JP2671008B2 - シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物 - Google Patents
シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物Info
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- JP2671008B2 JP2671008B2 JP63105945A JP10594588A JP2671008B2 JP 2671008 B2 JP2671008 B2 JP 2671008B2 JP 63105945 A JP63105945 A JP 63105945A JP 10594588 A JP10594588 A JP 10594588A JP 2671008 B2 JP2671008 B2 JP 2671008B2
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- dna
- cgtase
- strain
- dna encoding
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Description
【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、アルカリ側に最適pHを有するシクロマルト
デキストリングるカノトランスフェラーゼ（以下「CGTa
se」という）をコードするDNA、そのDNAを含む組換えプ
ラスミドDNA及びそのプラスミドDNAを含む形質転換微生
物に関する。
デキストリングるカノトランスフェラーゼ（以下「CGTa
se」という）をコードするDNA、そのDNAを含む組換えプ
ラスミドDNA及びそのプラスミドDNAを含む形質転換微生
物に関する。
（発明の背景） シクロデキストリン（CD）は、６個以上のグルコース
分子がα−１、４−グルコシド結合で環状に結合した非
還元性のマルトオリゴ糖である。これらのCDのうち、工
業的に生産可能で最も有用と考えられているのは、構成
するグルコースの数が、６、７、８個のα、β、γ−CD
である。これらのCDは、特異的な包接化合物形成能や酵
素類似（触媒）機能を有することから医薬品や食品への
利用、あるいは一般化学工業用途に関する報告が多くな
されている。ところで、CDが化学的試薬として比較的安
価に供給されるようになったのは最近のことである。本
発明者らは、先に、好アルカリ性微生物を土壌中から分
離し、それらの中からアルカリ側においてβ−CDをデン
プンから優先的に生成する特性を有するCGTase生産菌、
バチルス属No.38−２菌（ATCC21783）及び17−１菌（AT
CC31007、微工研菌寄第612号）を単離し、該CGTase生産
菌を利用したアルカリ発酵法によるβ−CDの生産法を確
率した（N.Nakamura and K.Horikoshi,Agric.Biol.Che
m.,40（４）、753（1976）；特公昭53−31223号及び特
公昭52−93号参照）。
分子がα−１、４−グルコシド結合で環状に結合した非
還元性のマルトオリゴ糖である。これらのCDのうち、工
業的に生産可能で最も有用と考えられているのは、構成
するグルコースの数が、６、７、８個のα、β、γ−CD
である。これらのCDは、特異的な包接化合物形成能や酵
素類似（触媒）機能を有することから医薬品や食品への
利用、あるいは一般化学工業用途に関する報告が多くな
されている。ところで、CDが化学的試薬として比較的安
価に供給されるようになったのは最近のことである。本
発明者らは、先に、好アルカリ性微生物を土壌中から分
離し、それらの中からアルカリ側においてβ−CDをデン
プンから優先的に生成する特性を有するCGTase生産菌、
バチルス属No.38−２菌（ATCC21783）及び17−１菌（AT
CC31007、微工研菌寄第612号）を単離し、該CGTase生産
菌を利用したアルカリ発酵法によるβ−CDの生産法を確
率した（N.Nakamura and K.Horikoshi,Agric.Biol.Che
m.,40（４）、753（1976）；特公昭53−31223号及び特
公昭52−93号参照）。
（発明の目的） 本発明の目的は、CGTaseをコードするDNA、そのDNAを
含む組換えプラスミドDNA及びそのプラスミドDNAを含む
形質転換微生物を提供することである。
含む組換えプラスミドDNA及びそのプラスミドDNAを含む
形質転換微生物を提供することである。
（発明の構成） 本発明は、アルカリ側に最適pHを有するCGTaseをコー
ドするDNAに関し、また、本発明は、CGTaseをコードす
るDNAとベクター・プラスミドの全部又は１部のDNAとが
結合してなるプラスミドDNAに関し、さらに、本発明
は、CGTaseをコードするDNAとベクター・プラスミドの
全部又は１部のDNAとが結合してなるプラスミドDNAによ
って形質転換された微生物に関する。
ドするDNAに関し、また、本発明は、CGTaseをコードす
るDNAとベクター・プラスミドの全部又は１部のDNAとが
結合してなるプラスミドDNAに関し、さらに、本発明
は、CGTaseをコードするDNAとベクター・プラスミドの
全部又は１部のDNAとが結合してなるプラスミドDNAによ
って形質転換された微生物に関する。
本発明に使用するCGTaseをコードするDNAとは、例え
ば、バチルス属No.38−２又は17−１由来のアルカリ側
に最適pHを有するCGTaseをコードするDNAである。
ば、バチルス属No.38−２又は17−１由来のアルカリ側
に最適pHを有するCGTaseをコードするDNAである。
本発明のDNAによりコードされるアルカリ側に最適pH
を有するCGTaseであって、No.38−２由来のCGTaseのア
ミノ酸配列を以下に示す。
を有するCGTaseであって、No.38−２由来のCGTaseのア
ミノ酸配列を以下に示す。
また、本発明のDNAによりコードされるアルカリ側に
最適pHを有するCGTaseであって、No.17−１由来のCGTas
eのアミノ酸配列を以下に示す。
最適pHを有するCGTaseであって、No.17−１由来のCGTas
eのアミノ酸配列を以下に示す。
以下、上記DNA、これを含む組換えDNA、およびこれに
よって形質転換された微生物の製造法について説明す
る。
よって形質転換された微生物の製造法について説明す
る。
＜染色体DNAの調製＞ 本発明のCGTase生産菌として、例えば、バチルス属N
o.38−２菌（以下「38−２株」という。）及び17−１菌
（以下「17−１株」という。）を挙げることができ、こ
れらの株は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ション（The American Type Culture Collection）に寄
託番号ATCC21783及び31007でそれぞれ寄託されており、
何人も入手可能である〔The American Type Culture Co
llection Catalogue of Strains,13th Edition 1978、p
40参照）。
o.38−２菌（以下「38−２株」という。）及び17−１菌
（以下「17−１株」という。）を挙げることができ、こ
れらの株は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ション（The American Type Culture Collection）に寄
託番号ATCC21783及び31007でそれぞれ寄託されており、
何人も入手可能である〔The American Type Culture Co
llection Catalogue of Strains,13th Edition 1978、p
40参照）。
上記38−２株又は17−１株をアルカリ性培地で、37℃
で好気的に撹拌培養する。対数増殖後期の菌体を遠心分
離等により、集菌後、例えば、フェノール法によるDNA
抽出法〔サイトウら、バイオキミカ・バイオフイジカ・
アクタ（Saito,H.＆ Miura,K.Biochimica et Biophysic
a Acta）72、619−629（1963）参照〕によって、38−２
株又は17−１株の染色体DNAを抽出、精製して得る。
で好気的に撹拌培養する。対数増殖後期の菌体を遠心分
離等により、集菌後、例えば、フェノール法によるDNA
抽出法〔サイトウら、バイオキミカ・バイオフイジカ・
アクタ（Saito,H.＆ Miura,K.Biochimica et Biophysic
a Acta）72、619−629（1963）参照〕によって、38−２
株又は17−１株の染色体DNAを抽出、精製して得る。
＜DNA断片のベクター・プラスミドの挿入及び形質転換
＞ 本発明に使用するベクター・プラスミドDNAとして
は、大腸菌を宿主とするクローニング・ベクターのほと
んどすべてを含むことができ、例えば、pBR322、pCR1、
pUC19、p15A系のpACYC177、pACYC184であり、好ましく
は、pBR322及びpUC19である。これらのベクターに上記C
GTaseをコードするDNA、または、該DNAにハイブリッド
するDNAを導入し、組換えDNA分子を形成する。
＞ 本発明に使用するベクター・プラスミドDNAとして
は、大腸菌を宿主とするクローニング・ベクターのほと
んどすべてを含むことができ、例えば、pBR322、pCR1、
pUC19、p15A系のpACYC177、pACYC184であり、好ましく
は、pBR322及びpUC19である。これらのベクターに上記C
GTaseをコードするDNA、または、該DNAにハイブリッド
するDNAを導入し、組換えDNA分子を形成する。
この組換えDNA分子は、上記したCGTase活性を有する
ポリペプチドをコードするいずれかのDNAが発現コント
ロール配列に発現可能に結合されているものである。
ポリペプチドをコードするいずれかのDNAが発現コント
ロール配列に発現可能に結合されているものである。
（イ）プラスミドpCS110の構築 ベクター・プラスミドpBR322は、例えば、メイヤーズ
らの方法によって調製することもできるが〔J.Meyers e
t al,J.Bacteriol.Vol.127,1529−1537（1976）参
照〕、市販のものも使用できる（例えば、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）社製）。次に、上記染色体DNAに制限酵素Sau3AI
を作用させ切断する。一方プラスミドpBR322をBamHIで
切断し、上記切断した染色体DNAを加えDNAリガーゼによ
ってDNA鎖の結合反応を行う。得られた結合混合物を、
常法（例えば、レーデルベルグら、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Lederderg,E.M.,＆Cohen,S.N.Journ
al of Bacteriology）119、1072−1074（1974）参照）
により大腸菌に形質転換を行って、１μgDNA当り、約3
0,000株の形質転換株を得る。
らの方法によって調製することもできるが〔J.Meyers e
t al,J.Bacteriol.Vol.127,1529−1537（1976）参
照〕、市販のものも使用できる（例えば、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）社製）。次に、上記染色体DNAに制限酵素Sau3AI
を作用させ切断する。一方プラスミドpBR322をBamHIで
切断し、上記切断した染色体DNAを加えDNAリガーゼによ
ってDNA鎖の結合反応を行う。得られた結合混合物を、
常法（例えば、レーデルベルグら、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Lederderg,E.M.,＆Cohen,S.N.Journ
al of Bacteriology）119、1072−1074（1974）参照）
により大腸菌に形質転換を行って、１μgDNA当り、約3
0,000株の形質転換株を得る。
これら形質転換株のうち、アンピシリン及び澱粉を含
んだLB寒天プレート上で、コロニーを形成し、ヨード呈
色法等により澱粉を分解しているコロニーを選択し得
る。得られた形質転換株を増殖させ、常法によりプラス
ミドを抽出・精製し、約3.1Kb（キロベース）のBamHI/S
au3AI断片を含むプラスミドpCS110を得る。
んだLB寒天プレート上で、コロニーを形成し、ヨード呈
色法等により澱粉を分解しているコロニーを選択し得
る。得られた形質転換株を増殖させ、常法によりプラス
ミドを抽出・精製し、約3.1Kb（キロベース）のBamHI/S
au3AI断片を含むプラスミドpCS110を得る。
（38−2CGTaseをコードするDNA及びアミノ酸配列） プラスミドpCS110のCGTaseは、3.1Kb BamHI/Sau3AI断
片上に、少なくとも発現に必要な部位が存在する。
片上に、少なくとも発現に必要な部位が存在する。
pCS110の制限酵素切断地図を第１図に示す。
シークエンシングは、常法、例えば、pUC19を用いた
サンガーのジデオキシ鎖末端法〔Dideoxy chain termin
ation method:Sanger et al,プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oceedings of the National Academy of Sciencse）、
U.S.A.,74、5463−5467（1967）参照〕およびエキソヌ
クレアーゼ・ディレッション法（exonuclease deletion
method）（S.Henikoff,Gene,28、351（1984）参照）に
より行う。このようにして得られたプラスミドpCS110の
38−2CGTaseをコードするDNAの塩基配列及びアミノ酸配
列を第２図に示す。
サンガーのジデオキシ鎖末端法〔Dideoxy chain termin
ation method:Sanger et al,プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oceedings of the National Academy of Sciencse）、
U.S.A.,74、5463−5467（1967）参照〕およびエキソヌ
クレアーゼ・ディレッション法（exonuclease deletion
method）（S.Henikoff,Gene,28、351（1984）参照）に
より行う。このようにして得られたプラスミドpCS110の
38−2CGTaseをコードするDNAの塩基配列及びアミノ酸配
列を第２図に示す。
第２図の塩基配列は、38−2CGTaseに相当するシング
ル・オープン・リーディング・フレームを示し、この21
39bpのオープン・リーディング・フレームから7.5Kダル
トンの分子量のたんぱくが翻訳される。
ル・オープン・リーディング・フレームを示し、この21
39bpのオープン・リーディング・フレームから7.5Kダル
トンの分子量のたんぱくが翻訳される。
菌体外38−2CGTaseのＮ−末端アミノ酸の配列は、ペ
プチド・シークエンサーによるとNH2−Ala−Pro−Asp−
Thr−Ser−Val−Ser−Asn−Lys−Gln−Asn−Phe−Ser−
Thr−Asp−Val−Ileである。したがって、この結果は、
Ｎ末端側の27個のアミノ酸残基（アミノ酸残基−27から
−１）が、CGTaseの分泌の際に除かれるシグナル・ペプ
チドであることを示している。又、推定されるリボソー
ム結合部位（S.D.配列）、GAGGAGGは、開始コドンの6bp
上流に認められ枯草菌（Bacillus subtilis）16Sリボソ
ーマルRNAの３′−末端に相補している。
プチド・シークエンサーによるとNH2−Ala−Pro−Asp−
Thr−Ser−Val−Ser−Asn−Lys−Gln−Asn−Phe−Ser−
Thr−Asp−Val−Ileである。したがって、この結果は、
Ｎ末端側の27個のアミノ酸残基（アミノ酸残基−27から
−１）が、CGTaseの分泌の際に除かれるシグナル・ペプ
チドであることを示している。又、推定されるリボソー
ム結合部位（S.D.配列）、GAGGAGGは、開始コドンの6bp
上流に認められ枯草菌（Bacillus subtilis）16Sリボソ
ーマルRNAの３′−末端に相補している。
（38−２株の生産するCGTaseと形質転換株エシェリチア
・コリHB101（pCS110）） （Escherichia coli HB101（pCS110））の生産するCGTa
seの比較） 上記で得られたポリペプチドは、例えば、38−２株の
生産する精製CGTaseより作製した抗体を用いて、それぞ
れのCGTaseを免疫学的に確認し得る。この方法によれば
エシェリチア・コリ（E.coli）HB101（pCS110）由来のC
GTaseは、38−２株由来のCGTase抗体と沈降線を生じ、
菌体外38−２株のCGTaseによるものと完全に１本の沈降
線で連結しており、同一のものであることが確認され
る。
・コリHB101（pCS110）） （Escherichia coli HB101（pCS110））の生産するCGTa
seの比較） 上記で得られたポリペプチドは、例えば、38−２株の
生産する精製CGTaseより作製した抗体を用いて、それぞ
れのCGTaseを免疫学的に確認し得る。この方法によれば
エシェリチア・コリ（E.coli）HB101（pCS110）由来のC
GTaseは、38−２株由来のCGTase抗体と沈降線を生じ、
菌体外38−２株のCGTaseによるものと完全に１本の沈降
線で連結しており、同一のものであることが確認され
る。
（ロ）プラスミドpUCP1の構築 一方、ベクター・プラスミドpUC19も上記メイヤーズ
らの方法によって調製することができるが〔J.Meyers e
t al,J.Bacteriol.Vol.127,1529−1537（1976）参
照〕、市販のものも使用できる（例えば、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）社製）。次に、上記染色体DNAに制限酵素PstIを
作用させ切断する。一方プラスミドpUC19をPstIで切断
し、上記切断した染色体DNAを加えDNAリガーゼによって
DNA鎖の結合反応を行う。得られた混合混合物を、常法
（例えば、レーデルベルグら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Lederderg,E.M.,＆ Cohen,S.N.Journal
of Bacteriology）119、1072−1074（1974）参照）によ
り大腸菌に形質転換を行って、１μgDNA当り、約35,000
株の形質転換株を得る。
らの方法によって調製することができるが〔J.Meyers e
t al,J.Bacteriol.Vol.127,1529−1537（1976）参
照〕、市販のものも使用できる（例えば、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）社製）。次に、上記染色体DNAに制限酵素PstIを
作用させ切断する。一方プラスミドpUC19をPstIで切断
し、上記切断した染色体DNAを加えDNAリガーゼによって
DNA鎖の結合反応を行う。得られた混合混合物を、常法
（例えば、レーデルベルグら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Lederderg,E.M.,＆ Cohen,S.N.Journal
of Bacteriology）119、1072−1074（1974）参照）によ
り大腸菌に形質転換を行って、１μgDNA当り、約35,000
株の形質転換株を得る。
これらの形質転換株のうち、アンピシリン及び澱粉を
含んだLB寒天プレート上で、コロニーを形成し、ヨード
呈色法等により澱粉を分解しているコロニーを選択し得
る。得られた形質転換株を増殖させ、常法によりプラス
ミドを抽出・精製し、約5.6Kb（キロベース）のPstI断
片を含むプラスミドpUCP1を得る。
含んだLB寒天プレート上で、コロニーを形成し、ヨード
呈色法等により澱粉を分解しているコロニーを選択し得
る。得られた形質転換株を増殖させ、常法によりプラス
ミドを抽出・精製し、約5.6Kb（キロベース）のPstI断
片を含むプラスミドpUCP1を得る。
（17−1CGTaseをコードするDNA配列及びアミノ酸配列） プラスミドpUCP1のCGTaseは、5.6Kb PstI断片上に、
少なくとも発現に必要な部位が存在する。
少なくとも発現に必要な部位が存在する。
pUCP1の制限酵素切断地図を第４図に示す。
シークエンシングは、常法、例えば、pUC19を用いた
サンガーのジデオキシ鎖末端法〔Dideoxy chain termin
ation method:Sanger et al,プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc
eedings of the National Academy of Sciences）、U.
S.A.,74、5463−5467（1967）参照〕およびエキソヌク
レアーゼ・ディレッション法（exonuclease deletion m
ethod）（S.Henikoff,Gene,28、351（1984）参照）によ
り行う。このようにして得られたプラスミドpUCP1の17
−1CGTaseをコードするDNAの塩基配列及びアミノ酸配列
を第５図に示す。
サンガーのジデオキシ鎖末端法〔Dideoxy chain termin
ation method:Sanger et al,プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc
eedings of the National Academy of Sciences）、U.
S.A.,74、5463−5467（1967）参照〕およびエキソヌク
レアーゼ・ディレッション法（exonuclease deletion m
ethod）（S.Henikoff,Gene,28、351（1984）参照）によ
り行う。このようにして得られたプラスミドpUCP1の17
−1CGTaseをコードするDNAの塩基配列及びアミノ酸配列
を第５図に示す。
第５図の塩基配列は、17−1CGTaseに相当するシング
ル・オープン・リーディング・フレームを示し、この21
42bpのオープン・リーディング・フレームから7.5Kダル
トンの分子量のたんぱくが翻訳される。
ル・オープン・リーディング・フレームを示し、この21
42bpのオープン・リーディング・フレームから7.5Kダル
トンの分子量のたんぱくが翻訳される。
又、推定されるリボソーム結合部位（S.D.配列）、AG
GAGGは、開始コドンの6bp上流に認められ枯草菌（Bacil
lus subtilis）16SリボソーマルRNAの３′−末端に相補
している。
GAGGは、開始コドンの6bp上流に認められ枯草菌（Bacil
lus subtilis）16SリボソーマルRNAの３′−末端に相補
している。
（17−１株の生産するCGTaseと形質転換株エシェリチア
・コリHB101（pUCP1）） （Escherichia coli HB101（pUCP1））の生産するCGTas
eの比較） 上記で得られたポリペプチドは、例えば、17−１株の
生産する精製CGTaseより作製した抗体を用いて、それぞ
れのCGTaseを免疫学的に確認し得る。この方法によれば
エシェリチア・コリ（E.coli）HB101（pUCP1）由来のCG
Taseは、17−１株由来のCGTase抗体と沈降線を生じ、菌
体外17−１株のCGTaseによるものと完全に１本の沈降線
で連結しており、同一のものであることが確認される。
・コリHB101（pUCP1）） （Escherichia coli HB101（pUCP1））の生産するCGTas
eの比較） 上記で得られたポリペプチドは、例えば、17−１株の
生産する精製CGTaseより作製した抗体を用いて、それぞ
れのCGTaseを免疫学的に確認し得る。この方法によれば
エシェリチア・コリ（E.coli）HB101（pUCP1）由来のCG
Taseは、17−１株由来のCGTase抗体と沈降線を生じ、菌
体外17−１株のCGTaseによるものと完全に１本の沈降線
で連結しており、同一のものであることが確認される。
実施例１ ＜1.染色体DNAの調製＞ 前記38−２株（ATCC21783）のCGTase遺伝子を含む染
色体DNAは、斉藤、三浦等の方法（Biochem.Biophys.Act
a Vol.72、619−629（1963）に準じて調製した。すなわ
ち、38−２株をアルカリII培地500ml（１％可溶性澱
粉、0.5％イースト・エクストラクト、0.5％ポリペプト
ン、0.1％リン酸二カリウム、0.02％硫酸マグネシウ
ム、１％炭酸ナトリウム;pH10.0）に接種し、37℃で一
昼夜通気撹拌培養した。培養液を遠心分離して集菌し、
得られた菌体10g（湿重量）をVSS緩衝液（0.15M NaCl、
0.1M EDTA、25％シュクロース;pH8）に懸濁し、37℃で3
0分リゾチーム処理した。これにTSS緩衝液（0.1Mトリス
塩酸（pH9）、0.1M NaCl、１％SDS）を加えた後、TE（1
0mMトリス塩酸（pH7.5）、1mM EDTA）飽和フェノールを
加え、氷水中で撹拌、更にクロロホルム−イソアミルア
ルコール混液（24/1、v/v）を加え、氷水中で撹拌し
た。これを遠心分離して得られた上清に冷エタノールを
加えて染色体DNAを回収し（約15mg）、SSC緩衝液（0.15
M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）に溶解後、リボヌ
クレアーゼ及びプロテアーゼで処理した。処理液を、再
度フェノール及びクロロホルム−イソアミルアルコール
で処理後、水層を回収し、精製染色体DNA溶液とした。
色体DNAは、斉藤、三浦等の方法（Biochem.Biophys.Act
a Vol.72、619−629（1963）に準じて調製した。すなわ
ち、38−２株をアルカリII培地500ml（１％可溶性澱
粉、0.5％イースト・エクストラクト、0.5％ポリペプト
ン、0.1％リン酸二カリウム、0.02％硫酸マグネシウ
ム、１％炭酸ナトリウム;pH10.0）に接種し、37℃で一
昼夜通気撹拌培養した。培養液を遠心分離して集菌し、
得られた菌体10g（湿重量）をVSS緩衝液（0.15M NaCl、
0.1M EDTA、25％シュクロース;pH8）に懸濁し、37℃で3
0分リゾチーム処理した。これにTSS緩衝液（0.1Mトリス
塩酸（pH9）、0.1M NaCl、１％SDS）を加えた後、TE（1
0mMトリス塩酸（pH7.5）、1mM EDTA）飽和フェノールを
加え、氷水中で撹拌、更にクロロホルム−イソアミルア
ルコール混液（24/1、v/v）を加え、氷水中で撹拌し
た。これを遠心分離して得られた上清に冷エタノールを
加えて染色体DNAを回収し（約15mg）、SSC緩衝液（0.15
M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）に溶解後、リボヌ
クレアーゼ及びプロテアーゼで処理した。処理液を、再
度フェノール及びクロロホルム−イソアミルアルコール
で処理後、水層を回収し、精製染色体DNA溶液とした。
＜2. CGTase遺伝子を含む組換えDNAの作成＞ ベクター・プラスミドとして使用するpBR322は、J.メ
イヤーズ等の方法（J.Bacteriol.,Vol.127、1529−1537
（1976））に準じて大腸菌から分離、調製した。
イヤーズ等の方法（J.Bacteriol.,Vol.127、1529−1537
（1976））に準じて大腸菌から分離、調製した。
上記染色体DNAに、制限酵素Sau3AIを加え、37℃で１
時間作用させ、DNA断片が、１〜20Kbとなるよう部分分
解した。一方、前記プラスミドpBR322は、制限酵素BamH
Iを加えて、37℃で１時間作用させて完全に切断し、更
にこれをアルカリフォスファターゼで処理してベクター
断片とした。その後、切断した染色体DNA3μｇとベクタ
ー・プラスミドDNA1μｇを混合し、T4ファージ由来のDN
Aリガーゼを加え、16℃で一夜反応させ、組換えDNAを作
成した。
時間作用させ、DNA断片が、１〜20Kbとなるよう部分分
解した。一方、前記プラスミドpBR322は、制限酵素BamH
Iを加えて、37℃で１時間作用させて完全に切断し、更
にこれをアルカリフォスファターゼで処理してベクター
断片とした。その後、切断した染色体DNA3μｇとベクタ
ー・プラスミドDNA1μｇを混合し、T4ファージ由来のDN
Aリガーゼを加え、16℃で一夜反応させ、組換えDNAを作
成した。
＜3.組換えDNAによる形質転換＞ エシェリチア・コリHB101（Escherichia coli HB10
1）〔Goldfarb et al,Proceedings of the National Ac
ademy of Sciences of the United States of America7
9、5886−5890（1982）参照〕（遺伝形質:pro、leu B,
B.1 lac Y,hsd R, hsd M, ara 14、gal KZ、xy1−５、m
t1−１、supE44、F-、endo I、recA、Strr）を用い、レ
ーデルベルグらの方法に従って形質転換を行った（Lede
rberg,E.M.,＆ Cohen,S.N.119,1072−1074（1974参
照）。すなわち、前記HB101株をLB培地（トリプトン１
％、酵母エキス0.5％、NaCl1％:pH7.0）で37℃、４時間
培養後集菌し、10mM NaCl、次いで30mMCaCl2で遠心洗浄
し、この菌体を30mMCaCl2に懸濁した。
1）〔Goldfarb et al,Proceedings of the National Ac
ademy of Sciences of the United States of America7
9、5886−5890（1982）参照〕（遺伝形質:pro、leu B,
B.1 lac Y,hsd R, hsd M, ara 14、gal KZ、xy1−５、m
t1−１、supE44、F-、endo I、recA、Strr）を用い、レ
ーデルベルグらの方法に従って形質転換を行った（Lede
rberg,E.M.,＆ Cohen,S.N.119,1072−1074（1974参
照）。すなわち、前記HB101株をLB培地（トリプトン１
％、酵母エキス0.5％、NaCl1％:pH7.0）で37℃、４時間
培養後集菌し、10mM NaCl、次いで30mMCaCl2で遠心洗浄
し、この菌体を30mMCaCl2に懸濁した。
（いずれも氷冷下で操作した。これに、２で得られた
組換えDNAを加え、氷水中で30分間静置後、42℃で２分
間処理し、細胞内にとり込ませた。その後LB培地（トリ
プトン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl10g、水１
中:pH7）を加え、37℃で２時間保った後、アンピシリン
及び澱粉を含むLB寒天平板培地上に拡げ、更に37℃で24
時間保ってコロニーを形成させ、約30,000株の形質転換
株を得た。本平板から、ヨード呈色法により澱粉を分解
しているコロニーを選択し、これをLB培地で液体培養後
（37℃、16時間）超音波処理により菌体を破砕し、CGTa
se活性をペーパー・クロマトグラフィー（溶媒;n−ブタ
ノール:n−プロパノール：水＝3:5:4、３重展開、ヨー
ド・スプレーにて発色）で調べCGTase活性を確認した。
この結果を第３図に示す。このようにして得られたプラ
スミドpCS110を含む形質転換株をエシェリチア・コリHB
101（pCS110）（Escherichia coli HB101（pCS110）
〔微工研菌寄第9420号（FERM P−9420）〕と命名した。
組換えDNAを加え、氷水中で30分間静置後、42℃で２分
間処理し、細胞内にとり込ませた。その後LB培地（トリ
プトン（Difco）10g、酵母エキス5g、NaCl10g、水１
中:pH7）を加え、37℃で２時間保った後、アンピシリン
及び澱粉を含むLB寒天平板培地上に拡げ、更に37℃で24
時間保ってコロニーを形成させ、約30,000株の形質転換
株を得た。本平板から、ヨード呈色法により澱粉を分解
しているコロニーを選択し、これをLB培地で液体培養後
（37℃、16時間）超音波処理により菌体を破砕し、CGTa
se活性をペーパー・クロマトグラフィー（溶媒;n−ブタ
ノール:n−プロパノール：水＝3:5:4、３重展開、ヨー
ド・スプレーにて発色）で調べCGTase活性を確認した。
この結果を第３図に示す。このようにして得られたプラ
スミドpCS110を含む形質転換株をエシェリチア・コリHB
101（pCS110）（Escherichia coli HB101（pCS110）
〔微工研菌寄第9420号（FERM P−9420）〕と命名した。
上記形質転換株を次のように処理して、精製プラスミ
ドを得た。
ドを得た。
実施例２ 前記17−１株（ATCC31007）のCGTase遺伝子を含む染
色体DNAは、斉藤、三浦等の方法〔Biochem.Biophys.Act
a Vol.72、619−629（1963）〕に準じて調製した。すな
わち、17−１株をアルカリII培地500ml（１％可溶性澱
粉、0.5％イースト・エクストラクト、0.5％ポリペプト
ン、0.1％リン酸二カリウム、0.02％硫酸マグネシウ
ム、１％炭酸ナトリウム;pH10.0）に接種し、37℃で一
昼夜通気撹拌培養した。培養液を遠心分離して集菌し、
得られた菌体10g（湿重量）をVSS緩衝液（0.15M NaCl、
0.1M EDTA、25％シュクロース;pH8）に懸濁し、37℃で3
0分リゾチーム処理した。これにTSS緩衝液（0.1Mトリス
塩酸（pH9）、0.1M NaCl、１％SDS）を加えた後、TE（1
0mMトリス塩酸（pH7.5）、1mM EDTA）飽和フェノールを
加え、氷水中で撹拌、更にクロロホルム−イソアミルア
ルコール混液（24/1、v/v）を加え、氷水中で撹拌し
た。これを遠心分離して得られた上清に冷エタノールを
加えて染色体DNAを回収し（約15mg）、SSC緩衝液（0.15
M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）に溶解後、リボヌ
クレアーゼ及びプロテアーゼで処理した。処理液を、再
度フェノール及びクロロホルム−イソアミルアルコール
で処理後、水層を回収し、精製染色体DNA溶液とした。
色体DNAは、斉藤、三浦等の方法〔Biochem.Biophys.Act
a Vol.72、619−629（1963）〕に準じて調製した。すな
わち、17−１株をアルカリII培地500ml（１％可溶性澱
粉、0.5％イースト・エクストラクト、0.5％ポリペプト
ン、0.1％リン酸二カリウム、0.02％硫酸マグネシウ
ム、１％炭酸ナトリウム;pH10.0）に接種し、37℃で一
昼夜通気撹拌培養した。培養液を遠心分離して集菌し、
得られた菌体10g（湿重量）をVSS緩衝液（0.15M NaCl、
0.1M EDTA、25％シュクロース;pH8）に懸濁し、37℃で3
0分リゾチーム処理した。これにTSS緩衝液（0.1Mトリス
塩酸（pH9）、0.1M NaCl、１％SDS）を加えた後、TE（1
0mMトリス塩酸（pH7.5）、1mM EDTA）飽和フェノールを
加え、氷水中で撹拌、更にクロロホルム−イソアミルア
ルコール混液（24/1、v/v）を加え、氷水中で撹拌し
た。これを遠心分離して得られた上清に冷エタノールを
加えて染色体DNAを回収し（約15mg）、SSC緩衝液（0.15
M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）に溶解後、リボヌ
クレアーゼ及びプロテアーゼで処理した。処理液を、再
度フェノール及びクロロホルム−イソアミルアルコール
で処理後、水層を回収し、精製染色体DNA溶液とした。
＜2. CGTase遺伝子を含む組換えDNAの作成＞ ベクター・プラスミドとして使用するpUC19は、J.メ
イヤーズ等の方法（J.Bacteriol.,Vol.127、1529−1537
（1976））に準じて大腸菌から分離、調製した。
イヤーズ等の方法（J.Bacteriol.,Vol.127、1529−1537
（1976））に準じて大腸菌から分離、調製した。
上記染色体DNAに、制限酵素Pst Iを加え、37℃で１時
間作用させ、DNA断片が、１〜20Kbとなるよう部分分解
した。一方、前記プラスミドpUC19は、制限酵素Pst Iを
加えて、37℃で１時間作用させて完全に切断し、更にこ
れをアルカリフォスファターゼで処理してベクター断片
とした。その後、切断した染色体DNA3μｇとベクター・
プラスミドDNA1μｇを混合し、T4ファージ由来のDNAリ
ガーゼを加え、16℃で一夜反応させ、組換えDNAを作成
した。
間作用させ、DNA断片が、１〜20Kbとなるよう部分分解
した。一方、前記プラスミドpUC19は、制限酵素Pst Iを
加えて、37℃で１時間作用させて完全に切断し、更にこ
れをアルカリフォスファターゼで処理してベクター断片
とした。その後、切断した染色体DNA3μｇとベクター・
プラスミドDNA1μｇを混合し、T4ファージ由来のDNAリ
ガーゼを加え、16℃で一夜反応させ、組換えDNAを作成
した。
＜3.組換えDNAによる形質転換＞ エシェリチア・コリHB101（Escherichia coli HB10
1）〔Goldfarb et al,Proceedings of the National Ac
ademy of Sciences of the United States of America7
9、5886−5890（1982）参照〕（遺伝形質:por、leu B,
B.1 lac Y,hsd R, hsd M, ara 14、gal KZ、xy1−５、m
t1−１、supE44、F-、endo I、recA、Strr）を用い、レ
ーデルベルグらの方法に従って形質転換を行った〔Lede
rberg,E.M.,＆ Cohen,S.N.119,1072−1074（1974）参
照〕。すなわち、前記HB101株をLB培地（トリプトン１
％、酵母エキス0.5％、NaCl1％:pH7.0）で37℃、４時間
培養後集菌し、10mM NaCl、次いで30mMCaCl2で遠心洗
浄、この菌体を30mMCaCl2に懸濁した。（いずれも氷冷
下で操作した。これに、２で得られた組換えDNAを加
え、氷水中で30分間静置後、42℃で２分間処理し、細胞
内にとり込ませた。その後LB培地（トリプトン（Difc
o）10g、酵母エキス5g、NaCl10g、水１中:pH7）を加
え、37℃で２時間保った後、アンピシリン及び澱粉を含
むLB寒天平板培地上に拡げ、更に37℃で24時間保ってコ
ロニーを形成させ、約35,000株の形質転換株を得た。本
平板から、ヨード呈色法により澱粉を分解しているコロ
ニーを選択し、これをLB培地で液体培養後（37℃、16時
間）超音波処理により菌体を破砕し、CGTase活性をペー
パー・クロマトグラフィー（溶媒;n−ブタノール:n−プ
ロパノール：水＝3:5:4、３重展開、ヨード・スプレー
にて発色）で調べCGTase活性を確認した。この結果を第
６図に示す。このようにして得られたプラスミドpUCP1
を含む形質転換株をエシェリチア・コリHB101（pUCP1）
（Escherichia coli HB101（pUCP1）〔微工研菌寄第100
02号（FERM P−10002）〕と命名した。
1）〔Goldfarb et al,Proceedings of the National Ac
ademy of Sciences of the United States of America7
9、5886−5890（1982）参照〕（遺伝形質:por、leu B,
B.1 lac Y,hsd R, hsd M, ara 14、gal KZ、xy1−５、m
t1−１、supE44、F-、endo I、recA、Strr）を用い、レ
ーデルベルグらの方法に従って形質転換を行った〔Lede
rberg,E.M.,＆ Cohen,S.N.119,1072−1074（1974）参
照〕。すなわち、前記HB101株をLB培地（トリプトン１
％、酵母エキス0.5％、NaCl1％:pH7.0）で37℃、４時間
培養後集菌し、10mM NaCl、次いで30mMCaCl2で遠心洗
浄、この菌体を30mMCaCl2に懸濁した。（いずれも氷冷
下で操作した。これに、２で得られた組換えDNAを加
え、氷水中で30分間静置後、42℃で２分間処理し、細胞
内にとり込ませた。その後LB培地（トリプトン（Difc
o）10g、酵母エキス5g、NaCl10g、水１中:pH7）を加
え、37℃で２時間保った後、アンピシリン及び澱粉を含
むLB寒天平板培地上に拡げ、更に37℃で24時間保ってコ
ロニーを形成させ、約35,000株の形質転換株を得た。本
平板から、ヨード呈色法により澱粉を分解しているコロ
ニーを選択し、これをLB培地で液体培養後（37℃、16時
間）超音波処理により菌体を破砕し、CGTase活性をペー
パー・クロマトグラフィー（溶媒;n−ブタノール:n−プ
ロパノール：水＝3:5:4、３重展開、ヨード・スプレー
にて発色）で調べCGTase活性を確認した。この結果を第
６図に示す。このようにして得られたプラスミドpUCP1
を含む形質転換株をエシェリチア・コリHB101（pUCP1）
（Escherichia coli HB101（pUCP1）〔微工研菌寄第100
02号（FERM P−10002）〕と命名した。
上記形質転換株を実施例１と同様に処理して、精製プ
ラスミドを得た。
ラスミドを得た。
（発明の効果） 本発明の形質転換株は、LB平板上で約16時間培養後も
CGTase活性を示すことから、本発明の38−2CGTase遺伝
子及び17−1CGTase遺伝子は、それぞれ大腸菌体内で安
定に保持され、かつ効率よくCGTaseへと翻訳されている
ことが認められる。
CGTase活性を示すことから、本発明の38−2CGTase遺伝
子及び17−1CGTase遺伝子は、それぞれ大腸菌体内で安
定に保持され、かつ効率よくCGTaseへと翻訳されている
ことが認められる。
したがって、本発明の形質転換株からCGTase活性を有
するポリペプチドを大量に取得することができる。
するポリペプチドを大量に取得することができる。
第１図は、本発明のプラスミドpCS110の制限酵素切断地
図を示す。第２図は、プラスミドpCS110の3.1Kb BamHI/
San3AI−San3AI/BamHI断片中にエンコードされているCG
Tase遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示
す。第３図は、CGTase活性を調べたペーパー・クロマト
グラフィーの結果を示す。第４図は、本発明のプラスミ
ドpUCP1の制限酵素切断地図を示す。第５図は、プラス
ミドpUCP1の5.6Kb Pst I断片中にエンコードされている
CGTase遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示
す。第６図は、CGTase活性を調べたペーパー・クロマト
グラフィーの結果を示す。
図を示す。第２図は、プラスミドpCS110の3.1Kb BamHI/
San3AI−San3AI/BamHI断片中にエンコードされているCG
Tase遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示
す。第３図は、CGTase活性を調べたペーパー・クロマト
グラフィーの結果を示す。第４図は、本発明のプラスミ
ドpUCP1の制限酵素切断地図を示す。第５図は、プラス
ミドpUCP1の5.6Kb Pst I断片中にエンコードされている
CGTase遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示
す。第６図は、CGTase活性を調べたペーパー・クロマト
グラフィーの結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 工藤 俊章 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究 所内 (72)発明者 宋 基榜 東京都渋谷区西原２―49―５ 国際協力 事業団東京国際研修センター内
Claims (3)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列１又は２で表される、
アルカリ側に最適pHを有するシクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼをコードするDNA。 アミノ酸配列１ アミノ酸配列２ - 【請求項２】請求項１記載のDNAを含有する組換えプラ
スミド。 - 【請求項３】請求項２記載のプラスミドにより形質転換
された微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63105945A JP2671008B2 (ja) | 1987-07-10 | 1988-04-28 | シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17272287 | 1987-07-10 | ||
| JP62-172722 | 1987-07-10 | ||
| JP63105945A JP2671008B2 (ja) | 1987-07-10 | 1988-04-28 | シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02455A JPH02455A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2671008B2 true JP2671008B2 (ja) | 1997-10-29 |
Family
ID=26446165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63105945A Expired - Fee Related JP2671008B2 (ja) | 1987-07-10 | 1988-04-28 | シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2671008B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100363344C (zh) * | 2005-05-25 | 2008-01-23 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种用于提纯过氧化氢异丙苯的活性组合物及其应用 |
-
1988
- 1988-04-28 JP JP63105945A patent/JP2671008B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOTECHNOL.BIOENG=1984 * |
| J.BACTERIOL=1986 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02455A (ja) | 1990-01-05 |
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