JP3060019B2 - マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 - Google Patents
マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には、本発明は、マルトテ
トラオース生成酵素遺伝子を高分泌発現ベクター断片に
連結してなるプラスミド及び、該プラスミドをバチルス
ブレビスに保有してなる新規微生物、並びに該微生物を
培養し、培養物中にマルトテトラオース生成酵素を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする製造法に関す
る。
関するものであり、更に詳細には、本発明は、マルトテ
トラオース生成酵素遺伝子を高分泌発現ベクター断片に
連結してなるプラスミド及び、該プラスミドをバチルス
ブレビスに保有してなる新規微生物、並びに該微生物を
培養し、培養物中にマルトテトラオース生成酵素を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】マルトテトラオース生成酵素（ＥＣ３．
２．１．６０，ｅｘｏｍａｌｔｏｔｅｒａｏｈｙｄｒｏ
ｌａｓｅ）は、１９７１年ＲｏｂｙｔとＡｃｋｅｒｍａ
ｎによってシュードモナス・スツッツエリ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）の培養液中に初めて
発見された。近年マルトテトラオース生成酵素はシュー
ドモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）も産生することが明らか
となった。マルトテトラオースは臨床検査試薬や機能性
食品素材として需要が増大している。しかし、従来知ら
れている微生物によるマルトテトラオース生成酵素の生
産量は低く供給量を増大させることが望まれていた。
２．１．６０，ｅｘｏｍａｌｔｏｔｅｒａｏｈｙｄｒｏ
ｌａｓｅ）は、１９７１年ＲｏｂｙｔとＡｃｋｅｒｍａ
ｎによってシュードモナス・スツッツエリ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）の培養液中に初めて
発見された。近年マルトテトラオース生成酵素はシュー
ドモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）も産生することが明らか
となった。マルトテトラオースは臨床検査試薬や機能性
食品素材として需要が増大している。しかし、従来知ら
れている微生物によるマルトテトラオース生成酵素の生
産量は低く供給量を増大させることが望まれていた。
【０００３】このような業界の要望に応えるため、本発
明者らは、先に、シュードモナス・サッカロフィラ由来
のマルトテトラオース生成酵素遺伝子をクローン化し、
該遺伝子を適当なベクターに連結し、マルトテトラオー
ス生成酵素遺伝子を発現可能な宿主菌（大腸菌）に導入
しこの形質転換体でマルトテトラオース生成酵素を製造
することに成功した（特開平２−２２２６８６号）。
明者らは、先に、シュードモナス・サッカロフィラ由来
のマルトテトラオース生成酵素遺伝子をクローン化し、
該遺伝子を適当なベクターに連結し、マルトテトラオー
ス生成酵素遺伝子を発現可能な宿主菌（大腸菌）に導入
しこの形質転換体でマルトテトラオース生成酵素を製造
することに成功した（特開平２−２２２６８６号）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た本発明者らの開発に係るシステムでは、未だマルトテ
トラオース生成酵素の生産量が充分ではなく、産業上必
要な量を安価に供給するには更に技術開発を行う必要が
ある。
た本発明者らの開発に係るシステムでは、未だマルトテ
トラオース生成酵素の生産量が充分ではなく、産業上必
要な量を安価に供給するには更に技術開発を行う必要が
ある。
【０００５】本発明は、このような技術の現状に鑑み、
マルトテトラオース生成酵素遺伝子をクローニングし、
この遺伝子を高分泌発現ベクターに連結し、この高分泌
発現プラスミドを宿主微生物に導入し、新規形質転換体
を作製し、更に当該新規組換体を培養し、培養物よりマ
ルトテトラオースを採取することにより産業上利用出来
る量の該酵素を安価に提供する目的でなされたものであ
る。
マルトテトラオース生成酵素遺伝子をクローニングし、
この遺伝子を高分泌発現ベクターに連結し、この高分泌
発現プラスミドを宿主微生物に導入し、新規形質転換体
を作製し、更に当該新規組換体を培養し、培養物よりマ
ルトテトラオースを採取することにより産業上利用出来
る量の該酵素を安価に提供する目的でなされたものであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは、マ
ルトテトラオース生成酵素を安定にかつ効率よく生産さ
せる方法を提供すベく鋭意研究を重ねたところ、バチル
ス・ブレビスを宿主として用いてマルトテトラオース生
成酵素遺伝子を発現させることにより、培養物中に著量
のマルトテトラオース生成酵素が生産されることを見出
し、これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発
明を完成した。
成するためになされたものであって、本発明者らは、マ
ルトテトラオース生成酵素を安定にかつ効率よく生産さ
せる方法を提供すベく鋭意研究を重ねたところ、バチル
ス・ブレビスを宿主として用いてマルトテトラオース生
成酵素遺伝子を発現させることにより、培養物中に著量
のマルトテトラオース生成酵素が生産されることを見出
し、これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発
明を完成した。
【０００７】すなわち本発明は、宿主菌、特にバチルス
・ブレビスで高発現する新規なマルトテトラオース生成
酵素発現プラスミドに関するものである。また更に本発
明は、このプラスミドで形質転換した微生物、及びこの
形質転換体を培養することによるマルトテトラオース生
成酵素の工業的大量生産法に関するものである。以下、
本発明を具体的に説明するが、マルトテトラオース生成
酵素遺伝子をＧ４遺伝子、Ｇ４ ｇｅｎｅないし単にＧ
４という場合もある。
・ブレビスで高発現する新規なマルトテトラオース生成
酵素発現プラスミドに関するものである。また更に本発
明は、このプラスミドで形質転換した微生物、及びこの
形質転換体を培養することによるマルトテトラオース生
成酵素の工業的大量生産法に関するものである。以下、
本発明を具体的に説明するが、マルトテトラオース生成
酵素遺伝子をＧ４遺伝子、Ｇ４ ｇｅｎｅないし単にＧ
４という場合もある。
【０００８】［（１） マルトテトラオース生成酵素遺
伝子のクローン化］マルトテトラオース生成酵素遺伝子
としてはマルトテトラオース生成酵素をコードするもの
であればいずれでもよく、公知の方法でクローン化され
たものが挙げられ、具体例としては、特開平２−２２２
６８６号公報に記載の方法に従ってクローン化されたプ
ラスミドｐＧＦ１１が挙げられる。プラスミドｐＧＦ１
１は８．０Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマップを図
１に示す。ここで白ぬきの部分はベクターｐＨＹ３００
ＰＬＫ（ヤクトル社製）由来で、黒塗りの部分はマルト
テトラオース生成酵素遺伝子が含まれる部分であり、各
略記号はすべて制限酵素である。このプラスミドｐＧＦ
１１で形質転換されたエシェリヒア・コリＣ６００−ｐ
ＧＦ１１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ−６
００ｐＧＦ１１）は、微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１０４１１として寄託されている。
伝子のクローン化］マルトテトラオース生成酵素遺伝子
としてはマルトテトラオース生成酵素をコードするもの
であればいずれでもよく、公知の方法でクローン化され
たものが挙げられ、具体例としては、特開平２−２２２
６８６号公報に記載の方法に従ってクローン化されたプ
ラスミドｐＧＦ１１が挙げられる。プラスミドｐＧＦ１
１は８．０Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマップを図
１に示す。ここで白ぬきの部分はベクターｐＨＹ３００
ＰＬＫ（ヤクトル社製）由来で、黒塗りの部分はマルト
テトラオース生成酵素遺伝子が含まれる部分であり、各
略記号はすべて制限酵素である。このプラスミドｐＧＦ
１１で形質転換されたエシェリヒア・コリＣ６００−ｐ
ＧＦ１１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ−６
００ｐＧＦ１１）は、微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１０４１１として寄託されている。
【０００９】Ｇ４遺伝子の導入は、例えば適当なクロー
ニングベクター（例えばｐＵＢ系べクター）を用い、バ
チルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）を宿主にして、適宜実施すればよい。
ニングベクター（例えばｐＵＢ系べクター）を用い、バ
チルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）を宿主にして、適宜実施すればよい。
【００１０】プロモーターとしては、宿主内に機能する
ものであればいずれでもよいが、シュードモナス サッ
カロフィラのマルトテトラオース生成酵素遺伝子のプロ
モーターをそのまま利用することもできるが、バチルス
属細菌由来のより好ましくはバチルス・ブレビス由来の
プロモーターがよい。例えばバチルス・ブレビス４７
（ＦＥＲＭ−Ｐ７２２４）あるいはバチルス・ブレビス
Ｈ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の主要菌体外蛋
白質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子、ＭＷＰ遺伝子）のプロモー
ターなどが例示される。該プロモーターは１種または２
種以上保有されていてもよい。プロモーター領域を含有
するＤＮＡは、上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻訳
開始コドン等を有していることが必要である。
ものであればいずれでもよいが、シュードモナス サッ
カロフィラのマルトテトラオース生成酵素遺伝子のプロ
モーターをそのまま利用することもできるが、バチルス
属細菌由来のより好ましくはバチルス・ブレビス由来の
プロモーターがよい。例えばバチルス・ブレビス４７
（ＦＥＲＭ−Ｐ７２２４）あるいはバチルス・ブレビス
Ｈ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の主要菌体外蛋
白質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子、ＭＷＰ遺伝子）のプロモー
ターなどが例示される。該プロモーターは１種または２
種以上保有されていてもよい。プロモーター領域を含有
するＤＮＡは、上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻訳
開始コドン等を有していることが必要である。
【００１１】本発明において、マルトテトラオース生成
酵素は宿主の菌体内、菌体外のいずれかに蓄積されても
良いが、マルトテトラオース生成酵素の抽出、精製を容
易にし、また生産量を増大させるためには、菌体外にマ
ルトテトラオース生成酵素を蓄積させるのが望ましく、
この場合、マルトテトラオース生成酵素遺伝子の５’側
にシグナルベプチドをコードする領域を存在させる。
酵素は宿主の菌体内、菌体外のいずれかに蓄積されても
良いが、マルトテトラオース生成酵素の抽出、精製を容
易にし、また生産量を増大させるためには、菌体外にマ
ルトテトラオース生成酵素を蓄積させるのが望ましく、
この場合、マルトテトラオース生成酵素遺伝子の５’側
にシグナルベプチドをコードする領域を存在させる。
【００１２】シグナルペプチドとしては、マルトテトラ
オース生成酵素を宿主の菌体外に分泌させるものであれ
ばいずれでもよく、例えばシュードモナス サッカロフ
ィラのマルトテトラオース生成酵素遺伝子のシグナルペ
プチドやバチルス・ブレビス４７あるいはバチルス・ブ
レビスＨ１０２の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチド
などが挙げられるが、なかでもバチルス・ブレビス４７
（ＦＥＲＭＰ−７２２４）由来のＭＷＰ蛋白質（ｍｉｄ
ｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチ
ドが好ましい。
オース生成酵素を宿主の菌体外に分泌させるものであれ
ばいずれでもよく、例えばシュードモナス サッカロフ
ィラのマルトテトラオース生成酵素遺伝子のシグナルペ
プチドやバチルス・ブレビス４７あるいはバチルス・ブ
レビスＨ１０２の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチド
などが挙げられるが、なかでもバチルス・ブレビス４７
（ＦＥＲＭＰ−７２２４）由来のＭＷＰ蛋白質（ｍｉｄ
ｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチ
ドが好ましい。
【００１３】プラスミドを構築する方法としては、常法
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニングに
記載の方法などが例示され、Ｇ４遺伝子、プロモータ
ー、シグナルペプチド等のＤＮＡ断片をそれぞれ連結し
て目的とするプラスミドを構築してもよいし、Ｇ４とシ
グナルとを連結しておき、その後にプロモーター領域を
連結する等各種の変形手段を採ることも可能である。
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニングに
記載の方法などが例示され、Ｇ４遺伝子、プロモータ
ー、シグナルペプチド等のＤＮＡ断片をそれぞれ連結し
て目的とするプラスミドを構築してもよいし、Ｇ４とシ
グナルとを連結しておき、その後にプロモーター領域を
連結する等各種の変形手段を採ることも可能である。
【００１４】宿主微生物としては、バチルス・ブレビス
に属する微生物であれば何れでも良く、例えば、バチル
ス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチル
ス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が
挙げられるが、好適にはバチルス・ブレビスＨ１０２が
用いられる。なお、バチルス・ブレビスＨ１０２は、バ
チルス・ブレビスＨＰＤ３１とも称される（日本農芸化
学大会昭和６２年度大会講演要旨集ｐ２７、日本農芸化
学会誌６１，６６９（１９８７））。
に属する微生物であれば何れでも良く、例えば、バチル
ス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチル
ス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が
挙げられるが、好適にはバチルス・ブレビスＨ１０２が
用いられる。なお、バチルス・ブレビスＨ１０２は、バ
チルス・ブレビスＨＰＤ３１とも称される（日本農芸化
学大会昭和６２年度大会講演要旨集ｐ２７、日本農芸化
学会誌６１，６６９（１９８７））。
【００１５】宿主微生物を形質転換する方法は、公知の
方法、例えばＴａｋａｈａｓｈｉらの方法［Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９８３）］、Ｔ
ａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５３，３０９９−３１００（１９８９））などを
採用することができる。
方法、例えばＴａｋａｈａｓｈｉらの方法［Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９８３）］、Ｔ
ａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５３，３０９９−３１００（１９８９））などを
採用することができる。
【００１６】組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物
の選択方法は、液体選択培地で培養し、培養液中のマル
トテトラオース生成酵素活性を測定する方法、澱粉含有
寒天選択培地上にコロニーを形成させ、ヨード液を噴霧
することでアミラーゼ活性を測定する方法等既知の方法
によって測定できる。選択培地にはベクター上のマーカ
ーによって、最小培地や、抗性物質添加培地が適宜用い
られる。
の選択方法は、液体選択培地で培養し、培養液中のマル
トテトラオース生成酵素活性を測定する方法、澱粉含有
寒天選択培地上にコロニーを形成させ、ヨード液を噴霧
することでアミラーゼ活性を測定する方法等既知の方法
によって測定できる。選択培地にはベクター上のマーカ
ーによって、最小培地や、抗性物質添加培地が適宜用い
られる。
【００１７】酵素活性の測定は、培養液に澱粉溶液を加
え、４０℃で保温した後、薄層クロマトグラフィーや高
速液体クロマトグラフィーを用いて生成されたマルトテ
トラオースの同定や定量をすることによって行なわれ
る。
え、４０℃で保温した後、薄層クロマトグラフィーや高
速液体クロマトグラフィーを用いて生成されたマルトテ
トラオースの同定や定量をすることによって行なわれ
る。
【００１８】得られたマルトテトラオース生成酵素生産
菌を液体選択培地にて３７℃で培養し、公知の方法、例
えば、アルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ａ
ｎｄＤｏｌｙ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，７，１５１３，（１９７９））によってプラス
ミドを得ることができる。マルトテトラオース生成酵素
遺伝子を含む組替えＤＮＡは、上記の方法で、適宜制限
酵素で切断し、他のベクターに組み込んだり、他の宿主
に導入することができる。
菌を液体選択培地にて３７℃で培養し、公知の方法、例
えば、アルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ａ
ｎｄＤｏｌｙ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，７，１５１３，（１９７９））によってプラス
ミドを得ることができる。マルトテトラオース生成酵素
遺伝子を含む組替えＤＮＡは、上記の方法で、適宜制限
酵素で切断し、他のベクターに組み込んだり、他の宿主
に導入することができる。
【００１９】［（２） ＤＮＡ塩基配列の決定］ＤＮＡ
の塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍ
ａｘａｍ，Ａ，Ｍ，ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４
９９，（１９８０））やジデオキシヌクレオチド鎖終結
法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，
Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９，（１９８２））等によ
り決定することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列
は、塩基配列より解読することができる。また、ポリペ
プチドを菌体外に分泌させるシグナル配列のアミノ酸配
列も、同様にして決定する。
の塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍ
ａｘａｍ，Ａ，Ｍ，ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４
９９，（１９８０））やジデオキシヌクレオチド鎖終結
法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，
Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９，（１９８２））等によ
り決定することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列
は、塩基配列より解読することができる。また、ポリペ
プチドを菌体外に分泌させるシグナル配列のアミノ酸配
列も、同様にして決定する。
【００２０】［（３） マルトテトラオース生成酵素活
性を有するポリペプチドの調製］マルトテトラオース生
成酵素活性を有するポリペプチドを次のようにして調製
することができる。マルトテトラオース生成酵素産生
菌、あるいは上記の方法によってマルトテトラオース生
成酵素産生能を獲得した形質転換微生物を液体培養す
る。培地としては、該微生物の通常の培養に用いられる
ものであればいずれでもよい。
性を有するポリペプチドの調製］マルトテトラオース生
成酵素活性を有するポリペプチドを次のようにして調製
することができる。マルトテトラオース生成酵素産生
菌、あるいは上記の方法によってマルトテトラオース生
成酵素産生能を獲得した形質転換微生物を液体培養す
る。培地としては、該微生物の通常の培養に用いられる
ものであればいずれでもよい。
【００２１】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。
該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。
栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい，該栄養物質としては、アミノ酸
類、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。
該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。
栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい，該栄養物質としては、アミノ酸
類、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
【００２２】培養後、酵素が菌体内にある場合には、培
養液を遠心分雛して菌体を得、超音波や細胞壁溶解酵素
等で処理し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗酵素液と
する。また、酵素が培地中にある場合には、培養液を遠
心分離して菌体を除き、以後の精製を行なう。得られた
粗酵素液から、塩析、透析、イオン交換樹脂、アフィニ
ティクロマトグラフ処理等一般的酵素精製法によりマル
トテトラオース生成酵素を単離することができる。
養液を遠心分雛して菌体を得、超音波や細胞壁溶解酵素
等で処理し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗酵素液と
する。また、酵素が培地中にある場合には、培養液を遠
心分離して菌体を除き、以後の精製を行なう。得られた
粗酵素液から、塩析、透析、イオン交換樹脂、アフィニ
ティクロマトグラフ処理等一般的酵素精製法によりマル
トテトラオース生成酵素を単離することができる。
【００２３】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。
る。
【００２４】〔実施例１ バチルス・ブレビスへのマル
トテトラオース生成酵素遺伝子のクローン化〕プラスミ
ドｐＧＦ１１（特開昭２−２２２６８６、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ６００−ｐＧＦ１１（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４１１）
由来）に制限酵素ＸｈｏＩを作用させた。この反応液を
０．７％アガロース電気泳動に供し、そこに観察される
５．５ＫｂＤＮＡとマルトテトラオース生成酵素遺伝子
を含む２．４ＫｂＤＮＡのうち、２．４ＫｂＤＮＡのみ
を市販のＤＮＡ精製キットＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（ＴＭ）
（フナコシ社製）により回収精製した。
トテトラオース生成酵素遺伝子のクローン化〕プラスミ
ドｐＧＦ１１（特開昭２−２２２６８６、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ６００−ｐＧＦ１１（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４１１）
由来）に制限酵素ＸｈｏＩを作用させた。この反応液を
０．７％アガロース電気泳動に供し、そこに観察される
５．５ＫｂＤＮＡとマルトテトラオース生成酵素遺伝子
を含む２．４ＫｂＤＮＡのうち、２．４ＫｂＤＮＡのみ
を市販のＤＮＡ精製キットＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（ＴＭ）
（フナコシ社製）により回収精製した。
【００２５】遺伝子の導入にはバチルス・ブレビスＨ１
０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）を宿主、プラスミド
ｐＵＢ１１０ＥＸ（４．５Ｋｂ）をベクターに用いた。
ｐＵＢ１１０ＥＸはプラスミドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲ
Ｉ部位にＸｈｏＩリンカー（宝酒造社製）を挿入したプ
ラスミド誘導体である。このｐＵＢ１１０ＥＸにＸｈｏ
Ｉを作用させた後、アルカリフォスターゼで処理し、さ
きに回収精製したマルトテトラオース生成酵素遺伝子を
含む２．４ＫｂＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、トリス
−ＰＥＧ形質転換法により、バチルス・ブレビスＨ１０
２を形質転換した。得られた形質転換処理菌体を選択培
地である１％可溶性澱粉、ネオマイシン６０μｇ／ｍ
ｌ、寒天１．２％を含むＴ２培地（ポリペプトン１％、
肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１
％、ｐＨ７．０）に塗布して３７℃で培養し、ネオマイ
シン耐性株を得た。このネオマイシン耐性株を、ネオマ
イシン６０μｇ／ｍｌ、寒天１．２％を含むＴ２培地に
て３７℃で２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオ
ース生成酵素活性の有無を薄層クロマトグラフィーによ
って調べた（薄層クロマトグラフィーは、培養液をｎ−
ブタノール：ｎ−プロパノール：水＝３：５：４の溶媒
系で６０℃、２回上昇展開を行った後、硫酸を噴霧して
マルトテトラオースの有無を調べた。）。その結果マル
トテトラオース生成酵素分泌株を分離することができ
た。
０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）を宿主、プラスミド
ｐＵＢ１１０ＥＸ（４．５Ｋｂ）をベクターに用いた。
ｐＵＢ１１０ＥＸはプラスミドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲ
Ｉ部位にＸｈｏＩリンカー（宝酒造社製）を挿入したプ
ラスミド誘導体である。このｐＵＢ１１０ＥＸにＸｈｏ
Ｉを作用させた後、アルカリフォスターゼで処理し、さ
きに回収精製したマルトテトラオース生成酵素遺伝子を
含む２．４ＫｂＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、トリス
−ＰＥＧ形質転換法により、バチルス・ブレビスＨ１０
２を形質転換した。得られた形質転換処理菌体を選択培
地である１％可溶性澱粉、ネオマイシン６０μｇ／ｍ
ｌ、寒天１．２％を含むＴ２培地（ポリペプトン１％、
肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１
％、ｐＨ７．０）に塗布して３７℃で培養し、ネオマイ
シン耐性株を得た。このネオマイシン耐性株を、ネオマ
イシン６０μｇ／ｍｌ、寒天１．２％を含むＴ２培地に
て３７℃で２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオ
ース生成酵素活性の有無を薄層クロマトグラフィーによ
って調べた（薄層クロマトグラフィーは、培養液をｎ−
ブタノール：ｎ−プロパノール：水＝３：５：４の溶媒
系で６０℃、２回上昇展開を行った後、硫酸を噴霧して
マルトテトラオースの有無を調べた。）。その結果マル
トテトラオース生成酵素分泌株を分離することができ
た。
【００２６】得られたマルトテトラオース生成酵素生産
株を、ネオマイシン６０μｇ／ｍｌを含むＴ２培地にて
３７℃で培養し、培養液を遠心分離して集菌し、洗浄
後、分離菌体からアルカリ抽出法によってプラスミドを
分離した。このプラスミドをプラスミドｐＨＳＤ０１と
命名し、プラスミドｐＨＳＤ０１を保持する形質転換体
をバチルス・ブレビスＨ１０２−Ｇ４（ＦＥＲＭ Ｐ−
１０２８７）と命名した。プラスミドｐＨＳＤ０１は
７．０Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマップを図１に
示す。ここで白ぬきの部分はベクターｐＵＢ１１０ＥＸ
由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分である。
株を、ネオマイシン６０μｇ／ｍｌを含むＴ２培地にて
３７℃で培養し、培養液を遠心分離して集菌し、洗浄
後、分離菌体からアルカリ抽出法によってプラスミドを
分離した。このプラスミドをプラスミドｐＨＳＤ０１と
命名し、プラスミドｐＨＳＤ０１を保持する形質転換体
をバチルス・ブレビスＨ１０２−Ｇ４（ＦＥＲＭ Ｐ−
１０２８７）と命名した。プラスミドｐＨＳＤ０１は
７．０Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマップを図１に
示す。ここで白ぬきの部分はベクターｐＵＢ１１０ＥＸ
由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分である。
【００２７】〔実施例２ マルトテトラオース生成酵素
高分泌発現プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４の構築と形質転
換体の調製〕実施例１で得られたプラスミドｐＨＳＤ０
１を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断しその１．２Ｋ
ｂの断片と０．９５Ｋｂの断片を得た（図２）。１．２
Ｋｂの断片にはマルトテトラオース生成酵素遺伝子の中
央部より上流側、０．９５Ｋｂの断片にはその下流側が
存在している。プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）を
制限酵素ＳａｌＩとＰＳｔＩで切断し、１．２Ｋｂの断
片を挿入してｐＵＣＤ０１を得た。このプラスミドｐＵ
ＣＤ０１を持つ大腸菌ＭＶ１１８４（宝酒造製）からモ
レキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の
方法に従って環状１本鎖ＤＮＡを単離した。図３に示し
たように、この１本鎖ＤＮＡのマルトテトラオース生成
酵素遺伝子のシグナルペプチド切断部位より上流３アミ
ノ酸目から、６アミノ酸残基に対応するＤＮＡに相補的
な１本鎖ＤＮＡを化学合成した。ただし、シグナルペプ
チド切断部位の上流２アミノ酸目のロイシン（Ｌｅｕ）
がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換するように塩基配
列を変えて合成した。この合成ＤＮＡとマルトテトラオ
ース生成酵素遺伝子の中央部より上流部を持つた環状１
本鎖ＤＮＡを混合し、部分２本鎖化（アニーリング）し
た。これにＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌａｒｇｅ Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ）で処理して環状２本鎖化した。その後、マン
グビーン核酸分解酵素（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ）と制限酵素ＰｓｔＩで処理をし、０．９５Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を得た。
高分泌発現プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４の構築と形質転
換体の調製〕実施例１で得られたプラスミドｐＨＳＤ０
１を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断しその１．２Ｋ
ｂの断片と０．９５Ｋｂの断片を得た（図２）。１．２
Ｋｂの断片にはマルトテトラオース生成酵素遺伝子の中
央部より上流側、０．９５Ｋｂの断片にはその下流側が
存在している。プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）を
制限酵素ＳａｌＩとＰＳｔＩで切断し、１．２Ｋｂの断
片を挿入してｐＵＣＤ０１を得た。このプラスミドｐＵ
ＣＤ０１を持つ大腸菌ＭＶ１１８４（宝酒造製）からモ
レキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の
方法に従って環状１本鎖ＤＮＡを単離した。図３に示し
たように、この１本鎖ＤＮＡのマルトテトラオース生成
酵素遺伝子のシグナルペプチド切断部位より上流３アミ
ノ酸目から、６アミノ酸残基に対応するＤＮＡに相補的
な１本鎖ＤＮＡを化学合成した。ただし、シグナルペプ
チド切断部位の上流２アミノ酸目のロイシン（Ｌｅｕ）
がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換するように塩基配
列を変えて合成した。この合成ＤＮＡとマルトテトラオ
ース生成酵素遺伝子の中央部より上流部を持つた環状１
本鎖ＤＮＡを混合し、部分２本鎖化（アニーリング）し
た。これにＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌａｒｇｅ Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ）で処理して環状２本鎖化した。その後、マン
グビーン核酸分解酵素（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ）と制限酵素ＰｓｔＩで処理をし、０．９５Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を得た。
【００２８】一方、ｐＨＳＤ０１のＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ
切断で得られたマルトテトラオース生成酵素遺伝子の中
央部より下流側を含む０．９５ＫｂのＤＮＡ断片をベク
ターｐＢＲＡＮ３のＳａｌＩ、ＰｓｔＩ切断部位に挿入
し、この０．９５ＫｂのＤＮＡ断片及びＭＷＰシグナル
ペプチド領域を含むプラスミドｐＢＲＳＤ１１を得た。
このプラスミドｐＢＲＳＤ１１を制限酵素ＮｃｏＩで切
断後Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ）で処
理し、その末端を平滑化した後、制限酵素ＰｓｔＩで切
断した。このようにして処理したプラスミドｐＢＲＳＤ
１１に、上記処理にて１本鎖ＤＮＡより合成して得られ
た０．９５ＫｂＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連
結し、ｐＢＲＳＤ１２を得た。このプラスミドｐＢＲＳ
Ｄ１２を、制限酵素ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
することでシグナルペプチドの中間付近以降からマルト
テトラオース生成酵素遺伝子のＣ末端までをコードする
２．１ＫｂのＤＮＡ断片を単離した（図４）。
切断で得られたマルトテトラオース生成酵素遺伝子の中
央部より下流側を含む０．９５ＫｂのＤＮＡ断片をベク
ターｐＢＲＡＮ３のＳａｌＩ、ＰｓｔＩ切断部位に挿入
し、この０．９５ＫｂのＤＮＡ断片及びＭＷＰシグナル
ペプチド領域を含むプラスミドｐＢＲＳＤ１１を得た。
このプラスミドｐＢＲＳＤ１１を制限酵素ＮｃｏＩで切
断後Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ）で処
理し、その末端を平滑化した後、制限酵素ＰｓｔＩで切
断した。このようにして処理したプラスミドｐＢＲＳＤ
１１に、上記処理にて１本鎖ＤＮＡより合成して得られ
た０．９５ＫｂＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連
結し、ｐＢＲＳＤ１２を得た。このプラスミドｐＢＲＳ
Ｄ１２を、制限酵素ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
することでシグナルペプチドの中間付近以降からマルト
テトラオース生成酵素遺伝子のＣ末端までをコードする
２．１ＫｂのＤＮＡ断片を単離した（図４）。
【００２９】続いて、発現ベクターｐＮＵ２００（Ｙａ
ｍａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６，３５８９（１９８
９））をＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これに
プラスミドｐＢＲＳＤ１２より単離した２．１Ｋｂ Ａ
ｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結し、その反応液を用いてＴａｋａｇｉらの方法
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．ＣｈｅＭ．，５３，３０９９
（１９８９））によってバチルス・ブレビスＨ１０２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の形質転換を行った。得
られたエリスロマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ
ドを単離し、これをｐＮＵ２００Ｇ４と命名し（図
４）、プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４を保持する形質転換
体をバチルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵ２００Ｇ４
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９９６）と命名した。
ｍａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６，３５８９（１９８
９））をＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これに
プラスミドｐＢＲＳＤ１２より単離した２．１Ｋｂ Ａ
ｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結し、その反応液を用いてＴａｋａｇｉらの方法
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．ＣｈｅＭ．，５３，３０９９
（１９８９））によってバチルス・ブレビスＨ１０２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の形質転換を行った。得
られたエリスロマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ
ドを単離し、これをｐＮＵ２００Ｇ４と命名し（図
４）、プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４を保持する形質転換
体をバチルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵ２００Ｇ４
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９９６）と命名した。
【００３０】［実施例３］ 実施例２で創製したバチルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮ
Ｕ２００Ｇ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９９６）を、グルコ
ース１％、ペプトン１％、酵素エキス０．２％、肉エキ
ス０．５％、ネオマイシン０．００６％の組成の培地１
００ｍｌを収容した５００ｍｌ容三角フラスコに接種
し、３７℃で一夜振とう培養し、種培養液を得た。
Ｕ２００Ｇ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９９６）を、グルコ
ース１％、ペプトン１％、酵素エキス０．２％、肉エキ
ス０．５％、ネオマイシン０．００６％の組成の培地１
００ｍｌを収容した５００ｍｌ容三角フラスコに接種
し、３７℃で一夜振とう培養し、種培養液を得た。
【００３１】上記と同じ組成の培地１５ｌを収容した３
０ｌ容ジャーファーメンターに、上記で得た種培養液２
００ｍｌを加え、通気量１ｖｖｍ、撹拌数２００ｒｐｍ
で３７℃、４８時間通気撹拌培養を行った。
０ｌ容ジャーファーメンターに、上記で得た種培養液２
００ｍｌを加え、通気量１ｖｖｍ、撹拌数２００ｒｐｍ
で３７℃、４８時間通気撹拌培養を行った。
【００３２】得られた培養液を８０００ｒｐｍで遠心分
離することによって菌体を除去し、上澄１４ｌを得た。
この培養上澄に硫安９ｋｇを添加することにより塩析を
行い、生産されたマルトテトラオース生成酵素を沈澱物
として集めた。更にこの沈澱物を、５０ｍＭ ＮａＯＡ
ｃ（ｐＨ６．０）を添加した１ｍＭ ＣａＣｌ２液５０
ｍｌに溶解後、遠心分離することにより、不溶解物を除
き同緩衝液に一夜透析した後の内液をマルトテトラオー
ス生成粗酵素液とした。この粗酵素液の活性は３０００
０ＩＵ／ｍｌであった。
離することによって菌体を除去し、上澄１４ｌを得た。
この培養上澄に硫安９ｋｇを添加することにより塩析を
行い、生産されたマルトテトラオース生成酵素を沈澱物
として集めた。更にこの沈澱物を、５０ｍＭ ＮａＯＡ
ｃ（ｐＨ６．０）を添加した１ｍＭ ＣａＣｌ２液５０
ｍｌに溶解後、遠心分離することにより、不溶解物を除
き同緩衝液に一夜透析した後の内液をマルトテトラオー
ス生成粗酵素液とした。この粗酵素液の活性は３０００
０ＩＵ／ｍｌであった。
【００３３】
【発明の効果】本発明によってはじめてＧ４遺伝子高分
泌発現プラスミドが開発され、この新規プラスミドで形
質転換したバチルス・ブレビス等の形質転換体を培養す
ることにより、マルトテトラオース生成酵素を著量生産
することができる。
泌発現プラスミドが開発され、この新規プラスミドで形
質転換したバチルス・ブレビス等の形質転換体を培養す
ることにより、マルトテトラオース生成酵素を著量生産
することができる。
【図１】ｐＨＳＤ０１の構築図である。
【図２】ｐＢＲＳＤ１２の構築図である。
【図３】ｐＢＲＳＤ１２の制限酵素切断地図である。
【図４】シグナルペプチドをコードする領域の導入図で
ある。
ある。
【図５】Ｇ４高分泌発現プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４の
構築図である。
構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） (56)参考文献 特開 平２−222686（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−56277（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12N 9/24
Claims (3)
- 【請求項１】 シュードモナス・サッカロフィラ（Pseu
domonas saccharophila）のマルトテトラオース生成酵
素遺伝子を含むＤＮＡとバチルス・ブレビス（Bacillus
brevis）由来のプロモーター領域及びシグナルペプチ
ドを連結してなるプラスミドをバチルス・ブレビスＨ１
０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）を宿主菌として導入
してなる微生物。 - 【請求項２】 請求項１に記載の形質転換体Bacillus b
revis H102/pNU200G4。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の微生物を培養
し、培養物からマルトテトラオース生成酵素を採取する
ことを特徴とする該酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12321991A JP3060019B2 (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12321991A JP3060019B2 (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349888A JPH04349888A (ja) | 1992-12-04 |
| JP3060019B2 true JP3060019B2 (ja) | 2000-07-04 |
Family
ID=14855152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12321991A Expired - Fee Related JP3060019B2 (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3060019B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017030908A (ja) * | 2015-07-30 | 2017-02-09 | 吉川英男 | テープカッター |
-
1991
- 1991-03-06 JP JP12321991A patent/JP3060019B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017030908A (ja) * | 2015-07-30 | 2017-02-09 | 吉川英男 | テープカッター |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04349888A (ja) | 1992-12-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |