JPH08503609A - 病原性−特異的細菌ｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 シゲラ種および腸管組織侵入性大腸菌（EIEC）における病原性に関連するATPジホスホハイドロラーゼ（アピラーゼ、EC 3.6.1.5）をコードするヌクレオチド配列が開示される。更にそのヌクレオチド配列またはその特異的部分より成るハイブリッド形成プローブ；そのハイブリッド形成プローブを使用して成る病原性シゲラ種およびEIECの特異的検出方法；および前記診断に使用するための診断キットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 病原性−特異的細菌ＤＮＡ配列 技術分野 シゲラ種（Shigella sp.）および腸管組織侵入性大腸菌（EIEC）における病原 性に関連するATPジホスホハイドロラーゼ（アピラーゼ（apyrase）、EC 3.6.1.5 ）をコードするヌクレオチド配列が開示される。更に、そのヌクレオチド配列ま たはその特異的部分より成るハイブリッド形成プローブ、そのハイブリッド形成 プローブを使用して成る病原性シゲラ種およびEIECの特異的検出方法および前記 診断に使用するための診断キットが開示される。 背景技術 シゲラまたは関連の腸管組織侵入性大腸菌（EIEC）に起因する赤痢は、速かに 治療しないと致命傷となり得る。死亡率および罹患率は、とりわけ発展途上国の 小児にあっては極めて高い。シゲラに起因する赤痢は、細菌側の要因と宿主側の 要因の双方が関与するいくつかの複雑な生化学的事象の発現である。結腸上皮細 胞への細菌侵入は初期の必須段階であって、その後に、細胞内増殖および隣接細 胞の再感染が続くのである（１）。分子遺伝学的研究によりシゲラの染色体およ び220-230kbメガプラスミド上に病原性表現型、例えばコンゴ-レッド（Congo Re d）結合（引用文献２に総括されている）、侵入（３、４）、細胞内展開（５、 ６、７）および体温調節（８）を担う細菌タンパク質をコードするいくつかの領 域が確認されている。初期の研究から、二つの侵入プラスミド抗原（invasionpl asmid antigen（ipa））、すなわち63kDa（ipa b）と43kDa（ipa c）のレベルが 内皮細胞へのシゲラの侵入中に調節されることが明らかとなって いる。 病原性シゲラによる宿主死の生化学的基礎は大体において未だに知られていな い。SansonettiおよびMournier（９）は、J774マクロファージを用いた研究から 、ATP濃度の急激かつ劇的な低下、ピルベート濃度の増加およびラクテート生産 の停止に反映されるような、侵入細菌による宿主細胞のエネルギー代謝の干渉が 細胞死の理由になり得ると結論した。 核酸（DNAおよびRNA）ハイブリッド形成は、ウイルス、細菌、真菌および寄生 生物を含む様々な感染症の原因体の検出に現在よく使われている（10）。シゲラ 症の初期（急性期）に血清診断を行うことは可能ではなく、一方従来からの微生 物学的および生化学的方法は手間がかかり時間もかかる。 EIECおよびシゲラ検出のための診断法の開発には二つのアプローチがとられて いる。一群の研究において、その生物のDNAの非反復（ユニーク）配列が同定さ れそしてプローブとして用いられた。すなわち、SmallおよびFalkow（11）は、 四つの病原性シゲラ種およびEIECから単離されたDNAと特異的にハイブリッド形 成したEIECのメガプラスミドからの2.5kb HindIII DNA断片を報告した。前記2.5 kb断片の配列決定セグメントに相当する21-塩基合成オリゴヌクレオチドはすべ てのシゲラ種およびEIECのDNAとハイブリッド形成することが報告された（12） 。もう一つの報告（13）においては、シゲラとEIEC双方のDNAの検出にフレキシ ナー菌（S．flexneri）５の17-kbEcoＲＩ断片が用いられた。Venkatesanら（14 ）は、シゲラとEIEC双方の特異的同定のために、シゲラメガプラスミドDNAの未 同定遺伝子配列の一部を用いた。もう一つのアプローチとして、病原生物の 同定のために、同定された病原性-特異的抗原の遺伝子が用いられた。すなわち 、Venkatesanら（15）は、病原性シゲラ種およびEIECの検出のために、侵入陽性 抗原（invasion positive antigen）をコードすることが知られている三種類の 遺伝子の部分を用いた。 本発明の簡単な説明 本発明は、ヌクレオシドトリホスフェートおよびヌクレオシドジホスフェート をヌクレオシドモノホスフェートに加水分解し、シゲラの全種（例えばフレキシ ナー菌、赤痢菌（S．dysenteriae）、ゾンネ菌（S．sonnei）、ボイド菌（S．bo ydii）および関連のEIECと関係する酵素（ATPジホスホハイドロラーゼまたはア ピラーゼ）の同定に基づくものである。アピラーゼをコードする遺伝子がクロー ン化され配列決定されている。開示された遺伝子の非反復ヌクレオチド配列は、 例えば病原性シゲラおよび腸管組織侵入性大腸菌といった病原性細菌の病原性決 定因子の検出に潜在的用途を有している。 そのタンパク質をコードする遺伝子を構成するDNA配列は配列表（配列番号： １）に開示されている。本発明は（ｉ）そのDNA配列、（ii）そのDNA配列または その部分より成るDNAハイブリッド形成プローブ、（iii）かかるプローブを用い るシゲラ種およびEIECの同定方法、および（iv）前記DNA配列、またはその部分 、を病原体の検出に用いた診断キットに関する。 本発明の詳細な説明 一面において、本発明はシゲラおよび／またはEIEC株においてATPジホスホハ イドロラーゼ（アピラーゼ）をコードするDNA配列に関する。もう一つの面にお いて、本発明は配列表（配列番号：１） に示されたDNA配列に関する。 更にもう一つの面において、本発明は配列表（配列番号：１）に示されたヌク レオチド位置310から978までのヌクレオチド配列より成るDNA配列、または（ｉ ）そのアミノ酸配列が配列表（配列番号：２）に示された位置１から223までの アミノ酸配列と少なくとも90％相同であるペプチドをコードする、または（ii） 前記DNA配列の有効亜配列を構成する前記DNA配列の類似体に関する。 この文脈において、「DNA配列」という用語は、配列表に示された一本鎖DNA配 列のほか、同DNA配列の相補鎖および相当する二本鎖配列をも包含する。 前記において用いられた「有効亜配列」とは、シゲラおよび／またはEIEC株に おけるアピラーゼ活性に関し少なくとも部分的には機能的である亜配列（snbseq uence）のことである。この亜配列は、DNA配列のいずれかの端を切除した結果、 あるいはそのDNA配列の一以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を除去し た結果であってよい。 更にまた、ストリンジェントなハイブリッド形成条件の下で前記DNA配列また はその特異的部分とハイブリッド形成するDNA配列も本発明に包含される。「ス トリンジェントなハイブリッド形成条件」という用語はその普通の意味を有する ものとして、すなわち、ハイブリッド形成が通常の実験室マニュアル例えばSamb rook，J.，Fritsch，E．F．およびManiatis，T．E．：Molecular Cloning．A La boratory Manual．（Cold Spring Harbor，NY，1989）に従って行われるものと して理解されるべきである。 本発明のもう一つの面は、前述のDNA配列より成るハイブリッド 形成プローブである。すなわち、本発明のハイブリッド形成プローブは、適切に は、配列表（配列番号：１）に開示されたヌクレオチド241から始まりそしてヌ クレオチド978で終わる738ヌクレオチドDNA断片で構成され得る。 本発明のハイブリッド形成プローブは既知の方法により病原性シゲラのメガプ ラスミドDNAに特異的にハイブリッド形成できる。少なくとも30ヌクレオチドを 含む本発明のDNA配列の連続セグメントも同じハイブリッド形成能を有するはず であると考えられる。換言すると、ここに記載のDNA配列の断片は大小にかかわ りなくハイブリッド形成プローブとして用いることができるのである。 ハイブリッド形成プローブは、特異的mRNAとハイブリッド形成させるために相 補鎖から設計することもできそれによってハイブリッド形成可能な配列の濃度を 高めることができる。このためには、DNAと完全なmRNAの両配列とハイブリッド 形成させるべく、配列の両端からプローブを合成するのが望ましい。 本発明のハイブリッド形成プローブは標識された形で用いるのが好ましい。そ の標識は、プローブに共有結合的に結合した放射性標識または非放射性レポータ ー分子のいずれであってもよい。プローブは、例えば多くのホスホジエステル結 合のところであるいはプローブDNAの末端のところで³²Pなどの放射性元素をプロ ーブ内に取り込んだり、発色団または発蛍光団あるいは化学的または免疫学的方 法により検出され得る分子である有機分子を連結するなどして標識することがで きる（17）。 本発明のもう一つの面は、前述のハイブリッド形成プローブとシゲラおよびEI ECの全DNAとのハイブリッド形成を利用する病原性シ ゲラのメガプラスミドDNAの検出方法である。 この方法を行うために、所望長のオリゴヌクレオチドをアピラーゼ遺伝子の73 8 nt DNA配列から合成することができる。かかるオリゴヌクレオチドの一つを放 射性または非放射性レポーター分子で標識したものを検体DNAとのハイブリッド 形成に用いることができる。738 nt DNA配列内の異なる領域から合成される一以 上の付加的なオリゴヌクレオチドを微量滴定（マイクロタイター）プレートの被 覆に用いることができる。この被覆された微量滴定プレートは次いで、その微量 滴定プレート上での第二のハイブリッド形成によるすでに標識合成オリゴヌクレ オチドとハイブリッド形成済みの検体DNAの捕捉に用いることができる。その捕 捉ハイブリッドは次いで、レポーター分子の性質に依存する適切なプロトコール を用いて評価することができる。プレート上でハイブリッドが検出されれば検体 中に特異的DNAが存在することが示唆されることになる。 図１はかかるプロトコールを図示したものである。 従って、シゲラおよびEIECの診断方法は適切には次の諸段階より成る： （ａ）シゲラまたはEIECの有無を試験すべき臨床標本由来の細菌を適切な培地で 増殖する。 （ｂ）核酸を培養物から抽出する。細菌を適切には４Ｍ塩酸グアニジン、12.5mM EDTA、0.5％ナトリウムラウリルサルコシン、0.5％トリトンＸ-100を含む溶液 で溶菌させることができる。所望により、抽出された核酸物質を標準的手順を用 いたPCRにより増幅させることができる。 （ｃ）段階（ｂ）で得られた核酸（DNAおよび／またはRNA）と、前述 の方法で標識された前述のハイブリッド形成プローブとをハイブリッド形成させ る。 （ｄ）（ｃ）におけるプローブとは異なる領域の配列から合成された前述の第二 のハイブリッド形成プローブ（その第二のハイブリッド形成プローブは適切には 固体支持体上に被覆される）により段階（ｃ）で得られたハイブリッドを捕捉す る。 （ｅ）例えば、放射性利用法、比色法、蛍光分析法または酵素的方法により、標 識されたハイブリッド形成物質の有無を検出する。 この方法に基づき、シゲラおよびEIEC検出用診断キットを既知の方法により設 計することができる（10）。かかるキットも本発明の範囲に包含され、また適切 には次のパーツを含み得る： （１）既知の方法で標識済みのハイブリッド形成プローブをも含有する、細菌溶 菌用溶菌溶液。 （２）そのプレート上に細菌DNAおよび／またはRNAを捕捉するための、（１）に よるプローブとは異なる領域の配列から合成された第二のハイブリッド形成プロ ーブで被覆された微量滴定プレート。 （３）（１）に従って細菌DNA／RNAにハイブリッド形成した後（２）に従って微 量滴定プレート上に捕捉された標識されたプローブを検出するための適切な試薬 。 本発明の更なる面は次のとおりである： ・例えば研究具として用いるための、前記DNA配列から取得し得る組換えポリペ プチド。 ・そのタンパク質をコードするDNAを宿主生物で発現させることより成る前記組 換えポリペプチドの製造方法。 ・前記ポリペプチドをコードするDNAを含有する組換えクローニ ングベクター。 ・前記ポリペプチドをコードするDNAが移入した微生物または細胞培養物。 ・例えば研究具として用いるための、実質的に純粋な形のシゲラまたはEIEC株由 来の病原性関連アピラーゼタンパク質。 ・（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィ、および（ｂ）分取式ゲル電気泳動を行 うことより成る実質的に純粋な形の前記アピラーゼタンパク質の取得方法。 ・病原性シゲラおよび／またはEIEC株におけるアピラーゼタンパク質またはその 活性を酵素的および／または免疫学的方法により検出することより成る前記株の 検出方法。 ・アピラーゼ酵素の活性を干渉することより成るシゲラおよび／またはEIEC感染 からの宿主の保護方法、およびアピラーゼ酵素のシゲラおよび／またはEIEC感染 治療のための標的として使用。 ・開示されたDNA配列から入手できる（ｉ）DNA配列、（ii）ハイブリッド形成プ ローブ、（iii）実質的に純粋なアピラーゼタンパク質、および／または（iv） 組換えポリペプチドの病原性シゲラおよび／またはEIEC株検出のための使用。 実施例 （ｉ）シゲラおよびEIECにおける病原性特異的アデノシントリホス ファターゼ（ATPアーゼ）活性の実証 細菌をLB培地で一夜増殖させ、低速遠心分離（5000×g、10分間）により集菌 しそして10mM Hepes緩衝液、pH7.5で２回洗浄した。洗浄した菌体（３×10⁹個） を200μlの50mM Tris-Cl、pH7.5、10mM EDTA、５mM ATP（中和したもの）に再懸 濁し、そして37℃で30分間インキ ュベートした。菌体をエッペンドルフ遠心機で遠心分離することにより除去した 後、遊離したP_iをChenの方法（16）により評価した。 表１は様々な増殖条件の下で増殖させたフレキシナー菌の様々な株のATPアー ゼ活性を示す。この活性は病原性単離物にのみ見られ、非病原性単離物またはプ ラスミドキュアリングを施した株には見られなかった。シゲラの他の多くの病原 性関連特性と同様に、この活性はその病原性細菌をシゲラが非病原性となる温度 の30℃または42℃で増殖させると大幅に低下した（引用文献２参照）。この表は また、この酵素活性が他の病原性系統のシゲラ、すなわち赤痢菌、ゾンネ菌およ びボイド菌（S．boydii）、および関連のEIECには認められたが非侵入性大腸菌K -12には認められなかったことをも示している。 （ii）ATPアーゼ活性を有する25kDaタンパク質の精製およびそのＮ -末端アミノ酸配列決定 このタンパク質の好都合でありかつ比較的高濃度の給源（0.8μmole／分／mg- タンパク質）として役立つ菌体ペレットのEDTA抽出液から酵素を単離するために 簡単な二段階精製スキームを開発した。DEAE Sephadex A-50クロマトグラフィー を用いて50倍濃縮物が60％収率で得られた。酵素は0.3〜0.35M NaClの間に単一 ピークとして溶出した。この画分をSarkosylを含む分取式ポリアクリルアミドゲ ルでの電気泳動および電気溶出（electroelution）にかけた結果、SDS-PAGEによ って明らかとなるように（図２）高度に濃縮された調製物が得られた。このタン パク質の分子質量は25kDaである と評価された。Sephadex G-100ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて30kDa球状 タンパク質の位置に単一ピークとしてそれが溶出したことは、天然状態の酵素が モノマーであったことを示唆している。このタンパク質の部分Ｎ-末端アミノ酸 配列は次のとおりであることがわかった： Leu Lys Ala Glu Gly Phe Leu Thr Gln Gln Thr Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ile Leu Pro （配列表の配列番号：３） （iii）ATPジホスホハイドロラーゼとしてのタンパク質の同定 精製酵素調製物はNTPに関しほとんど特異性を示さず、ATPに関する相対的活性 は、GTP、CTPおよびUTPについてそれぞれ1.5、1.0および0.8であった。更にそれ はADPも加水分解したが0.16という比較的低い相対的割合であった。しかしなが らそれはｐ-ニトロフェニルホスフェートを加水分解しなかった。ATP加水分解の 反応生成物のTLC分析からADPがATPからAMPへの転化における中間体であることが わかったが（図３）、このことはその酵素によりATPからP_iが逐次的に遊離され ることを示唆している。それ故、このタンパク質は、アピラーゼとも称されるAT Pジホスホハイドロラーゼ（EC 3.6.1.5）であると同定された。 （iv）酵素がメガプラスミドDNAの0.9kb断片によりコードされてい ることの実証 シゲラのプラスミドキュアリングを施した株（BS176）にはATPアーゼ活性が無 いことからその酵素は病原性シゲラのメガプラスミドによりコードされているこ とが示唆された。ATPアーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するために、フレキ シナー菌メガプラスミド DNAライブラリーをHindIII部位のところでベクターpUC8中に構築し、そして宿主 HB101に形質転換した。組換えクローンをATPアーゼ活性の有無で選抜した。試験 した約512個のクローンから一つがATPアーゼ活性陽性であることがわかり、これ をpARC 25と名付けた。このpARC 25クローンを部分制限地図分析にかけた。それ は2.1kbのインサートを有していた（図４）。この2.1kbインサートから、M13 mp 18にクローン化された0.9kb PvuII-HindIII断片（図４）がATPアーゼ活性をコー ドする遺伝子の最小サイズであることがわかった。2.1kbおよび0.9kb構築物のい ずれからのタンパク質も25kDaの見掛け分子質量を有した（図２）。更に、クロ ーン化された酵素から配列決定されたＮ-末端の最初の10アミノ酸は病原性シゲ ラから単離された酵素と符合した。 （ｖ）ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の決定 2.1kb HindIII断片上の1134bp領域のヌクレオチド配列を両鎖について決定し た（配列表の配列番号：１）。738塩基の単一の転写解読枠は非反復PvuII部位の 38塩基下流から始まりそして978位のTAAトリプレットで終止することがわかった 。この配列はシゲラメガプラスミドDNAのいずれの公表配列とも符合しなかった 。前記ヌクレオチド配列から翻訳されたペプチド（配列表の配列番号：２）の20 個のＮ-末端アミノ酸（配列表の配列番号：２の位置１〜20）はタンパク質配列 決定により決定されたＮ-末端の20個のアミノ酸（配列表の配列番号：３）と完 全に符合した。誘導されたアミノ酸配列から、成熟タンパク質には存在せず、ま たその転位に不可欠なシグナル配列の明らかに一部をなしていた２３アミノ酸長 リーダーペプチドの存在が明らかとなった。 （vi）アピラーゼ遺伝子のクローニングおよび過剰発現 クローンpARC25からのプラスミドDNAを鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反 応（PCR）によりアピラーゼ遺伝子配列を増幅した。 NcoI部位を強制挿入した A A A C C A T G G A A A C C A A A A A C T T T C T T C （配列表の配列番号：４）なる配列を有する27塩基長正プライマーは配列の位置 236から開始し、一方、 G C C G G A T C C A G G C T G T C C A G C （配列表の配列番号：５）を有しBamＨＩ部位を強制挿入した21塩基長逆プライ マーは位置1003から開始した。PCR増幅生成物をベクターpTrc 99cのNcoＩ／Bam ＨＩ部位にクローン化しそして宿主BL21（DE3）を形質転換した。陽性クローン をまず形質転換コロニーのPCR増幅により同定した。次にそれらを、IPTGでクロ ーンを誘導した後、ATPアーゼ活性を測定することにより確認した。組換えクロ ーンのATPアーゼ活性は野生型フレキシナー菌に比べ約１５倍増加した。 シゲラ種およびEIECにおける前記酵素活性の存在は生物学的に有意義であると 思われる。何故ならばそれは、細菌が侵入した細胞内で細胞毒として作用し得、 そして宿主細胞のエネルギー代謝に干渉し得るからである。 （vii）ATPアーゼ酵素活性の特異性および感度 酵素活性を測定するために、細菌をルリアブロス（Luriabroth）中で一夜増殖 し、低速遠心分離により集菌しそして10mM Hepes緩衝液、pH7.5で洗浄した。洗 浄した細菌（５×10⁸個）を前述の如く全菌体ATPアーゼ測定にかけた。 シゲラおよびEIECにおけるATPアーゼ活性の特異性が表２で更に 実証されている。多くの腸管病原体について特異的ATPアーゼ活性の有無を試験 した。これらの生物はいずれも、病原性シゲラおよびEIECに比べ有意水準の酵素 活性を示さなかった。 酵素アッセイの感度を測定するために、一夜増殖させたシゲラの10倍連続希釈 液を固定数の大腸菌K-12の存在下および非存在下に測定した（表３）。並行実験 として、様々な数のシゲラを大腸菌K-12と共に一夜増殖しそしてATPアーゼ活性 を測定した（表４）。一定数のシゲラをスパイクして加えた正常便検体も純粋な シゲラと同水準まで陽性酵素活性を示したが、このことは便検体それ自体はシゲ ラATPアーゼ活性の検出に干渉しないことを示唆している。 この酵素アッセイの感度は10⁸個の生物であるが、これは適当な培地で一夜増 殖する場合、便検体／混合培養物への接種物としては50個以下の生物となる。 （viii）ドットブロットハイブリッド形成による特異性および感度の 測定 特異性を測定するために、細菌をルリアブロスで一夜増殖した。培養液（1.0m l）をペレット化しそして100μlの溶菌溶液（２％ Triton X-100または４Ｍグア ニジンHCl、0.5％ Na-ラウリルサルコシン、0.5％ Triton X-100、12.5mM EDTA ）で溶菌した。溶菌溶液を10分間沸騰させ、そして遠心分離後に、５〜10μlの 上清を蒸留水で100μlに希釈し、次いで等容の0.5N NaOHで変性した。変性させ たDNAサンプルを0.5M NaOH、1.5M NaCl中で予めインキュベートしたナイロン膜 上にスポットした。それらの膜を1.5M NaClを含有する0.5M Tris-Cl、pH8.0で中 和した。前ハイブリッド形成をシールされたプラスチック袋内で２〜３時間、55 ℃で行った。前ハイブリッド形成緩衝液は、６×SSC、１％SDS、２×Denhardt溶 液、100μg／mlサケ精子DNAから構成した。前ハイブリッド形成は、同じ袋内で^{3 2} P-標識プローブ（アピラーゼ遺伝子の0.5kb内部断片）の添加後に行った。55℃ で一夜ハイブリッド形成を行った後、それらの膜を、２×SSC、２％SDS中、55℃ で15分間２回洗浄し、２×SSC、0.2％SDS中、55℃で15分間１回洗浄し、そして 最後に0.2×SSC中、55℃で１回洗浄した。膜をＸ線フィルムに24時間、−70℃で 曝露した（図５、パネルＡ）。 このドットブロット分析の感度を測定するために、50〜５×10⁶の範囲の様々 な数のシゲラを大腸菌K-12（10⁷個）と共に37℃で一 夜増殖した。1.0mlのこれらの培養液をドットブロットハイブリッド形成のため に前述の如く処理した（図５、パネルＢ）。並行実験として、ドットブロットハ イブリッド形成により検出可能な最少細菌数を、既知数のシゲラを溶菌しそして それら溶菌液をドットブロット分析に用いることにより測定した（図５、パネル Ｃ）。前記実験は、ハイブリッド形成実験に用いられたプローブが様々なシゲラ 種およびEIECにのみ特異的であったことを示唆した。検出感度は10⁷個のシゲラ であったがこれは、適当な培地中で一夜増殖させる場合、便検体／混合培養物へ の接種物としては50個以下の生物となる。 （ix）PCRによる特異性および感度の測定 ドットブロット分析のために、シゲラおよび他の生物の1.0ml一夜培養液から 前述の如くに溶菌物を調製した。それら溶菌物の１：100希釈液10μlをPCR反応 に用い、アピラーゼ遺伝子のヌクレオチド位置243で開始する25-マー正プライマ ーおよびヌクレオチド位置794で開始する27-マー逆プライマーを使用してアピラ ーゼ遺伝子の0.5kb内部断片を増幅した。このPCRは125μMの全dNTPおよび200ng の前記プライマーを用いて100μlの反応容量として30サイクル行った。このPCR の条件は、変性目的の94℃で30秒間の、アニーリング目的の55℃で30秒間の、お よび延長目的の72℃で１分間のインキュベーションを含む。10μlのPCR生成物を 次いで１％アガロースゲルで分析した（図６、パネルＡおよびＢ）。 前記PCR分析の感度を測定するために、食塩水に懸濁した正常便検体にシゲラ の純培養液の10倍希釈液をスパイクして加え、溶菌させそしてそれら溶菌物をPC R分析に用いた（図７、パネルＡ）。 別の実験として、５〜50×106個のシゲラを10⁷個の大腸菌K-12と共にルリアブ ロス中に接種しそして37℃で一夜増殖した。菌体を溶菌しそして前述の如くにPC Rのための処理を行った（図７、パネルＢ）。 このPCR分析はアピラーゼ遺伝子が様々な種のシゲラおよびEIECにのみ存在す ることを示唆した。PCRによる検出感度は混合菌集団中約100個のシゲラの存在で あった。更に、便検体はPCRを有意水準に阻害することは全くなかった。 引用文献 図面の簡単な説明 図１ （A）アピラーゼ遺伝子の738 nt DNA配列から合成された標識されたオリゴヌ クレオチドプローブと細菌核酸配列との溶液ハイブリッド形成。 （B）アピラーゼ遺伝子の738 nt DNA配列から合成された別のオリゴヌクレオ チドで被覆された微量滴定ウエル。 （C）（A）で得たハイブリッドと（B）におけるオリゴヌクレオチドとの捕捉 ハイブリッド形成。 （D）既知方法による標識検出準備の整った洗浄後の捕捉ハイブリッド。 図２ フレキシナー菌またはクローンpARC 25からアピラーゼを精製する過程での様 々な画分の12％SDS-PAGE分析。 レーン１：DEAE Sephadex A-50カラムクロマトグラフィーからプ ールされたΛＴＰアーゼ陽性画分； レーン２：天然PAGE（フレキシナー菌）からの電気溶出されたATP アーゼ陽性画分； レーン３：分子量マーカー； レーン４：天然PAGE（クローンpARC 25）からの電気溶出されたATP アーゼ陽性画分は25kDaアピラーゼタンパク質の位置 を示している。 図３ ATP加水分解の反応生成物の分析。精製酵素（８または80mU）（Ｕ＝μmole／ 分）をアッセイ媒体中でATPと共に15分間または30分 間インキュベートした。反応生成物はイソ酪酸：アンモニア：水（66：１：33 ）溶媒系を用いてポリエチレンイミンシートでTLCにより分析した。ヌクレオシ ドホスフェートは短波長UVで明らかにした。 レーン１：標準ヌクレオシドホスフェート； レーン２：８mU酵素、15分間インキュベーション； レーン３：８mU酵素、30分間インキュベーション； レーン４：80mU酵素、15分間インキュベーション； レーン５：80mU酵素、30分間インキュベーション。 図４ アピラーゼ遺伝子を含むクローンpARC 25の部分制限地図。 HindIII消化によりクローンpARC 25のプラスミドから得られた2.1kb DNA断片を 様々な酵素で消化しそして１％アガロースゲルで分析した。生成した断片を適当 なベクターにサブクローン化しそしてΛＴＰアーゼ活性の発現を試験した。H，H indIII；ＲＶ，EcoRＶ；ｐ，pstＩ；ＲＩ，EcoRＩ；ＨＩ，HpaＩ。 図５ ドットブロットハイブリッド形成の特異性および感度の測定。 パネルＡ 列ａ：１，フレキシナー菌２ａ；２，赤痢菌；３，ボイド菌；４，ゾンネ菌； ５，EIEC；６，フレキシナー菌２ａ（無プラスミド変異体）；７，フレキシナー 菌２ａ（非病原性）。 列ｂ：１，EPEC；２，ETEC；３，ネズミチフス菌；４，エーロモナス；５，エ ンテロバクター；６，クレブシエラ（klebsiella）；７，チフス菌。 列ｃ：１，エルジニア；２，プソイドモナス；３，ビブリオ：４，正常便フロ ーラ；５，プレイソモナス；６，c600（大腸菌）；７，大腸菌Ｋ-12。 パネルＢ １〜６、５×10⁶から50個までのシゲラの10倍連続希釈液を10⁷個の大腸菌Ｋ-1 2と共に一夜増殖させた。 パネルＣ １〜６、10⁹から10⁴個までのシゲラの10倍連続希釈液。 図６ PCRの特異性 パネルＡ レーン１，フレキシナー菌２ａ；２，赤痢菌；３，ボイド菌；４，ゾンネ菌； ５，EIEC；６，マーカー（λDNA、EcoRＩ／HindIII消化物）；７，フレキシナー 菌２ａ（無プラスミド変異体）；８，EPEC；９，ETEC；10，大腸菌Ｋ-12；11， チフス菌。 パネルＢ レーン１，ネズミチフス菌；２，エーロモナス；３，エンテロバクター；４， クレブシエラ；５，マーカー（λDNA、EcoRＩ／HindIII消化物）；６，エルジニ ア；７，プソイドモナス；８，正常便フローラ；９，ビブリオ；10，プレイソモ ナス；11，M90T（フレキシナー菌２ａ病原性）。 図７ PCRの感度 パネルＡ レーン１〜７，および９〜11，10⁹から１個までのシゲラの10 倍連続希釈液；レーン８，マーカー（λDNA、EcoRＩ／HindIII消化物）；レーン 12，正常便フローラ；レーン13，陰性コントロール。 パネルＢ レーン１〜６，５×10⁶から50個までの10倍連続希釈液を10⁷個の大腸菌Ｋ-12 と共に一夜増殖した；レーン７，マーカー（λDNA、EcoRＩ／HindIII消化物）； レーン８，大腸菌Ｋ-12。 配列表 （１）一般情報 （i）出願人 （A）名称：エー・ビー・アストラ（AB ASTRA） （B）通り名：クバルンベルガガタン（Kvarnbergagatan）16 （C）市名：ソーデルタリエ（Sodertalje） （E）国名：スエーデン （F）郵便番号（ZIP）：S-151 85 （G）電話：＋46-8-553 260 00 （H）ファクシミリ：＋46-8-553 288 20 （I）テレックス：19237 astra s （ii）発明の名称：病原性-特異的細菌DNA配列 （iii）配列数：５ （iv）コンピューターリーダブルフォーム： （A）媒体のタイプ：フロッピーディスク （B）コンピュ-ター：IBM PCコンパチブル （C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウエア：PatentIn Release ＃1.0 Version ＃1.25（EPO） （vi）先願データ： （A）出願番号：IN 874/MAS/91 （B）出願日：1991年11月26日 （vi）先願データ： （A）出願番号：SE 9203506-2 （B）出願日：1992年11月23日 （２）配列番号：１の情報： （i）配列の特性： （A）配列の長さ：1134塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：両形態 （D）トポロジー：直線状 （vi）起源： （A）生物名：フレキシナー菌（Shigella flexneri） （vii）直接の起源： （B）クローン：pARC 25 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表わす記号：CDS （B）存在位置：241..981 （ix）配列の特徴： （A）特徴を表わす記号：mat peptide （B）存在位置：310..978 （C）他の情報：／EC number＝3.6.1.5 ／product＝“Apyrase” （xi）配列：配列番号：１： （２）配列番号：２の情報： （i）配列の特性： （A）配列の長さ：246アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直線状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号：２： （２）配列番号：３の情報： （i）配列の特性： （A）配列の長さ：20アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直線状 （vi）起源： （A）生物名：フレキシナー菌 （xi）配列：配列番号：３： （２）配列番号：４の情報： （i）配列の特性： （A）配列の長さ：27塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直線状 （xi）配列：配列番号：４ （２）配列番号：５の情報： （i）配列の特性： （A）配列の長さ：21塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直線状 （xi）配列：配列番号：５：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 9/14 8827−4Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロイ，ラーマン・ケイ インド国バンガロール 560 003．マレス ワラム．イレブンスクロス．セブンスメイ ン151．アビージトアパートメント ナン バー42 (72)発明者 ラマチヤーンドラン，バサンテイ インド国バンガロール 560 022．イエシ ユワントプール．ケイ・エヌイクステンシ ヨン．フアーストクロス．フアーストメイ ン981

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シゲラおよび／またはEIEC株においてATPジホスホハイドロラーゼ（アピラ ーゼ）をコードするDNA配列。 ２．配列表（配列番号：１）に示されたDNA配列。 ３．配列表（配列番号：１）に示された位置310から位置978までの配列より成る DNA配列、または（ｉ）そのアミノ酸配列が配列表（配列番号：２）に示された 位置１から位置223までのアミノ酸配列と少なくとも90％相同であるポリペプチ ドをコードするかまたは（ii）前記DNA配列の有効亜配列を構成する前記DNA配列 の類似体。 ４．少なくとも30塩基または塩基対長である前記請求項１〜３のいずれかに記載 のDNA配列の連続断片。 ５．ストリンジェントなハイブリッド形成条件の下で前記請求項１〜４のいずれ かに記載のDNA配列またはその特異的部分とハイブリッド形成するDNA配列。 ６．前記請求項１〜５のいずれかに記載のDNA配列またはその特異的部分より成 るハイブリッド形成プローブ。 ７．一本鎖の形態の前記請求項６記載のハイブリッド形成プローブ。 ８．病原性シゲラおよび／またはEIEC株から核酸を捕捉できる前記請求項６また は７記載のハイブリッド形成プローブ。 ９．放射性または非放射性標識で標識された前記請求項６〜８のいずれかに記載 のハイブリッド形成プローブ。 10．前記請求項６〜９のいずれかに記載のハイブリッド形成プローブを用いる病 原性シゲラおよび／またはEIEC株の検出方法。 11．次の諸段階、すなわち （ａ）臨床検体由来の細菌を適当な培地中で増殖する； （ｂ）その細菌から核酸を抽出しそして所望によりその核酸をポリメラーゼ連 鎖反応により増殖する； （ｃ）段階（ｂ）で得られた核酸を前記請求項６に記載の標識されたハイブリ ッド形成プローブとハイブリッド形成させる； （ｄ）段階（ｃ）で得られたハイブリッドを固体支持体上に被覆された前記請 求項６に記載の第二のハイブリッド形成プローブで捕捉する； （ｅ）標識されたハイブリッド形成物質の有無を検出する 段階より成る病原性シゲラおよびEIEC株の検出方法。 12．病原性シゲラおよび／またはEIEC株を前記請求項10または11に記載の方法に より検出するための診断キット。 13．前記請求項３に記載のDNA配列から取得し得る組換えポリペプチド。 14．そのタンパク質をコードするDNAを宿主生物で発現させることより成る、前 記請求項13記載の組換えポリペプチドの製造方法。 15．前記請求項13記載のポリペプチドをコードするDNAを含有する組換えクロー ニングベクター。 16．前記請求項13記載のポリペプチドをコードするDNAが移入した微生物または 細胞培養物。 17．実質的に純粋な形のシゲラまたはEIEC株由来の病原性関連アピラーゼタンパ ク質。 18．（ａ）シゲラまたはEIECからの菌体抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィ ーにかけ、そして（ｂ）（ａ）からの検体を分取式ゲル電 気泳動にかけることより成る実質的に純粋な形の前記請求項17記載のアピラーゼ タンパク質の取得方法。 19．病原性シゲラおよび／またはEIEC株におけるアピラーゼタンパク質またはそ の活性を酵素的および／または免疫学的方法により検出することより成る前記株 の検出方法。 20．アピラーゼ酵素の活性を干渉することより成るシゲラおよび／またはEIEC感 染からの宿主の保護方法。 21．前記請求項17記載のアピラーゼタンパク質の、シゲラおよび／またはEIEC感 染治療のための標的としての使用。 22．前記請求項１〜５のいずれかに記載のDNA配列の、病原性シゲラおよび／ま たはEIEC株の検出のための使用。 23．前記請求項６〜９のいずれかに記載のハイブリッド形成プローブの、病原性 シゲラおよび／またはEIEC株の検出のための使用。 24．前記請求項13記載のポリペプチドの、病原性シゲラおよび／またはEIEC株の 検出のための使用。 25．前記請求項17記載のアピラーゼタンパク質の、病原性シゲラおよび／または EIEC株の検出のための使用。