JP3264514B2 - クラミジアの検出法 - Google Patents
クラミジアの検出法Info
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- JP3264514B2 JP3264514B2 JP12858192A JP12858192A JP3264514B2 JP 3264514 B2 JP3264514 B2 JP 3264514B2 JP 12858192 A JP12858192 A JP 12858192A JP 12858192 A JP12858192 A JP 12858192A JP 3264514 B2 JP3264514 B2 JP 3264514B2
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- Japan
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- chlamydia
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- microorganism
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ)を利用したクラミジア属微生物の検出法、同
定法およびそれに使用するプライマー並びに上記ＰＣＲ
による増幅生産物に関するものである。
応(ＰＣＲ)を利用したクラミジア属微生物の検出法、同
定法およびそれに使用するプライマー並びに上記ＰＣＲ
による増幅生産物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】クラ
ミジアは球菌様微生物であって、クラミジア科は単一の
属としてクラミジア属を含み、この属は３つの種、すな
わちクラミジア・トラコマチス(Ｃhlamydia trachomat
is)、クラミジア・シッタシー(Ｃhlamydia psittaci)
およびクラミジア・ニューモニアエ(Ｃhlamydia pneum
oniae)を含んでいる。これらは、宿主細胞の空胞内で増
殖し、トラコーマ、封入体結膜炎、性病性リンパ肉芽腫
(ＬＧＶ)、肺炎等の原因となる。
ミジアは球菌様微生物であって、クラミジア科は単一の
属としてクラミジア属を含み、この属は３つの種、すな
わちクラミジア・トラコマチス(Ｃhlamydia trachomat
is)、クラミジア・シッタシー(Ｃhlamydia psittaci)
およびクラミジア・ニューモニアエ(Ｃhlamydia pneum
oniae)を含んでいる。これらは、宿主細胞の空胞内で増
殖し、トラコーマ、封入体結膜炎、性病性リンパ肉芽腫
(ＬＧＶ)、肺炎等の原因となる。
【０００３】クラミジア感染症の病原体検出法として現
在最も信頼度が高いものは、分離培養法である。しか
し、この方法は判定までに数日の日数を要し、しかも操
作、判定に熟練を要するという欠点があった。また、酵
素免疫測定法を利用する方法もあるが、これは常在菌と
の交差反応の存在が問題であり、ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法は感度がまだ満足できる程でない。さらに、
上記何れの方法においても、クラミジア属に属する３種
を識別することはできなかった。
在最も信頼度が高いものは、分離培養法である。しか
し、この方法は判定までに数日の日数を要し、しかも操
作、判定に熟練を要するという欠点があった。また、酵
素免疫測定法を利用する方法もあるが、これは常在菌と
の交差反応の存在が問題であり、ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法は感度がまだ満足できる程でない。さらに、
上記何れの方法においても、クラミジア属に属する３種
を識別することはできなかった。
【０００４】ＰＣＲ法は、ＤＮＡを高倍率で増幅できる
ので、最近微量のＤＮＡの検出に利用されている。クラ
ミジア３種の外膜蛋白遺伝子の塩基配列については、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids
Ｒes．)１７巻８３６６頁、同誌１８巻１０６１頁、３
４１４頁、６１３６頁、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー
・レタース(ＦＥＭＳ Ｍicrobiol．Ｌett．)４２巻１８
５−１９０頁、同誌５５巻２２９−２３４頁、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ．Ｂacteriol．)１６８
巻１２７７−１２８２頁、インフェクション・アンド・
イミュニテイ(Ｉnfect．Ｉmmun．)５９巻２１９５−２
１９９頁、同２８５３−２８５５頁、ジャーナル・オブ
・ゼネラル・マイクロバイオロジー(Ｊ．Ｇen．Ｍicrob
iol．)１３７巻４６５−４７５頁等に報告されている。
ので、最近微量のＤＮＡの検出に利用されている。クラ
ミジア３種の外膜蛋白遺伝子の塩基配列については、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids
Ｒes．)１７巻８３６６頁、同誌１８巻１０６１頁、３
４１４頁、６１３６頁、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー
・レタース(ＦＥＭＳ Ｍicrobiol．Ｌett．)４２巻１８
５−１９０頁、同誌５５巻２２９−２３４頁、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ．Ｂacteriol．)１６８
巻１２７７−１２８２頁、インフェクション・アンド・
イミュニテイ(Ｉnfect．Ｉmmun．)５９巻２１９５−２
１９９頁、同２８５３−２８５５頁、ジャーナル・オブ
・ゼネラル・マイクロバイオロジー(Ｊ．Ｇen．Ｍicrob
iol．)１３７巻４６５−４７５頁等に報告されている。
【０００５】また、ＰＣＲを利用したクラミジアの検出
法については、感染症学雑誌６５巻１１８３−１１８７
頁およびザ・ジャーナル・オブ・インフェクシアス・デ
イジージズ(Ｊ．Ｉnfect．Ｄis．)１６２巻９８４−９
８７頁に記載があるが、前者の方法はクラミジア・シッ
タシーおよびクラミジア・ニューモニアエには適用でき
ず(１１８５頁左欄１１−１３行)、後者の方法は３種の
プライマー・ペアーを用いた結果を比較して識別すると
いうわずらわしさがあった。この発明は、上記のような
欠点のないクラミジアの検出・識別法を提供しようとし
てなされたものである。
法については、感染症学雑誌６５巻１１８３−１１８７
頁およびザ・ジャーナル・オブ・インフェクシアス・デ
イジージズ(Ｊ．Ｉnfect．Ｄis．)１６２巻９８４−９
８７頁に記載があるが、前者の方法はクラミジア・シッ
タシーおよびクラミジア・ニューモニアエには適用でき
ず(１１８５頁左欄１１−１３行)、後者の方法は３種の
プライマー・ペアーを用いた結果を比較して識別すると
いうわずらわしさがあった。この発明は、上記のような
欠点のないクラミジアの検出・識別法を提供しようとし
てなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち、この発明は、
下記のものを提供するものである。 (１)下記配列
下記のものを提供するものである。 (１)下記配列
【化３】 で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ｔもしくは−ＴＡを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置きかえることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 (２)下記配列
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ｔもしくは−ＴＡを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置きかえることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 (２)下記配列
【化４】 で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(ニ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除するか、または端にＧ
−もしくはＣＧ−を付加すること、(ホ)３'側の端から
１または２個の塩基を削除すること、(ヘ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置きかえることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。
端から１または２個の塩基を削除するか、または端にＧ
−もしくはＣＧ−を付加すること、(ホ)３'側の端から
１または２個の塩基を削除すること、(ヘ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置きかえることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。
【０００７】(３)１または２記載の化合物からなるプラ
イマー。 (４)クラミジア属微生物の主要外膜蛋白遺伝子を含む媒
質に(３)記載のプライマーとＤＮＡポリメラーゼを加
え、熱変性・アニーリング・伸長サイクルを適用するこ
とを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応による塩基配列
増幅法。 (５)(４)記載の方法による増幅生産物であるヌクレオチ
ド。 (６)クラミジア属微生物を含む疑のある試料に(４)記載
の増幅法を適用し、増幅生産物であるヌクレオチドを検
索することを特徴とする、クラミジア属微生物の外膜蛋
白遺伝子の検出法。 (７)さらに、増幅生産物であるヌクレオチドを制限酵素
ＡluＩ、ＰvuＩＩおよびＳau３ＡＩで消化し、生成物を
相互にまたは主要外膜蛋白質遺伝子を用いて得た増幅生
産物の消化物と比較することを特徴とする、クラミジア
属微生物種の同定法。
イマー。 (４)クラミジア属微生物の主要外膜蛋白遺伝子を含む媒
質に(３)記載のプライマーとＤＮＡポリメラーゼを加
え、熱変性・アニーリング・伸長サイクルを適用するこ
とを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応による塩基配列
増幅法。 (５)(４)記載の方法による増幅生産物であるヌクレオチ
ド。 (６)クラミジア属微生物を含む疑のある試料に(４)記載
の増幅法を適用し、増幅生産物であるヌクレオチドを検
索することを特徴とする、クラミジア属微生物の外膜蛋
白遺伝子の検出法。 (７)さらに、増幅生産物であるヌクレオチドを制限酵素
ＡluＩ、ＰvuＩＩおよびＳau３ＡＩで消化し、生成物を
相互にまたは主要外膜蛋白質遺伝子を用いて得た増幅生
産物の消化物と比較することを特徴とする、クラミジア
属微生物種の同定法。
【０００８】この発明でプライマーとして使用するヌク
レオチドのうち、配列番号:１および配列番号:２のヌク
レオチドは、クラミジア・トラコマチス(Ｃlamydia tr
achomatis)の外膜蛋白遺伝子の一部をなすものである。
クラミジア・トラコマチスには少なくとも１５種類の血
清型(Ａ、Ｂ、Ｂa、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、
Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)が知られているが、配列番号:１
および配列番号:２(アンチセンス鎖)のセンス鎖(配列番
号:３で示す)の配列は少なくとも血清型Ｌ２とＨにおい
て完全に共通であり、これは下記配列表の比較から明ら
かである。なお、下記比較表中、配列番号:４は血清型
Ｌ２の外膜蛋白遺伝子配列の一部分であり、配列番号:
５は同じくＨの配列一部分である。
レオチドのうち、配列番号:１および配列番号:２のヌク
レオチドは、クラミジア・トラコマチス(Ｃlamydia tr
achomatis)の外膜蛋白遺伝子の一部をなすものである。
クラミジア・トラコマチスには少なくとも１５種類の血
清型(Ａ、Ｂ、Ｂa、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、
Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)が知られているが、配列番号:１
および配列番号:２(アンチセンス鎖)のセンス鎖(配列番
号:３で示す)の配列は少なくとも血清型Ｌ２とＨにおい
て完全に共通であり、これは下記配列表の比較から明ら
かである。なお、下記比較表中、配列番号:４は血清型
Ｌ２の外膜蛋白遺伝子配列の一部分であり、配列番号:
５は同じくＨの配列一部分である。
【化５】
【０００９】これらのプライマーは、クラミジア・トラ
コマテイスの変性した外膜蛋白遺伝子にアニールできる
ことはいうまでもないが、この発明によると、これらは
クラミジア・シッタシー(Ｃ．psittaci)およびクラミジ
ア・ニューモニアエ(Ｃ．pneumoniae)の変性した外膜蛋
白質遺伝子にもアニールできることが明らかになった。
クラミジア・シッタシーＡ２２／Ｍ株およびクラミジア
・ニューモニアエ標準株(アメリカで分離され、継代培
養されているもの)についてこれらの関係を示すと下記
比較表の通りである。なお、配列番号:３は上記比較表
と同じくクラミジア・トラコマチス血清型Ｌ２であり、
配列番号:６はクラミジア・シッタシーＡ２２／Ｍ株、
配列番号:７はクラミジア・ニューモニアエ標準株であ
る。
コマテイスの変性した外膜蛋白遺伝子にアニールできる
ことはいうまでもないが、この発明によると、これらは
クラミジア・シッタシー(Ｃ．psittaci)およびクラミジ
ア・ニューモニアエ(Ｃ．pneumoniae)の変性した外膜蛋
白質遺伝子にもアニールできることが明らかになった。
クラミジア・シッタシーＡ２２／Ｍ株およびクラミジア
・ニューモニアエ標準株(アメリカで分離され、継代培
養されているもの)についてこれらの関係を示すと下記
比較表の通りである。なお、配列番号:３は上記比較表
と同じくクラミジア・トラコマチス血清型Ｌ２であり、
配列番号:６はクラミジア・シッタシーＡ２２／Ｍ株、
配列番号:７はクラミジア・ニューモニアエ標準株であ
る。
【化６】
【化７】
【００１０】これらの比較表から明らかなように、配列
番号:１に対応するクラミジア・シッタシーの配列(配列
番号:８で示す)およびクラミジア・ニューモニアエの配
列(配列番号:９で示す)は、配列番号:１の配列と一か所
が異なっている。この発明によると、このように１か所
または２か所が異なっている場合にもアニールすること
ができ、プライマーとして使用し得ることが明らかにな
った。また逆に、配列番号:１に前記(イ)、(ロ)、(ハ)
に示すような変更を加えたものおよび配列番号:２に前
記(ニ)、(ホ)、(ヘ)に示すような変更を加えたものも、
アニールすることができ、プライマーとして使用できる
ことが明らかになった。プライマーとして好ましいもの
は配列番号:１または配列番号:２そのものまたは(ハ)も
しくは(ヘ)の変更を加えたものまたは配列番号:８もし
くは配列番号:９(これらの配列は同一である)に示すも
のである。プライマーは、例えばＤＮＡ合成機を用い
て、当技術で知られた方法により合成することができ
る。合成したプライマーは、例えば高速液体クロマトグ
ラフィーのような精製手段により精製するのが好まし
い。
番号:１に対応するクラミジア・シッタシーの配列(配列
番号:８で示す)およびクラミジア・ニューモニアエの配
列(配列番号:９で示す)は、配列番号:１の配列と一か所
が異なっている。この発明によると、このように１か所
または２か所が異なっている場合にもアニールすること
ができ、プライマーとして使用し得ることが明らかにな
った。また逆に、配列番号:１に前記(イ)、(ロ)、(ハ)
に示すような変更を加えたものおよび配列番号:２に前
記(ニ)、(ホ)、(ヘ)に示すような変更を加えたものも、
アニールすることができ、プライマーとして使用できる
ことが明らかになった。プライマーとして好ましいもの
は配列番号:１または配列番号:２そのものまたは(ハ)も
しくは(ヘ)の変更を加えたものまたは配列番号:８もし
くは配列番号:９(これらの配列は同一である)に示すも
のである。プライマーは、例えばＤＮＡ合成機を用い
て、当技術で知られた方法により合成することができ
る。合成したプライマーは、例えば高速液体クロマトグ
ラフィーのような精製手段により精製するのが好まし
い。
【００１１】ＰＣＲ反応による塩基配列の増幅は、例え
ば自動増幅装置を用いて、例えば緩衝液のような適当な
媒質中で鋳型ＤＮＡ、各塩基、プライマーおよびＤＮＡ
ポリメラーゼを温度変換サイクルにかける等の当技術で
知られた方法により行なうことができる。好ましい実施
方法の一例を示すと次の通りである。 (１)０.５mlの遠心管に下記組成の反応液を入れる。好
ましくは、ミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５
１６)で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.５μＭの順方向プライマー ０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl2 ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えば
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大
腸菌で発現させたもの]が適当である。
ば自動増幅装置を用いて、例えば緩衝液のような適当な
媒質中で鋳型ＤＮＡ、各塩基、プライマーおよびＤＮＡ
ポリメラーゼを温度変換サイクルにかける等の当技術で
知られた方法により行なうことができる。好ましい実施
方法の一例を示すと次の通りである。 (１)０.５mlの遠心管に下記組成の反応液を入れる。好
ましくは、ミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５
１６)で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.５μＭの順方向プライマー ０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl2 ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えば
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大
腸菌で発現させたもの]が適当である。
【００１２】(２)自動増幅装置に反応液をセットし、熱
変性段階、アニーリング段階および伸長段階からなるサ
イクルを２０サイクル以上、好ましくは３０サイクル以
上行なう。熱変性温度は通常９０−９５℃、アニーリン
グ温度は通常４０−６０℃、伸長温度は通常７０−７５
℃が適当であるが、アニーリング温度はプライマーの長
さとＧＣ含量により異なる。アニーリング温度は、通常
Ｔm℃[但し、Ｔm℃＝４×(Ｇ＋Ｃ)＋２×(Ａ＋Ｔ)]から
Ｔm−２０℃が適当であり、Ｔm−５℃前後が好ましい。
熱変性時間は２０秒以上、アニーリング時間は２０秒以
上、伸長時間は３０秒以上が好ましい。自動増幅装置
は、例えばパーキン・エルマー・シータス社から販売さ
れている。
変性段階、アニーリング段階および伸長段階からなるサ
イクルを２０サイクル以上、好ましくは３０サイクル以
上行なう。熱変性温度は通常９０−９５℃、アニーリン
グ温度は通常４０−６０℃、伸長温度は通常７０−７５
℃が適当であるが、アニーリング温度はプライマーの長
さとＧＣ含量により異なる。アニーリング温度は、通常
Ｔm℃[但し、Ｔm℃＝４×(Ｇ＋Ｃ)＋２×(Ａ＋Ｔ)]から
Ｔm−２０℃が適当であり、Ｔm−５℃前後が好ましい。
熱変性時間は２０秒以上、アニーリング時間は２０秒以
上、伸長時間は３０秒以上が好ましい。自動増幅装置
は、例えばパーキン・エルマー・シータス社から販売さ
れている。
【００１３】増幅生産物は、前記の比較表（化５、６、
７）においてそれぞれ配列番号:１から３(クラミジア・
トラコマチス)、配列番号８から３(クラミジア・シッタ
シー)および配列番号９から３(クラミジア・ニューモニ
アエ)にはさまれた塩基配列およびそのアンチセンス鎖
であり、これらは例えばアガロースゲル電気泳動のよう
な分離手段により分離される。また、生産物はマーカー
との比較によるバンドの長さにより検出されるが、さら
に標識プローブを用いるサザンハイブリダイゼーション
により確認することができる。プローブとしては、例え
ば前記比較表中に示した配列番号:１０、配列番号:１
１、配列番号:１２を用いることができる。標識として
は、32Ｐ、ビオチン、ジゴキシゲニン等が用いられる。
これらを用いる実験方法は文献に記載されている。増幅
生産物の存在は、クラミジア属微生物の外膜蛋白遺伝子
の存在を示し、したがって上記微生物存在の指標とな
る。
７）においてそれぞれ配列番号:１から３(クラミジア・
トラコマチス)、配列番号８から３(クラミジア・シッタ
シー)および配列番号９から３(クラミジア・ニューモニ
アエ)にはさまれた塩基配列およびそのアンチセンス鎖
であり、これらは例えばアガロースゲル電気泳動のよう
な分離手段により分離される。また、生産物はマーカー
との比較によるバンドの長さにより検出されるが、さら
に標識プローブを用いるサザンハイブリダイゼーション
により確認することができる。プローブとしては、例え
ば前記比較表中に示した配列番号:１０、配列番号:１
１、配列番号:１２を用いることができる。標識として
は、32Ｐ、ビオチン、ジゴキシゲニン等が用いられる。
これらを用いる実験方法は文献に記載されている。増幅
生産物の存在は、クラミジア属微生物の外膜蛋白遺伝子
の存在を示し、したがって上記微生物存在の指標とな
る。
【００１４】さらに、この発明によると、増幅生産物を
異なる制限酵素により消化すると、クラミジア属微生物
の種に応じて異なる消化物を生じ、それによって３種の
微生物の識別が可能である。例えば、クラミジア・トラ
コマチスの場合、生産物をＡluＩで消化すると、それぞ
れ６７、８５および８８bpの３種の断片を生ずるが、電
気泳動上は２本のバンドがみられ、そのうち大きなバン
ドは２種の断片が重なっているため太く(または濃く)見
える。また、ＰvuＩＩでは消化されず、Ｓau３ＡＩでは
消化されて等しくない２つの断片となる。クラミジア・
シッタシーの場合、ＡluＩおよびＰvuＩＩでは消化され
てそれぞれ等しくない２つの断片となり、Ｓau３ＡＩで
は消化されない。また、クラミジア・ニューモニアエの
場合、ＡluＩおよびＳau３ＡＩでは消化されてそれぞれ
等しくない２つの断片となり、ＰvuＩＩでは消化されな
い。したがって、消化パターンと断片の観察により、こ
れら３種を識別することができる。上記の識別法または
同定法を実施するには、実施に必要な試剤および器具を
まとめてキットにしておくのが便利である。このような
キットは、下記のものの中から選ばれたものを含むこと
ができる。(１)順方向プライマー、(２)逆方向プライマ
ー、(３)緩衝液、(４)ＫＣl、(５)ＭgＣl2、(６)ゼラチ
ン、(７)４種類のdＮＴＰ、(８)ＤＮＡポリメラーゼ、
(９)ミネラル・オイル、(１０)遠心管、(１１)発色試薬
(例えばエチジウムブロミド)、(１２)制限酵素(３種)、
等。検体としては、細胞、組織、粘膜、これらの破砕
物、粘液、血液、滲出液、培地等を挙げることができ
る。
異なる制限酵素により消化すると、クラミジア属微生物
の種に応じて異なる消化物を生じ、それによって３種の
微生物の識別が可能である。例えば、クラミジア・トラ
コマチスの場合、生産物をＡluＩで消化すると、それぞ
れ６７、８５および８８bpの３種の断片を生ずるが、電
気泳動上は２本のバンドがみられ、そのうち大きなバン
ドは２種の断片が重なっているため太く(または濃く)見
える。また、ＰvuＩＩでは消化されず、Ｓau３ＡＩでは
消化されて等しくない２つの断片となる。クラミジア・
シッタシーの場合、ＡluＩおよびＰvuＩＩでは消化され
てそれぞれ等しくない２つの断片となり、Ｓau３ＡＩで
は消化されない。また、クラミジア・ニューモニアエの
場合、ＡluＩおよびＳau３ＡＩでは消化されてそれぞれ
等しくない２つの断片となり、ＰvuＩＩでは消化されな
い。したがって、消化パターンと断片の観察により、こ
れら３種を識別することができる。上記の識別法または
同定法を実施するには、実施に必要な試剤および器具を
まとめてキットにしておくのが便利である。このような
キットは、下記のものの中から選ばれたものを含むこと
ができる。(１)順方向プライマー、(２)逆方向プライマ
ー、(３)緩衝液、(４)ＫＣl、(５)ＭgＣl2、(６)ゼラチ
ン、(７)４種類のdＮＴＰ、(８)ＤＮＡポリメラーゼ、
(９)ミネラル・オイル、(１０)遠心管、(１１)発色試薬
(例えばエチジウムブロミド)、(１２)制限酵素(３種)、
等。検体としては、細胞、組織、粘膜、これらの破砕
物、粘液、血液、滲出液、培地等を挙げることができ
る。
【００１５】
【実施例】以下、この発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、実施例はこの発明を制限するものではな
い。 実施例１(プライマーの合成) アプライド・バイオシステムズ・ジャパン株式会社製モ
デル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ ＥＰＤＮＡシンセサイザ
ーを使用し、同社のオペレーターズマニュアルに従って
塩基の結合と脱保護を行い、プライマーＣＭ−１（配列
番号：１）およびＣＭ−２（配列番号：２）を合成し
た。
に説明するが、実施例はこの発明を制限するものではな
い。 実施例１(プライマーの合成) アプライド・バイオシステムズ・ジャパン株式会社製モ
デル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ ＥＰＤＮＡシンセサイザ
ーを使用し、同社のオペレーターズマニュアルに従って
塩基の結合と脱保護を行い、プライマーＣＭ−１（配列
番号：１）およびＣＭ−２（配列番号：２）を合成し
た。
【００１６】実施例２(クラミジア感染ＨeＬa細胞から
の検出) クラミジアに感染したＨeＬa細胞を、ラバーポリスマン
で剥がし、ウログラフィン（商標）不連続密度勾配法に
よりクラミジアＥＢを粗精製した。そのＥＢ粗精製液
を、１００μg／mlのプロテイナーゼＫを含む溶解緩衝
液[１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.０)、５mＭ ＥＤＴ
Ａ、０.５％ ＳＤＳ]中に加え、５５℃１５分間、３７
℃４５分間反応させた。その後、フェノール／クロロホ
ルム抽出を施行し、エタノール沈澱を行い緩衝液[１０m
Ｍトリス・ＨＣl(pＨ８.０)、１mＭＥＤＴＡ]に再懸濁
させた。その溶液の一部を実施例３記載のＰＣＲ反応の
鋳型ＤＮＡ試料とし反応を行った。
の検出) クラミジアに感染したＨeＬa細胞を、ラバーポリスマン
で剥がし、ウログラフィン（商標）不連続密度勾配法に
よりクラミジアＥＢを粗精製した。そのＥＢ粗精製液
を、１００μg／mlのプロテイナーゼＫを含む溶解緩衝
液[１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.０)、５mＭ ＥＤＴ
Ａ、０.５％ ＳＤＳ]中に加え、５５℃１５分間、３７
℃４５分間反応させた。その後、フェノール／クロロホ
ルム抽出を施行し、エタノール沈澱を行い緩衝液[１０m
Ｍトリス・ＨＣl(pＨ８.０)、１mＭＥＤＴＡ]に再懸濁
させた。その溶液の一部を実施例３記載のＰＣＲ反応の
鋳型ＤＮＡ試料とし反応を行った。
【００１７】実施例３(ＰＣＲ反応) クラミジア３種の検出のために、ペアプライマーＣＭ−
１(配列番号:１)およびＣＭ−２(配列番号:２)を使用し
た。ＰＣＲの反応は、タカラ・ジーン・アンプ(商標)Ｐ
ＣＲ試薬キット、アンプリタック(商標)ＤＮＡポリメラ
ーゼ(ＴaＫaＲa ＧeneＡmp(商標) ＰＣＲ Ｒeagent
Ｋit。本製品はパーキン−エルマー・シータス・イン
ストルメンツ社で製造された)を使用して行った。ＰＣ
Ｒ混合液としては、１×反応緩衝液[１０mＭトリス・Ｈ
Ｃl(pＨ８.３)、５０mＭ ＫＣl;１.５mＭ ＭgＣl2、
０.００１％ゼラチン]、２５０μＭずつのdＧＴＰ、dＡ
ＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、０.５μＭのＣＭ−１および
ＣＭ−２、１.２５単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼを
含ませ全量５０μlとした。鋳型ＤＮＡとしては、クラ
ミジア培養物または後記実施例４の溶液を用いた。ＰＣ
Ｒ温度条件は、９４℃で３分間の長い変性過程の後、９
４℃の変性３０秒、５５℃のアニーリング３０秒、７２
℃の伸長６０秒を３５サイクル行った。最終サイクルの
後、７２℃の長い伸長を７分間行った。ＰＣＲ反応終了
後、ＰＣＲ生産物を分析するまで４℃で保存した。
１(配列番号:１)およびＣＭ−２(配列番号:２)を使用し
た。ＰＣＲの反応は、タカラ・ジーン・アンプ(商標)Ｐ
ＣＲ試薬キット、アンプリタック(商標)ＤＮＡポリメラ
ーゼ(ＴaＫaＲa ＧeneＡmp(商標) ＰＣＲ Ｒeagent
Ｋit。本製品はパーキン−エルマー・シータス・イン
ストルメンツ社で製造された)を使用して行った。ＰＣ
Ｒ混合液としては、１×反応緩衝液[１０mＭトリス・Ｈ
Ｃl(pＨ８.３)、５０mＭ ＫＣl;１.５mＭ ＭgＣl2、
０.００１％ゼラチン]、２５０μＭずつのdＧＴＰ、dＡ
ＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、０.５μＭのＣＭ−１および
ＣＭ−２、１.２５単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼを
含ませ全量５０μlとした。鋳型ＤＮＡとしては、クラ
ミジア培養物または後記実施例４の溶液を用いた。ＰＣ
Ｒ温度条件は、９４℃で３分間の長い変性過程の後、９
４℃の変性３０秒、５５℃のアニーリング３０秒、７２
℃の伸長６０秒を３５サイクル行った。最終サイクルの
後、７２℃の長い伸長を７分間行った。ＰＣＲ反応終了
後、ＰＣＲ生産物を分析するまで４℃で保存した。
【００１８】実施例４(アガロースゲル電気泳動） ＰＣＲ反応後、その反応液（ＰＣＲ産物)の一部とその
６分の１量の６×ゲル・ローデイング緩衝液[０.２５％
(w／v)ブロモフェノールブルー、０.２５％(w／v)キシ
レンシアノール、３０％(v／v)グリセリン]を混合し、
ＴＡＥ[４０mＭトリス・アセテート、１mＭ ＥＤＴＡ]
に溶解し、２％アガロースゲル[ＮuＳieve（商標）３：
１アガロースまたはシーケム(商標)ＧＴＧアガロース]
に負荷した。電気泳動[条件:１００Ｖ、１５〜２０分泳
動（Ｍupid−２（商標）、コスモバイオ）]後、ＵＶト
ランスイルミネーターを使用してバンドを観察し、ポラ
ロイドカメラにより写真を撮った。クラミジア・トラコ
マチスについての結果を、図１に示すようなバンドが認
められた。なお、クラミジア・シッタシーＭｎ，ＩＴ
Ｏ，Ｆｅ／１４５、クラミジア・ニューモニアエＴＷ−
１８３（アメリカ合衆国９８１０５ワシントン、シアト
ル、スイート３２２、エヌ・イー・フォーティーフィフ
ス・ストリート １１０７番、ワシントン・リサーチ・
ファウンデーションから分与）を用いて上記のように泳
動を行っても図２に示すように検出可能であった。
６分の１量の６×ゲル・ローデイング緩衝液[０.２５％
(w／v)ブロモフェノールブルー、０.２５％(w／v)キシ
レンシアノール、３０％(v／v)グリセリン]を混合し、
ＴＡＥ[４０mＭトリス・アセテート、１mＭ ＥＤＴＡ]
に溶解し、２％アガロースゲル[ＮuＳieve（商標）３：
１アガロースまたはシーケム(商標)ＧＴＧアガロース]
に負荷した。電気泳動[条件:１００Ｖ、１５〜２０分泳
動（Ｍupid−２（商標）、コスモバイオ）]後、ＵＶト
ランスイルミネーターを使用してバンドを観察し、ポラ
ロイドカメラにより写真を撮った。クラミジア・トラコ
マチスについての結果を、図１に示すようなバンドが認
められた。なお、クラミジア・シッタシーＭｎ，ＩＴ
Ｏ，Ｆｅ／１４５、クラミジア・ニューモニアエＴＷ−
１８３（アメリカ合衆国９８１０５ワシントン、シアト
ル、スイート３２２、エヌ・イー・フォーティーフィフ
ス・ストリート １１０７番、ワシントン・リサーチ・
ファウンデーションから分与）を用いて上記のように泳
動を行っても図２に示すように検出可能であった。
【００１９】実施例５(クラミジア３種の識別) 実施例３で得られたクラミジア３種のＰＣＲ生産物を３
種の制限酵素によって消化することにより、その識別が
出来た。制限酵素ＡluＩ、ＰvuＩＩ、Ｓau３ＡＩを使用
した。ＰＣＲ反応液１０μlを取り、それぞれの酵素の
緩衝液を加え、至適温度(３７℃)で反応させた。その
後、２μlの６×ゲル・ローデイング緩衝液を加え、電
気泳動により分析を行った。この分析の結果を表１に示
す。
種の制限酵素によって消化することにより、その識別が
出来た。制限酵素ＡluＩ、ＰvuＩＩ、Ｓau３ＡＩを使用
した。ＰＣＲ反応液１０μlを取り、それぞれの酵素の
緩衝液を加え、至適温度(３７℃)で反応させた。その
後、２μlの６×ゲル・ローデイング緩衝液を加え、電
気泳動により分析を行った。この分析の結果を表１に示
す。
【表１】 ＡluＩ ＰvuＩＩ Ｓau３ＡＩ クラミジア・トラコマチス ＋＋ − ＋ クラミジア・シッタシー ＋ ＋ − クラミジア・ニューモニアエ ＋ − ＋ ＋:カットされる。 −:カットされない。 ＋＋:２本のバンドが観察され、そのうち１本は太く見える。
【００２０】配列表
【００２１】配列番号:１ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：CAGGACATCT TGTCTGGCTT 20
【００２２】配列番号:２ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス:Ｙes 配列：CAAGGATCGG AAGGATCTCC 20
【００２３】配列番号:３ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia trachomatis 株名 Ｌ２ 配列：GGAGATCCTT GCGATCCTTG 20
【００２４】配列番号:４ 配列の長さ:２４５ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia trachomatis 株名 Ｌ２ 配列： CAGGACATCT TGTCTGGCTT TAACTAGGAC GCAGTGCCGC CAGAAAAAGA TAGCGAGCAC 60 AAAGAGAGCT AATTATACAA TTTAGAGGTA AGAATGAAAA AACTCTTGAA ATCGGTATTA 120 GTGTTTGCCG CTTTGAGTTC TGCTTCCTCC TTGCAAGCTC TGCCTGTGGG GAATCCTGCT 180 GAACCAAGCC TTATGATCGA CGGAATTCTA TGGGAAGGTT TCGGCGGAGA TCCTTGCGAT 240 CCTTG 245
【００２５】配列番号:５ 配列の長さ:３６０ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia trachomatis 株名 Ｈ 配列： CAGGACATCT TGTCTGGCTT TAACTAGGAC GCAGTGCCGC CAGAAAAAGA TAGCGAGCAC 60 AAAGAGAGCT AATTATACAA TCTTAGAGGT AAGAATGAAA AAACTCTTGA AATCGGTATT 120 AGTATTTGCC GCTTTGAGTT CTGCTTCCTC CTTGCAAGCT CTGCCTGTGG GGAATCCTGC 180 TGAACCAAGC CTTATGATCG ACGGAATTCT GTGGGAAGGT TTTGGCGGAG ATCCTTGCGA 240 TCCTTG 246
【００２６】配列番号:６ 配列の長さ:４２０ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia psittaci 株名 Ａ２２／Ｍ 配列： CAGGATATCT TGTCTGGCTT TAACTTGGAC GTGGTGCCGC CAGAAGAGCA AATTAGAATA 60 GCGAGCACAA AAAGAAAAGA TACTAAGCAT AATCTTTAGA GGTGAGTATG AAAAAACTCT 120 TGAAATCGGC ATTATTGTTT GCCGCTACGG GTTCCGCTCT CTCCTTACAA GCCTTGCCTG 180 TAGGGAACCC AGCTGAACCA AGTTTATTAA TCGATGGCAC TATGTGGGAA GGTGCTTCAG 240 GAGATCCTTG CGATCCTTG 259
【００２７】配列番号:７ 配列の長さ:３００ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia pneumoniae 株名 標準株 配列： CAGGATATCT TGTCTGGCTT TAATTTGGAC GTCGTGTCGC CAAAATATGA GTAATAGCGA 60 GCACATAAAT AAAAGATACT AAGCATAATC TTTAGAGGTG AGTATGAAAA AACTCTTAAA 120 GTCGGCGTTA TTATCCGCCG CATTTGCTGG TTCTGTCGGC TCCTTACAAG CCTTGCCTGT 180 AGGGAACCCT TCTGATCCAA GCTTATTAAT TGATGGTACA ATTATGGGAA GGTGCTGCAG 240 GAGATCCTTG CGATCCTTG 259
【００２８】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia psittaci 株名 Ａ２２／Ｍ 配列：CAGGATATCT TGTCTGGCTT 20
【００２９】配列番号:９ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia pneumoniae 株名 標準株 配列：CAGGATATCT TGTCTGGCTT 20
【００３０】配列番号:１０ 配列の長さ:３０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：ATCGGTATTA GTGTTTGCCG CTTTGAGTTC 30
【００３１】配列番号:１１ 配列の長さ:３０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：ATCGGCATTA TTGTTTGCCG CTACGGGTTC 30
【００３２】配列番号:１２ 配列の長さ:３３ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：GTCGGCGTTA TTATCCGCCG CATTTGCTGG TTC ３
３
３
【図１】クラミジア・トラコマチスに関する実施例４の
電気泳動の写真である。
電気泳動の写真である。
【図２】クラミジア・シッタシーおよびクラミジア・ニ
ューモニアエに関する実施例４の電気泳動の写真であ
る。
ューモニアエに関する実施例４の電気泳動の写真であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 吉田 洋 大阪府大阪市城東区森之宮２丁目３番30 号 扶桑薬品工業株式会社研究開発セン ター内 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎ ｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ, 1990，Ｖｏｌ．162，ｐ．984−987 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，1989，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ. ４，ｐ．1040−1049 Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ, 1991，Ｖｏｌ．137，ｐ．465−475 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ ，1989，Ｖｏｌ．57，Ｎ ｏ．５，ｐ．1621−1625 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, 1992，Ｖｏｌ．30，Ｎｏ．５，ｐ．1098 −1104 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12Q 1/04 C12N 15/09 C12N 15/31 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 クラミジア属微生物の主要外膜蛋白遺伝
子の検出方法であって、クラミジア属微生物を含む疑い
のある試料について、上記微生物の主要外膜蛋白遺伝子
の一部をポリメラーゼ連鎖反応にて増幅可能な下記プラ
イマーを用いて増幅し増幅生産物を得、上記増幅生産物
を検索すること、および上記プライマーが、 下記配列(配列番号：１) ５'−ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴ−３' で示されるヌクレオチド、または上記配列に (イ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
と、 (ロ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
または端に−Ｔもしくは−ＴＡを付加すること、 (ハ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
ら選ばれた他の塩基に置きかえることの少なくとも１つ
の変更を加えて得られる誘導体；および 下記配列(配列番号：２) ５'−ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＣＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＣＣ−３' で示されるヌクレオチド、または上記配列に (ニ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
または端にＧ−もしくはＣＧ−を付加すること、 (ホ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
と、 (ヘ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
ら選ばれた他の塩基に置きかえることの少なくとも１つ
の変更を加えて得られる誘導体からなることを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 クラミジア属微生物種の同定方法であっ
て、請求項１に記載の上記増幅生産物を、制限酵素Ａlu
ＩおよびＰvuIIおよび／またはＳau３ＡＩで消化し、消
化物を相互に比較して、クラミジア・トラコマチス、ク
ラミジア・シタッシおよびクラミジア・ニューモニエを
同定することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12858192A JP3264514B2 (ja) | 1992-05-21 | 1992-05-21 | クラミジアの検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12858192A JP3264514B2 (ja) | 1992-05-21 | 1992-05-21 | クラミジアの検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317097A JPH05317097A (ja) | 1993-12-03 |
| JP3264514B2 true JP3264514B2 (ja) | 2002-03-11 |
Family
ID=14988295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12858192A Expired - Lifetime JP3264514B2 (ja) | 1992-05-21 | 1992-05-21 | クラミジアの検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3264514B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2045261A1 (en) * | 1994-09-20 | 2009-04-08 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptides |
| US6682889B1 (en) | 2000-11-08 | 2004-01-27 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of organisms of the Chlamydiaceae family |
| JP2014230510A (ja) * | 2013-05-29 | 2014-12-11 | 東洋紡株式会社 | クラミドフィラ・ニューモニエおよびクラミドフィラ・シッタシの検出方法 |
| KR102259445B1 (ko) * | 2016-03-30 | 2021-06-01 | 후지필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤 | 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트 |
-
1992
- 1992-05-21 JP JP12858192A patent/JP3264514B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ，１９８９，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．５，ｐ．１６２１−１６２５ |
| Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９８９，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４，ｐ．１０４０−１０４９ |
| Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，Ｖｏｌ．１３７，ｐ．４６５−４７５ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．５，ｐ．１０９８−１１０４ |
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９０，Ｖｏｌ．１６２，ｐ．９８４−９８７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05317097A (ja) | 1993-12-03 |
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