JP4052605B2 - α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は糖鎖及び糖タンパク質の構造や機能の解析等の糖鎖工学に有用なα−１，３／４−フコシダーゼをコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列に関する。本発明は、また、該遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた組換体を用いるα−１，３／４−フコシダーゼの工業的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−フコースは糖タンパク質や糖脂質、グリコサミノグリカンと言ったいわゆる複合糖質の構成糖として、主に糖鎖の非還元末端に存在している。α−１，３／４結合したフコースはルイス式血液型抗原や腫瘍関連抗原、あるいは細胞接着因子であるセレクチンのリガンドに含まれており、これらの糖鎖構造の解析あるいは機能の解析のためにはα−１，３／４−フコシダーゼが極めて有用な試薬として用いられている。
α−１，３／４−フコシダーゼとしてはアーモンド由来のα−フコシダーゼＩ〔アーカイブズ オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジクス（Archieves of Biochemistry and Biophysics) 、第１８１巻、第３５３〜３５８頁（１９７７）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological chemistry)、第２５７巻、第８２０５〜８２１０頁（１９８２）〕及びα−フコシダーゼIII 〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６５巻、第１６４７２〜１６４７７頁（１９９０）〕、及びストレプトマイセス（Streptomyces) 由来のもの〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）〕が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アーモンドミールあるいはアーモンドエムルシンからα−フコシダーゼを取得する方法は、アーモンド中に多種多様な糖加水分解酵素が混在するためそれらと目的のα−フコシダーゼを完全に分離し、高度に精製するのは非常に困難であった。またストレプトマイセス属放線菌を培養してα−１，３／４−フコシダーゼを取得する方法の場合は、酵素の生産を誘導するために培養時に高価なＬ−フコースを添加する必要がある上に、同時にプロテアーゼ、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼなどの酵素が生産され、これらの酵素と分離精製することが困難であった。したがって、より安価に高純度なα−１，３／４−フコシダーゼを製造する方法が求められていた。従来α−１，３／４−フコシダーゼをアーモンドやストレプトマイセス属放線菌から精製する方法に関しては前述のように報告があるが、α−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列や遺伝子構造は不明である。
また、α−１，３／４−フコシダーゼの工業的に有利な製造方法についても開示されていない。したがって本酵素の遺伝子が明らかとなれば、遺伝子工学的に単一で高純度品の酵素製造が可能となり、糖鎖及び糖タンパク質の構造や機能の解析等の糖鎖工学に有用な酵素を製造することも可能になる。また、本酵素のＤＮＡ配列により本酵素とは配列が異なるが同様の酵素活性を持つと期待される本酵素類似の遺伝子の探索も可能となる。本酵素のＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は本酵素の抗体を作製することに用いるのにも有用である。
本発明の目的は、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子、そのＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸配列を提供し、α−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は配列表の配列番号２に記載したＤＮＡ配列からなるα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子に関する。第２の発明は、上記第１の発明の遺伝子をプローブとし、６×ＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃、２０時間のハイブリダイゼーションを行って得られるα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子に関する。本発明の第３の発明は、α−１，３／４−フコシダーゼの工業的な製造方法に関する。特に、前記第１又は第２の発明の該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた組換体を培養し、該培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを採取することを特徴とするα−１，３／４−フコシダーゼの製造方法を提供する。
【０００５】
本発明者らは、該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を取得するために、ストレプトマイセスｓｐ １４２よりα−１，３／４−フコシダーゼを高度に精製し、Ｎ末端アミノ酸配列、及び部分アミノ酸配列を決定した。次にこれらのアミノ酸配列の情報を基に常法に従い合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ったが、該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を取得できなかった。また、該プライマーをプローブとして用いても、目的の遺伝子は得られなかった。そこで本発明者らは、ＰＣＲ反応を行う際に種々の条件を鋭意検討を重ねた結果、特定の条件下で、特定の合成プライマー対を用いることにより該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を増幅することに成功し、該増幅遺伝子をプローブとし、目的の遺伝子の単離を行い、その塩基配列を決定し、更に微生物において活性型α−１，３／４−フコシダーゼを発現する組換えプラスミドの構築を行い、該プラスミドにより形質転換した微生物を用いて、該α−１，３／４−フコシダーゼを生産させることに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
以下、ストレプトマイセスｓｐ １４２を例として本発明を具体的に説明する。本菌は、特開平３−９８５８３号公報に記載の菌であり、Streptomyces sp １４２と表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９として寄託されている。
【０００７】
まず、ストレプトマイセスｓｐ １４２より粗酵素液を調製し、各種クロマトグラフィーによりα−１，３／４−フコシダーゼを高度に精製する。
この精製されたα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列に関する情報を得るために、例えばジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で精製したα−１，３／４−フコシダーゼを直接常法に従ってエドマン分解法によりアミノ酸配列分析に供してもよいし、あるいは特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相系ＨＰＬＣを用いて分離精製する。精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。この部分アミノ酸配列の情報を基にα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクローニングするには一般的にＰＣＲ法を用いる方法あるいはハイブリダイゼーションによる方法を用いることができる。
【０００８】
１）カセットＤＮＡを用いるＰＣＲ法
ストレプトマイセスｓｐ １４２から常法に従って抽出したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、既知の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮＡ）を連結したものを鋳型として、部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従ってデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーとカセットＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（カセットプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。カセットＤＮＡあるいはカセットプライマーについては例えば宝酒造社製のものを利用することができる。カセットＤＮＡは２種類のカセットプライマーに対応する配列を含んでおり、まず制限酵素サイトから遠い方のプライマーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行い、その反応液の一部を鋳型として更に制限酵素サイトに近い方のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと効果的に目的のＤＮＡ断片を増幅することができることが知られている。本発明者らはこの方法に従って本発明の遺伝子の取得を試みた。まずＮ末端配列Ｎ−１（配列番号３）と部分アミノ酸配列５７（配列番号４）からそれぞれ合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−１（配列番号５）及び５７Ｒ（配列番号６）を合成する。ストレプトマイセスｓｐ １４２から常法に従って抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌＩで消化し、対応するカセットＤＮＡ（宝酒造社製）をそれぞれ連結する。これを鋳型としてＦＳＥ−１とＣ１プライマー（宝酒造社製）、５７ＲとＣ１プライマーの組合せでＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲはＰＣＲテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒＨＡ（Erlich) 編集、ストックトンプレス社発行、１９８９年〕に記載の方法に準じて行う。例えば、ジーンアンプＰＣＲリージェント キット（GeneAmp PCR Reagent Kit 、宝酒造社製）を用いて行うことができる。例えば９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、１分のサイクルを３０サイクル行い、この反応液の一部を用いてＦＳＥ−１とＣ２プライマー（宝酒造社製）、５７ＲとＣ２プライマーの組合せで同様の条件で更にＰＣＲ反応を行う。本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析しても特異的に増幅したＤＮＡ断片は検出できず、この方法では本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクローニングすることはできない。
【０００９】
２）通常のＰＣＲ法
部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従ってデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。まず部分アミノ酸配列５７（配列番号４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー５７Ｆ（配列番号７）、部分アミノ酸配列３９（配列番号８）から３９Ｆ（配列番号９）と３９Ｒ（配列番号１０）、部分アミノ酸配列４５（配列番号１１）から４５Ｆ（配列番号１２）と４５Ｒ（配列番号１３）を合成する。
上述の１）に記載のＦＳＥ−１（配列番号５）及び５７Ｒ（配列番号６）も含めて表１の組合せのプライマーを用いて、ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。
【００１０】
【表１】
【００１１】
ＰＣＲ反応は例えばジーンアンプ ＰＣＲ リージェントキットを用いて、９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、１．５分のサイクルを３５サイクル行い、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析すると、ＦＳＥ−１（配列番号５）と４５Ｒ（配列番号１３）の組合せ〔表１中の（３）〕と４５Ｆ（配列番号１２）と３９Ｒ（配列番号１０）の組合せ〔表１中の（９）〕のみでそれぞれ２００ｂｐ、９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されるがその他の組合せでは増幅が見られないか、若しくは多くの増幅産物が観察される。表１中の（３）と（９）で特異的に増幅したＤＮＡ断片について通常用いられる方法で塩基配列を決定しても、合成したＤＮＡの配列以外に目的の遺伝子と考えられる配列は見出すことができない。
【００１２】
３）合成ＤＮＡハイブリダイゼーション法
部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従って合成オリゴヌクレオチドをデザインしハイブリダイゼーションによって目的のＤＮＡを検出する方法も一般的に用いられる。本発明者らはこの方法に従って本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の検出を試みた。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブとして、上述の２）に記載のＰＣＲ法で述べた合成オリゴヌクレオチド、ＦＳＥ−１（配列番号５）、３９Ｆ（配列番号７）、及び部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）からデザインした合成オリゴヌクレオチド２８Ｆ（配列番号１５）、３２（配列番号１６）からデザインした３２Ｒ（配列番号１７）を用いる。ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを制限酵素、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後常法に従いナイロン膜にブロッティングする。ハイブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行うことができる。例えば６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ（Denhardt's) 、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５℃でナイロン膜をブロッキングし、32Ｐでラベルした各合成オリゴヌクレオチドを加えて４０℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで５０℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。プローブとして用いた３９Ｆ（配列番号７）についてはハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出することができず、その他のプローブとして用いたＦＳＥ−１（配列番号５）、２８Ｆ（配列番号１５）、３２Ｒ（配列番号１７）に関しては各制限酵素消化物のレーン上に多数のバンドが検出され、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を特定することはできない。
【００１３】
以上に述べたように、通常の方法においてはストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡから本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクローニングすることは非常に難しく、ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノム遺伝子を鋳型とした場合、ポリメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニーリングが起こるなどして、ＰＣＲ法においては増幅阻害、非特異的ＤＮＡ断片の増幅等が、また、ハイブリダイゼーション法においても非特異的ハイブリッドの形成などが起こる可能性が考えられる。本発明者らはこれらの点を考慮し、ＰＣＲ反応を行う際、二次構造の形成によるＤＮＡ鎖の伸長阻害を防ぐと共に非特異的なアニーリングを極力押える条件下でＰＣＲを行った。
すなわち、ＰＣＲ反応の基質ｄＧＴＰの代りにその誘導体である２′−デオキシ−７−デアザグアノシントリホスフェート（ｄｃ7 ＧＴＰ）を加え、更にアニーリング温度を６０℃に上げて反応を行い、その後反応液の一部を鋳型としてｄＧＴＰの入った普通の基質を用いて２回目の反応を行い、特定のプライマー対の組合せで、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部が初めて増幅されることを見出した。
【００１４】
以下、より詳細に説明すれば上述の２）で記載の合成オリゴヌクレオチドプライマーに加えて新たに部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー２８Ｒ（配列番号１８）、部分アミノ酸配列３２（配列番号１６）からデザインした３２Ｆ（配列番号１９）を合成する。表２の組合せのプライマーを用いて、ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。
【００１５】
【表２】
【００１６】
ＰＣＲ反応は例えばジーンアンプＰＣＲリージェントキットを用いて、ｄＮＴＰ混合液の代りにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃ7 ＧＴＰの混合液を用いて、９４℃、３０秒、６０℃、１分、７２℃、２分のサイクルを２５サイクルを行う。この反応液の一部を鋳型として、今度は通常のｄＮＴＰ混合液を基質として再度同じサイクルＰＣＲ反応を行う。反応液の一部をアガロースゲル電気泳動で分析する。別に１回目のＰＣＲ反応液の一部を鋳型として、それぞれ１種類のプライマーだけを加えてＰＣＲ反応を行い、片方のプライマーだけで増幅してくるＤＮＡ断片を調べておく。その結果、片方だけのプライマーで増幅するＤＮＡ断片を除くとＰＣＲ反応によって増幅してくるＤＮＡ断片の数は表３に示したようになる。
【００１７】
【表３】
【００１８】
これらのＤＮＡ断片の塩基配列を通常用いられる方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター法で決定したところ４５Ｆ−３２Ｒの組合せ〔表２中の（１９）〕で増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）中にプライマーの配列に続いてα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を取得することに成功した。
【００１９】
ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、上記のＰＣＲ産物〔４５Ｆ−３２Ｒの組合せで増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）、配列番号２０〕をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的にハイブリダイズするバンドを検出することができる。検出されたバンドに相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製した後、通常用いられる方法によってプラスミドベクターに組込むことができる。プラスミドベクターとしては公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。
【００２０】
次いで組換えプラスミドを宿主に導入し、宿主を形質転換するが、宿主として大腸菌を使用する場合、宿主大腸菌としては形質転換能を有するものであれば野生株、変異株いずれも使用できる。導入の方法は通常用いられる方法、例えばモレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス（T.Maniatis) ほか著、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー １９８２年発行〕第２５０頁に記載の方法を用いることができる。
このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入した後、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１９の場合、アンピシリン耐性を有するコロニー、あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しかつ白色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導入されたコロニーを選別することができる。次に上記集団のなかから目的のＤＮＡ断片を含むベクターを有するコロニーを選択するが、選択の方法はベクターの種類によってコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションを適宜用いればよい。また、ＰＣＲ法を用いることもできる。目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選別できればこのベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター法により決定することができる。決定された塩基配列を、α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量などと比較することによって目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の構造及びα−１，３／４−フコシダーゼの全アミノ酸配列を知ることができる。こうして得られる塩基配列の一例を配列表の配列番号２に、またその塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２１】
目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を含むベクターで宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、α−１，３／４−フコシダーゼ活性を持つポリペプチドないしタンパク質を生産させることができる。場合によっては該ポリペプチドを封入体（inclusion body) の形で生産させることもできる。発現ベクターとしては、適当な宿主において発現できるようなベクターに、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を接続すればよい。
【００２２】
宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。発現の確認は例えばα−１，３／４−フコシダーゼの活性を測定することにより行うことができる。活性測定は例えば組換体大腸菌の細胞抽出液を酵素液としてジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で行うことができる。目的のα−１，３／４−フコシダーゼの発現が認められた場合はその発現の最適条件を検討する。
【００２３】
形質転換体の培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを精製するには通常の方法が用いられる。例えば宿主が大腸菌の場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕して、遠心分離等によって、可溶性画分を集める。その後イオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製すれば高純度のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができる。また、封入体となっている場合は、封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリホールディング操作を行うことによって活性を保持した目的のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができる。
【００２４】
また、得られたこれらの遺伝子をプローブとして厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、本酵素と配列は少し異なるが同様の酵素活性を持つと期待されるすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが期待できる。ここで言う厳密な条件下とは、以下の条件下のことを言う。すなわち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２０時間プローブとハイブリダイゼーションを行うことを言う。
【００２５】
本発明により、α−１，３／４−フコシダーゼの一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、α−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子工学的な製造が可能となった。本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安価に高純度なα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることが可能となる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１ α−１，３／４−フコシダーゼ構造遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの抽出精製
α−１，３／４−フコシダーゼの生産菌株であるストレプトマイセスｓｐ １４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９）をＬ−フコース１％、酵母エキス０．０１％、ペプトン０．０３％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ｐＨ７．０からなる培地２０ｍｌに接種し、３０℃で４４時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、液体窒素中に投入して乳鉢で完全に粉砕した。これを１０倍量の抽出緩衝液〔１０ｍＭトリス（tris) −ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ８．０〕中に穏やかにかくはんしながら少量ずつ添加し、１０ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ １００μｌを添加した後、３７℃で１時間保温した。この後室温に戻し、等容のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム溶液を加えて穏やかにかくはんし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後上層を回収した（以下、フェノール抽出と略す）。これを２回繰返し、水層に０．６等量のイソプロピルアルコールを加えて１４０００ｒｐｍで１分間遠心した後、７０％エタノールでリンスして軽く風乾した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ約４４０μｇを得た。
【００２８】
（２）α−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列の決定
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で精製したα−１，３／４−フコシダーゼを直接常法に従って気相エドマン分解法によるアミノ酸配列分析に供してＮ末端アミノ酸配列Ｎ−１（配列番号３）を決定した。更に、酵素タンパク質をピリジルエチル化した後リシルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片の混合物をＨＰＬＣで分離精製した。各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い部分アミノ酸配列５７（配列番号４）、３９（配列番号８）、４５（配列番号１１）、２８（配列番号１４）、３２（配列番号１６）を決定した。
【００２９】
（３）プライマーの合成とＰＣＲによる増幅
（２）で決定したＮ末端アミノ酸配列Ｎ−１（配列番号３）から合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−１（配列番号５）、部分アミノ酸配列５７（配列番号４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー５７Ｆ（配列番号７）、５７Ｒ（配列番号６）、部分アミノ酸配列３９（配列番号８）から合成オリゴヌクレオチドプライマー３９Ｆ（配列番号９）、３９Ｒ（配列番号１０）、部分アミノ酸配列４５（配列番号１１）から合成オリゴヌクレオチドプライマー４５Ｆ（配列番号１２）、４５Ｒ（配列番号１３）、部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー２８Ｆ（配列番号１５）、２８Ｒ（配列番号１８）、部分アミノ酸配列３２（配列番号１６）から合成オリゴヌクレオチドプライマー３２Ｆ（配列番号１９）、３２Ｒ（配列番号１７）をそれぞれ合成した。テンプレートとしては（１）で調製したゲノムＤＮＡを用い、表２に示した組合せのプライマーを用いた。１０分間熱変性させたゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、２５ｐｍｏｌずつの合成オリゴヌクレオチドプライマーを含むジーンアンプＰＣＲリージェントキット（宝酒造社製）の反応系で、ｄＮＴＰ混合液の代りに終濃度１．２ｍＭ ｄＡＴＰ、１．２ｍＭ ｄＣＴＰ、１．２ｍＭ ＴＴＰ、０．９ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄｃ7 ＧＴＰ（ベーリンガー社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。１．２５ユニットのアンプリタック（Ampli Taq)と滅菌水を加えて反応液量を２５μｌとし、この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler、宝酒造社製）を用いた増幅反応に供した。反応条件は、９４℃で３０秒間（変性）→６０℃で１分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で２分間（合成反応）のサイクルを２５サイクル行った。次に、この反応液１μｌをテンプレートとして、ジーンアンプＰＣＲリージェントキットを用いて５０μｌの反応系で通常のｄＮＴＰ混合液を用い、先と同じ条件でＰＣＲ反応を再度行った。反応液の１０μｌについて、３％アガロースゲル電気泳動を行った後エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅ＤＮＡ断片を調べた。同様にして、２度目の反応においてそれぞれ１種類のプライマーのみを加えて反応を行い、片方のプライマーだけで増幅してくるＤＮＡ断片を調べておく。その結果、片方のプライマーだけで増幅してきたものを除くと、反応により増幅したＤＮＡ断片数は表３に示したようになった。これらのＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーター法で決定したところプライマー４５Ｆと３２Ｒの組合せ〔表２中の（１９）〕で増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）中にプライマーの配列に続いてα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を取得することに成功した。このＰＣＲにより増幅したＤＮＡフラグメントを４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）と命名した。
【００３０】
（４）α−１，３／４−フコシダーゼ全長遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング
（１）で調製したゲノムＤＮＡ５０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ各１２０ユニットで各々３７℃で２時間消化し、６０ユニットの酵素を追加して更に４時間反応させた。この反応液からフェノール抽出で得られたＤＮＡ１０μｇ相当について０．７％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、サザンブロット法（遺伝子研究法II、第２１８〜２２１頁、東京化学同人、１９８６年発行）により、ナイロン膜〔ハイボンドＮ+ （Hybond-N+ ) 、アマシャム社製〕にＤＮＡを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、（３）で得られたＤＮＡフラグメント４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）を用いた。
このフラグメント５ｐｍｏｌをメガラベル（MEGALABEL 、宝酒造社製）を用いて32Ｐで標識した。上記調製したフィルターを用いて、６×ＳＳＣ〔１×ＳＳＣは、８．７７ｇのＮａＣｌ、及び４．４１ｇをクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物〕、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルツ〔ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％濃度で含む〕を含む溶液中、６５℃で３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを１ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるように加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次に６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１時間洗浄し、余分な水分を除いた後、増感紙を当てて−７０℃で一晩オートラジオグラフを行った。
その結果、ＢａｍＨＩ消化物で約４．５Ｋｂ、ＰｓｔＩ消化物で約２．３Ｋｂ、ＳａｃＩ消化物で約１０Ｋｂ、ＳａｌＩ消化物で約１．９Ｋｂの位置に、プローブとハイブリダイズするバンドを認めた。
以後の実験は、取扱いの簡便さからＰｓｔＩ、及びＳａｌＩ消化物について進めた。先に制限酵素消化したゲノムＤＮＡ１０μｇの０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、上述のハイブリダイゼーションで認められたバンドに相当する部分を切り出した。これをイージートラップ（EASYTRAP、宝酒造社製）を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩあるいはＳａｌＩサイトに挿入した。
【００３１】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、直径８．５ｃｍの丸シャーレ３枚に、１枚当り２００〜１０００個のコロニーを形成させた。次に、これらのプレートより制限酵素１種類当り２００個のコロニーを選択し、ナイロン膜（ハイボンドＮ+ 、アマシャム社製）上に写した。３７℃で３時間保温した後、このナイロン膜を０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ ＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣでリンスした。このナイロン膜とＤＮＡフラグメント４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）を用い、前述と同じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、ＰｓｔＩ断片で１個、ＳａｌＩ断片で２個のポジティブシグナルが得られた。それぞれの大腸菌ＪＭ１０９をＰ５４、Ｓ３０、Ｓ６８と命名した。
【００３２】
アルカリ溶菌法により、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれｐＵＦＳＥＰ５４、ｐＵＦＳＥＳ３０、ｐＵＦＳＥＳ６８と命名した。これを数種の制限酵素で消化し、電気泳動により切断パターンを解析した。その結果、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩなどの制限酵素サイトの存在を確認した。なお、この解析によりプラスミドｐＵＦＳＥＳ３０とｐＵＦＳＥＳ６８は同一であることが判明したので、以後の実験はｐＵＦＳＥＰ５４及びｐＵＦＳＥＳ３０を用いて行った。また、ｐＵＦＳＥＰ５４及びｐＵＦＳＥＳ３０の挿入部分は約８００ｂｐの共通配列を有することが推定された。これらのクローンを適当な制限酵素で消化し、ライゲーションキット（DNA Ligation Kit、宝酒造社製）でセルフライゲーションを行って、各種の欠失変異体を作製した。ジデオキシ法によってこれらの変異体の塩基配列を決定した結果、２つのクローンに渡って、挿入断片中に１６８９ｂｐの読み取り枠が見出された。この読み取り枠中に、α−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列分析により得られた配列がすべて見出された。以上の結果より、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。その結果を図１に示す。すなわちＡは２．３ｋｂ ＰｓｔＩ断片及びＢは１．９ｋｂ ＳａｌＩ断片の制限酵素地図と、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の位置を示した図であり、図中矢印はα−１，３／４−フコシダーゼの翻訳開始点、太線はα−１，３／４−フコシダーゼのコード領域を示し、Ａの太線中のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ間は、Ｓの太線中のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ間に相当し、ＡとＢを合せることにより、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の全長を知ることができる。また、α−１，３／４−フコシダーゼをコードする塩基配列を配列表の配列番号２に、その塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３３】
実施例２ α−１，３／４−フコシダーゼポリペプチドを発現するプラスミドの構築
（１）α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端側ポリペプチドをコードするプラスミドの構築
α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端側ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅するために２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅ（配列番号２１）、プライマーＳ３０ＲＶ（配列番号２２）をデザインし合成した。プライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅは配列番号２の塩基配列番号１３６−１５３の５′−３′の向きに相当する１８ｍｅｒの上流にＨｉｎｄ III及びＮｄｅＩサイトをデザインした３４ｍｅｒであり、プライマーＳ３０ＲＶは配列番号２、塩基配列番号４４３−４６１の３′−５′の向きに相当する１９ｍｅｒの合成ＤＮＡである。
テンプレートとして、実施例１で得られたプラスミドｐＵＦＳＥＰ５４約１００ｐｇをジーンアンプＰＣＲリージェントキット（宝酒造社製）中の１０μｌの１０倍濃度増幅用緩衝液、１６μｌの１．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌのプライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅ、２０ｐｍｏｌのプライマーＳ３０ＲＶ、２．５ユニットのアンプリタックと混合し、更に滅菌水を加えて１００μｌの溶液にした。この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーによる増幅反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間（変性）→５５℃で１分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で１．５分間（合成反応）のサイクルを２５サイクル行った。反応液の１０μｌについて３％アガロースゲル電気泳動を行った後エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、予想される３４２ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を確認した。ＰＣＲ反応液の残りをエタノール沈殿により濃縮した後二つに分けた。一方はＨｉｎｄ III、ＳａｌＩで切断後、ｐＴＶ１１９ＮＮｄｅ〔ｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩに変換することにより作製〕のＨｉｎｄ III−ＳａｌＩサイトに挿入し、もう一方はＮｄｅＩ、ＳａｌＩで切断後、ｐＴＶ１１９ＮＮｄｅのＮｄｅＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。それぞれをｐＴＦＳＥＦ１０１Ｎ及びｐＴＦＳＥＭ１０１Ｎと命名した。各々で宿主として大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後、ＰＣＲ法による挿入断片の確認、ジデオキシチェーンターミネーター法による挿入断片の塩基配列の確認を行った。
【００３４】
（２）α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子全長をコードするプラスミドの構築
実施例１で得られたプラスミドｐＵＦＳＥＳ３０をＳａｌＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行い、１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを切り出し抽出精製した。次に、実施例２−（１）で得られたプラスミドｐＴＦＳＥＭ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換させた。アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、ＳａｌＩ消化によるＳａｌＩサイト再生の確認、及びＳａｃＩ消化による挿入断片の方向確認を行った。こうして得られたα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子全長をコードするプラスミドをｐＴＦＳＥＭ２０１と命名した。同様に実施例２−（１）で得られたプラスミドｐＴＦＳＥＦ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを挿入したプラスミドｐＴＦＳＥＦ２０１を構築した。このプラスミドには、α−１，３／４−フコシダーゼＮ末端の上流にｌａｃＺα由来のペプチドを含む１０アミノ酸残基（Ｍｅｔ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｍｅｔ）〔配列番号２３〕をコードする配列が含まれており、ｌａｃＺのＳＤ配列及びその開始コドンを利用してｌａｃＺαとの融合体としてのα−１，３／４−フコシダーゼの誘導発現が期待される。
ｐＴＦＳＥＭ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１と表示する。また、ｐＴＦＳＥＦ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１と表示し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４９５０として寄託されている。
【００３５】
実施例３ 組換体α−１，３／４−フコシダーゼの大腸菌における発現
（１）α−１，３／４−フコシダーゼポリペプチドの大腸菌における発現
実施例２で得られた大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１あるいは Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地５ｍｌに接種して３７℃で一晩振とう培養し、その１％を新たに同培地５ｍｌに接種した。培養後の濁度（６００ｎｍの吸光度）がおよそ０．５の段階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液１００μｌを遠心分離して菌体を集め、５０ｍＭ リン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。次に、同緩衝液１００ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液とした。この抽出液及び沈殿をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１由来の抽出液及び沈殿には分子量約５５，０００のα−１，３／４−フコシダーゼと考えられるバンドが観察され、α−１，３／４−フコシダーゼタンパク質を発現していることが確認できたが、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１はほとんど酵素タンパク質を発現していないことがわかった。そこで次に Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の菌体抽出液のα−１，３／４−フコシダーゼ活性測定を、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って行った。その結果、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の菌体抽出液の活性は培養液１ｍｌ当りに換算して約１ミリユニットであることがわかった。なお、α−１，３／４−フコシダーゼ構造遺伝子をコードしないｐＴＶ１１９Ｎｄｅ、及びＮ末端部分のみをコードするｐＴＦＳＥＦ１０１Ｎを保持する大腸菌ＪＭ１０９を同様に処理したが、α−１，３／４−フコシダーゼ活性は全く認められなかった。以上の結果から、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１が生産するα−１，３／４−フコシダーゼの大部分は封入体の形で不溶化している可能性が考えられた。
【００３６】
（２）α−１，３／４−フコシダーゼの大腸菌における発現と封入体の精製
大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地１０ｍｌに接種して３７℃で５時間振とう培養し、これを５００ｍｌの同じ培地の入った２リットル三角フラスコに５ｍｌ植菌して３７℃で１００ｒｐｍで振とう培養した。培養液の濁度（６６０ｎｍの吸光度）がおよそ０．５になった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍｌに懸濁して超音波処理を行い菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して封入体を含む不溶性画分を集めた後、２０ｍｌの１Ｍショ糖溶液に懸濁した。これを１８，０００×ｇで３０分間遠心分離して封入体を含む沈殿を得た。これを１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２％トリトンＸ−１００溶液４０ｍｌに懸濁し、一晩４℃に静置した。遠心分離により不溶物を集めてから再度同じ操作を繰返し封入体を洗浄した。得られた封入体の一部をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、半分以上のタンパク質は分子量約５５，０００の位置に泳動されており、得られた封入体画分の半分以上のタンパク質は組換体α−１，３／４−フコシダーゼであると推定された。またこの組換体α−１，３／４−フコシダーゼのタンパク質量は、同時に分析した牛血清アルブミンのバンドとの比較から、培養液１リットル当り少なくとも１０ｍｇ以上得られると推定された。
【００３７】
（３）封入体の可溶化とリフォールディング
得られた封入体の１／１０量（培養液１００ｍｌ相当）を８Ｍ 尿素、１０ｍＭ ジチオスレイトールを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌに懸濁し、室温で１時間かくはんして可溶化した。遠心分離により残った不溶物を除去した後、上清の５０μｌに同じ緩衝液を加え５ｍｌとした。これを分子量１０，０００カットの透析チューブに入れて０．６Ｍ ＫＣｌを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５００ｍｌに対して１５℃で一晩透析した。透析内液を遠心分離して不溶物を除き、上清７ｍｌを得た。この溶液のα−１，３／４−フコシダーゼ活性をジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って測定した。その結果、この上清中の活性は約１０ｍＵ／ｍｌであることがわかった。すなわち、本発明の遺伝子をもつ大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の培養液１リットルから約１４ユニットの組換体α−１，３／４−フコシダーゼが得られることがわかった。
【００３８】
（４）組換体α−１，３／４−フコシダーゼの基質特異性
ピリジルアミノ化（ＰＡ−）ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII （宝酒造社製）、１００ｐｍｏｌを含む３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０に実施例３−（３）で得られた酵素溶液１０μｌを加えて３７℃で一晩反応を行った。反応液を凍結乾燥した後、グライコタッグ（Glyco TAG 、宝酒造社製）を用いてＰＡ化反応を行い、この反応液を陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを用いた単糖分析に供した。その結果、組換体酵素の作用によって、基質であるＰＡ−ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII からフコースが遊離してきたことを確認することができた。
【００３９】
また、種々のＰＡ化オリゴ糖を基質としてα−１，３／４−フコシダーゼ活性をジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って測定したところ、該組換体酵素はα１，３及びα１，４フコシド結合に特異的で、α１，２フコシド結合及びα１，６フコシド結合には全く作用しないことがわかった。またα２，３シアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースIIにもほとんど作用しなかった。以上の基質特異性は、ストレプトマイセスｓｐ １４２のα−１，３／４−フコシダーゼのものと全く同じであった。
【００４０】
【発明の効果】
以上の結果から、本発明によりα−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、これにより、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を提供することが可能となり、α−１，３／４−フコシダーゼ活性を持つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。本発明によれば、本酵素生産においてＬ−フコースによる誘導培養は不要であり、生産性は高い。また、α−１，３／４−フコシダーゼの存在、あるいは発現の様子を調べるターゲットが提供されたことにより、この塩基配列を基にプローブやプライマーを作製することや、アミノ酸配列を基に抗体を作製することなどが可能となった。
【００４１】
【配列表】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Pst I 断片とSal I 断片の制限酵素地図の相関を示す図でありＡは２．３Kb Pst I断片及びＢは１．９Kb Sal I断片の制限酵素地図を示す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は糖鎖及び糖タンパク質の構造や機能の解析等の糖鎖工学に有用なα−１，３／４−フコシダーゼをコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列に関する。本発明は、また、該遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた組換体を用いるα−１，３／４−フコシダーゼの工業的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−フコースは糖タンパク質や糖脂質、グリコサミノグリカンと言ったいわゆる複合糖質の構成糖として、主に糖鎖の非還元末端に存在している。α−１，３／４結合したフコースはルイス式血液型抗原や腫瘍関連抗原、あるいは細胞接着因子であるセレクチンのリガンドに含まれており、これらの糖鎖構造の解析あるいは機能の解析のためにはα−１，３／４−フコシダーゼが極めて有用な試薬として用いられている。
α−１，３／４−フコシダーゼとしてはアーモンド由来のα−フコシダーゼＩ〔アーカイブズ オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジクス（Archieves of Biochemistry and Biophysics) 、第１８１巻、第３５３〜３５８頁（１９７７）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological chemistry)、第２５７巻、第８２０５〜８２１０頁（１９８２）〕及びα−フコシダーゼIII 〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６５巻、第１６４７２〜１６４７７頁（１９９０）〕、及びストレプトマイセス（Streptomyces) 由来のもの〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）〕が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アーモンドミールあるいはアーモンドエムルシンからα−フコシダーゼを取得する方法は、アーモンド中に多種多様な糖加水分解酵素が混在するためそれらと目的のα−フコシダーゼを完全に分離し、高度に精製するのは非常に困難であった。またストレプトマイセス属放線菌を培養してα−１，３／４−フコシダーゼを取得する方法の場合は、酵素の生産を誘導するために培養時に高価なＬ−フコースを添加する必要がある上に、同時にプロテアーゼ、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼなどの酵素が生産され、これらの酵素と分離精製することが困難であった。したがって、より安価に高純度なα−１，３／４−フコシダーゼを製造する方法が求められていた。従来α−１，３／４−フコシダーゼをアーモンドやストレプトマイセス属放線菌から精製する方法に関しては前述のように報告があるが、α−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列や遺伝子構造は不明である。
また、α−１，３／４−フコシダーゼの工業的に有利な製造方法についても開示されていない。したがって本酵素の遺伝子が明らかとなれば、遺伝子工学的に単一で高純度品の酵素製造が可能となり、糖鎖及び糖タンパク質の構造や機能の解析等の糖鎖工学に有用な酵素を製造することも可能になる。また、本酵素のＤＮＡ配列により本酵素とは配列が異なるが同様の酵素活性を持つと期待される本酵素類似の遺伝子の探索も可能となる。本酵素のＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は本酵素の抗体を作製することに用いるのにも有用である。
本発明の目的は、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子、そのＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸配列を提供し、α−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は配列表の配列番号２に記載したＤＮＡ配列からなるα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子に関する。第２の発明は、上記第１の発明の遺伝子をプローブとし、６×ＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃、２０時間のハイブリダイゼーションを行って得られるα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子に関する。本発明の第３の発明は、α−１，３／４−フコシダーゼの工業的な製造方法に関する。特に、前記第１又は第２の発明の該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた組換体を培養し、該培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを採取することを特徴とするα−１，３／４−フコシダーゼの製造方法を提供する。
【０００５】
本発明者らは、該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を取得するために、ストレプトマイセスｓｐ １４２よりα−１，３／４−フコシダーゼを高度に精製し、Ｎ末端アミノ酸配列、及び部分アミノ酸配列を決定した。次にこれらのアミノ酸配列の情報を基に常法に従い合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ったが、該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を取得できなかった。また、該プライマーをプローブとして用いても、目的の遺伝子は得られなかった。そこで本発明者らは、ＰＣＲ反応を行う際に種々の条件を鋭意検討を重ねた結果、特定の条件下で、特定の合成プライマー対を用いることにより該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を増幅することに成功し、該増幅遺伝子をプローブとし、目的の遺伝子の単離を行い、その塩基配列を決定し、更に微生物において活性型α−１，３／４−フコシダーゼを発現する組換えプラスミドの構築を行い、該プラスミドにより形質転換した微生物を用いて、該α−１，３／４−フコシダーゼを生産させることに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
以下、ストレプトマイセスｓｐ １４２を例として本発明を具体的に説明する。本菌は、特開平３−９８５８３号公報に記載の菌であり、Streptomyces sp １４２と表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９として寄託されている。
【０００７】
まず、ストレプトマイセスｓｐ １４２より粗酵素液を調製し、各種クロマトグラフィーによりα−１，３／４−フコシダーゼを高度に精製する。
この精製されたα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列に関する情報を得るために、例えばジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で精製したα−１，３／４−フコシダーゼを直接常法に従ってエドマン分解法によりアミノ酸配列分析に供してもよいし、あるいは特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相系ＨＰＬＣを用いて分離精製する。精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。この部分アミノ酸配列の情報を基にα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクローニングするには一般的にＰＣＲ法を用いる方法あるいはハイブリダイゼーションによる方法を用いることができる。
【０００８】
１）カセットＤＮＡを用いるＰＣＲ法
ストレプトマイセスｓｐ １４２から常法に従って抽出したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、既知の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮＡ）を連結したものを鋳型として、部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従ってデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーとカセットＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（カセットプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。カセットＤＮＡあるいはカセットプライマーについては例えば宝酒造社製のものを利用することができる。カセットＤＮＡは２種類のカセットプライマーに対応する配列を含んでおり、まず制限酵素サイトから遠い方のプライマーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行い、その反応液の一部を鋳型として更に制限酵素サイトに近い方のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと効果的に目的のＤＮＡ断片を増幅することができることが知られている。本発明者らはこの方法に従って本発明の遺伝子の取得を試みた。まずＮ末端配列Ｎ−１（配列番号３）と部分アミノ酸配列５７（配列番号４）からそれぞれ合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−１（配列番号５）及び５７Ｒ（配列番号６）を合成する。ストレプトマイセスｓｐ １４２から常法に従って抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌＩで消化し、対応するカセットＤＮＡ（宝酒造社製）をそれぞれ連結する。これを鋳型としてＦＳＥ−１とＣ１プライマー（宝酒造社製）、５７ＲとＣ１プライマーの組合せでＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲはＰＣＲテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒＨＡ（Erlich) 編集、ストックトンプレス社発行、１９８９年〕に記載の方法に準じて行う。例えば、ジーンアンプＰＣＲリージェント キット（GeneAmp PCR Reagent Kit 、宝酒造社製）を用いて行うことができる。例えば９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、１分のサイクルを３０サイクル行い、この反応液の一部を用いてＦＳＥ−１とＣ２プライマー（宝酒造社製）、５７ＲとＣ２プライマーの組合せで同様の条件で更にＰＣＲ反応を行う。本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析しても特異的に増幅したＤＮＡ断片は検出できず、この方法では本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクローニングすることはできない。
【０００９】
２）通常のＰＣＲ法
部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従ってデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。まず部分アミノ酸配列５７（配列番号４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー５７Ｆ（配列番号７）、部分アミノ酸配列３９（配列番号８）から３９Ｆ（配列番号９）と３９Ｒ（配列番号１０）、部分アミノ酸配列４５（配列番号１１）から４５Ｆ（配列番号１２）と４５Ｒ（配列番号１３）を合成する。
上述の１）に記載のＦＳＥ−１（配列番号５）及び５７Ｒ（配列番号６）も含めて表１の組合せのプライマーを用いて、ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。
【００１０】
【表１】
ＰＣＲ反応は例えばジーンアンプ ＰＣＲ リージェントキットを用いて、９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、１．５分のサイクルを３５サイクル行い、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析すると、ＦＳＥ−１（配列番号５）と４５Ｒ（配列番号１３）の組合せ〔表１中の（３）〕と４５Ｆ（配列番号１２）と３９Ｒ（配列番号１０）の組合せ〔表１中の（９）〕のみでそれぞれ２００ｂｐ、９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されるがその他の組合せでは増幅が見られないか、若しくは多くの増幅産物が観察される。表１中の（３）と（９）で特異的に増幅したＤＮＡ断片について通常用いられる方法で塩基配列を決定しても、合成したＤＮＡの配列以外に目的の遺伝子と考えられる配列は見出すことができない。
【００１２】
３）合成ＤＮＡハイブリダイゼーション法
部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従って合成オリゴヌクレオチドをデザインしハイブリダイゼーションによって目的のＤＮＡを検出する方法も一般的に用いられる。本発明者らはこの方法に従って本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の検出を試みた。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブとして、上述の２）に記載のＰＣＲ法で述べた合成オリゴヌクレオチド、ＦＳＥ−１（配列番号５）、３９Ｆ（配列番号７）、及び部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）からデザインした合成オリゴヌクレオチド２８Ｆ（配列番号１５）、３２（配列番号１６）からデザインした３２Ｒ（配列番号１７）を用いる。ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを制限酵素、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後常法に従いナイロン膜にブロッティングする。ハイブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行うことができる。例えば６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ（Denhardt's) 、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５℃でナイロン膜をブロッキングし、32Ｐでラベルした各合成オリゴヌクレオチドを加えて４０℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで５０℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。プローブとして用いた３９Ｆ（配列番号７）についてはハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出することができず、その他のプローブとして用いたＦＳＥ−１（配列番号５）、２８Ｆ（配列番号１５）、３２Ｒ（配列番号１７）に関しては各制限酵素消化物のレーン上に多数のバンドが検出され、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を特定することはできない。
【００１３】
以上に述べたように、通常の方法においてはストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡから本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクローニングすることは非常に難しく、ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノム遺伝子を鋳型とした場合、ポリメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニーリングが起こるなどして、ＰＣＲ法においては増幅阻害、非特異的ＤＮＡ断片の増幅等が、また、ハイブリダイゼーション法においても非特異的ハイブリッドの形成などが起こる可能性が考えられる。本発明者らはこれらの点を考慮し、ＰＣＲ反応を行う際、二次構造の形成によるＤＮＡ鎖の伸長阻害を防ぐと共に非特異的なアニーリングを極力押える条件下でＰＣＲを行った。
すなわち、ＰＣＲ反応の基質ｄＧＴＰの代りにその誘導体である２′−デオキシ−７−デアザグアノシントリホスフェート（ｄｃ7 ＧＴＰ）を加え、更にアニーリング温度を６０℃に上げて反応を行い、その後反応液の一部を鋳型としてｄＧＴＰの入った普通の基質を用いて２回目の反応を行い、特定のプライマー対の組合せで、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部が初めて増幅されることを見出した。
【００１４】
以下、より詳細に説明すれば上述の２）で記載の合成オリゴヌクレオチドプライマーに加えて新たに部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー２８Ｒ（配列番号１８）、部分アミノ酸配列３２（配列番号１６）からデザインした３２Ｆ（配列番号１９）を合成する。表２の組合せのプライマーを用いて、ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。
【００１５】
【表２】
ＰＣＲ反応は例えばジーンアンプＰＣＲリージェントキットを用いて、ｄＮＴＰ混合液の代りにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃ7 ＧＴＰの混合液を用いて、９４℃、３０秒、６０℃、１分、７２℃、２分のサイクルを２５サイクルを行う。この反応液の一部を鋳型として、今度は通常のｄＮＴＰ混合液を基質として再度同じサイクルＰＣＲ反応を行う。反応液の一部をアガロースゲル電気泳動で分析する。別に１回目のＰＣＲ反応液の一部を鋳型として、それぞれ１種類のプライマーだけを加えてＰＣＲ反応を行い、片方のプライマーだけで増幅してくるＤＮＡ断片を調べておく。その結果、片方だけのプライマーで増幅するＤＮＡ断片を除くとＰＣＲ反応によって増幅してくるＤＮＡ断片の数は表３に示したようになる。
【００１７】
【表３】
これらのＤＮＡ断片の塩基配列を通常用いられる方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター法で決定したところ４５Ｆ−３２Ｒの組合せ〔表２中の（１９）〕で増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）中にプライマーの配列に続いてα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を取得することに成功した。
【００１９】
ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、上記のＰＣＲ産物〔４５Ｆ−３２Ｒの組合せで増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）、配列番号２０〕をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的にハイブリダイズするバンドを検出することができる。検出されたバンドに相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製した後、通常用いられる方法によってプラスミドベクターに組込むことができる。プラスミドベクターとしては公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。
【００２０】
次いで組換えプラスミドを宿主に導入し、宿主を形質転換するが、宿主として大腸菌を使用する場合、宿主大腸菌としては形質転換能を有するものであれば野生株、変異株いずれも使用できる。導入の方法は通常用いられる方法、例えばモレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス（T.Maniatis) ほか著、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー １９８２年発行〕第２５０頁に記載の方法を用いることができる。
このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入した後、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１９の場合、アンピシリン耐性を有するコロニー、あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しかつ白色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導入されたコロニーを選別することができる。次に上記集団のなかから目的のＤＮＡ断片を含むベクターを有するコロニーを選択するが、選択の方法はベクターの種類によってコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションを適宜用いればよい。また、ＰＣＲ法を用いることもできる。目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選別できればこのベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター法により決定することができる。決定された塩基配列を、α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量などと比較することによって目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の構造及びα−１，３／４−フコシダーゼの全アミノ酸配列を知ることができる。こうして得られる塩基配列の一例を配列表の配列番号２に、またその塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２１】
目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を含むベクターで宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、α−１，３／４−フコシダーゼ活性を持つポリペプチドないしタンパク質を生産させることができる。場合によっては該ポリペプチドを封入体（inclusion body) の形で生産させることもできる。発現ベクターとしては、適当な宿主において発現できるようなベクターに、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を接続すればよい。
【００２２】
宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。発現の確認は例えばα−１，３／４−フコシダーゼの活性を測定することにより行うことができる。活性測定は例えば組換体大腸菌の細胞抽出液を酵素液としてジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で行うことができる。目的のα−１，３／４−フコシダーゼの発現が認められた場合はその発現の最適条件を検討する。
【００２３】
形質転換体の培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを精製するには通常の方法が用いられる。例えば宿主が大腸菌の場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕して、遠心分離等によって、可溶性画分を集める。その後イオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製すれば高純度のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができる。また、封入体となっている場合は、封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリホールディング操作を行うことによって活性を保持した目的のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができる。
【００２４】
また、得られたこれらの遺伝子をプローブとして厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、本酵素と配列は少し異なるが同様の酵素活性を持つと期待されるすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが期待できる。ここで言う厳密な条件下とは、以下の条件下のことを言う。すなわち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２０時間プローブとハイブリダイゼーションを行うことを言う。
【００２５】
本発明により、α−１，３／４−フコシダーゼの一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、α−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子工学的な製造が可能となった。本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安価に高純度なα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることが可能となる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１ α−１，３／４−フコシダーゼ構造遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの抽出精製
α−１，３／４−フコシダーゼの生産菌株であるストレプトマイセスｓｐ １４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９）をＬ−フコース１％、酵母エキス０．０１％、ペプトン０．０３％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ｐＨ７．０からなる培地２０ｍｌに接種し、３０℃で４４時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、液体窒素中に投入して乳鉢で完全に粉砕した。これを１０倍量の抽出緩衝液〔１０ｍＭトリス（tris) −ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ８．０〕中に穏やかにかくはんしながら少量ずつ添加し、１０ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ １００μｌを添加した後、３７℃で１時間保温した。この後室温に戻し、等容のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム溶液を加えて穏やかにかくはんし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後上層を回収した（以下、フェノール抽出と略す）。これを２回繰返し、水層に０．６等量のイソプロピルアルコールを加えて１４０００ｒｐｍで１分間遠心した後、７０％エタノールでリンスして軽く風乾した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ約４４０μｇを得た。
【００２８】
（２）α−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列の決定
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で精製したα−１，３／４−フコシダーゼを直接常法に従って気相エドマン分解法によるアミノ酸配列分析に供してＮ末端アミノ酸配列Ｎ−１（配列番号３）を決定した。更に、酵素タンパク質をピリジルエチル化した後リシルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片の混合物をＨＰＬＣで分離精製した。各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い部分アミノ酸配列５７（配列番号４）、３９（配列番号８）、４５（配列番号１１）、２８（配列番号１４）、３２（配列番号１６）を決定した。
【００２９】
（３）プライマーの合成とＰＣＲによる増幅
（２）で決定したＮ末端アミノ酸配列Ｎ−１（配列番号３）から合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−１（配列番号５）、部分アミノ酸配列５７（配列番号４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー５７Ｆ（配列番号７）、５７Ｒ（配列番号６）、部分アミノ酸配列３９（配列番号８）から合成オリゴヌクレオチドプライマー３９Ｆ（配列番号９）、３９Ｒ（配列番号１０）、部分アミノ酸配列４５（配列番号１１）から合成オリゴヌクレオチドプライマー４５Ｆ（配列番号１２）、４５Ｒ（配列番号１３）、部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー２８Ｆ（配列番号１５）、２８Ｒ（配列番号１８）、部分アミノ酸配列３２（配列番号１６）から合成オリゴヌクレオチドプライマー３２Ｆ（配列番号１９）、３２Ｒ（配列番号１７）をそれぞれ合成した。テンプレートとしては（１）で調製したゲノムＤＮＡを用い、表２に示した組合せのプライマーを用いた。１０分間熱変性させたゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、２５ｐｍｏｌずつの合成オリゴヌクレオチドプライマーを含むジーンアンプＰＣＲリージェントキット（宝酒造社製）の反応系で、ｄＮＴＰ混合液の代りに終濃度１．２ｍＭ ｄＡＴＰ、１．２ｍＭ ｄＣＴＰ、１．２ｍＭ ＴＴＰ、０．９ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄｃ7 ＧＴＰ（ベーリンガー社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。１．２５ユニットのアンプリタック（Ampli Taq)と滅菌水を加えて反応液量を２５μｌとし、この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler、宝酒造社製）を用いた増幅反応に供した。反応条件は、９４℃で３０秒間（変性）→６０℃で１分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で２分間（合成反応）のサイクルを２５サイクル行った。次に、この反応液１μｌをテンプレートとして、ジーンアンプＰＣＲリージェントキットを用いて５０μｌの反応系で通常のｄＮＴＰ混合液を用い、先と同じ条件でＰＣＲ反応を再度行った。反応液の１０μｌについて、３％アガロースゲル電気泳動を行った後エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅ＤＮＡ断片を調べた。同様にして、２度目の反応においてそれぞれ１種類のプライマーのみを加えて反応を行い、片方のプライマーだけで増幅してくるＤＮＡ断片を調べておく。その結果、片方のプライマーだけで増幅してきたものを除くと、反応により増幅したＤＮＡ断片数は表３に示したようになった。これらのＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーター法で決定したところプライマー４５Ｆと３２Ｒの組合せ〔表２中の（１９）〕で増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）中にプライマーの配列に続いてα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を取得することに成功した。このＰＣＲにより増幅したＤＮＡフラグメントを４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）と命名した。
【００３０】
（４）α−１，３／４−フコシダーゼ全長遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング
（１）で調製したゲノムＤＮＡ５０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ各１２０ユニットで各々３７℃で２時間消化し、６０ユニットの酵素を追加して更に４時間反応させた。この反応液からフェノール抽出で得られたＤＮＡ１０μｇ相当について０．７％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、サザンブロット法（遺伝子研究法II、第２１８〜２２１頁、東京化学同人、１９８６年発行）により、ナイロン膜〔ハイボンドＮ+ （Hybond-N+ ) 、アマシャム社製〕にＤＮＡを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、（３）で得られたＤＮＡフラグメント４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）を用いた。
このフラグメント５ｐｍｏｌをメガラベル（MEGALABEL 、宝酒造社製）を用いて32Ｐで標識した。上記調製したフィルターを用いて、６×ＳＳＣ〔１×ＳＳＣは、８．７７ｇのＮａＣｌ、及び４．４１ｇをクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物〕、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルツ〔ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％濃度で含む〕を含む溶液中、６５℃で３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを１ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるように加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次に６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１時間洗浄し、余分な水分を除いた後、増感紙を当てて−７０℃で一晩オートラジオグラフを行った。
その結果、ＢａｍＨＩ消化物で約４．５Ｋｂ、ＰｓｔＩ消化物で約２．３Ｋｂ、ＳａｃＩ消化物で約１０Ｋｂ、ＳａｌＩ消化物で約１．９Ｋｂの位置に、プローブとハイブリダイズするバンドを認めた。
以後の実験は、取扱いの簡便さからＰｓｔＩ、及びＳａｌＩ消化物について進めた。先に制限酵素消化したゲノムＤＮＡ１０μｇの０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、上述のハイブリダイゼーションで認められたバンドに相当する部分を切り出した。これをイージートラップ（EASYTRAP、宝酒造社製）を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩあるいはＳａｌＩサイトに挿入した。
【００３１】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、直径８．５ｃｍの丸シャーレ３枚に、１枚当り２００〜１０００個のコロニーを形成させた。次に、これらのプレートより制限酵素１種類当り２００個のコロニーを選択し、ナイロン膜（ハイボンドＮ+ 、アマシャム社製）上に写した。３７℃で３時間保温した後、このナイロン膜を０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ ＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣでリンスした。このナイロン膜とＤＮＡフラグメント４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）を用い、前述と同じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、ＰｓｔＩ断片で１個、ＳａｌＩ断片で２個のポジティブシグナルが得られた。それぞれの大腸菌ＪＭ１０９をＰ５４、Ｓ３０、Ｓ６８と命名した。
【００３２】
アルカリ溶菌法により、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれｐＵＦＳＥＰ５４、ｐＵＦＳＥＳ３０、ｐＵＦＳＥＳ６８と命名した。これを数種の制限酵素で消化し、電気泳動により切断パターンを解析した。その結果、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩなどの制限酵素サイトの存在を確認した。なお、この解析によりプラスミドｐＵＦＳＥＳ３０とｐＵＦＳＥＳ６８は同一であることが判明したので、以後の実験はｐＵＦＳＥＰ５４及びｐＵＦＳＥＳ３０を用いて行った。また、ｐＵＦＳＥＰ５４及びｐＵＦＳＥＳ３０の挿入部分は約８００ｂｐの共通配列を有することが推定された。これらのクローンを適当な制限酵素で消化し、ライゲーションキット（DNA Ligation Kit、宝酒造社製）でセルフライゲーションを行って、各種の欠失変異体を作製した。ジデオキシ法によってこれらの変異体の塩基配列を決定した結果、２つのクローンに渡って、挿入断片中に１６８９ｂｐの読み取り枠が見出された。この読み取り枠中に、α−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列分析により得られた配列がすべて見出された。以上の結果より、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。その結果を図１に示す。すなわちＡは２．３ｋｂ ＰｓｔＩ断片及びＢは１．９ｋｂ ＳａｌＩ断片の制限酵素地図と、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の位置を示した図であり、図中矢印はα−１，３／４−フコシダーゼの翻訳開始点、太線はα−１，３／４−フコシダーゼのコード領域を示し、Ａの太線中のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ間は、Ｓの太線中のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ間に相当し、ＡとＢを合せることにより、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の全長を知ることができる。また、α−１，３／４−フコシダーゼをコードする塩基配列を配列表の配列番号２に、その塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３３】
実施例２ α−１，３／４−フコシダーゼポリペプチドを発現するプラスミドの構築
（１）α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端側ポリペプチドをコードするプラスミドの構築
α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端側ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅するために２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅ（配列番号２１）、プライマーＳ３０ＲＶ（配列番号２２）をデザインし合成した。プライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅは配列番号２の塩基配列番号１３６−１５３の５′−３′の向きに相当する１８ｍｅｒの上流にＨｉｎｄ III及びＮｄｅＩサイトをデザインした３４ｍｅｒであり、プライマーＳ３０ＲＶは配列番号２、塩基配列番号４４３−４６１の３′−５′の向きに相当する１９ｍｅｒの合成ＤＮＡである。
テンプレートとして、実施例１で得られたプラスミドｐＵＦＳＥＰ５４約１００ｐｇをジーンアンプＰＣＲリージェントキット（宝酒造社製）中の１０μｌの１０倍濃度増幅用緩衝液、１６μｌの１．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌのプライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅ、２０ｐｍｏｌのプライマーＳ３０ＲＶ、２．５ユニットのアンプリタックと混合し、更に滅菌水を加えて１００μｌの溶液にした。この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーによる増幅反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間（変性）→５５℃で１分間（プライマーのアニーリング）→７２℃で１．５分間（合成反応）のサイクルを２５サイクル行った。反応液の１０μｌについて３％アガロースゲル電気泳動を行った後エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、予想される３４２ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を確認した。ＰＣＲ反応液の残りをエタノール沈殿により濃縮した後二つに分けた。一方はＨｉｎｄ III、ＳａｌＩで切断後、ｐＴＶ１１９ＮＮｄｅ〔ｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩに変換することにより作製〕のＨｉｎｄ III−ＳａｌＩサイトに挿入し、もう一方はＮｄｅＩ、ＳａｌＩで切断後、ｐＴＶ１１９ＮＮｄｅのＮｄｅＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。それぞれをｐＴＦＳＥＦ１０１Ｎ及びｐＴＦＳＥＭ１０１Ｎと命名した。各々で宿主として大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後、ＰＣＲ法による挿入断片の確認、ジデオキシチェーンターミネーター法による挿入断片の塩基配列の確認を行った。
【００３４】
（２）α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子全長をコードするプラスミドの構築
実施例１で得られたプラスミドｐＵＦＳＥＳ３０をＳａｌＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行い、１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを切り出し抽出精製した。次に、実施例２−（１）で得られたプラスミドｐＴＦＳＥＭ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換させた。アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、ＳａｌＩ消化によるＳａｌＩサイト再生の確認、及びＳａｃＩ消化による挿入断片の方向確認を行った。こうして得られたα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子全長をコードするプラスミドをｐＴＦＳＥＭ２０１と命名した。同様に実施例２−（１）で得られたプラスミドｐＴＦＳＥＦ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを挿入したプラスミドｐＴＦＳＥＦ２０１を構築した。このプラスミドには、α−１，３／４−フコシダーゼＮ末端の上流にｌａｃＺα由来のペプチドを含む１０アミノ酸残基（Ｍｅｔ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｍｅｔ）〔配列番号２３〕をコードする配列が含まれており、ｌａｃＺのＳＤ配列及びその開始コドンを利用してｌａｃＺαとの融合体としてのα−１，３／４−フコシダーゼの誘導発現が期待される。
ｐＴＦＳＥＭ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１と表示する。また、ｐＴＦＳＥＦ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１と表示し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４９５０として寄託されている。
【００３５】
実施例３ 組換体α−１，３／４−フコシダーゼの大腸菌における発現
（１）α−１，３／４−フコシダーゼポリペプチドの大腸菌における発現
実施例２で得られた大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１あるいは Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地５ｍｌに接種して３７℃で一晩振とう培養し、その１％を新たに同培地５ｍｌに接種した。培養後の濁度（６００ｎｍの吸光度）がおよそ０．５の段階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液１００μｌを遠心分離して菌体を集め、５０ｍＭ リン酸カリ緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。次に、同緩衝液１００ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液とした。この抽出液及び沈殿をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１由来の抽出液及び沈殿には分子量約５５，０００のα−１，３／４−フコシダーゼと考えられるバンドが観察され、α−１，３／４−フコシダーゼタンパク質を発現していることが確認できたが、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１はほとんど酵素タンパク質を発現していないことがわかった。そこで次に Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の菌体抽出液のα−１，３／４−フコシダーゼ活性測定を、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って行った。その結果、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の菌体抽出液の活性は培養液１ｍｌ当りに換算して約１ミリユニットであることがわかった。なお、α−１，３／４−フコシダーゼ構造遺伝子をコードしないｐＴＶ１１９Ｎｄｅ、及びＮ末端部分のみをコードするｐＴＦＳＥＦ１０１Ｎを保持する大腸菌ＪＭ１０９を同様に処理したが、α−１，３／４−フコシダーゼ活性は全く認められなかった。以上の結果から、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１が生産するα−１，３／４−フコシダーゼの大部分は封入体の形で不溶化している可能性が考えられた。
【００３６】
（２）α−１，３／４−フコシダーゼの大腸菌における発現と封入体の精製
大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地１０ｍｌに接種して３７℃で５時間振とう培養し、これを５００ｍｌの同じ培地の入った２リットル三角フラスコに５ｍｌ植菌して３７℃で１００ｒｐｍで振とう培養した。培養液の濁度（６６０ｎｍの吸光度）がおよそ０．５になった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍｌに懸濁して超音波処理を行い菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して封入体を含む不溶性画分を集めた後、２０ｍｌの１Ｍショ糖溶液に懸濁した。これを１８，０００×ｇで３０分間遠心分離して封入体を含む沈殿を得た。これを１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２％トリトンＸ−１００溶液４０ｍｌに懸濁し、一晩４℃に静置した。遠心分離により不溶物を集めてから再度同じ操作を繰返し封入体を洗浄した。得られた封入体の一部をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、半分以上のタンパク質は分子量約５５，０００の位置に泳動されており、得られた封入体画分の半分以上のタンパク質は組換体α−１，３／４−フコシダーゼであると推定された。またこの組換体α−１，３／４−フコシダーゼのタンパク質量は、同時に分析した牛血清アルブミンのバンドとの比較から、培養液１リットル当り少なくとも１０ｍｇ以上得られると推定された。
【００３７】
（３）封入体の可溶化とリフォールディング
得られた封入体の１／１０量（培養液１００ｍｌ相当）を８Ｍ 尿素、１０ｍＭ ジチオスレイトールを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌに懸濁し、室温で１時間かくはんして可溶化した。遠心分離により残った不溶物を除去した後、上清の５０μｌに同じ緩衝液を加え５ｍｌとした。これを分子量１０，０００カットの透析チューブに入れて０．６Ｍ ＫＣｌを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５００ｍｌに対して１５℃で一晩透析した。透析内液を遠心分離して不溶物を除き、上清７ｍｌを得た。この溶液のα−１，３／４−フコシダーゼ活性をジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って測定した。その結果、この上清中の活性は約１０ｍＵ／ｍｌであることがわかった。すなわち、本発明の遺伝子をもつ大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の培養液１リットルから約１４ユニットの組換体α−１，３／４−フコシダーゼが得られることがわかった。
【００３８】
（４）組換体α−１，３／４−フコシダーゼの基質特異性
ピリジルアミノ化（ＰＡ−）ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII （宝酒造社製）、１００ｐｍｏｌを含む３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０に実施例３−（３）で得られた酵素溶液１０μｌを加えて３７℃で一晩反応を行った。反応液を凍結乾燥した後、グライコタッグ（Glyco TAG 、宝酒造社製）を用いてＰＡ化反応を行い、この反応液を陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを用いた単糖分析に供した。その結果、組換体酵素の作用によって、基質であるＰＡ−ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII からフコースが遊離してきたことを確認することができた。
【００３９】
また、種々のＰＡ化オリゴ糖を基質としてα−１，３／４−フコシダーゼ活性をジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って測定したところ、該組換体酵素はα１，３及びα１，４フコシド結合に特異的で、α１，２フコシド結合及びα１，６フコシド結合には全く作用しないことがわかった。またα２，３シアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースIIにもほとんど作用しなかった。以上の基質特異性は、ストレプトマイセスｓｐ １４２のα−１，３／４−フコシダーゼのものと全く同じであった。
【００４０】
【発明の効果】
以上の結果から、本発明によりα−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、これにより、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を提供することが可能となり、α−１，３／４−フコシダーゼ活性を持つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。本発明によれば、本酵素生産においてＬ−フコースによる誘導培養は不要であり、生産性は高い。また、α−１，３／４−フコシダーゼの存在、あるいは発現の様子を調べるターゲットが提供されたことにより、この塩基配列を基にプローブやプライマーを作製することや、アミノ酸配列を基に抗体を作製することなどが可能となった。
【００４１】
【配列表】
【００４２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Pst I 断片とSal I 断片の制限酵素地図の相関を示す図でありＡは２．３Kb Pst I断片及びＢは１．９Kb Sal I断片の制限酵素地図を示す図である。
Claims (3)
- 配列表の配列番号２に記載したＤＮＡ配列からなるα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子。
- 請求項１記載の遺伝子をプローブとし、６×ＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃、２０時間のハイブリダイゼーションを行って得られるα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子。
- 請求項１又は２に記載の遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた組換体を培養し、該培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを採取することを特徴とするα−１，３／４−フコシダーゼの製造方法。
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