JP3527021B2 - エンドグリコセラミダーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明はエンドグリコセラミ
ダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに
関する。更に詳しくは、糖脂質の構造や機能の解析等の
糖鎖工学に有用なエンドグリコセラミダーゼをコードす
る塩基配列及びそのアミノ酸配列に関する。本発明は、
また、該ＤＮＡを用いるエンドグリコセラミダーゼ活性
を有するポリペプチドの工業的な製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】スフィンゴ糖脂質はスフィンゴシン塩基
の第一級アルコール性水酸基がグリコシド結合によって
単糖またはオリゴ糖と結合し、さらに脂肪酸が酸アミド
結合したものであり、スフィンゴシン塩基と脂肪酸から
なる部分をセラミドと呼んでいる（脂質の化学、第３６
５頁、東京化学同人社、１９７４年発行）。スフィンゴ
糖脂質は動物界に幅広く分布しており細胞表層を構成す
る主要な成分であり血液型物質、細胞の抗原性、シグナ
ル伝達、分化等の機能との関連性が注目されている。 【０００３】エンドグリコセラミダーゼ（ＥＣ３．２．
１．１２３）はスフィンゴ糖脂質の糖鎖とセラミドの間
のグリコシド結合を加水分解し完全な形の糖鎖とセラミ
ドを遊離する酵素であるが、セレブロシダーゼとは異な
り単糖がセラミドに結合したセレブロシドには作用しな
い。エンドグリコセラミダーゼは放線菌ロドコッカスよ
り最初に発見された［ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（The Journal of Biological Ch
emistry)、第２６１巻、第１４２７８〜１４２８２頁
（１９８６）］。更にロドコッカスは基質特異性の異な
る３種類のエンドグリコセラミダーゼ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉ）を生産することが明らかとなっている［ザ ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６４
巻、第１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８
９）］。 【０００４】その後ヒル由来のもの［バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーシ
ョンズ（Biochemical and Biophysical Research Commu
nication）、第１４１巻、第３４６〜３５２頁（１９８
６）］、ミミズ由来のもの［バイオケミカル アンド
バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、
第１４９巻、第１６７〜１７２頁（１９８７）］、細菌
由来のもの［ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオ
ケミストリー（Europian Journal of Biochemistry）、
第２０５巻、第７２９〜７３５頁（１９９２）］、はま
ぐり由来のもの［ザ ファセブ ジャーナル（The FASE
B Journal)、第８巻、第Ａ１４３９頁（１９９４）］が
知られている。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかし、これまで発見
された生物からエンドグリコセラミダーゼを製造しよう
とする場合、生産量が少ない、糖質分解酵素やスフィン
ゴミエリナーゼの混在の為、精製が困難である等の理由
により、他の酵素の混在しない本酵素を簡便にかつ大量
に得ることは非常に困難であった。従ってより安価に高
純度な酵素を製造する方法が求められている。従来、エ
ンドグリコセラミダーゼを各種生物から精製する方法に
関しては前述のように報告があるが、エンドグリコセラ
ミダーゼのアミノ酸配列や遺伝子構造は全く不明である
ため、遺伝子工学的にエンドグリコセラミダーゼを製造
することは困難である。 【０００６】従って、本発明の第１の目的は、エンドグ
リコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡを提供することにある。本発明の第２の目的
は、これらのＤＮＡを組込んだ組換体を利用して、遺伝
子工学的に高純度のエンドグリコセラミダーゼを製造す
る方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、
該製造方法により得られるポリペプチドを提供すること
にある。本発明の第４の目的は、本発明のＤＮＡに特異
的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプロー
ブ又はプライマーを提供することにある。本発明の第５
の目的は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又は
その断片を提供することにある。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の状
況に鑑み、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを単離し、その塩基配列を
解明するために鋭意研究を続けた結果、遂にエンドグリ
コセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡの完全解明に成功し、この知見を基に遺伝子工学
的手法により、高純度のエンドグリコセラミダーゼを簡
易かつ容易に製造することに成功し、本発明の完成に至
った。 【０００８】即ち、本発明の要旨は、〔１〕 配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載
したアミノ酸配列であって、かつ、エンドグリコセラミ
ダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを
含有する、単離されたＤＮＡ、 〔２〕 配列表の配列番号：２又は配列番号：４に記載
したＤＮＡ配列であって、かつ、エンドグリコセラミダ
ーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有する前記〔１〕記載のＤＮＡ、 〔３〕 配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載
したアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残
基が欠失、付加、挿入、もしくは置換がなされており、
かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ、 〔４〕 前記〔１〕記載のＤＮＡに、６×ＳＳＣ、０．
５％ ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルツ、１０
０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、６５℃で
ハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグ
リコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、 〔５〕 エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペ
プチドが、ロドコッカス由来のものである、前記〔１〕
〜〔４〕いずれか記載のＤＮＡ、 〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載のＤＮＡを含
有する組換えＤＮＡ、 〔７〕 前記〔６〕記載の組換えＤＮＡを含有するベク
ター、 〔８〕 前記〔７〕記載のベクターで形質転換されてな
る細胞、並びに 〔９〕 前記〔８〕 記載の細胞を培養し、該培養物から
エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを
採取することを特徴とする、エンドグリコセラミダーゼ
活性を有するポリペプチドの製造方法、に関する。 【０００９】 【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書において、エンドグリコセラミダーゼとは、前
記のようにスフィンゴ糖脂質の糖鎖とセラミドの間のグ
リコシド結合を加水分解し完全な形の糖鎖とセラミドを
遊離する酵素をいい、各種の生物由来のものが含まれ
る。例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｕｓ）
由来のものには基質特異性の異なる３種のエンドグリコ
セラミダーゼ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）が知られているが、
これらは好適なものの一例として含まれる。また、エン
ドグリコセラミダーゼ活性は、例えばザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６４巻、第
１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）に記載の
方法に従って測定される。エンドグリコセラミダーゼ活
性を有するポリペプチド（本明細書においては、単にエ
ンドグリコセラミダーゼと記載する場合がある）とは、
天然型のアミノ酸配列を有するエンドグリコセラミダー
ゼのみならず、前記のような方法によりエンドグリコセ
ラミダーゼ活性が認められる限り天然型のアミノ酸配列
においてアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等によりア
ミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む
意味である。また、ここで言う天然型のアミノ酸配列を
有するエンドグリコセラミダーゼとしては、例えばロド
コッカス由来のものが挙げられるが、本発明においては
これに限定されるものではなく、その他の放線菌類はも
ちろん、細菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌
類等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物、昆虫等
の生物体由来のものも含まれる。 【００１０】本明細書において、機能的に同等の活性を
有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。天
然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の
多形や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び
精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中に
アミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりう
るが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実
質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあること
が知られている。このように構造的に差異があっても、
その機能については大きな違いが認められないものを機
能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。 【００１１】人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記
のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合
は更に多種多様の変異体を作製することが可能である
が、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示
す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有する
ポリペプチドと解釈される。例えば、大腸菌で発現され
たタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多
くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により
除去されるとされているが、タンパク質の種類によって
はメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生
成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無は
タンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。また、
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中
の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチ
ドがインターロイキン２活性を保持することが知られて
いる［サイエンス(Science）、第２２４巻、第１４３１
頁（１９８４）］。 【００１２】更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を
行う際には、融合タンパク質として発現させることがし
ばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を
増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタ
ンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的の
タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド
鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和
性を持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質
の精製を容易にすることなどが行われている。 【００１３】また、遺伝子上でアミノ酸を指定するコド
ン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１
〜６種類ずつが存在することが知られている。したがっ
て、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配
列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自
然界において決して安定に存在しているものではなく、
その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上
に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を
与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、こ
の場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子
が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配
列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する
生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコード
する多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できな
い。 【００１４】更に、同じアミノ酸配列をコードする多種
類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工
学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺伝
子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質
をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドン
が、使用している宿主中では使用頻度の低いものであっ
た場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このよ
うな場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を
与えることなく、そのコドンを宿主で繁用されているも
のに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の
高発現を図ることが行われている。このように特定のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製
することが可能なことは言うまでもない。したがって、
これらの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドで
あっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードさ
れている限り、本発明に包含されるものである。更に、
目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個若しくは複数個
のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少
なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質
と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、こ
のようなポリペプチドをコードする遺伝子も、天然由来
の単離されたものであれ人為的に作製されたものであ
れ、本発明に包含される。 【００１５】一般に、機能的に同等の活性を有するポリ
ペプチドは、それをコードするＤＮＡが相同性を有する
ことが多い。したがって、本発明に用いるＤＮＡとハイ
ブリダイズすることができ、かつ、エンドグリコセラミ
ダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも
本発明に含まれる。 【００１６】以下にロドコッカス由来のエンドグリコセ
ラミダーゼＩＩを例として本発明を詳細に説明する。ま
ず、精製されたエンドグリコセラミダーゼＩＩの部分ア
ミノ酸配列に関する情報を取得する。例えば、ザ ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６
４巻、第１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）
に記載の方法で精製したエンドグリコセラミダーゼＩＩ
を直接常法に従ってエドマン分解法［ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５６巻、第
７９９０〜７９９７頁（１９８１）］によりアミノ酸配
列分析を行う。しかし、エンドグリコセラミダーゼＩＩ
においては、Ｎ末端アミノ酸配列を決定することはＮ末
端が保護されているためにできない。従って、部分アミ
ノ酸配列を決定する為には、保護基あるいは保護された
アミノ酸をはずした後アミノ酸配列分析をおこなっても
よいし、あるいはリジルエンドペプチダーゼ等の特異性
の高いタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分
解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し精製ペプ
チド断片についてアミノ酸配列分析を行ってもよい。こ
の部分アミノ酸配列の情報を基にエンドグリコセラミダ
ーゼＩＩ遺伝子をクローニングするには、一般的にＰＣ
Ｒ法あるいはハイブリダイゼーション法を用いることが
できる。 【００１７】次に、部分アミノ酸配列の情報をもとにサ
ザンハイブリダイゼーション用のプローブとして、合成
オリゴヌクレオチドをデザインする。ロドコッカスｓ
ｐ．Ｍ−７７７のゲノムＤＮＡをMlu I 、Sal I 、Pst
I 、BamH I等の制限酵素で完全消化し、アガロースゲル
電気泳動［モレキュラー クローニング ア ラボラト
リー マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory M
anua）、第２版、Ｔ．マニアティス（T ．Maniatis）他
著、第６章、第３〜２０頁、コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory
Press）社、１９８９年発行］で分離後常法に従いナイ
ロン膜にブロッティングする（モレキュラー クローニ
ング ア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マ
ニアティス他著、第９章、第３４頁、コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行）。
ハイブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行
うことが出来る。例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣはＮａ
Ｃｌ８．７７ｇ、及びクエン酸ナトリウム４．４１ｇを
１リットルの水に溶解したもの）、０．５％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×デンハルツ（Denhardt'
s、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィ
コールをそれぞれ０．１％濃度で含む）、１００μｇ／
ｍｌ鮭精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶
液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングし、³²Ｐでラ
ベルした各合成オリゴヌクレオチドを加えて６５℃で一
晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む２
×ＳＳＣで６２℃、３０分間洗浄した後、オートラジオ
グラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。検出された
バンドに相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製した
後、通常用いられる方法によってプラスミドベクターに
組込むことができる。プラスミドベクターとしては、例
えば市販のｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐ
ＴＶ１１８Ｎ（全て宝酒造社製）などが使用できるがこ
れらに限定されるものではない。 【００１８】次いで組換えプラスミドを宿主細胞に導入
し、宿主細胞を形質転換し、組換体を作製する。宿主細
胞としては、大腸菌等の細菌、枯草菌や放線菌等の原核
細胞、酵母、真菌や動物、植物由来の真核細胞のいずれ
も使用することができる。宿主細胞として大腸菌を使用
する場合、宿主大腸菌としては形質転換能を有し遺伝子
の発現能に欠陥のないものであれば野生株、変異株何れ
も使用できる。導入の方法は通常用いられる方法、例え
ばモレキュラー クローニング ア ラボラトリー マ
ニュアル 第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド
スプリングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発
行）記載の方法を用いることができる。 【００１９】このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に
導入した後、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ
１９の場合、アンピシリン耐性を有するコロニー、或い
はアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しかつ白色
を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導
入されたコロニーを選別することができる。次に、上記
集団のなかから目的のＤＮＡ断片を含むベクターを有す
るコロニーを選択する。選択の方法はベクターの種類に
よってコロニーハイブリダイゼーション（モレキュラー
クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２
版、Ｔ．マニアティス他著、第１章、第９０〜１０４
頁、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
社、１９８９年発行）、プラークハイブリダイゼーショ
ン（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第２章、
第１０８〜１１７頁、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー社、１９８９年発行）を適宜用いればよ
い。また、ＰＣＲ法（モレキュラー クローニング ア
ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティ
ス他著、第１４章、第１５〜１９頁、コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行）を
用いることもできる。 【００２０】得られたＤＮＡ断片を含むベクターが選別
できればこのベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断
片の塩基配列は通常の方法、例えばジデオキシチェーン
ターミネーター法（モレキュラー クローニング ア
ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス
他著、第１３章、第３〜１０頁、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行）により
決定する。決定された塩基配列を、エンドグリコセラミ
ダーゼＩＩの部分アミノ酸配列、分子量などと比較する
ことによって目的のエンドグリコセラミダーゼＩＩ遺伝
子の構造及びエンドグリコセラミダーゼＩＩの全アミノ
酸配列を知ることができる。 【００２１】得られたＤＮＡ断片がエンドグリコセラミ
ダーゼＩＩ遺伝子の全長を含まない場合は、得られたＤ
ＮＡ断片の一部をプローブとして用い、ロドコッカスｓ
ｐ．Ｍ−７７７のゲノムＤＮＡを他の制限酵素で消化し
たものから同様にしてハイブリダイゼーション法等によ
って欠損している部分を得た後、つなぎ合わせればよ
い。目的のエンドグリコセラミダーゼＩＩ遺伝子を含む
ベクターで宿主細胞を形質転換し組換体を作製する。次
いで該組換体の培養を通常用いられる条件で行うことに
よって、エンドグリコセラミダーゼＩＩ活性を持つポリ
ペプチドを生産させる。 【００２２】例えば、宿主細胞として大腸菌を用い、プ
ラスミドベクターとしてｐＴＶ１１８Ｎを用いた場合
は、該組換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
培地（トリプトン０．１％、酵母エキス０．０５％、Ｎ
ａＣｌ０．１％、ｐＨ７．２）に３７℃で一晩培養し、
６００ｎｍにおける吸光度が約０．５程度になったとき
にＩＰＴＧを加えてさらに３７℃で約４時間培養を行
う。菌体を回収し、溶菌、超音波処理等により菌体内に
生成蓄積された目的のエンドグリコセラミダーゼＩＩを
可溶化し、遠心分離上清としてエンドグリコセラミダー
ゼＩＩの無細胞抽出液を得ることができる。場合によっ
ては該酵素を封入体（inclusion body）の形で生産させ
ることもできる。 【００２３】発現の確認は、例えばエンドグリコセラミ
ダーゼＩＩの活性を測定することにより行うことができ
る。活性測定は、例えば組換体大腸菌の無細胞抽出液を
酵素液としてザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー、第２６４巻、第１６号、第９５１０〜９
５１９頁（１９８９）に記載の方法に従って精製アシア
ロＧＭ１を基質としパーク・ジョンソン法により測定す
ることができる。目的のエンドグリコセラミダーゼＩＩ
の発現が認められた場合はその発現の最適条件を検討す
る。 【００２４】組換体の培養物からエンドグリコセラミダ
ーゼＩＩを精製するには通常のタンパク質精製法が利用
できる。培養終了後遠心分離によって組換体を集め、こ
れを超音波処理などによって破砕し、遠心分離等によっ
て、無細胞抽出液を得る。これを、塩析や、イオン交
換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマ
トグラフィー等により精製することができる。用いる宿
主−ベクター系によっては発現産物が組換体外に分泌さ
れる場合があるが、この場合は培地中から同様に精製を
行えばよい。また、例えば宿主細胞が大腸菌の場合、発
現産物が不溶性の封入体として形成される場合がある。
この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、こ
れを超音波処理などによって破砕して、遠心分離を行う
ことにより精製封入体を含む不溶性画分を集める。封入
体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、
例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応
じてこれをイオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティ
ーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製
した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリフォール
ディング操作を行うことによって活性を保持した目的の
エンドグリコセラミダーゼＩＩ標品を得ることができ
る。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィ
ーによって精製すれば、高純度のエンドグリコセラミダ
ーゼＩＩ標品を得ることができる。 【００２５】本発明のＤＮＡは、このようなエンドグリ
コセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡを有する単離されたＤＮＡであり、具体例として
は、配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載した
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡが挙
げられる。また、配列表の配列番号：１又は配列番号：
３に記載したアミノ酸配列の一部であって、かつ、エン
ドグリコセラミダーゼ活性又はその機能的に同等の活性
を有する部分をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡも含
むものである。具体的なＤＮＡ配列の例としては、配列
表の配列番号：２又は配列番号：４に記載したＤＮＡ配
列、又はその一部であって、かつ、エンドグリコセラミ
ダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを
含有するものが挙げられる。 【００２６】本発明においては、更にこれらのＤＮＡに
ハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグ
リコセラミダーゼ活性又はその機能的に同等の活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡをも含むものであ
る。また、本発明の遺伝子はシグナル配列を含むもの
も、含まないものも含む。例えば、エンドグリコセラミ
ダーゼＩＩの全アミノ酸配列（シグナル配列を含むも
の）としては、配列番号：１に、そのＤＮＡ配列として
は配列番号：２に示される。また、エンドグリコセラミ
ダーゼＩＩの全アミノ酸配列（シグナル配列を含ないＮ
末端からの配列）としては、配列番号：３に、そのＤＮ
Ａ配列としては配列番号：４に示される。本発明のエン
ドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは、本発明の塩基配列を利用するハイブリ
ダイゼーションにより、他の細胞由来の遺伝子またはｃ
ＤＮＡから得ることもできる。この場合は、例えば以下
の方法が適用できる。 【００２７】まず他の細胞の遺伝子源から得た染色体Ｄ
ＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素により作製した
ｃＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに
接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。その
ライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー
又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し
取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を
あらかじめ³²Ｐ等で標識したプローブ（使用するプロー
ブとしては、配列表の配列番号：１あるいは配列番号：
３に記載したアミノ酸配列、またはその一部をコードす
るＤＮＡであればよく、例えば、配列表の配列番号：２
あるいは配列番号：４に記載したＤＮＡ、またはその一
部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜
上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させ
る。 【００２８】例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、５
×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間、プロー
ブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼー
ション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラ
フィー等によりプローブとハイブリッド形成したクロー
ンを同定する。この操作をハイブリット形成したクロー
ンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクロー
ンの中には、目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿
入されている。得られた遺伝子は、例えば次のように塩
基配列を決定し、得られた遺伝子が目的のエンドグリコ
セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡであるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリ
ダイゼーションにより得られたクローンの場合、組換体
が大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを
常法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入
断片を取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクロ
ーニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。
組換体がファージの場合も基本的に同様のステップによ
り塩基配列を決定することが出来る。これら培養から塩
基配列決定までの基本的な操作法については、例えば、
モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニ
ュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発
行）に記載されているとおりに行うことができる。 【００２９】得られた遺伝子が目的のエンドグリコセラ
ミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
であるかどうかは、決定された塩基配列を本発明のエン
ドグリコセラミダーゼ遺伝子及び配列表の配列番号：１
又は配列番号：３に記載したアミノ酸配列と比較してそ
の相同性から推定することができる。得られた遺伝子が
エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする領域の全てを含まないと考えられる場合に
は、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを
作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得ら
れた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブ
ラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、本発明のエンドグリコセラミダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダ
イズするエンドグリコセラミダーゼの全コード領域の塩
基配列を決定することができる。 【００３０】次に、エンドグリコセラミダーゼ活性を有
するポリペプチドを遺伝子工学的に製造する方法につい
て説明する。まず前記のような本発明のエンドグリコセ
ラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを適当な宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、
酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において
発現できるような発現ベクターに常法に従い接続して、
それを宿主細胞に導入し組換体を作製する。この組換体
を培養することにより、エンドグリコセラミダーゼ活性
を有するポリペプチドを生産させることが出来る。ま
た、真核生物由来のエンドグリコセラミダーゼの場合、
酵素自身に糖鎖を有している可能性があり、本発明のエ
ンドグリコシダーゼ遺伝子にハイブリダイズする真核生
物由来のエンドグリコシダーゼ遺伝子を用い、宿主とし
て糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば大腸菌、枯草
菌、放線菌の様な原核生物、あるいは酵母、真菌、動物
細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能力を失った
変異細胞を用いることによって糖鎖を持たないエンドグ
リコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを発現させ
ることができる。 【００３１】用いる発現系によっては、組換体中で発現
されたポリペプチドが不溶物（封入体）として蓄積され
る場合がある。この場合は、この不溶物を回収し、穏和
な条件、例えば尿素などで可溶化した後に、変性剤を除
くことによって活性を回復させることができる。発現
は、前記のような方法によりエンドグリコセラミダーゼ
活性を測定することにより確認できる。組換体からのエ
ンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを精
製するには、通常のクロマトグラフィーの手法を用いる
ことができる。例えば、培養菌体を破砕し、目的のポリ
ペプチドが可溶化していればその上清を、疎水、イオン
交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィーによって発現し
た目的のポリペプチドを得ることができる。発現産物が
不溶物として蓄積されている場合は、細胞を破砕後、沈
澱を回収し、尿素などの変性剤で可溶化する。その後、
変性剤を除きリフォールディングさせた後、前述のよう
なクロマトグラフィーにより目的の活性を持ったポリペ
プチドを得ることができる。 【００３２】このように、本発明によりエンドグリコセ
ラミダーゼＩＩの一次構造及び遺伝子構造が提供され
る。更に、エンドグリコセラミダーゼＩＩの遺伝子工学
的な製造が可能となった。本発明の遺伝子工学的製造法
を用いれば安価に高純度なエンドグリコセラミダーゼＩ
Ｉを得ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡに特
異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプロ
ーブ又はプライマーは、常法により本発明のＤＮＡの検
出や増幅等に有用である。本発明のポリペプチドに特異
的に結合する抗体又はその断片は、常法により本発明の
エンドグリコセラミダーゼＩＩの精製等において有用で
ある。 【００３３】 【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。 実施例１エンドグリコセラミダーゼＩＩ構造遺伝子のクローニン
グ （１）ゲノムＤＮＡの抽出精製 エンドグリコセラミダーゼＩＩの生産菌であるロドコッ
カスｓｐ．Ｍ−７７７を１．５％マイコロジカルペプト
ン（オクソイド社製）、０．２％ＮａＣｌ、０．１％酵
母エキス、ｐＨ７．０からなる培地９００ｍｌに接種し
３日間、２８℃で振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め１０ｍＭトリス（Tris）−Ｈ
Ｃｌ、２０ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ８．０）
４．５ｍｌに懸濁した後、凍結、融解を行った。この菌
体に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、４ｍ
ｇ／ｍｌリゾチームを含む緩衝液（ｐＨ８．０）２．５
ｍｌを加え、３０℃で１６時間保温した。さらに抽出緩
衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、０．４ｍ
ｇ／ｍｌプロティナーゼＫ、ｐＨ７．５）１０ｍｌを加
え５０℃で１６時間保温し、更に抽出緩衝液１０ｍｌを
追加し１６時間保温した。この後、室温に戻し、等容量
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム溶液を
加えて穏やかに回転攪拌を１６時間行い、３５００ｒｐ
ｍで３０分間遠心した後上層を回収した。この溶液を５
ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に対して４℃で透析を行いゲノムＤＮＡ溶液
を得た。 【００３４】（２）エンドグリコセラミダーゼＩＩの部
分アミノ酸配列の決定 まずエンドグリコセラミダーゼＩＩをザ ジャーナル
オブ バイオロジカルケミストリー、第２６４巻、第１
６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）に記載の方
法で精製した。精製エンドグリコセラミダーゼＩＩのＮ
末端アミノ酸配列はＮ末端がブロックされているためエ
ドマン分解法により決定することはできなかった。そこ
で、内部アミノ酸配列を以下のように決定した。ピリジ
ン４μｌ、４−ビニルピリジン１μｌ、トリブチルフォ
スフィン１μｌおよび蒸留水５μｌの入った試験管中に
精製エンドグリコセラミダーゼＩＩの入った小サンプル
管を挿入し真空封管した。これを１００℃、５分間加熱
することによりエンドグリコセラミダーゼＩＩ中のシス
テイン残基を気相下でピリジルエチル化した。この様に
Ｓ−ピリジルエチル化したエンドグリコセラミダーゼＩ
Ｉの１ｎｍｏｌを４Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ９．０）５０μｌに溶解し、リジルエンドペプチ
ダーゼ（ピアース社製）を８ｐｍｏｌ添加し、３７℃で
１６時間消化を行った。ついでμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８
ＳＣ２．１／１０カラム（ファルマシア社製）を用い
ＳＭＡＲＴ システム（ファルマシア社製）によって
０．０６５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む蒸留水
から０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルへの濃度グ
ラジエントの逆相クロマトグラフィーを行いペプチド断
片の精製を行った。 【００３５】得られたペプチド断片をモデル４７７気相
式ペプチドシークエンサー（アプライド バイオシステ
ム社製）を用いてエドマン分解法により分析し、部分ア
ミノ酸配列ＥＧＣ１（配列番号：５）、ＥＧＣ２（配列
番号：６）、ＥＧＣ４（配列番号：７）、ＥＧＣ５（配
列番号：８）、ＥＧＣ７（配列番号：９）、ＥＧＣ８
（配列番号：１０）、ＥＧＣ１１（配列番号：１１）を
決定した。 【００３６】（３）エンドグリコセラミダーゼＩＩ遺伝
子を含むＤＮＡ断片のクローニング 前記実施例１の（１）で調製したゲノムＤＮＡ３０μｇ
を制限酵素Mlu I 、Pst I 、Sal I の各１００ユニット
で各々３７℃で６時間消化し、１００ユニットの酵素を
追加してさらに１６時間反応させた。この反応液からＤ
ＮＡ５μｇ相当分について０．７％アガロースゲル電気
泳動を行った。泳動後、サザンブロット法（遺伝子研究
法ＩＩ、第２１８〜２２１頁、東京化学同人社発行）に
より、ナイロン膜［ハイボンドＮ+ （Hybond-N+ ）、ア
マシャム社製］にＤＮＡを転写した。このメンブレンは
同じものを２枚用意した。 【００３７】ハイブリダイゼーションのプローブとして
は、実施例１の（２）で決定した部分アミノ酸配列ＥＧ
Ｃ１から合成オリゴヌクレオチドＥＧＩＨ１（配列番
号：１２）、及びＥＧＩＨ２（配列番号：１３）をそれ
ぞれ合成し用いた。これらの合成オリゴヌクレオチドの
５ｐｍｏｌをメガラベル(MEGALABEL^TM、宝酒造社製）を
用いて³²Ｐで標識し、標識プローブとした。上記で調製
したメンブレン２枚をそれぞれ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
は、ＮａＣｌ８．７７ｇ、及びクエン酸ナトリウム４．
４１ｇを１リットルの水に溶解した物）、０．５％ＳＤ
Ｓ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハル
ツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィ
コールをそれぞれ０．１％濃度で含む）を含む溶液中、
６５℃で５時間プレハイブリダイゼーションを行った
後、標識プローブをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ／ｍｌの濃
度になるように加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。次に６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間、０．２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６２℃で３０分間洗浄
し、余分な溶液を除いた後、イメージングプレート（富
士フィルム社製）に３時間当てた後、ＢＡＳ２０００イ
メージングアナライザー（富士フィルム社製）にて検出
した。 【００３８】その結果、プローブとして用いた合成オリ
ゴヌクレオチドＥＧＩＨ１に対して、Mlu I 消化物で約
４．４ｋｂｐ、Pst I 消化物で約１．９ｋｂｐ、Sal I
消化物で約１．２ｋｂｐの位置にハイブリダイズするバ
ンドを認めた。また合成オリゴヌクレオチドＥＧＩＨ２
に対しては、合成オリゴヌクレオチドＥＧＩＨ１で検出
されたバンド以外に非特異的なバンドが多数検出され
た。以後の実験は、MluI 消化物について進めた。 【００３９】ｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素Hinc
II で消化した物にリン酸化Mlu Iリンカー（宝酒造社
製）を挿入し、ライゲーションすることによってｐＵＣ
１９にMlu I サイトを持たせたプラスミドを構築しこれ
をｐＵＣ１９Ｍとした。先に制限酵素Mlu I で消化した
ゲノムＤＮＡ２０μｇを、０．７％アガロースゲル電気
泳動を行い、上述のハイブリダイゼーションで認められ
たバンドに相当する寒天部分を切り出した。これをイー
ジートラップ（EASYTRAP^TM、宝酒造社製）を用いて抽出
精製を行い、得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９Ｍを制限
酵素Mlu I で消化したものにライゲーションし組込ん
だ。 【００４０】このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ培地の
寒天培地（Ｌ寒天培地）を含む直径８．５ｃｍの丸シャ
ーレ５枚に、１枚当り２００〜１０００個のコロニーを
形成させた。次に、これらのプレートより５００個のコ
ロニーを選択し、同じ培地プレート上においたナイロン
膜（ハイボンドＮ+ 、アマシャム社製）上に写した。３
７℃で３時間保温した後、このナイロン膜を０．５ＭＮ
ａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分
間（変性）、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
０）、３ＭＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（中
和）それぞれ処理した後、２×ＳＳＣでリンスした。こ
のナイロン膜とプローブとして合成オリゴヌクレオチド
ＥＧＩＨ１（配列番号：１２）を用い、前述と同じ条件
でハイブリダイゼーションを行ったところ、２個のポジ
ティブシグナルを示すクローンが得られた。このクロー
ンに相当する大腸菌ＪＭ１０９を１−２５、３−６と命
名した。アルカリ溶菌法（モレキュラー クローニング
ア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニア
ティス他著、第１章、第２５〜２８頁、コールド スプ
リング ハーバーラボラトリー社、１９８９年発行）に
より、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを分離精製
し、それぞれｐＥＧＣＭ１２５、ｐＥＧＣＭ３６と命名
した。これを数種類の制限酵素（Mlu I 、EcoR I、Hind
III）で消化し、電気泳動により切断パターンを解析し
た。その結果、ｐＥＧＣＭ１２５はMlu I 断片が２つ挿
入されたものであることが判った。従って以降の解析は
ｐＥＧＣＭ３６を用いて行った。 【００４１】ｐＥＧＣＭ３６を２４種の制限酵素で消化
し電気泳動により切断パターンを得るとともにサザンブ
ロット法により前述のようにナイロン膜（ハイボンドＮ
+ 、アマシャム社製）に転写し、プローブとして合成ヌ
クレオチドＥＧＩＨ１（配列番号：１２）を用い、前述
と同じ条件でハイブリダイゼーションを行った。プロー
ブとハイブリダイズしたバンドのうち、制限酵素Hinc I
I 消化により得られた約１ｋｂｐＤＮＡ断片と制限酵素
Kpn I 消化により得られた約１．１ｋｂｐＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動により精製し、それぞれをｐＵ
Ｃ１９のHinc II サイトあるいはKpn I サイトにそれぞ
れサブクローニングした。得られたプラスミドをそれぞ
れｐＭ３６ＨあるいはｐＭ３６Ｋとした。これらのプラ
スミドをさらに適当な制限酵素（Pst I 、Sph I 、Sma
I ／Nae I ）で消化し、ＤＮＡライゲーション キット
（DNA Ligation Kit、宝酒造社製）でセルフライゲーシ
ョンを行って各種の欠失変異体を作製した。 【００４２】これらの欠失変異体及びｐＭ３６Ｈ、ｐＭ
３６Ｋ、ｐＥＧＣＭ３６をそれぞれ末端からジデオキシ
チェーン ターミネーター法（モレキュラー クローニ
ングア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニ
アティス他著、第１３章、第３〜１０頁、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発
行）によって塩基配列を決定した結果、ｐＭ３６Ｈ挿入
断片と、ｐＭ３６Ｋ挿入断片は重なり合って、ｐＥＧＣ
Ｍ３６挿入断片の末端に位置することが判った。また部
分アミノ酸配列ＥＧＣ１（配列番号：５）、ＥＧＣ２
（配列番号：６）、ＥＧＣ４（配列番号：７）、ＥＧＣ
５（配列番号：８）、ＥＧＣ８（配列番号：１０）、Ｅ
ＧＣ１１（配列番号：１１）をコードする塩基配列が同
一のフレーム上に含まれていることが明かとなり、さら
にその上流にはシグナルペプチド様のものをコードする
配列が存在することが判った。 【００４３】しかし、ここで決定した塩基配列には部分
アミノ酸配列ＥＧＣ７（配列番号：９）をコードする塩
基配列は存在せず、また部分アミノ酸配列ＥＧＣ１、Ｅ
ＧＣ２、ＥＧＣ４、ＥＧＣ５、ＥＧＣ８、ＥＧＣ１１を
コードするフレームの下流域には停止コドンは見いだせ
なかった。 【００４４】（４）エンドグリコセラミダーゼＩＩのＣ
末端領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片のクロー
ニング エンドグリコセラミダーゼＩＩ遺伝子の全長をカバーす
るために、ｐＥＧＣＭ３６では欠損していたＣ末端付近
をコードするＤＮＡ断片をさらに上記実施例１の（３）
と同様にしてサザンハイブリダイゼーション法によりス
クリーニングした。プローブは最もＣ末端寄りのＤＮＡ
配列を含むｐＭ３６ＫのHinc II 消化断片約２００ｂｐ
を用いた。すなわちｐＭ３６ＫをHinc II で消化し、１
％アガロースゲル電気泳動を行い、遊離する約２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を切り出した。このHinc II 消化断片を
スピンバインド（SpinBind^TM、宝酒造社製）を用いて抽
出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をＢｃａＢＥＳＴ^TM
ラベリング キット(BcaBEST^TM Labeling Kit 、宝酒
造社製）を用いて³²Ｐで標識し、標識プローブとした。
上記実施例１の（１）で調製したゲノムＤＮＡ５０μｇ
を制限酵素BamHI、Pst I 、Hinc II の各１８０ユニッ
トを用い各々３７℃で６時間消化した。この反応液から
ＤＮＡ１０μｇ相当を用い上記実施例１の（３）と同様
に調製したメンブレンを６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、Ｎ
ａＣｌ８．７７ｇ、及びクエン酸ナトリウム４．４１ｇ
を１リットルの水に溶解した物）、０．５％ＳＤＳ、１
００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウ
シ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコール
をそれぞれ０．１％濃度で含む）を含む溶液中、６８℃
で３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識
プローブを０．１ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるように加
え、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次
に６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ中、室温で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ中、７０℃で３０分間洗浄し、余分な溶液を除
いた後、イメージングプレート（富士フィルム社製）に
１０分間当てた後、ＢＡＳ２００イメージングアナライ
ザー（富士フィルム社製）にて検出した。 【００４５】その結果、BamH I消化物で約２．７ｋｂ
ｐ、Pst I 消化物で約１．３ｋｂｐ、Hinc II 消化物で
約０．３ｋｂｐの位置に、プローブとハイブリダイズす
るバンドを認めた。上記実施例１の（３）と同様に、Ba
mH I消化したゲノムＤＮＡ２０μｇを０．７％アガロー
スゲル電気泳動し、上述のハイブリダイゼーションで認
められた約２．７ｋｂｐの位置のバンドに相当する寒天
部分を切り出した。これをイージートラップ（宝酒造社
製）を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をｐ
ＵＣ１９のBamH Iサイトに挿入した。 【００４６】このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９で形質
転換した後、一晩培養し、アンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌを含むＬ寒天培地を流した直径８．５ｃｍの丸シャー
レ１０枚に、１枚当たり２００〜５００個のコロニーを
形成させ、その内５００コロニーを選択し同じ培地プレ
ート上においたナイロン膜（ハイボンドＮ+ 、アマシャ
ム社製）上に写した。３７℃で１０時間保温した後、こ
のナイロン膜を０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌの
溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、３ＭＮａＣｌの溶液に
浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣ
でリンスした。このナイロン膜を前述と同じ様にｐＭ３
６Ｋの約２００ｂｐのHinc II 断片をプローブとして用
い、前述と同じ条件でハイブリダイゼーションを行った
ところ、１個のポジティブシグナルを示すクローンが得
られた。アルカリ溶菌法により、得られたクローンのプ
ラスミドＤＮＡを調製しｐＥＧＣＢ２０と命名した。 【００４７】これを数種類の制限酵素（BamH I、EcoR
I、Hinc II 、Hind III、Kpn I 、Pst I 、Sac I 、Sal
I 、Sma I 、Sph I 、Xba I ）で消化し電気泳動によ
り切断パターンを得るとともにサザンブロット法により
前述のようにナイロン膜（ハイボンドＮ+ 、アマシャム
社製）に転写し、ｐＭ３６Ｋの約２００ｂｐのHinc II
断片をプローブとして用い、前述と同じ条件でハイブリ
ダイゼーションを行った。プローブとハイブリダイズし
たバンドのうち、制限酵素Sph I 消化により得られた１
ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精
製し、ｐＵＣ１９のSph I サイトにサブクローニング
し、得られたプラスミドをｐＢＳ１Ｋとした。このプラ
スミドをさらに適当な制限酵素（Mlu I 、Nae I 、Sph
I ）で消化し、サブクローニングを行った。 【００４８】これらのサブクローン及びｐＢＳ１Ｋをそ
れぞれ末端からジデオキシ法によって塩基配列を決定し
た結果、ｐＭ３６Ｋの約２００ｂｐのHinc II 断片の塩
基配列が現われ、さらに部分アミノ酸配列ＥＧＣ７（配
列番号：９）をコードする塩基配列も含まれていること
が明かとなった。さらに、上記実施例１の（３）で決定
したｐＥＧＣＭ３６のMlu I 挿入断片とｐＥＧＣＢ２０
のBamH I挿入断片に渡って、１４７３ｂｐの読み取り枠
（ＯＲＦ）が見いだされた。このＯＲＦに、上記実施例
１の（２）で決定したエンドグリコセラミダーゼＩＩの
アミノ酸配列分析により得られた配列が全て見出され
た。 【００４９】以上の結果より、エンドグリコセラミダー
ゼＩＩ遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。
その結果を図１に示す。すなわち図１はｐＭ３６Ｈ、ｐ
Ｍ３６Ｋ、ｐＢＳ１Ｋの挿入断片の制限酵素地図と各挿
入断片とエンドグリコセラミダーゼＩＩ遺伝子の位置を
示した図である。またエンドグリコセラミダーゼＩＩ遺
伝子のＯＲＦの塩基配列の１例を配列表の配列番号：２
に示す。またエンドグリコセラミダーゼＩＩ遺伝子がコ
ードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番
号：１に示す。またこれら配列表からもわかるようにエ
ンドグリコセラミダーゼ合成の開始コドンに対応する遺
伝子上のヌクレオチド配列はＧＴＧである。 【００５０】実施例２エンドグリコセラミダーゼＩＩを発現するプラスミドの
構築 エンドグリコセラミダーゼＩＩの大腸菌での発現プラス
ミドの構築は実施例１で得られたｐＥＧＣＭ３６とｐＥ
ＧＣＢ２０上に分割されて存在するエンドグリコセラミ
ダーゼＩＩ構造遺伝子を取り出し、大腸菌での発現に適
したプラスミドにつなぎ合わせ組込むことにより行っ
た。他の宿主細胞の場合も原理的には同様であり、選択
された宿主細胞での発現に適したプラスミドにｐＥＧＣ
Ｍ３６とｐＥＧＣＢ２０上に分割されて存在するエンド
グリコセラミダーゼＩＩ構造遺伝子をつなぎ合わせて組
込むことにより当該宿主細胞でのエンドグリコセラミダ
ーゼＩＩ発現プラスミドを構築することができる。 【００５１】まずｐＥＧＣＭ３６を制限酵素Acc III で
消化した後、ＤＮＡ ブランティング キット（DNA Bl
unting Kit、宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更に
制限酵素Mlu I で消化した後、アガロースゲル電気泳動
を行い、ゲルより抽出精製を行うことによって約１ｋｂ
ｐのフラグメントＥＧＣＭ３６−Acc III ／Mlu I を調
製した。また実施例１において、ｐＥＧＣＢ２０からサ
ブクローニングによって得たｐＢＳ１Ｋを制限酵素Mlu
I 、Sph I で消化し、アガロース電気泳動を行い、約５
００ｂｐのフラグメントＢＳ１Ｋ−Mlu I ／Sph I を切
り出し抽出した。これらのフラグメントＥＧＣＭ３６−
Acc III ／Mlu I 及びＢＳ１Ｋ−Mlu I／Sph I をｐＴ
Ｖ１１８Ｎ（宝酒造社製）を制限酵素EcoR Iで消化した
後平滑末端化し、さらに制限酵素Sph I で消化したもの
に、同時にライゲーションして組込むことによってｐＴ
ＥＧ２を得た（図２）。 【００５２】このプラスミドには、エンドグリコセラミ
ダーゼＩＩのシグナル様の配列を除いたＮ末端の上流に
ｌａｃＺα由来のペプチドを含む６アミノ酸残基（配列
番号：１４）をコードする配列が含まれており、ｌａｃ
ＺのＳＤ配列及びその開始コドンを利用してｌａｃＺα
との融合体としてのエンドグリコセラミダーゼＩＩの誘
導発現が期待される。また同様にフラグメントＥＧＣＭ
３６−Acc III ／Mlu I 及びＢＳ１Ｋ−MluI ／Sph I
をｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）を制限酵素Sal I で消
化した後、平滑末端化し、さらに制限酵素Sph I で消化
したものに、同時にライゲーションして組込むことによ
ってプラスミドｐＴＥＧ３を得た（図３）。このプラス
ミドには、エンドグリコセラミダーゼＩＩのシグナル様
の配列を除いたＮ末端の上流にｌａｃＺα由来のペプチ
ドを含む１８アミノ酸残基（配列番号：１５）をコード
する配列が含まれている。 【００５３】さらにシグナル様の配列も含めた発現用の
プラスミドを構築した。実施例１で得られたｐＭ３６Ｈ
を制限酵素Acc III 及び制限酵素PmaC Iで消化した後ア
ガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより抽出精製を行う
ことによって約９０ｂｐのフラグメントＭ３６Ｈ−Acc
III ／PmaC Iを調製した。また、前記のｐＴＥＧ２を制
限酵素Acc III 及び制限酵素Hind IIIで消化した後アガ
ロースゲル電気泳動を行い、ゲルより抽出精製を行うこ
とによって約１．６ｋｂｐのフラグメントＴＥＧ２−Ac
c III ／Hind IIIを調製した。これらのフラグメントＭ
３６Ｈ−Acc III ／PmaC I及びＴＥＧ２−Acc III ／Hi
nd IIIをｐＴＶ１１８Ｎを制限酵素Pst I で消化した後
平滑末端化し、さらに制限酵素HindIIIで消化したもの
に、同時にライゲーションして組込むことによってｐＴ
ＥＧＰ１を得た（図４）。 【００５４】これらのプラスミドを大腸菌宿主に形質転
換し組換体を得た。ｐＴＥＧ２、ｐＴＥＧ３、ｐＴＥＧ
Ｐ１でそれぞれ形質転換した大腸菌ＪＭ１０９をそれぞ
れEscherichia coli JM109／pTEG2 、Escherichia coli
JM109／pTEG3 、Escherichia coli JM109／pTEGP1と表
示する。このうち、Escherichia coli JM109／pTEGP1
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭＢＰ−５５３０として寄託されている。 【００５５】実施例３組換体エンドグリコセラミダーゼＩＩの大腸菌における
発現 実施例２で得られたEscherichia coli JM109／pTEG2 、
Escherichia coli JM109／pTEG3 、Escherichia coli J
M109／pTEGP1をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬ培地（０．１％トリプトン、０．０５％酵母
エキス、０．１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）５ｍｌに接種
して３７℃で一晩振とう培養し、その１００μｌを新た
に同培地１２０ｍｌに接種した。３７℃で一晩振とう培
養し、濁度（６００ｎｍの吸光度）がおよそ０．５の段
階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に、３７℃で
４時間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心
分離し、菌体を集め、０．５ｍＭフッ化４−（２−アミ
ノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩を含む１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌに懸濁して超
音波処理を行い菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心
分離して上清を取り粗酵素液とした。 【００５６】この粗酵素液のエンドグリコセラミダーゼ
ＩＩ活性をザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミ
ストリー、第２６４巻、第１６号、第９５１０〜９５１
９頁（１９８９）に記載の方法に従って、精製アシアロ
ＧＭ１を基質としパーク・ジョンソン法により測定し
た。すなわち、５０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．５）中に５０ｎｍｏｌの精製アシアロＧＭ
１、１０μｇウシ血清アルブミン、適当量の酵素および
０．４％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００を溶解した
反応混合液を３７℃にて１５分間インキュベートした。
反応は２５０μｌのカーボネート−シアナイド溶液（ｐ
Ｈ１１）を添加して停止させた。ついで、生成した還元
糖をパーク・ジョンソン法［ジャーナル オブ バイオ
ロジカルケミストリー、第１８１巻、第１４９〜１５１
頁（１９４９）］で測定した。コントロールとしては、
基質溶液を３７℃で１５分間インキュベートした後アル
カリ溶液を添加し、その後に酵素を添加したものを用い
た。本酵素の１ユニットは、上記の条件下で１分間当た
り１μモルの精製アシアロＧＭ１の加水分解を触媒する
に要する酵素量と定義する。 【００５７】その結果、これらの抽出物中の活性はEsch
erichia coli JM109／pTEG2 は約１９ｍＵ／ｍｌ、Esch
erichia coli JM109／pTEG3 は約２４４ｍＵ／ｍｌ、Es
cherichia coli JM109／pTEGP1は約１５ｍＵ／ｍｌであ
ることがわかった。すなわち、本発明の遺伝子をもつEs
cherichia coli JM109／pTEG2 の培養液１リットルから
約０．５Ｕの、Escherichia coli JM109／pTEG3 の培養
液１リットルから約６．１Ｕの、Escherichia coli JM1
09／pTEGP1の培養液１リットルから約０．４Ｕの組換体
エンドグリコセラミダーゼＩＩが得られることがわかっ
た。 【００５８】 【発明の効果】本発明によりエンドグリコセラミダーゼ
ＩＩのアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとな
り、これによりエンドグリコセラミダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することが可能
となった。また、該ＤＮＡを用いるエンドグリコセラミ
ダーゼ活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝
子工学的製造方法が提供される。 【００５９】 【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：490 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Arg Arg Thr Arg Leu Val Ser Leu Ile Val Thr Gly Ser Leu 1 5 10 15 Val Phe Gly Gly Gly Val Ala Ala Ala Gln Ser Ser Leu Ala Ala 20 25 30 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Leu Thr Pro Ser Tyr 35 40 45 Leu Lys Asp Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe Asn 50 55 60 Thr Ala Ser Ser Ala Lys Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln Phe 65 70 75 Thr Glu Ala Asp Leu Ala Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr Asn 80 85 90 Phe Val Arg Phe Leu Ile Ser Trp Arg Ser Val Glu Pro Ala Pro 95 100 105 Gly Val Tyr Asp Gln Gln Tyr Leu Asp Arg Val Glu Asp Arg Val 110 115 120 Gly Trp Tyr Ala Glu Arg Gly Tyr Lys Val Met Leu Asp Met His 125 130 135 Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr Pro Glu Gly Asn Ser Gly 140 145 150 Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly Ala Pro Ala Trp Ala Thr 155 160 165 Tyr Met Asp Gly Leu Pro Val Glu Pro Gln Pro Arg Trp Glu Leu 170 175 180 Tyr Tyr Ile Gln Pro Gly Val Met Arg Ala Phe Asp Asn Phe Trp 185 190 195 Asn Thr Thr Gly Lys His Pro Glu Leu Val Glu His Tyr Ala Lys 200 205 210 Ala Trp Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala Val 215 220 225 Val Ala Tyr Asp Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu Gln 230 235 240 Gly Pro Ala Phe Glu Ala Gly Pro Leu Ala Ala Met Tyr Gln Arg 245 250 255 Thr Thr Asp Ala Ile Arg Gln Val Asp Gln Asp Thr Trp Val Cys 260 265 270 Val Ala Pro Gln Ala Ile Gly Val Asn Gln Gly Leu Pro Ser Gly 275 280 285 Leu Thr Lys Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile Ala 290 295 300 Tyr Cys Pro His Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly Asp Gly 305 310 315 His Glu Gly Leu Ala Arg Thr Leu Thr Asp Val Thr Ile Asp Ala 320 325 330 Trp Arg Ala Asn Thr Ala His Thr Ala Arg Val Leu Gly Asp Val 335 340 345 Pro Ile Ile Leu Gly Glu Phe Gly Leu Asp Thr Thr Leu Pro Gly 350 355 360 Ala Arg Asp Tyr Ile Glu Arg Val Tyr Gly Thr Ala Arg Glu Met 365 370 375 Gly Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ser Ser Asp Pro Gly Pro Trp Gly 380 385 390 Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Thr Gln Thr Leu Leu Val Asp Thr Leu 395 400 405 Asn Lys Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr Pro Thr Glu Trp 410 415 420 Ser Ser Thr Ser Asp Arg Leu Gln Leu Thr Ile Glu Pro Asp Ala 425 430 435 Ala Ile Thr Ala Pro Thr Glu Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Gly Phe 440 445 450 Pro Gly Asp Val His Val Glu Gly Ala Asp Val Val Gly Trp Asp 455 460 465 Arg Gln Ser Arg Leu Leu Thr Val Arg Thr Pro Ala Asp Ser Gly 470 475 480 Asn Val Thr Val Thr Val Thr Pro Ala Ala 485 490 【００６０】配列番号：2 配列の長さ：1473 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： GTGCGTCGCA CCCGGCTCGT ATCGCTGATC GTGACAGGTT CGCTGGTGTT CGGCGGCGGC 60 GTTGCCGCCG CTCAGAGCAG CTTGGCCGCA TCCGGAAGCG GAAGTGGCAG TGGTACCGCG 120 CTGACGCCGT CCTACCTGAA GGACGATGAC GGCCGCTCAC TGATCCTGCG CGGGTTCAAC 180 ACGGCATCGA GCGCGAAGAG CGCGCCGGAC GGCATGCCGC AGTTCACCGA GGCGGACCTG 240 GCGCGCGAGT ATGCAGACAT GGGAACCAAC TTCGTTCGGT TCCTCATCTC GTGGCGGTCG 300 GTCGAACCAG CACCGGGCGT GTACGACCAG CAGTATCTGG ACCGTGTCGA AGATCGGGTC 360 GGCTGGTACG CCGAGCGCGG CTACAAGGTG ATGCTCGACA TGCACCAGGA CGTGTACTCC 420 GGCGCGATCA CCCCGGAGGG CAACAGCGGC AACGGTGCCG GCGCCATCGG CAACGGCGCA 480 CCGGCCTGGG CGACCTACAT GGACGGCCTT CCGGTCGAGC CGCAGCCCCG GTGGGAGCTG 540 TACTACATCC AGCCCGGCGT GATGCGCGCG TTCGACAACT TCTGGAACAC CACCGGCAAG 600 CACCCCGAAC TCGTCGAGCA CTACGCGAAA GCGTGGCGGG CGGTCGCCGA CCGATTCGCC 660 GACAACGACG CCGTCGTGGC CTACGACCTG ATGAACGAGC CGTTCGGAGG ATCCCTGCAG 720 GGACCGGCGT TCGAGGCAGG GCCGCTCGCC GCGATGTACC AGCGCACCAC CGACGCCATC 780 CGGCAGGTAG ACCAGGACAC CTGGGTCTGC GTGGCCCCGC AGGCGATCGG CGTCAACCAG 840 GGTCTCCCCA GCGGGCTCAC CAAGATCGAC GACCCTCGTG CGGGTCAACA GCGCATCGCG 900 TACTGCCCGC ACCTCTACCC ACTGCCGCTG GATATCGGTG ACGGCCACGA GGGCCTGGCC 960 CGGACGCTCA CCGACGTGAC CATCGACGCC TGGCGTGCCA ACACCGCCCA CACCGCCCGT 1020 GTGCTGGGTG ACGTGCCCAT CATCCTCGGC GAGTTCGGCC TGGACACAAC GCTGCCCGGG 1080 GCCCGGGATT ACATCGAACG CGTCTACGGG ACCGCGCGAG AGATGGGGGC CGGAGTCTCG 1140 TACTGGTCCA GCGATCCCGG CCCCTGGGGC CCGTACCTGC CTGACGGCAC GCAGACGCTG 1200 CTCGTCGACA CCCTGAACAA GCCGTACCCC CGCGCAGTGG CCGGCACACC CACCGAGTGG 1260 TCGTCGACCT CCGATCGCCT CCAATTGACG ATCGAGCCGG ACGCCGCGAT CACCGCTCCC 1320 ACCGAGATCT ACCTCCCGGA GGCAGGATTC CCGGGCGACG TCCACGTCGA AGGCGCCGAC 1380 GTCGTGGGGT GGGATCGGCA GAGTCGACTG CTCACGGTGC GCACTCCGGC CGACTCGGGC 1440 AACGTGACCG TGACGGTCAC TCCGGCAGCC TGA 1473 【００６１】配列番号：3 配列の長さ：461 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Leu Thr Pro Ser 1 5 10 15 Tyr Leu Lys Asp Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe 20 25 30 Asn Thr Ala Ser Ser Ala Lys Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln 35 40 45 Phe Thr Glu Ala Asp Leu Ala Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr 50 55 60 Asn Phe Val Arg Phe Leu Ile Ser Trp Arg Ser Val Glu Pro Ala 65 70 75 Pro Gly Val Tyr Asp Gln Gln Tyr Leu Asp Arg Val Glu Asp Arg 80 85 90 Val Gly Trp Tyr Ala Glu Arg Gly Tyr Lys Val Met Leu Asp Met 95 100 105 His Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr Pro Glu Gly Asn Ser 110 115 120 Gly Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly Ala Pro Ala Trp Ala 125 130 135 Thr Tyr Met Asp Gly Leu Pro Val Glu Pro Gln Pro Arg Trp Glu 140 145 150 Leu Tyr Tyr Ile Gln Pro Gly Val Met Arg Ala Phe Asp Asn Phe 155 160 165 Trp Asn Thr Thr Gly Lys His Pro Glu Leu Val Glu His Tyr Ala 170 175 180 Lys Ala Trp Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala 185 190 195 Val Val Ala Tyr Asp Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu 200 205 210 Gln Gly Pro Ala Phe Glu Ala Gly Pro Leu Ala Ala Met Tyr Gln 215 220 225 Arg Thr Thr Asp Ala Ile Arg Gln Val Asp Gln Asp Thr Trp Val 230 235 240 Cys Val Ala Pro Gln Ala Ile Gly Val Asn Gln Gly Leu Pro Ser 245 250 255 Gly Leu Thr Lys Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile 260 265 270 Ala Tyr Cys Pro His Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly Asp 275 280 285 Gly His Glu Gly Leu Ala Arg Thr Leu Thr Asp Val Thr Ile Asp 290 295 300 Ala Trp Arg Ala Asn Thr Ala His Thr Ala Arg Val Leu Gly Asp 305 310 315 Val Pro Ile Ile Leu Gly Glu Phe Gly Leu Asp Thr Thr Leu Pro 320 325 330 Gly Ala Arg Asp Tyr Ile Glu Arg Val Tyr Gly Thr Ala Arg Glu 335 340 345 Met Gly Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ser Ser Asp Pro Gly Pro Trp 350 355 360 Gly Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Thr Gln Thr Leu Leu Val Asp Thr 365 370 375 Leu Asn Lys Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr Pro Thr Glu 380 385 390 Trp Ser Ser Thr Ser Asp Arg Leu Gln Leu Thr Ile Glu Pro Asp 395 400 405 Ala Ala Ile Thr Ala Pro Thr Glu Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Gly 410 415 420 Phe Pro Gly Asp Val His Val Glu Gly Ala Asp Val Val Gly Trp 425 430 435 Asp Arg Gln Ser Arg Leu Leu Thr Val Arg Thr Pro Ala Asp Ser 440 445 450 Gly Asn Val Thr Val Thr Val Thr Pro Ala Ala 455 460 【００６２】配列番号：4 配列の長さ：1386 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： GCATCCGGAA GCGGAAGTGG CAGTGGTACC GCGCTGACGC CGTCCTACCT GAAGGACGAT 60 GACGGCCGCT CACTGATCCT GCGCGGGTTC AACACGGCAT CGAGCGCGAA GAGCGCGCCG 120 GACGGCATGC CGCAGTTCAC CGAGGCGGAC CTGGCGCGCG AGTATGCAGA CATGGGAACC 180 AACTTCGTTC GGTTCCTCAT CTCGTGGCGG TCGGTCGAAC CAGCACCGGG CGTGTACGAC 240 CAGCAGTATC TGGACCGTGT CGAAGATCGG GTCGGCTGGT ACGCCGAGCG CGGCTACAAG 300 GTGATGCTCG ACATGCACCA GGACGTGTAC TCCGGCGCGA TCACCCCGGA GGGCAACAGC 360 GGCAACGGTG CCGGCGCCAT CGGCAACGGC GCACCGGCCT GGGCGACCTA CATGGACGGC 420 CTTCCGGTCG AGCCGCAGCC CCGGTGGGAG CTGTACTACA TCCAGCCCGG CGTGATGCGC 480 GCGTTCGACA ACTTCTGGAA CACCACCGGC AAGCACCCCG AACTCGTCGA GCACTACGCG 540 AAAGCGTGGC GGGCGGTCGC CGACCGATTC GCCGACAACG ACGCCGTCGT GGCCTACGAC 600 CTGATGAACG AGCCGTTCGG AGGATCCCTG CAGGGACCGG CGTTCGAGGC AGGGCCGCTC 660 GCCGCGATGT ACCAGCGCAC CACCGACGCC ATCCGGCAGG TAGACCAGGA CACCTGGGTC 720 TGCGTGGCCC CGCAGGCGAT CGGCGTCAAC CAGGGTCTCC CCAGCGGGCT CACCAAGATC 780 GACGACCCTC GTGCGGGTCA ACAGCGCATC GCGTACTGCC CGCACCTCTA CCCACTGCCG 840 CTGGATATCG GTGACGGCCA CGAGGGCCTG GCCCGGACGC TCACCGACGT GACCATCGAC 900 GCCTGGCGTG CCAACACCGC CCACACCGCC CGTGTGCTGG GTGACGTGCC CATCATCCTC 960 GGCGAGTTCG GCCTGGACAC AACGCTGCCC GGGGCCCGGG ATTACATCGA ACGCGTCTAC 1020 GGGACCGCGC GAGAGATGGG GGCCGGAGTC TCGTACTGGT CCAGCGATCC CGGCCCCTGG 1080 GGCCCGTACC TGCCTGACGG CACGCAGACG CTGCTCGTCG ACACCCTGAA CAAGCCGTAC 1140 CCCCGCGCAG TGGCCGGCAC ACCCACCGAG TGGTCGTCGA CCTCCGATCG CCTCCAATTG 1200 ACGATCGAGC CGGACGCCGC GATCACCGCT CCCACCGAGA TCTACCTCCC GGAGGCAGGA 1260 TTCCCGGGCG ACGTCCACGT CGAAGGCGCC GACGTCGTGG GGTGGGATCG GCAGAGTCGA 1320 CTGCTCACGG TGCGCACTCC GGCCGACTCG GGCAACGTGA CCGTGACGGT CACTCCGGCA 1380 GCCTGA 1386 【００６３】配列番号：5 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 配列： Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Asp Leu Ala 1 5 10 15 Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr Asn Phe 20 25 【００６４】配列番号：6 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 配列： Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile Ala Tyr Pro Pro 1 5 10 15 His Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly 20 25 【００６５】配列番号：7 配列の長さ：31 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 配列： Ala Trp Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala Val 1 5 10 15 Val Ala Tyr Xaa Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu Gln 20 25 30 Gly 【００６６】配列番号：8 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 配列： Val Met Leu Asp Met His Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr 1 5 10 15 Pro Glu Gly Asn Ser Gly Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly 20 25 30 【００６７】配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 配列： Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr Pro Thr Glu Trp Ser Ser 1 5 10 15 Thr Xaa Asp Arg Leu Gln 20 【００６８】配列番号：10 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 【００６９】配列番号：11 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：内部フラグメント 配列： Asp Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe Asn Thr Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ala Lys 【００７０】配列番号：12 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AAGTCSGCCC CCGACGGYAT GCCSCAGTTC ACSGARGCCG ACCTCGC 47 【００７１】配列番号：13 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCACCGAGG CCGACCTSGC SCGSGARTAY GCCGACATGG GYACCAACTT 50 【００７２】配列番号：14 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 【００７３】配列番号：15 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ala Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Glu Asp Pro Leu 1 5 10 15 Glu Ser Thr

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｐＭ３６Ｈ、ｐＭ３６Ｋ、ｐＢＳ１Ｋ
の挿入断片の制限酵素地図と各挿入断片とエンドグリコ
セラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）ＩＩ遺伝子の位置を示し
た図である。

【図２】図２は、プラスミドｐＴＥＧ２の構築図を示
す。

【図３】図３は、プラスミドｐＴＥＧ３の構築図を示
す。

【図４】図４は、プラスミドｐＴＥＧＰ１の構築図を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 佐野 睦 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 伊東 信 福岡県福岡市西区愛宕浜４丁目34−１ (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．264，Ｎｏ．16，ｐｐ. 9510−9519（1989) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖ ｏｌ．181，Ｎｏ．３，ｐｐ．563−570 （1989) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏ ｌ．31，Ｎｏ．37，ｐｐ．9000−9007 （1992) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．269，Ｎｏ．23，ｐｐ. 16203−16211（Ｊｕｎｅ 10， 1994) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号：１又は配列番号：３
   に記載したアミノ酸配列であって、かつ、エンドグリコ
   セラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡを含有する、単離されたＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号：２又は配列番号：４
   に記載したＤＮＡ配列であって、かつ、エンドグリコセ
   ラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａを含有する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号：１又は配列番号：３
   に記載したアミノ酸配列において、１個又は数個のアミ
   ノ酸残基が欠失、付加、挿入、もしくは置換がなされて
   おり、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡに、６×ＳＳＣ、
   ０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルツ、
   １００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、６５
   ℃でハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エン
   ドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコー
   ドするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 エンドグリコセラミダーゼ活性を有する
   ポリペプチドが、ロドコッカス由来のものである、請求
   項１〜４いずれか記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡを含
   有する組換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えＤＮＡを含有する
   ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターで形質転換され
   てなる細胞。
9. 【請求項９】 請求項８記載の細胞を培養し、該培養物
   からエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチ
   ドを採取することを特徴とする、エンドグリコセラミダ
   ーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。