サイクル繰り返し、最後に、72℃ 5分間の反応
をDNA Thermal Cycler(パーキン
エルマー社)を用いて行った後、バチルスエスピーKS
M−KP43株由来プラスミドDNAの複製開始領域を
含む2.2kbpのDNA断片をThe GENECLEAN キット
(バイオ 101社製)を用いて単離し、さらにT4DNA
ポリメラーゼにより末端の平滑化を行った。
来プラスミドpAMα1上のテトラサイクリン遺伝子を
含むDNA断片1.6kbpをPCRによって増幅し
た。エンテロコッカス フェーカリス由来プラスミドp
AMα1を鋳型として約1ng用い、PCRバッファー
(ベーリンガー Pwo DNAポリメラーゼ添付)1
0μL、2種類のオリゴヌクレオチド(プライマー1;
5’−TGCAATGTGGAATTGGGAACGG−3’(配列番号
5))、(プライマー2;5’−CCCTTAACGATTTAGAAATC
CC−3’(配列番号6))20pmol、及び4種類の
ヌクレオチド(A, T, G,C)各20pmolを加え脱イオ
ン水で100μLに調製した。94℃ 2分間の処理
後、94℃ 1分、55℃ 1分、72℃ 1分の反応
を1サイクルとして30サイクル繰り返し、最後に、7
2℃ 5分間の反応をDNA Thermal Cyc
ler(パーキン エルマー社)を用いて行った後、テ
トラサイクリン遺伝子を含むDNA断片1.6kbpを
The GENECLEAN キット (バイオ 101社製)を用いて単離
し、さらにT4DNAポリメラーゼにより末端の平滑化
を行った後バチルスエスピーKSM−KP43株由来プ
ラスミドDNAの複製開始領域を含むDNA断片2.2
kbpとT4 DNAリガーゼで結合した。この結合反応
物による枯草菌ISW1214株(leu A8, metB8, hsrM
1)の形質転換をプロトプラスト法(S. ChangとS. N. Ch
oen;Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1978))に従
って行ない、5μg/mLテトラサイクリンを含むプロ
トプラスト再生用DM3培地[0.5%コハク酸ナトリ
ウム(pH7.3)、0.5%カザミノ酸、0.5%酵
母エキス、0.35%K2HPO4 、0.15%KH2P
O4 、0.5%グルコース、20mM MgCl2 、
0.01%牛血清アルブミン(シグマ社製)]を用いて
形質転換体を選択した。
をBirnboimとDolyの方法(Nucl. Acids. Res, 7, 1513-
1523(1979))に従って調製し、得られた組換えプラスミ
ドの制限酵素切断点の解析をアガロースゲル電気泳動法
を用いて行って、プラスミドベクターpTS43TC
(第1図)を得た。
ス・エスピー KSM−64株 (FERM BP-2886) を0.
5%ポリペプトン(日本製薬社製)、0.5%酵母エキ
ス(ディフコ社製)、0.1%KH2PO4 、0.02
%MgSO4・7H2O、及び0.5%Na2CO3 から
なる培地1100mLで30℃で12時間振盪培養し
た。遠心分離によって集めた菌体から、SaitoとMiuraの
方法(Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963))
に従って染色体DNAを取得した。得られた染色体DN
A50ngを鋳型とし、2種類のオリゴヌクレオチド(プ
ライマー5;5’−GGGAATTCGATGCAACAGGCTTATATTTAGAG
−3’(配列番号7))、(プライマー6;5’−GAAT
TCAAGCTTGCAGTATTTCTTGGTC−3’(配列番号8))20
pmol、及び4種類のヌクレオチド(A, T, G, C)各
20pmolを加え脱イオン水で100μLに調製し
た。94℃ 5分間の処理後、94℃ 1分、55℃
1分、72℃ 3分の反応を1サイクルとして28サイ
クル繰り返し、最後に、74℃ 5分間の反応をDNA
Thermal Cycler(パーキンエルマー
社)を用いて行った。増幅したDNA断片の解析をアガ
ロースゲル電気泳動法を用いて行った。KSM−64株
由来セルラーゼ構造遺伝子を含む3.3kb DNA増
幅断片をHigh Pure PCR Product Purification Kit (ベ
ーリンガー マンハイム社製)を用いて精製した。制限
酵素EcoRI処理したKSM−64株由来セルラーゼ
遺伝子増幅断片と、制限酵素EcoRI処理したpTS
43TCをT4 DNAリガーゼで結合した。この結合反
応物による枯草菌ISW1214株の形質転換を実施例
1と同様にプロトプラスト法に従って行なった。5μg
/mLテトラサイクリン、カルボキシセルロース1.0
%(w/v)及びトリパンブルー0.005%(w/
v)を加えたプロトプラスト再生用DM3培地上で、ハ
ローを形成したプラスミドpTCEL64(第1図)を
保持する組換え枯草菌ISW1214(pTCEL6
4)株を選択した。
4)株を50mLのポリペプトンS2.8%、魚肉エキ
ス0.5%、酵母エキス0.05%、KH2PO40.1
%、MgSO4・7H2O 0.02%、マルトース4
%、テトラサイクリン7.5μg/mLを含む500m
L容坂口フラスコに、得られた培養液を1%(v/v)
接種し、30℃、3日間振盪培養行った。形質転換体I
SW1214(pTCEL64)のセルラーゼ(CMC
アーゼ)生産性は、約26,000U/Lの非常に高い
生産性が得られた。
複製開始領域配列との相同性について検討した。配列番
号2中、アミノ酸番号1〜432の間でこれまでに報告
されている既知ポリペプチドとの相同性を検討すると、
第2図に示すようにクロストリディウムに由来するプラ
スミド複製開始タンパク(GarnierとCole, Plasmid 19,
134-150(1988))と39.7%の相同性があるにすぎない。従
って、配列番号2に示されるアミノ酸配列と適切にアラ
イメントしたとき40%以上の相同性があるポリペプチ
ド又はタンパクをコードする遺伝子配列を含むDNA断
片は本発明に含まれると解すべきである。
ス属細菌で安定に存在し、且つ有用遺伝子を効率よく増
幅させることより、有用なタンパク質又はペプチドを大
量に生産することが可能となる。
製開始領域を含むプラスミドベクターpTS43TCと
該プラスミドがさらにKSM−64株由来セルラーゼ遺
伝子を含むプラスミドpTCEL64の構築の過程を示
すものである。
製開始領域内にコードされているタンパクのアミノ酸配
列とクロストリディウムに由来するプラスミド複製開始
タンパクのアミノ酸配列の相同性を示したものである。
両配列に共通しているアミノ酸を示す tet:テトラサイクリン遺伝子 ori:複製起点
Claims (5)
- 【請求項1】 配列番号1で示される塩基配列からなる
DNA断片を含有するプラスミドベクター又は該塩基配
列に1個若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付
加した塩基配列からなるDNA断片を含有し、バチルス
属細菌中で安定で、且つ高発現が可能なプラスミドベク
ター。 - 【請求項2】 配列番号2で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列からなるDNA断片を含有するプラス
ミドベクター又は該アミノ酸配列に1個若しくは複数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列
をコードする塩基配列からなるDNA断片を含有し、バ
チルス属細菌中で安定で、且つ高発現が可能なプラスミ
ドベクター。 - 【請求項3】 請求項1又は2記載のプラスミドベクタ
ーにタンパク質又はペプチドをコードする構造遺伝子を
挿入してなる組換えプラスミド。 - 【請求項4】 請求項3記載の組換えプラスミドを含有
する組換え微生物。 - 【請求項5】 請求項4記載の組換え微生物を培養し、
該培養物から目的タンパク質又はペプチドを採取するタ
ンパク質又はペプチドの製造法。
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