JPH0746986A - ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 - Google Patents
ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法Info
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- JPH0746986A JPH0746986A JP4287095A JP28709592A JPH0746986A JP H0746986 A JPH0746986 A JP H0746986A JP 4287095 A JP4287095 A JP 4287095A JP 28709592 A JP28709592 A JP 28709592A JP H0746986 A JPH0746986 A JP H0746986A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 式（１）
UAUCGGGGAGCAAGCGUGA （１）
で表される配列又はこれに相補的な配列を有するビフィ
ドバクテリウム・アドレッセンティスｒＲＮＡ由来のオ
リゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体を
プローブとして用いることを特徴とするビフィドバクテ
リウム・アドレッセンティスの検出方法。 【効果】 本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバ
クテリウム・アドレッセンティスに特異的なものであ
り、この標識体をプローブとして用いれば、ビィフィド
バクテリウム・アドレッセンティスを迅速、簡便かつ正
確に検出することができる。
ドバクテリウム・アドレッセンティスｒＲＮＡ由来のオ
リゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体を
プローブとして用いることを特徴とするビフィドバクテ
リウム・アドレッセンティスの検出方法。 【効果】 本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバ
クテリウム・アドレッセンティスに特異的なものであ
り、この標識体をプローブとして用いれば、ビィフィド
バクテリウム・アドレッセンティスを迅速、簡便かつ正
確に検出することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビフィドバクテリウム
・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）に特異的なオリゴヌクレ
オチド及びこれを用いる検出方法に関する。
・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）に特異的なオリゴヌクレ
オチド及びこれを用いる検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ビフィドバクテリウム属の種の同
定は、主に、表現形質、すなわち、糖分解性状、ガス産
生、発育温度などを検査することにより行われている。
また、近年、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行
われるようになっている〔Ｂｅｎｎｏ，Ｙ．，微生物，
Ｖｏｌ．６，ｐ．１〜１２（１９９０）〕。
定は、主に、表現形質、すなわち、糖分解性状、ガス産
生、発育温度などを検査することにより行われている。
また、近年、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行
われるようになっている〔Ｂｅｎｎｏ，Ｙ．，微生物，
Ｖｏｌ．６，ｐ．１〜１２（１９９０）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、表現形
質を基にした同定法は、試験者の熟練を必要とし、しか
も結果が出るまでにかなり時間がかかるという問題があ
った。また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる方法で
は、菌体からＤＮＡを抽出する必要があるが、ビフィド
バクテリウムはグラム陽性菌であるため、グラム陰性菌
に比べ溶菌操作が煩雑であるという欠点があった。更
に、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの値は、類縁性の高い種
同士では高い値を示し、明確な差が出ないという問題も
あった。
質を基にした同定法は、試験者の熟練を必要とし、しか
も結果が出るまでにかなり時間がかかるという問題があ
った。また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる方法で
は、菌体からＤＮＡを抽出する必要があるが、ビフィド
バクテリウムはグラム陽性菌であるため、グラム陰性菌
に比べ溶菌操作が煩雑であるという欠点があった。更
に、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの値は、類縁性の高い種
同士では高い値を示し、明確な差が出ないという問題も
あった。
【０００４】このため、ビフィドバクテリウム属のう
ち、特にビフィドバクテリウム・アドレセンティスを、
迅速、簡便かつ正確に検出できる方法が望まれていた。
ち、特にビフィドバクテリウム・アドレセンティスを、
迅速、簡便かつ正確に検出できる方法が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を行った。すなわち、ビフィドバク
テリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオ
チドの標識体をプローブとして用い、これとのハイブリ
ッドを検出する方法を考え、また、その際に塩基数２０
前後の短いオリゴヌクレオチドプローブを用いれば、核
酸の抽出を必要としないｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションを行うことができ、１塩基の相違まで検出でき
るという利点が得られる。また、プローブのターゲット
として１６Ｓ ｒＲＮＡ上の種特異的な部分を選べば、
１６Ｓ ｒＲＮＡの配列は最近、系統分類の指標として
信頼性の高いものとされており、また、菌体当たりのｒ
ＲＮＡのコピー数が染色体ＤＮＡに比べ非常に多いた
め、検出感度が上がると考えられる。
発明者らは鋭意研究を行った。すなわち、ビフィドバク
テリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオ
チドの標識体をプローブとして用い、これとのハイブリ
ッドを検出する方法を考え、また、その際に塩基数２０
前後の短いオリゴヌクレオチドプローブを用いれば、核
酸の抽出を必要としないｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションを行うことができ、１塩基の相違まで検出でき
るという利点が得られる。また、プローブのターゲット
として１６Ｓ ｒＲＮＡ上の種特異的な部分を選べば、
１６Ｓ ｒＲＮＡの配列は最近、系統分類の指標として
信頼性の高いものとされており、また、菌体当たりのｒ
ＲＮＡのコピー数が染色体ＤＮＡに比べ非常に多いた
め、検出感度が上がると考えられる。
【０００６】そこで、本発明者らは、種々のビフィドバ
クテリウムの標準株を酵素的に溶菌し、一般的な方法に
より粗高分子ＲＮＡを抽出し、この粗高分子ＲＮＡから
逆転写酵素を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を
決定した。得られた塩基配列を比較した結果、後記式
（１）で表わされる配列がビフィドバクテリウム・アド
レセンティスに特異的であり、プライマーとして有用で
あること、更にその標識体をプローブとして用いれば、
ビフィドバクテリウム・アドレセンティスを迅速、簡便
かつ正確に検出できることを見出し、本発明を完成し
た。
クテリウムの標準株を酵素的に溶菌し、一般的な方法に
より粗高分子ＲＮＡを抽出し、この粗高分子ＲＮＡから
逆転写酵素を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を
決定した。得られた塩基配列を比較した結果、後記式
（１）で表わされる配列がビフィドバクテリウム・アド
レセンティスに特異的であり、プライマーとして有用で
あること、更にその標識体をプローブとして用いれば、
ビフィドバクテリウム・アドレセンティスを迅速、簡便
かつ正確に検出できることを見出し、本発明を完成し
た。
【０００７】すなわち、本発明は、式（１） CGCUUUUGACUGGGAGC （１） で表わされる配列又はこれに相補的な配列を有するビフ
ィドバクテリウム・アドレセンティスｒＲＮＡ由来のオ
リゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体を
プローブとして用いることを特徴とするビフィドバクテ
リウム・アドレセンティスの検出方法を提供するもので
ある。
ィドバクテリウム・アドレセンティスｒＲＮＡ由来のオ
リゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドの標識体を
プローブとして用いることを特徴とするビフィドバクテ
リウム・アドレセンティスの検出方法を提供するもので
ある。
【０００８】本発明のビフィドバクテリウム・アドレセ
ンティスに特異的なオリゴヌクレオチドは、前記式
（１）で表わされるＲＮＡ配列もしくはこれに相補的な
式（２）又は（３）で表わされるＤＮＡ配列を有するも
のである。 ５′GCTCCCAGTCAAAAGCG ３′ （２） ３′CGAGGGTCAGTTTTCGC ５′ （３） また、これらの配列を有してプローブとしての機能を有
するものであれば、５′又は３′末端側に他の塩基が付
加されたものであってもよい。
ンティスに特異的なオリゴヌクレオチドは、前記式
（１）で表わされるＲＮＡ配列もしくはこれに相補的な
式（２）又は（３）で表わされるＤＮＡ配列を有するも
のである。 ５′GCTCCCAGTCAAAAGCG ３′ （２） ３′CGAGGGTCAGTTTTCGC ５′ （３） また、これらの配列を有してプローブとしての機能を有
するものであれば、５′又は３′末端側に他の塩基が付
加されたものであってもよい。
【０００９】これらのオリゴヌクレオチドは、例えばＤ
ＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによ
り、またビフィドバクテリウム・アドレセンティスの遺
伝子から酵素的に切り出すことにより調製することがで
きる。
ＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによ
り、またビフィドバクテリウム・アドレセンティスの遺
伝子から酵素的に切り出すことにより調製することがで
きる。
【００１０】これらのオリゴヌクレオチドを用いてビフ
ィドバクテリウム・アドレセンティスを検出するには、
このオリゴヌクレオチドの標識体をプローブとして用
い、このプローブとサンプルとのハイブリダイゼーショ
ンを行い、ハイブリッド形成の有無を調べることによ
り、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの存在を
確認することができる。
ィドバクテリウム・アドレセンティスを検出するには、
このオリゴヌクレオチドの標識体をプローブとして用
い、このプローブとサンプルとのハイブリダイゼーショ
ンを行い、ハイブリッド形成の有無を調べることによ
り、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの存在を
確認することができる。
【００１１】標識体は、例えばアイソトープや蛍光物質
などの検出可能な標識物を、通常の方法によりオリゴヌ
クレオチドに結合させたものを使用することができる。
標識体とサンプルとのハイブリダイゼーションは、通常
の方法により、例えばドットブロットハイブリダイゼー
ションやその他の方法により行うことができ、また、形
成したハイブリッドの確認は、オートラジオグラフィー
などにより標識物を検出することにより行えばよい。ま
た、これらのオリゴヌクレオチドのうちで、前述の式
（２）又は、（３）で表わされるＤＮＡ断片をプライマ
ーとして用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リア
クション）法によって菌種の同定を行うこともできる。
すなわち、同定の対象となる菌体を溶菌し、該菌の遺伝
子に対して、指標とする式（２）又は（３）のＤＮＡ断
片をプライマーの１つとして加え、ＤＮＡポリメラーゼ
で処理する。その後、電気泳動等によりＤＮＡの増幅
が、観察されれば、対象菌体は用いたＤＮＡ断片に対応
した遺伝子部分を保持していること、すなわち、同種の
菌であることが特定できる。
などの検出可能な標識物を、通常の方法によりオリゴヌ
クレオチドに結合させたものを使用することができる。
標識体とサンプルとのハイブリダイゼーションは、通常
の方法により、例えばドットブロットハイブリダイゼー
ションやその他の方法により行うことができ、また、形
成したハイブリッドの確認は、オートラジオグラフィー
などにより標識物を検出することにより行えばよい。ま
た、これらのオリゴヌクレオチドのうちで、前述の式
（２）又は、（３）で表わされるＤＮＡ断片をプライマ
ーとして用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リア
クション）法によって菌種の同定を行うこともできる。
すなわち、同定の対象となる菌体を溶菌し、該菌の遺伝
子に対して、指標とする式（２）又は（３）のＤＮＡ断
片をプライマーの１つとして加え、ＤＮＡポリメラーゼ
で処理する。その後、電気泳動等によりＤＮＡの増幅
が、観察されれば、対象菌体は用いたＤＮＡ断片に対応
した遺伝子部分を保持していること、すなわち、同種の
菌であることが特定できる。
【００１２】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１３】実施例１ 塩基配列の決定： （１）培養及び粗高分子ＲＮＡの調製 表１に示す標準株を、ＧＡＭ Ｂｒｏｔｈ( 日水製薬社
製）にグルコースを１％加えた培地で一昼夜培養した。
１００mlの培養液を遠心集菌し、洗液（５０mMトリス緩
衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH７．４) で３回洗浄し、菌体
を洗液７．３mlに懸濁した。この菌懸濁液に、２Ｍ ス
クロ−ス２．３ml、Ｍ１ 酵素（０．５mg／ml，生化学
工業社製) ０．３３ml、及びリゾチーム (５０mg／ml）
を０．０７mlを加え、３７℃で３０分間振とうして溶菌
させた。この溶菌液に、ＥＤＴＡ溶液（５０mM トリス
緩衝液, ２５０mM ＥＤＴＡ, pH８．０) ９２５μｌ及
びＳＤＳ溶液（２０％ドデシル硫酸ナトリウム, ５０mM
トリス緩衝液, ２０mMＥＤＴＡ, pH８．０) ５７５μ
ｌを加え、透明になるまで６０℃で振とうした。この溶
液を、ＴＥ溶液（１０mM トリス緩衝液, １mM ＥＤＴ
Ａ, pH７．４)で飽和させたフェノール及びクロロホル
ム／イソアミルアルコール（２４：１)により除タンパ
ク処理し、エタノールにより核酸を沈澱させた。
製）にグルコースを１％加えた培地で一昼夜培養した。
１００mlの培養液を遠心集菌し、洗液（５０mMトリス緩
衝液，１mM ＥＤＴＡ，pH７．４) で３回洗浄し、菌体
を洗液７．３mlに懸濁した。この菌懸濁液に、２Ｍ ス
クロ−ス２．３ml、Ｍ１ 酵素（０．５mg／ml，生化学
工業社製) ０．３３ml、及びリゾチーム (５０mg／ml）
を０．０７mlを加え、３７℃で３０分間振とうして溶菌
させた。この溶菌液に、ＥＤＴＡ溶液（５０mM トリス
緩衝液, ２５０mM ＥＤＴＡ, pH８．０) ９２５μｌ及
びＳＤＳ溶液（２０％ドデシル硫酸ナトリウム, ５０mM
トリス緩衝液, ２０mMＥＤＴＡ, pH８．０) ５７５μ
ｌを加え、透明になるまで６０℃で振とうした。この溶
液を、ＴＥ溶液（１０mM トリス緩衝液, １mM ＥＤＴ
Ａ, pH７．４)で飽和させたフェノール及びクロロホル
ム／イソアミルアルコール（２４：１)により除タンパ
ク処理し、エタノールにより核酸を沈澱させた。
【００１４】
【表１】
【００１５】次に、核酸を適当な量のＴＥ溶液（１０mM
トリス緩衝液, １mM ＥＤＴＡ,pH７．４）に溶解
し、等量の４Ｍ ＮａＣｌを加え、一晩、氷上に静置し
て、高分子ＲＮＡを沈澱させた。遠心分離により、高分
子ＲＮＡを集め、更にＴＥ溶液に溶解した後、エタノー
ル沈澱により塩を除いた。得られたＲＮＡは、７０％エ
タノール中で−７０℃で保存するか、又は適当な濃度の
ＴＥ溶液に溶解して用いた。
トリス緩衝液, １mM ＥＤＴＡ,pH７．４）に溶解
し、等量の４Ｍ ＮａＣｌを加え、一晩、氷上に静置し
て、高分子ＲＮＡを沈澱させた。遠心分離により、高分
子ＲＮＡを集め、更にＴＥ溶液に溶解した後、エタノー
ル沈澱により塩を除いた。得られたＲＮＡは、７０％エ
タノール中で−７０℃で保存するか、又は適当な濃度の
ＴＥ溶液に溶解して用いた。
【００１６】（２）１６Ｓ ｒＲＮＡの部分シークエン
ス ＲＮＡシークエンスキット（ベーリンガー・マンハイム
社製）を用い、プライマーとして次の塩基配列を有する
ユニバーサルプライマー（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８
２，６９５５−６９５９（１９８５））を用いてＲＮＡ
から直接シークエンスを行った。 G(A 又はT)ATTACCGCGGC(G 又はT)GCTG このプライマーがハイブリダイズするのは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの５１９−５３６に相当する。シ
ークエンスの際、（１）で得た高分子ＲＮＡ溶液（２．
０ mg ／ml) ４μｌ、プライマー（２０μｇ／ml) １．
５μｌ及び蒸留水１．５μｌを混合して、アニーリング
用溶液とした。また、電気泳動は６％ポリアクリルアミ
ド、８Ｍ尿素のゲルを用いて行った。
ス ＲＮＡシークエンスキット（ベーリンガー・マンハイム
社製）を用い、プライマーとして次の塩基配列を有する
ユニバーサルプライマー（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８
２，６９５５−６９５９（１９８５））を用いてＲＮＡ
から直接シークエンスを行った。 G(A 又はT)ATTACCGCGGC(G 又はT)GCTG このプライマーがハイブリダイズするのは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの５１９−５３６に相当する。シ
ークエンスの際、（１）で得た高分子ＲＮＡ溶液（２．
０ mg ／ml) ４μｌ、プライマー（２０μｇ／ml) １．
５μｌ及び蒸留水１．５μｌを混合して、アニーリング
用溶液とした。また、電気泳動は６％ポリアクリルアミ
ド、８Ｍ尿素のゲルを用いて行った。
【００１７】（３）ビフィドバクテリウム・アドレセン
ティスに種特異的な配列の選択 （２）で行ったシークエンスを比較することにより、ビ
フィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的な部分
を選択した。選択した部分を他の種のシークエンスの結
果と共に図１に示した。
ティスに種特異的な配列の選択 （２）で行ったシークエンスを比較することにより、ビ
フィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的な部分
を選択した。選択した部分を他の種のシークエンスの結
果と共に図１に示した。
【００１８】実施例２ （１）プローブの合成及び標識 図１の下線で示された配列に相補的な配列を持つオリゴ
ヌクレオチド（以下、プローブＰＡＤと呼ぶ）をＤＮＡ
合成機（アプライド・バイオシステムズ, Ｍｏｄｅｌ
３８０Ｂ）を用いて合成し、常法により精製した。この
プローブＰＡＤとプローブＰＰＲ (実施例１（２）でシ
ークエンスに用いたユニバーサル・プライマー）を、メ
ガラベル（宝酒造社製）を用いて５′末端を32Ｐでラベ
ルした。
ヌクレオチド（以下、プローブＰＡＤと呼ぶ）をＤＮＡ
合成機（アプライド・バイオシステムズ, Ｍｏｄｅｌ
３８０Ｂ）を用いて合成し、常法により精製した。この
プローブＰＡＤとプローブＰＰＲ (実施例１（２）でシ
ークエンスに用いたユニバーサル・プライマー）を、メ
ガラベル（宝酒造社製）を用いて５′末端を32Ｐでラベ
ルした。
【００１９】（２）高分子ＲＮＡのメンブレンへのドッ
トブロッティング 適当な量の高分子ＲＮＡを蒸留水１０μｌに溶解し、１
００％ホルムアミド２０μｌ、ホルムアルデヒド７μｌ
及び、２０倍ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ, ０．３Ｍ クエ
ン酸Ｎａ溶液）２μｌ加えた。この溶液を６８℃で１５
分間振とうしてＲＮＡを変性させた後、２倍量の２０倍
ＳＳＣを加え、この溶液をマイクロフィルトレーション
装置（バイオ−ドット，バイオ−ラッド製）にセットし
たナイロンメンブレン（ジーンスクリーンプラス，デュ
ポン社製）にアプライした。メンブレンを室温で乾かし
た後、ホルムアルデヒドを除くために、８０℃で３０分
間加熱した。
トブロッティング 適当な量の高分子ＲＮＡを蒸留水１０μｌに溶解し、１
００％ホルムアミド２０μｌ、ホルムアルデヒド７μｌ
及び、２０倍ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ, ０．３Ｍ クエ
ン酸Ｎａ溶液）２μｌ加えた。この溶液を６８℃で１５
分間振とうしてＲＮＡを変性させた後、２倍量の２０倍
ＳＳＣを加え、この溶液をマイクロフィルトレーション
装置（バイオ−ドット，バイオ−ラッド製）にセットし
たナイロンメンブレン（ジーンスクリーンプラス，デュ
ポン社製）にアプライした。メンブレンを室温で乾かし
た後、ホルムアルデヒドを除くために、８０℃で３０分
間加熱した。
【００２０】（３）ハイブリダイゼーション 高分子ＲＮＡをブロットしたメンブレンを６倍ＳＳＣ
（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸Ｎａ溶
液）に浸した後、プラスチックバックに入れ、プレハイ
ブリダイゼーション液 (６倍ＳＳＣ，５×デンハート氏
液，１％ＳＤＳ，０．１mg／ml サーモン精子ＤＮＡ,
１０％デキストランサルフェート）を加え、５０℃で１
時間振とうした。プレハイブリダイゼーション液をハイ
ブリダイゼーション液（６倍ＳＳＣ，２×デンハート氏
液，１％ＳＤＳ，１０％デキストランサルフェート，約
１０6 cpm の標識プローブ）に置き換えて、５０℃で、
２時間振とうした。メンブレンをプラスチックバックか
ら取り出し、６倍ＳＳＣで室温、5 分間の洗いを３回繰
り返した。更に、より厳重に、６０℃で３０分間以上洗
った。適当な時間オートラジオグラフィーを行うか、β
−スコープ（ベタジェン社製）を用いて結果を見た。表
２に、菌株から抽出した高分子ＲＮＡを用いて行ったド
ットブロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリ
ッド形成が認められたものを＋、認められなかったもの
を−で示した。
（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸Ｎａ溶
液）に浸した後、プラスチックバックに入れ、プレハイ
ブリダイゼーション液 (６倍ＳＳＣ，５×デンハート氏
液，１％ＳＤＳ，０．１mg／ml サーモン精子ＤＮＡ,
１０％デキストランサルフェート）を加え、５０℃で１
時間振とうした。プレハイブリダイゼーション液をハイ
ブリダイゼーション液（６倍ＳＳＣ，２×デンハート氏
液，１％ＳＤＳ，１０％デキストランサルフェート，約
１０6 cpm の標識プローブ）に置き換えて、５０℃で、
２時間振とうした。メンブレンをプラスチックバックか
ら取り出し、６倍ＳＳＣで室温、5 分間の洗いを３回繰
り返した。更に、より厳重に、６０℃で３０分間以上洗
った。適当な時間オートラジオグラフィーを行うか、β
−スコープ（ベタジェン社製）を用いて結果を見た。表
２に、菌株から抽出した高分子ＲＮＡを用いて行ったド
ットブロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリ
ッド形成が認められたものを＋、認められなかったもの
を−で示した。
【００２１】
【表２】
【００２２】表２から明らかなように、プローブＰＰＲ
は、すべてのＲＮＡとハイブリダイズした。このこと
は、このプローブの配列が、バクテリア１６Ｓ rＲＮＡ
に共通な部分に相補的なものであることを、よく反映し
ており、プローブＰＰＲは、ターゲットとするＲＮＡの
存在を確認するポジィティブコントロールとして用いて
いる。一方、プローブＰＡＤを用いた場合は、ビフィド
バクテリウム・アドレセンティスから抽出したＲＮＡに
はハイブリダイズしているが、他の種や、系統分類学的
に近いとされているアクチノミセス属の１つであるアク
チノミセス・ボビスを含む他の属からのものにはハイブ
リダイズしていない。すなわち、プローブＰＡＤはビフ
ィドバクテリウム・アドレセンティスに対して特異的で
あることが確認された。
は、すべてのＲＮＡとハイブリダイズした。このこと
は、このプローブの配列が、バクテリア１６Ｓ rＲＮＡ
に共通な部分に相補的なものであることを、よく反映し
ており、プローブＰＰＲは、ターゲットとするＲＮＡの
存在を確認するポジィティブコントロールとして用いて
いる。一方、プローブＰＡＤを用いた場合は、ビフィド
バクテリウム・アドレセンティスから抽出したＲＮＡに
はハイブリダイズしているが、他の種や、系統分類学的
に近いとされているアクチノミセス属の１つであるアク
チノミセス・ボビスを含む他の属からのものにはハイブ
リダイズしていない。すなわち、プローブＰＡＤはビフ
ィドバクテリウム・アドレセンティスに対して特異的で
あることが確認された。
【００２３】実施例３ 表３、表４に示す菌株について、固定した菌体を用いて
ドットブロットハイブリダイゼーションを行った。 （１）菌体のホルムアルデヒドによる固定 一晩培養した約 3 ml の菌体を遠心、及びリン酸緩衝液
（１４５ mM ＮａＣｌ，１００ mM リン酸ナトリウム，
pH７．４）で洗浄した後、菌体を 5 ml のリン酸緩衝液
に懸濁した。これにホルムアルデヒドを１％になるよう
に加え、時々振りながら 30 分間氷中に置く。遠心集菌
及びリン酸緩衝液による洗浄を２回繰り返した後、菌体
を適当な量の１４５ mM ＮａＣｌ、１０ mM トリス緩衝
液、pH７．４に懸濁した。 （２）ドットブロットハイブリダイゼーション 固定した菌体をバイオ−ドット（バイオ−ラッド社製）
を用いてジーンスクリーン・プラス（デュポン社製）に
ドットブロットした後、メンブレンを８０℃で１時間加
熱した。ハイブリダイゼーションは実施例２（３）と同
様に行った。菌株の固定した菌体を用いて行ったドット
ブロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリッド
形成が認められたものを＋、認められなかったものを−
として表３、表４に示す。
ドットブロットハイブリダイゼーションを行った。 （１）菌体のホルムアルデヒドによる固定 一晩培養した約 3 ml の菌体を遠心、及びリン酸緩衝液
（１４５ mM ＮａＣｌ，１００ mM リン酸ナトリウム，
pH７．４）で洗浄した後、菌体を 5 ml のリン酸緩衝液
に懸濁した。これにホルムアルデヒドを１％になるよう
に加え、時々振りながら 30 分間氷中に置く。遠心集菌
及びリン酸緩衝液による洗浄を２回繰り返した後、菌体
を適当な量の１４５ mM ＮａＣｌ、１０ mM トリス緩衝
液、pH７．４に懸濁した。 （２）ドットブロットハイブリダイゼーション 固定した菌体をバイオ−ドット（バイオ−ラッド社製）
を用いてジーンスクリーン・プラス（デュポン社製）に
ドットブロットした後、メンブレンを８０℃で１時間加
熱した。ハイブリダイゼーションは実施例２（３）と同
様に行った。菌株の固定した菌体を用いて行ったドット
ブロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリッド
形成が認められたものを＋、認められなかったものを−
として表３、表４に示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【００２６】表３、表４の結果から明らかなように、プ
ローブＰＰＲを用いた場合、表２と同様、属や種に関わ
らずすべての菌体にハイブリダイゼーションが認めら
れ、どの菌体もよく固定されているのがわかる。一方、
プローブＰＡＤを用いた場合、ビフィドバクテリウム・
アドレセンティスのすべての株にはハイブリッド形成が
認められた。すなわち、プローブＰＡＤはビフィドバク
テリウム・アドレセンティスという種に特異的であるこ
とが確認された。
ローブＰＰＲを用いた場合、表２と同様、属や種に関わ
らずすべての菌体にハイブリダイゼーションが認めら
れ、どの菌体もよく固定されているのがわかる。一方、
プローブＰＡＤを用いた場合、ビフィドバクテリウム・
アドレセンティスのすべての株にはハイブリッド形成が
認められた。すなわち、プローブＰＡＤはビフィドバク
テリウム・アドレセンティスという種に特異的であるこ
とが確認された。
【００２７】
【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフィ
ドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なものであ
り、この標識体をプローブとして用いれば、ビフィドバ
クテリウム・アドレセンティスを迅速、簡便かつ、正確
に検出することができる。
ドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なものであ
り、この標識体をプローブとして用いれば、ビフィドバ
クテリウム・アドレセンティスを迅速、簡便かつ、正確
に検出することができる。
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ
ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ
ｉｓ） 配列 CGCUUUUGACUGGGAGC 配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ
ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ
ｉｓ） 配列 ５′GCTCCCAGTCAAAAGCG ３′ 配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ
ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ
ｉｓ） 配列 ３′CGAGGGTCAGTTTTCGC ５′
ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ
ｉｓ） 配列 CGCUUUUGACUGGGAGC 配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ
ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ
ｉｓ） 配列 ５′GCTCCCAGTCAAAAGCG ３′ 配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ 起源 生物名：ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ
ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ
ｉｓ） 配列 ３′CGAGGGTCAGTTTTCGC ５′
【図１】実施例１で行ったシークエンスの結果を示す図
である。
である。
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】
【表２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】
【表３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】 式（１） CGCUUUUGACUGGGAGC （１） で表わされる配列又はこれに相補的な配列を有するビフ
ィドバクテリウム・アドレセンティスｒＲＮＡ由来のオ
リゴヌクレオチド - 【請求項２】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドの標
識体をプローブとして用いることを特徴とするビフィド
バクテリウム・アドレセンティスの検出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4287095A JPH0746986A (ja) | 1992-10-02 | 1992-10-02 | ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 |
| EP93111615A EP0581171B1 (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
| US08/093,884 US5443951A (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
| DE69316801T DE69316801T2 (de) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Spezies-Spezifische Oligonukleotide gegen Bifidobakterien und Verfahren zum Nachweis unter Verwendung derselben |
| CA002100919A CA2100919A1 (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4287095A JPH0746986A (ja) | 1992-10-02 | 1992-10-02 | ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0746986A true JPH0746986A (ja) | 1995-02-21 |
Family
ID=17712995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4287095A Pending JPH0746986A (ja) | 1992-07-20 | 1992-10-02 | ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに特異的なオリゴヌクレオチド及びこれを用いる検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0746986A (ja) |
-
1992
- 1992-10-02 JP JP4287095A patent/JPH0746986A/ja active Pending
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