JPH0670770A - ビフィドバクテリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 - Google Patents
ビフィドバクテリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法Info
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- JPH0670770A JPH0670770A JP19218392A JP19218392A JPH0670770A JP H0670770 A JPH0670770 A JP H0670770A JP 19218392 A JP19218392 A JP 19218392A JP 19218392 A JP19218392 A JP 19218392A JP H0670770 A JPH0670770 A JP H0670770A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 式（１）
UAUCGGGGAGCAAGCGAGA （１）
で表わされる配列又はこれに相補的な配列を有するビフ
ィドバクテリウム ロンガムｒＲＮＡ由来のオリゴヌク
レオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体をプローブ
として用いることを特徴とするビフィドバクテリウム
ロンガムの検出方法。 【効果】 本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバ
クテリウム ロンガムに特異的なものであり、この標識
体をプローブとして用いれば、ビフィドバクテリウム
ロンガムを迅速、簡便かつ正確に検出することができ
る。
ィドバクテリウム ロンガムｒＲＮＡ由来のオリゴヌク
レオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体をプローブ
として用いることを特徴とするビフィドバクテリウム
ロンガムの検出方法。 【効果】 本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバ
クテリウム ロンガムに特異的なものであり、この標識
体をプローブとして用いれば、ビフィドバクテリウム
ロンガムを迅速、簡便かつ正確に検出することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビフィドバクテリウム
ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎ
ｇｕｍ）に特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用い
る検出方法に関する。
ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎ
ｇｕｍ）に特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用い
る検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ビフィドバクテリウム属の種の同
定は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、ガス産
生、発育温度などを検査することにより行われている。
また、近年、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行
われるようになっている〔Ｂｅｎｎｏ，Ｙ．，微生物，
ｖｏｌ．６，ｐ．１〜１２（１９９０）〕。
定は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、ガス産
生、発育温度などを検査することにより行われている。
また、近年、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行
われるようになっている〔Ｂｅｎｎｏ，Ｙ．，微生物，
ｖｏｌ．６，ｐ．１〜１２（１９９０）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、表現形
質を基にした同定法は、試験者の熟練を必要とし、しか
も結果がでるまでにかなり時間がかかるという問題があ
った。また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる方法で
は、菌体からＤＮＡを抽出する必要があるが、ビフィド
バクテリウムはグラム陽性菌であるため、グラム陰性菌
に比べ溶菌操作が煩雑であるという欠点があった。更
に、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの値は、類縁性の高い種
同士、特にビフィドバクテリウム ロンガムとビフィド
バクテリウムインファンティスとでは、ともに高い値を
示し、明確な差がでないという問題もあった。
質を基にした同定法は、試験者の熟練を必要とし、しか
も結果がでるまでにかなり時間がかかるという問題があ
った。また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる方法で
は、菌体からＤＮＡを抽出する必要があるが、ビフィド
バクテリウムはグラム陽性菌であるため、グラム陰性菌
に比べ溶菌操作が煩雑であるという欠点があった。更
に、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの値は、類縁性の高い種
同士、特にビフィドバクテリウム ロンガムとビフィド
バクテリウムインファンティスとでは、ともに高い値を
示し、明確な差がでないという問題もあった。
【０００４】このため、ビフィドバクテリウム属のう
ち、特にビフィドバクテリウム ロンガムを迅速、簡便
かつ正確に検出する方法が望まれていた。
ち、特にビフィドバクテリウム ロンガムを迅速、簡便
かつ正確に検出する方法が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を行った。すなわち、ビフィドバク
テリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチドの標
識体をプローブとして用い、これとのハイブリッドを検
出する方法を考え、また、その際に塩基数２０前後の短
いオリゴヌクレオチドプローブを用いれば、核酸の抽出
を必要としないｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーショ
ンを行うことができ、１塩基の相違まで検出できるとい
う利点が得られる。また、プローブのターゲットとして
１６Ｓ ｒＲＮＡ上の種特異的な部分を選べば、１６Ｓ
ｒＲＮＡの配列は系統分類の指標として信頼性の高い
ものとされており、また、菌体当たりのｒＲＮＡのコピ
ー数が染色体ＤＮＡに比べ非常に多いため、検出感度が
上がると考えられる。
発明者らは鋭意研究を行った。すなわち、ビフィドバク
テリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチドの標
識体をプローブとして用い、これとのハイブリッドを検
出する方法を考え、また、その際に塩基数２０前後の短
いオリゴヌクレオチドプローブを用いれば、核酸の抽出
を必要としないｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーショ
ンを行うことができ、１塩基の相違まで検出できるとい
う利点が得られる。また、プローブのターゲットとして
１６Ｓ ｒＲＮＡ上の種特異的な部分を選べば、１６Ｓ
ｒＲＮＡの配列は系統分類の指標として信頼性の高い
ものとされており、また、菌体当たりのｒＲＮＡのコピ
ー数が染色体ＤＮＡに比べ非常に多いため、検出感度が
上がると考えられる。
【０００６】そこで、本発明者らは、種々のビフィドバ
クテリウムの標準株を酵素的に溶菌し、一般的な方法に
より粗高分子ＲＮＡを抽出し、この粗高分子ＲＮＡから
逆転写酵素を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を
決定した。得られた塩基配列を比較した結果、後記式
（１）で表わされる配列がビフィドバクテリウム ロン
ガムに特異的であり、プライマーとして有用であるこ
と、更にその標識体をプローブとして用いれば、ビフィ
ドバクテリウム ロンガムを迅速、簡便かつ正確に検出
できることを見出し、本発明を完成した。
クテリウムの標準株を酵素的に溶菌し、一般的な方法に
より粗高分子ＲＮＡを抽出し、この粗高分子ＲＮＡから
逆転写酵素を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を
決定した。得られた塩基配列を比較した結果、後記式
（１）で表わされる配列がビフィドバクテリウム ロン
ガムに特異的であり、プライマーとして有用であるこ
と、更にその標識体をプローブとして用いれば、ビフィ
ドバクテリウム ロンガムを迅速、簡便かつ正確に検出
できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、式（１） UAUCGGGGAGCAAGCGAGA （１） で表わされる配列又はこれに相補的な配列を有するビフ
ィドバクテリウム ロンガム ｒＲＮＡ由来のオリゴヌ
クレオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体をプロー
ブとして用いることを特徴とするビフィドバクテリウム
ロンガムの検出方法を提供するものである。
ィドバクテリウム ロンガム ｒＲＮＡ由来のオリゴヌ
クレオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体をプロー
ブとして用いることを特徴とするビフィドバクテリウム
ロンガムの検出方法を提供するものである。
【０００８】本発明のビフィドバクテリウム ロンガム
に特異的なオリゴヌクレオチドは、前記式（１）で表わ
されるＲＮＡ配列もしくはこれに相補的な式（２）又は
（３）で表わされるＤＮＡ配列を有するものである。 5′TCTCGCTTGCTCCCCGATA3′ （２） 3′AGAGCGAACGAGGGGCTAT5′ （３） また、これらの配列を有してプローブとしての機能を有
するものであれば、５′又は３′末端側に他の塩基が付
加されたものであってもよい。
に特異的なオリゴヌクレオチドは、前記式（１）で表わ
されるＲＮＡ配列もしくはこれに相補的な式（２）又は
（３）で表わされるＤＮＡ配列を有するものである。 5′TCTCGCTTGCTCCCCGATA3′ （２） 3′AGAGCGAACGAGGGGCTAT5′ （３） また、これらの配列を有してプローブとしての機能を有
するものであれば、５′又は３′末端側に他の塩基が付
加されたものであってもよい。
【０００９】これらのオリゴヌクレオチドは、例えばＤ
ＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによ
り、またビフィドバクテリウム ロンガムの遺伝子から
酵素的に切り出すことにより調製することができる。
ＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによ
り、またビフィドバクテリウム ロンガムの遺伝子から
酵素的に切り出すことにより調製することができる。
【００１０】これらのオリゴヌクレオチドを用いてビフ
ィドバクテリウム ロンガムを検出するには、このオリ
ゴヌクレオチドの標識体をプローブとして用い、このプ
ローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを行い、
ハイブリッド形成の有無を調べることにより、ビフィド
バクテリウム ロンガムの存在を確認することができ
る。
ィドバクテリウム ロンガムを検出するには、このオリ
ゴヌクレオチドの標識体をプローブとして用い、このプ
ローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを行い、
ハイブリッド形成の有無を調べることにより、ビフィド
バクテリウム ロンガムの存在を確認することができ
る。
【００１１】標識体は、例えばアイソトープや蛍光物質
などの検出可能な標識物を、通常の方法によりオリゴヌ
クレオチドに結合させたものを使用することができる。
標識体とサンプルとのハイブリダイゼーションは、通常
の方法により、例えばドットブロットハイブリダイゼー
ションやその他の方法により行うことができ、また、形
成したハイブリッドの確認は、オートラジオグラフィー
などにより標識物を検出することにより行えばよい。ま
た、これらのオリゴヌクレオチドのうちで、前述の式
（２）又は（３）で表わされるＤＮＡ断片をプライマー
として用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ チェーンリアクシ
ョン）法によって菌種の同定を行うこともできる。すな
わち、同定の対象となる菌体を溶菌し、該菌の遺伝子に
対して、指標とする式（２）又は（３）のＤＮＡ断片を
プライマーとして加え、ＤＮＡポリメラーゼで処理す
る。その後、電気泳動等によりＤＮＡの増幅が観察され
れば、対象菌体は用いたＤＮＡ断片に対応した遺伝子部
分を保持していること、すなわち、同種の菌であること
が特定できる。
などの検出可能な標識物を、通常の方法によりオリゴヌ
クレオチドに結合させたものを使用することができる。
標識体とサンプルとのハイブリダイゼーションは、通常
の方法により、例えばドットブロットハイブリダイゼー
ションやその他の方法により行うことができ、また、形
成したハイブリッドの確認は、オートラジオグラフィー
などにより標識物を検出することにより行えばよい。ま
た、これらのオリゴヌクレオチドのうちで、前述の式
（２）又は（３）で表わされるＤＮＡ断片をプライマー
として用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ チェーンリアクシ
ョン）法によって菌種の同定を行うこともできる。すな
わち、同定の対象となる菌体を溶菌し、該菌の遺伝子に
対して、指標とする式（２）又は（３）のＤＮＡ断片を
プライマーとして加え、ＤＮＡポリメラーゼで処理す
る。その後、電気泳動等によりＤＮＡの増幅が観察され
れば、対象菌体は用いたＤＮＡ断片に対応した遺伝子部
分を保持していること、すなわち、同種の菌であること
が特定できる。
【００１２】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１３】実施例１ 塩基配列の決定： （１）培養及び粗高分子ＲＮＡの調製 表１に示す標準株を、ＧＡＭ Ｂｒｏｔｈ（日水製薬
製）にグルコースを１％加えた培地で一昼夜培養した。
１００mlの培養液を遠心集菌し、洗液（５０mMトリス緩
衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH７．４）で３回洗浄し、菌体
を洗液７．３mlに懸濁した。この菌懸濁液に、２Ｍ ス
クロース２．３ml、Ｍ１ 酵素（０．５mg／ml，生化学
工業製）０．３３ml及びリゾチーム（１０mg／ml）０．
０７mlを加え、３７℃で３０分間振盪して溶菌させた。
この溶菌液に、ＥＤＴＡ溶液（５０mM トリス緩衝液，
２５０mM ＥＤＴＡ，pH８．０）９２５μl 及びＳＤＳ
溶液（２０％ドデシル硫酸ナトリウム，５０mM トリス
緩衝液，２０mM ＥＤＴＡ，pH８．０）５７５μl を加
え、透明になるまで６０℃で振盪した。この溶液を、Ｔ
Ｅ溶液（１０mM トリス緩衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH
７．４）で飽和させたフェノール及びクロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２４：１）により除タンパク処理
し、エタノールにより核酸を沈澱させた。
製）にグルコースを１％加えた培地で一昼夜培養した。
１００mlの培養液を遠心集菌し、洗液（５０mMトリス緩
衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH７．４）で３回洗浄し、菌体
を洗液７．３mlに懸濁した。この菌懸濁液に、２Ｍ ス
クロース２．３ml、Ｍ１ 酵素（０．５mg／ml，生化学
工業製）０．３３ml及びリゾチーム（１０mg／ml）０．
０７mlを加え、３７℃で３０分間振盪して溶菌させた。
この溶菌液に、ＥＤＴＡ溶液（５０mM トリス緩衝液，
２５０mM ＥＤＴＡ，pH８．０）９２５μl 及びＳＤＳ
溶液（２０％ドデシル硫酸ナトリウム，５０mM トリス
緩衝液，２０mM ＥＤＴＡ，pH８．０）５７５μl を加
え、透明になるまで６０℃で振盪した。この溶液を、Ｔ
Ｅ溶液（１０mM トリス緩衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH
７．４）で飽和させたフェノール及びクロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２４：１）により除タンパク処理
し、エタノールにより核酸を沈澱させた。
【００１４】
【表１】
【００１５】次に、核酸を適当な量のＴＥ溶液（１０mM
トリス緩衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH７．４）に溶解
し、等量の４Ｍ ＮａＣｌを加え、一晩、氷上に静置し
て高分子ＲＮＡを沈澱させた。遠心分離により、高分子
ＲＮＡを集め、更にＴＥ溶液に溶解した後、エタノール
沈澱により塩を除いた。得られたＲＮＡは、７０％エタ
ノール中で−７０℃で保存するか、又は適当な濃度のＴ
Ｅ溶液に溶解して用いた。
トリス緩衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH７．４）に溶解
し、等量の４Ｍ ＮａＣｌを加え、一晩、氷上に静置し
て高分子ＲＮＡを沈澱させた。遠心分離により、高分子
ＲＮＡを集め、更にＴＥ溶液に溶解した後、エタノール
沈澱により塩を除いた。得られたＲＮＡは、７０％エタ
ノール中で−７０℃で保存するか、又は適当な濃度のＴ
Ｅ溶液に溶解して用いた。
【００１６】（２）１６Ｓ ｒＲＮＡの部分シークエン
ス ＲＮＡシークエンスキット（ベーリンガー マンハイム
社製）を用い、プライマーとして次の塩基配列を有する
ユニバーサルプライマー（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８
２，６９５５−６９５９（１９８５））を用いてＲＮＡ
から直接シークエンスを行った。 G(A又はT)ATTACCGCGGC(G又はT)GCTG このプライマーがハイブリダイズするのは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの５１９−５３６に相当する。シ
ークエンスの際、（１）で得た高分子ＲＮＡ溶液（２．
０mg／ml）４μl 、プライマー（２０μg ／ml）１．５
μl 及び蒸留水１．５μl を混合して、アニーリング用
溶液とした。また、電気泳動は６％ポリアクリルアミ
ド，８Ｍ尿素のゲルを用いて行った。
ス ＲＮＡシークエンスキット（ベーリンガー マンハイム
社製）を用い、プライマーとして次の塩基配列を有する
ユニバーサルプライマー（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８
２，６９５５−６９５９（１９８５））を用いてＲＮＡ
から直接シークエンスを行った。 G(A又はT)ATTACCGCGGC(G又はT)GCTG このプライマーがハイブリダイズするのは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの５１９−５３６に相当する。シ
ークエンスの際、（１）で得た高分子ＲＮＡ溶液（２．
０mg／ml）４μl 、プライマー（２０μg ／ml）１．５
μl 及び蒸留水１．５μl を混合して、アニーリング用
溶液とした。また、電気泳動は６％ポリアクリルアミ
ド，８Ｍ尿素のゲルを用いて行った。
【００１７】（３）ビフィドバクテリウム ロンガムに
種特異的な配列の選択 （２）で行ったシークエンスを比較することにより、ビ
フィドバクテリウムロンガムに特異的な部分を選択し
た。選択した部分を他の種のシークエンスの結果と共に
図１に示した。
種特異的な配列の選択 （２）で行ったシークエンスを比較することにより、ビ
フィドバクテリウムロンガムに特異的な部分を選択し
た。選択した部分を他の種のシークエンスの結果と共に
図１に示した。
【００１８】実施例２ （１）プローブの合成及び標識 図１の下線で示された配列に相補的な配列を持つオリゴ
ヌクレオチド（以下、プローブＰＬＯと呼ぶ）をＤＮＡ
合成機（アプライド バイオシステムズ，Ｍｏｄｅｌ
３８０Ｂ）を用いて合成し、常法により精製した。この
プローブＰＬＯとプローブＰＰＲ（実施例１（２）でシ
ークエンスに用いたユニバーサル プライマー）を、メ
ガラベル（宝酒造社製）を用いて５′末端を32Ｐでラベ
ルした。
ヌクレオチド（以下、プローブＰＬＯと呼ぶ）をＤＮＡ
合成機（アプライド バイオシステムズ，Ｍｏｄｅｌ
３８０Ｂ）を用いて合成し、常法により精製した。この
プローブＰＬＯとプローブＰＰＲ（実施例１（２）でシ
ークエンスに用いたユニバーサル プライマー）を、メ
ガラベル（宝酒造社製）を用いて５′末端を32Ｐでラベ
ルした。
【００１９】（２）高分子ＲＮＡのメンブレンへのドッ
トブロッティング 適当な量の高分子ＲＮＡを蒸留水１０μl に溶解し、１
００％ホルムアミド２０μl 、ホルムアルデヒド７μl
及び２０倍ＳＳＣ（３Ｍ NaCl，０．３Ｍ クエン酸Na
溶液）２μl を加えた。この溶液を６８℃で１５分間振
とうしてＲＮＡを変性させた後、２倍量の２０倍ＳＳＣ
を加え、この溶液をマイクロフィルトレーション装置
（バイオ−ドット，バイオ−ラッド社製）にセットした
ナイロンメンブレン（ジーンスクリーンプラス，デュポ
ン社製）にアプライした。メンブレンを室温で乾かした
後、アルムアルデヒドを除くために８０℃で３０分間加
熱した。
トブロッティング 適当な量の高分子ＲＮＡを蒸留水１０μl に溶解し、１
００％ホルムアミド２０μl 、ホルムアルデヒド７μl
及び２０倍ＳＳＣ（３Ｍ NaCl，０．３Ｍ クエン酸Na
溶液）２μl を加えた。この溶液を６８℃で１５分間振
とうしてＲＮＡを変性させた後、２倍量の２０倍ＳＳＣ
を加え、この溶液をマイクロフィルトレーション装置
（バイオ−ドット，バイオ−ラッド社製）にセットした
ナイロンメンブレン（ジーンスクリーンプラス，デュポ
ン社製）にアプライした。メンブレンを室温で乾かした
後、アルムアルデヒドを除くために８０℃で３０分間加
熱した。
【００２０】（３）ハイブリダイゼーション 高分子ＲＮＡをブロットしたメンブレンを６倍ＳＳＣ
（１．８Ｍ NaCl，０．１８Ｍ クエン酸Na溶液）に浸
した後、プラスチックバックに入れ、プレハイブリダイ
ゼーション液（６倍ＳＳＣ，５×デーンハート氏液，１
％ＳＤＳ，０．１mg／mlサーモン精子ＤＮＡ，１０％デ
キストラン サルフェート）を加え、５５℃で１時間振
とうした。プレハイブリダイゼーション液をハイブリダ
イゼーション液（６倍ＳＳＣ，２×デーンハート氏液，
１％ＳＤＳ，１０％デキストランサルフェート，約１０
6 cpm の標識プローブ）に置き換えて、５５℃で２時間
振とうした。メンブレンをプラスチックバックから取り
出し、６倍ＳＳＣで室温、５分間の洗いを３回繰り返し
た。更に、より厳重に、６５℃で３０分間以上洗った。
適当な時間オートラジオグラフィーを行うか、β−スコ
ープ（ベタジェン社製）を用いて結果を見た。表２に、
菌株から抽出した高分子ＲＮＡを用いて行ったドットブ
ロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリッド形
成が認められたものを＋、認められなかったものを−で
示した。
（１．８Ｍ NaCl，０．１８Ｍ クエン酸Na溶液）に浸
した後、プラスチックバックに入れ、プレハイブリダイ
ゼーション液（６倍ＳＳＣ，５×デーンハート氏液，１
％ＳＤＳ，０．１mg／mlサーモン精子ＤＮＡ，１０％デ
キストラン サルフェート）を加え、５５℃で１時間振
とうした。プレハイブリダイゼーション液をハイブリダ
イゼーション液（６倍ＳＳＣ，２×デーンハート氏液，
１％ＳＤＳ，１０％デキストランサルフェート，約１０
6 cpm の標識プローブ）に置き換えて、５５℃で２時間
振とうした。メンブレンをプラスチックバックから取り
出し、６倍ＳＳＣで室温、５分間の洗いを３回繰り返し
た。更に、より厳重に、６５℃で３０分間以上洗った。
適当な時間オートラジオグラフィーを行うか、β−スコ
ープ（ベタジェン社製）を用いて結果を見た。表２に、
菌株から抽出した高分子ＲＮＡを用いて行ったドットブ
ロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリッド形
成が認められたものを＋、認められなかったものを−で
示した。
【００２１】
【表２】
【００２２】表２から明らかなように、プローブＰＰＲ
は、すべてのＲＮＡとハイブリダイズした。このこと
は、このプローブの配列が、バクテリア１６Ｓ ｒＲＮ
Ａに共通な部分に相補的なものであることを、よく反映
しており、プローブＰＰＲは、ターゲットとするＲＮＡ
の存在を確認するボジィティブコントロールとして用い
ている。一方、プローブＰＬＯを用いた場合は、ビフィ
ドバクテリウム ロンガムから抽出したＲＮＡにはハイ
ブリダイズしているが、他の種や、系統分類学的に近い
とされているアクチノミセス属の１つであるアクチノミ
セス ボビスを含む他の属からのものにはハイブリダイ
ズしていない。すなわち、プローブＰＬＯはビフィドバ
クテリウム ロンガムに対して特異的であることが確認
された。
は、すべてのＲＮＡとハイブリダイズした。このこと
は、このプローブの配列が、バクテリア１６Ｓ ｒＲＮ
Ａに共通な部分に相補的なものであることを、よく反映
しており、プローブＰＰＲは、ターゲットとするＲＮＡ
の存在を確認するボジィティブコントロールとして用い
ている。一方、プローブＰＬＯを用いた場合は、ビフィ
ドバクテリウム ロンガムから抽出したＲＮＡにはハイ
ブリダイズしているが、他の種や、系統分類学的に近い
とされているアクチノミセス属の１つであるアクチノミ
セス ボビスを含む他の属からのものにはハイブリダイ
ズしていない。すなわち、プローブＰＬＯはビフィドバ
クテリウム ロンガムに対して特異的であることが確認
された。
【００２３】実施例３ 表３、表４及び表５に示す菌株について、固定した菌体
を用いてドットブロットハイブリダイゼーションを行っ
た。 （１）菌体のホルムアルデヒドによる固定 一晩培養した約３mlの菌体を遠心、及びリン酸緩衝液
（１４５mM ＮａＣｌ，１００mM リン酸ナトリウム，
pH７．４）で洗浄した後、菌体を５mlのリン酸緩衝液に
懸濁した。これにホルムアルデヒドを１％になるように
加え、時々振りながら３０分間氷中に置く。遠心集菌及
びリン酸緩衝液による洗浄を２回繰り返した後、菌体を
適当な量の１４５mM ＮａＣｌ，１０mM トリス緩衝
液，pH７．４に懸濁した。 （２）ドットブロットハイブリダイゼーション 固定した菌体をバイオ−ドット（バイオ−ラッド社製）
を用いてジーンスクリーン プラス（デュポン社製）に
ドットブロットした後、メンブレンを８０℃で１時間加
熱した。ハイブリダイゼーションは実施例２（３）と同
様に行った。菌株の固定した菌体を用いて行ったドット
ブロットハイブリダイゼーションの結果を、ハイブリッ
ド形成が認められたものを＋、認められなかったものを
−として表３、表４及び表５に示す。
を用いてドットブロットハイブリダイゼーションを行っ
た。 （１）菌体のホルムアルデヒドによる固定 一晩培養した約３mlの菌体を遠心、及びリン酸緩衝液
（１４５mM ＮａＣｌ，１００mM リン酸ナトリウム，
pH７．４）で洗浄した後、菌体を５mlのリン酸緩衝液に
懸濁した。これにホルムアルデヒドを１％になるように
加え、時々振りながら３０分間氷中に置く。遠心集菌及
びリン酸緩衝液による洗浄を２回繰り返した後、菌体を
適当な量の１４５mM ＮａＣｌ，１０mM トリス緩衝
液，pH７．４に懸濁した。 （２）ドットブロットハイブリダイゼーション 固定した菌体をバイオ−ドット（バイオ−ラッド社製）
を用いてジーンスクリーン プラス（デュポン社製）に
ドットブロットした後、メンブレンを８０℃で１時間加
熱した。ハイブリダイゼーションは実施例２（３）と同
様に行った。菌株の固定した菌体を用いて行ったドット
ブロットハイブリダイゼーションの結果を、ハイブリッ
ド形成が認められたものを＋、認められなかったものを
−として表３、表４及び表５に示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【００２６】
【表５】
【００２７】表３、表４及び表５の結果から明らかなよ
うに、プローブＰＰＲを用いた場合、表２と同様、属や
種に関わらずすべての菌体にハイブリダイゼーションが
認められ、どの菌体もよく固定されているのがわかる。
一方、プローブＰＬＯを用いた場合、ビフィドバクテリ
ウム ロンガム以外の菌体にはハイブリッド形成が認め
られず、また、ここで用いたビフィドバクテリウム ロ
ンガムのすべての株にはハイブリッド形成が認められ
た。すなわち、プローブＰＬＯはビフィドバクテリウム
ロンガムという種に特異的であることが確認された。
うに、プローブＰＰＲを用いた場合、表２と同様、属や
種に関わらずすべての菌体にハイブリダイゼーションが
認められ、どの菌体もよく固定されているのがわかる。
一方、プローブＰＬＯを用いた場合、ビフィドバクテリ
ウム ロンガム以外の菌体にはハイブリッド形成が認め
られず、また、ここで用いたビフィドバクテリウム ロ
ンガムのすべての株にはハイブリッド形成が認められ
た。すなわち、プローブＰＬＯはビフィドバクテリウム
ロンガムという種に特異的であることが確認された。
【００２８】
【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフィ
ドバクテリウム ロンガムに特異的なものであり、この
標識体をプローブとして用いれば、ビフィドバクテリウ
ム ロンガムを迅速、簡便かつ正確に検出することがで
きる。
ドバクテリウム ロンガムに特異的なものであり、この
標識体をプローブとして用いれば、ビフィドバクテリウ
ム ロンガムを迅速、簡便かつ正確に検出することがで
きる。
【００２９】
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ） 配列 UAUCGGGGAGCAAGCGAGA
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ） 配列 UAUCGGGGAGCAAGCGAGA
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ） 配列 5′TCTCGCTTGCTCCCCGATA3′
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ） 配列 5′TCTCGCTTGCTCCCCGATA3′
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ） 配列 3′AGAGCGAACGAGGGGCTAT5′
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ） 配列 3′AGAGCGAACGAGGGGCTAT5′
【図１】実施例１で行ったシークエンスの結果を示す図
である。
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
Claims (2)
- 【請求項１】 式（１） UAUCGGGGAGCAAGCGAGA （１） で表わされる配列又はこれに相補的な配列を有するビフ
ィドバクテリウム ロンガムｒＲＮＡ由来のオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項２】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドの標
識体をプローブとして用いることを特徴とするビフィド
バクテリウム ロンガムの検出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19218392A JPH0670770A (ja) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | ビフィドバクテリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 |
| EP93111615A EP0581171B1 (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
| US08/093,884 US5443951A (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
| DE69316801T DE69316801T2 (de) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Spezies-Spezifische Oligonukleotide gegen Bifidobakterien und Verfahren zum Nachweis unter Verwendung derselben |
| CA002100919A CA2100919A1 (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19218392A JPH0670770A (ja) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | ビフィドバクテリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0670770A true JPH0670770A (ja) | 1994-03-15 |
Family
ID=16287063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19218392A Pending JPH0670770A (ja) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | ビフィドバクテリウム ロンガムに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0670770A (ja) |
-
1992
- 1992-07-20 JP JP19218392A patent/JPH0670770A/ja active Pending
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