JP3264579B2 - クラミジア・トラコマチス血清型の鑑別法 - Google Patents
クラミジア・トラコマチス血清型の鑑別法Info
- Publication number
- JP3264579B2 JP3264579B2 JP04911694A JP4911694A JP3264579B2 JP 3264579 B2 JP3264579 B2 JP 3264579B2 JP 04911694 A JP04911694 A JP 04911694A JP 4911694 A JP4911694 A JP 4911694A JP 3264579 B2 JP3264579 B2 JP 3264579B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bases
- seq
- sequence
- primer
- chlamydia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ)を利用したクラミジア・トラコマチス微生物
の検出法および／または血清型の鑑別法およびそれに使
用するプライマー並びに上記ＰＣＲによる増幅生産物に
関するものである。
応(ＰＣＲ)を利用したクラミジア・トラコマチス微生物
の検出法および／または血清型の鑑別法およびそれに使
用するプライマー並びに上記ＰＣＲによる増幅生産物に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】クラ
ミジアは球菌様微生物であって、宿主細胞の空胞内で増
殖する。クラミジア科は単一の属としてクラミジア属を
含み、この属は４つの種、すなわちクラミジア・トラコ
マチス(Ｃhlamydia trachomatis)、クラミジア・シッ
タシ(Ｃhlamydia psittaci)、クラミジア・ニューモニ
エ(Ｃhlamydia pneumoniae)およびクラミジア・ペコー
ラム（Ｃhlamydia pecorum）を含んでいる。クラミジア
・トラコマチスは、病原疫学的に幅広いスペクトルを持
った微生物であり、その病原性からトラコーマや尿道
炎、子宮頸管炎などを起こす生物型、鼠径リンパ肉芽腫
症を起こす生物型があるが、前者は、血清型で１２型
（Ａ、Ｂ、ＢＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、
Ｋ）、後者は、３型（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に型別されて
いる。クラミジア外膜は宿主細胞との吸着や抗原として
の点から注目され、また、界面活性剤であるザルコシル
により不溶性画分として比較的簡単に得られることから
研究が進んでいる。クラミジア外膜複合体は数種類の蛋
白質とリポ多糖体および脂質を含む。特に分子量約40,0
00前後の蛋白質は量的に最も多く、主要外膜蛋白質と呼
ばれている。
ミジアは球菌様微生物であって、宿主細胞の空胞内で増
殖する。クラミジア科は単一の属としてクラミジア属を
含み、この属は４つの種、すなわちクラミジア・トラコ
マチス(Ｃhlamydia trachomatis)、クラミジア・シッ
タシ(Ｃhlamydia psittaci)、クラミジア・ニューモニ
エ(Ｃhlamydia pneumoniae)およびクラミジア・ペコー
ラム（Ｃhlamydia pecorum）を含んでいる。クラミジア
・トラコマチスは、病原疫学的に幅広いスペクトルを持
った微生物であり、その病原性からトラコーマや尿道
炎、子宮頸管炎などを起こす生物型、鼠径リンパ肉芽腫
症を起こす生物型があるが、前者は、血清型で１２型
（Ａ、Ｂ、ＢＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、
Ｋ）、後者は、３型（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に型別されて
いる。クラミジア外膜は宿主細胞との吸着や抗原として
の点から注目され、また、界面活性剤であるザルコシル
により不溶性画分として比較的簡単に得られることから
研究が進んでいる。クラミジア外膜複合体は数種類の蛋
白質とリポ多糖体および脂質を含む。特に分子量約40,0
00前後の蛋白質は量的に最も多く、主要外膜蛋白質と呼
ばれている。
【０００３】このクラミジア外膜の主要外膜蛋白のアミ
ノ酸配列から４領域に血清型に関連した変異がみられ変
異ドメイン（variable domain：ＶＤＩ〜ＶＤＩＶ）と
呼び、クラミジア・トラコマチス血清型の違いや免疫学
的特異性が決定されているのはこの領域とされている
（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bccterio
l.）１６９巻３８７９−３８８５頁、インフェクション
・アンド・イミュニティ（Infect.Immun.）５７巻１０
４０−１０４９頁参照）。
ノ酸配列から４領域に血清型に関連した変異がみられ変
異ドメイン（variable domain：ＶＤＩ〜ＶＤＩＶ）と
呼び、クラミジア・トラコマチス血清型の違いや免疫学
的特異性が決定されているのはこの領域とされている
（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bccterio
l.）１６９巻３８７９−３８８５頁、インフェクション
・アンド・イミュニティ（Infect.Immun.）５７巻１０
４０−１０４９頁参照）。
【０００４】クラミジア・トラコマチスの病原体検出法
として現在最も信頼度が高いものは、分離培養法であ
る。しかし、この方法は判定までに数日の日数を要し、
しかも操作、判定に熟練を要するという欠点がある。Ｐ
ＣＲ法は、微量のＤＮＡを高倍率で増幅できるので、最
近感染症の病原体の検出に利用されている。
として現在最も信頼度が高いものは、分離培養法であ
る。しかし、この方法は判定までに数日の日数を要し、
しかも操作、判定に熟練を要するという欠点がある。Ｐ
ＣＲ法は、微量のＤＮＡを高倍率で増幅できるので、最
近感染症の病原体の検出に利用されている。
【０００５】すでにクラミジア・トラコマチスの血清型
の分類は、抗血清もしくはモノクローナル抗体を用いた
ものが行われている（感染症学雑誌６５巻４４７−４５
０頁およびザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・
ディジージズ（J.Infect.Dis.）１５２巻７９１−８０
０頁）。しかし、これらの方法はクラミジア菌株を分離
培養により増殖しなければならず、相当の時間が必要と
なり操作が繁雑である。また、ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・マイクロバイオロジー（J.Clin.Microbiol.）
２９巻１３３３−１３３８頁に、その培養継代を２継代
以下で型別がおこなえるマイクロタイター・セル・カル
チャー法（Microtiter Cell Culture Method）が報告さ
れているが、いずれにしても培養しなければいけないこ
とには変わりはない。
の分類は、抗血清もしくはモノクローナル抗体を用いた
ものが行われている（感染症学雑誌６５巻４４７−４５
０頁およびザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・
ディジージズ（J.Infect.Dis.）１５２巻７９１−８０
０頁）。しかし、これらの方法はクラミジア菌株を分離
培養により増殖しなければならず、相当の時間が必要と
なり操作が繁雑である。また、ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・マイクロバイオロジー（J.Clin.Microbiol.）
２９巻１３３３−１３３８頁に、その培養継代を２継代
以下で型別がおこなえるマイクロタイター・セル・カル
チャー法（Microtiter Cell Culture Method）が報告さ
れているが、いずれにしても培養しなければいけないこ
とには変わりはない。
【０００６】クラミジア・トラコマチスの外膜蛋白質を
コードしている遺伝子の配列については、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）１７巻８
３６６頁、同誌１８巻１０６１頁、３４１４頁、６１３
６頁、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レタース（FEMS
Microbiol.Lett.）４２巻１８５−１９０頁、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）１６８巻
１２７７−１２８２頁、ジーン（Gene）１０１巻１５９
−１６０頁等に報告されている。
コードしている遺伝子の配列については、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）１７巻８
３６６頁、同誌１８巻１０６１頁、３４１４頁、６１３
６頁、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レタース（FEMS
Microbiol.Lett.）４２巻１８５−１９０頁、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）１６８巻
１２７７−１２８２頁、ジーン（Gene）１０１巻１５９
−１６０頁等に報告されている。
【０００７】また、ＰＣＲを利用しその生産物の制限酵
素処理により得られる消化物の電気泳動パターンの解析
からクラミジア・トラコマチス血清型を分類する方法に
ついては、ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシアス・
ディジージズ(J.Infect.Dis.）１６３巻１１０３−１１
０７頁、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイ
オロジー（J.Clin.Microbiol.）２９巻１１３２−１１
３６頁、同誌３１巻１０６０−１０６５頁、ＦＥＭＳマ
イクロバイオロジー・レタース（FEMS Microbiol.Let
t.）８３巻７３−７８頁、セクシャリー・トランスミッ
テッド・デイジージズ（Sex Transm Dis）１９巻３０３
−３０８頁に記載があるが、すべての報告は７〜１０％
のポリアクリルアミドゲルを用いたもので銀染色を行っ
たものもあり若干操作的にわずらわしさがある。この発
明は、上記のような方法ではなくクラミジア・トラコマ
チス血清型の鑑別法を提供しようとしてなされたもので
ある。
素処理により得られる消化物の電気泳動パターンの解析
からクラミジア・トラコマチス血清型を分類する方法に
ついては、ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシアス・
ディジージズ(J.Infect.Dis.）１６３巻１１０３−１１
０７頁、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイ
オロジー（J.Clin.Microbiol.）２９巻１１３２−１１
３６頁、同誌３１巻１０６０−１０６５頁、ＦＥＭＳマ
イクロバイオロジー・レタース（FEMS Microbiol.Let
t.）８３巻７３−７８頁、セクシャリー・トランスミッ
テッド・デイジージズ（Sex Transm Dis）１９巻３０３
−３０８頁に記載があるが、すべての報告は７〜１０％
のポリアクリルアミドゲルを用いたもので銀染色を行っ
たものもあり若干操作的にわずらわしさがある。この発
明は、上記のような方法ではなくクラミジア・トラコマ
チス血清型の鑑別法を提供しようとしてなされたもので
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち、この発明は、
下記のものを提供するものである。 （１）下記配列（ＣＴＭ−１）（配列番号：１） ５'−ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ Ｔ
Ｔ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ｇもしくは−ＧＧを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （２）下記配列（ＣＴＭ−８）（配列番号：２） ５'−ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＴ Ｃ
Ｃ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ａもしくは−ＡＡを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （３）下記配列（ＣＴＭ−４）（配列番号：３） ５'−ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＡＣ Ｃ
Ｇ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ｔもしくは−ＴＧを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （４）下記配列（ＣＴＭ−７）（配列番号：４） ５'−ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＧＡ Ａ
Ｃ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ａもしくは−ＡＴを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （５）（１）〜（４）のいずれかの化合物からなるプラ
イマー。 （６）(イ)（１）と（２）、(ロ)（１）と（４）、(ハ)
（３）と（２）、および(ニ)（３）と（４）からなる群
から選ばれる順方向プライマーと逆方向プライマーの組
合せであるペアプライマー。
下記のものを提供するものである。 （１）下記配列（ＣＴＭ−１）（配列番号：１） ５'−ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ Ｔ
Ｔ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ｇもしくは−ＧＧを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （２）下記配列（ＣＴＭ−８）（配列番号：２） ５'−ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＴ Ｃ
Ｃ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ａもしくは−ＡＡを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （３）下記配列（ＣＴＭ−４）（配列番号：３） ５'−ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＡＣ Ｃ
Ｇ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ｔもしくは−ＴＧを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （４）下記配列（ＣＴＭ−７）（配列番号：４） ５'−ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＧＡ Ａ
Ｃ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に(イ)５'側の
端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
−Ａもしくは−ＡＴを付加すること、(ハ)両端以外の１
または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の塩
基に置き換えることの少なくとも１つの変更を加えて得
られる誘導体。 （５）（１）〜（４）のいずれかの化合物からなるプラ
イマー。 （６）(イ)（１）と（２）、(ロ)（１）と（４）、(ハ)
（３）と（２）、および(ニ)（３）と（４）からなる群
から選ばれる順方向プライマーと逆方向プライマーの組
合せであるペアプライマー。
【０００９】（７）クラミジア・トラコマチス微生物の
主要外膜蛋白をコードする遺伝子の変異ドメインＩ〜IV
の内、変異ドメインＩ〜IIIを含む標的配列に、ペアプ
ライマー(イ)〜(ニ)のいずれか１種とＤＮＡポリメラー
ゼを加え、熱変性・アニーリング・伸長サイクルを適用
することを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応による塩
基配列の増幅法。 （８）（６）のペアプライマー（イ）〜（ハ）のいずれ
かを用いて最初の増幅を行った後、（ロ）〜（ニ）のう
ち、最初の増幅で用いたペアプライマーより内側のペア
プライマーを用いてNested ＰＣＲを行うことを特徴と
するポリメラーゼ連鎖反応による塩基配列の増幅法。 （９）最初の増幅に(イ)、Nested ＰＣＲに(ニ)のペア
プライマーを用いる増幅法。 （１０）（７）〜（９）のいずれかの増幅法による増幅
生産物であるヌクレオチド。
主要外膜蛋白をコードする遺伝子の変異ドメインＩ〜IV
の内、変異ドメインＩ〜IIIを含む標的配列に、ペアプ
ライマー(イ)〜(ニ)のいずれか１種とＤＮＡポリメラー
ゼを加え、熱変性・アニーリング・伸長サイクルを適用
することを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応による塩
基配列の増幅法。 （８）（６）のペアプライマー（イ）〜（ハ）のいずれ
かを用いて最初の増幅を行った後、（ロ）〜（ニ）のう
ち、最初の増幅で用いたペアプライマーより内側のペア
プライマーを用いてNested ＰＣＲを行うことを特徴と
するポリメラーゼ連鎖反応による塩基配列の増幅法。 （９）最初の増幅に(イ)、Nested ＰＣＲに(ニ)のペア
プライマーを用いる増幅法。 （１０）（７）〜（９）のいずれかの増幅法による増幅
生産物であるヌクレオチド。
【００１０】（１１）クラミジア・トラコマチス微生物
を含む疑いのある試料に（７）〜（１０）のいずれかの
増幅法を適用し、増幅生産物であるヌクレオチドを検索
することを特徴とする、クラミジア・トラコマチス微生
物の外膜蛋白遺伝子の検出法。 （１２）さらに、増幅生産物であるヌクレオチドを制限
酵素Ａlu Ｉ、ＥcoＲ Ｖ、Ｈind III、Ｔaq ＩおよびＨ
haＩを用いて消化し、その消化物のＤＮＡ断片のサイズ
を解析し比較することを特徴とする、クラミジア・トラ
コマチス微生物血清型の鑑別法。 （１３）消化物を４％アガロースゲル電気泳動法に供
し、消化物を相互にまたは主要外膜蛋白質遺伝子を用い
て得た増幅生産物の消化物と比較してＤＮＡ断片のサイ
ズを解析し比較するものである、（１２）の鑑別法。
を含む疑いのある試料に（７）〜（１０）のいずれかの
増幅法を適用し、増幅生産物であるヌクレオチドを検索
することを特徴とする、クラミジア・トラコマチス微生
物の外膜蛋白遺伝子の検出法。 （１２）さらに、増幅生産物であるヌクレオチドを制限
酵素Ａlu Ｉ、ＥcoＲ Ｖ、Ｈind III、Ｔaq ＩおよびＨ
haＩを用いて消化し、その消化物のＤＮＡ断片のサイズ
を解析し比較することを特徴とする、クラミジア・トラ
コマチス微生物血清型の鑑別法。 （１３）消化物を４％アガロースゲル電気泳動法に供
し、消化物を相互にまたは主要外膜蛋白質遺伝子を用い
て得た増幅生産物の消化物と比較してＤＮＡ断片のサイ
ズを解析し比較するものである、（１２）の鑑別法。
【００１１】この発明でプライマーとして使用するヌク
レオチドのうち、配列番号:１〜配列番号:４のヌクレオ
チドは、クラミジア・トラコマチス(Ｃlamydia tracho
matis)の外膜蛋白をコードする遺伝子の一部をなすもの
である。クラミジア・トラコマチスには少なくとも１５
種類の血清型(Ａ、Ｂ、Ｂa、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、
Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)が知られているが、こ
のクラミジア・トラコマチスの外膜蛋白をコードしてい
る遺伝子配列には４つの変異ドメインＩ〜IVが存在す
る。その４つの変異ドメインのうちＩ〜IIIを含む領域
の遺伝子を増幅し、その増幅領域の配列の違いから制限
酵素を用い消化物を得ることにより、例えばその消化物
の電気泳動パターンの比較分析により、増幅生産物の切
断パターンの違いからクラミジア・トラコマチスの迅速
な血清型の鑑別が可能であることを見い出した。
レオチドのうち、配列番号:１〜配列番号:４のヌクレオ
チドは、クラミジア・トラコマチス(Ｃlamydia tracho
matis)の外膜蛋白をコードする遺伝子の一部をなすもの
である。クラミジア・トラコマチスには少なくとも１５
種類の血清型(Ａ、Ｂ、Ｂa、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、
Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)が知られているが、こ
のクラミジア・トラコマチスの外膜蛋白をコードしてい
る遺伝子配列には４つの変異ドメインＩ〜IVが存在す
る。その４つの変異ドメインのうちＩ〜IIIを含む領域
の遺伝子を増幅し、その増幅領域の配列の違いから制限
酵素を用い消化物を得ることにより、例えばその消化物
の電気泳動パターンの比較分析により、増幅生産物の切
断パターンの違いからクラミジア・トラコマチスの迅速
な血清型の鑑別が可能であることを見い出した。
【００１２】以下、本発明のクラミジア・トラコマチス
微生物の検出および血清型鑑別法について説明する。こ
の発明の１つの特徴は、クラミジア・トラコマチス微生
物の遺伝子の一部を増幅させた後、増幅領域に３つの変
異ドメインが存在することから、増幅生産物を適当な制
限酵素により処理を行い、消化物を電気泳動に供し、そ
の切断パターンを比較解析することによりクラミジア・
トラコマチスに生物の血清型を高感度にまた迅速に鑑別
し得ることである。
微生物の検出および血清型鑑別法について説明する。こ
の発明の１つの特徴は、クラミジア・トラコマチス微生
物の遺伝子の一部を増幅させた後、増幅領域に３つの変
異ドメインが存在することから、増幅生産物を適当な制
限酵素により処理を行い、消化物を電気泳動に供し、そ
の切断パターンを比較解析することによりクラミジア・
トラコマチスに生物の血清型を高感度にまた迅速に鑑別
し得ることである。
【００１３】遺伝子の増幅は、ポリメラーゼ・チェイン
・リアクション法（Polymerase Chain Reaction法、以
下ＰＣＲ法）（ＰＣＲ反応による塩基配列の増幅は、特
開昭６１−２７４６９７号公報、特開昭６２−２８１号
公報、サカイら（Sakai,et al.）サイエンス（Scienc
e）２３９巻４８７−４９１頁等参照）により容易に行
うことができる。たとえば自動増幅装置を用いて、例え
ば緩衝液のような適当な媒質の中で鋳型ＤＮＡ、各塩
基、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを温度変換サ
イクルにかける等の当技術で知られた方法により行うこ
とができる。
・リアクション法（Polymerase Chain Reaction法、以
下ＰＣＲ法）（ＰＣＲ反応による塩基配列の増幅は、特
開昭６１−２７４６９７号公報、特開昭６２−２８１号
公報、サカイら（Sakai,et al.）サイエンス（Scienc
e）２３９巻４８７−４９１頁等参照）により容易に行
うことができる。たとえば自動増幅装置を用いて、例え
ば緩衝液のような適当な媒質の中で鋳型ＤＮＡ、各塩
基、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを温度変換サ
イクルにかける等の当技術で知られた方法により行うこ
とができる。
【００１４】本発明は１回目のＰＣＲ反応の後、より多
量の増幅生産物を得るために、２回目のＰＣＲ、すなわ
ち、Nested ＰＣＲを行うことを含み、このNested ＰＣ
Ｒに用いられるプライマーをも提供するものである。Ne
sted ＰＣＲは一般にＰＣＲ法による検査の検出感度を
上昇させるために用いられる手段である。例えば、検体
の１回目の増幅生産物が一定量より少ないために、その
増幅生産物のＤＮＡ断片（バンド）はアガロースゲルを
エチジウムブロマイドで染色する方法では観察されず、
陰性と判定される。そこで、１回目のＰＣＲ生産物を鋳
型として、２回目のＰＣＲを行い、エチジウムブロマイ
ド染色で観察できる量とし検出感度を上げるためにNest
ed ＰＣＲが行われる。
量の増幅生産物を得るために、２回目のＰＣＲ、すなわ
ち、Nested ＰＣＲを行うことを含み、このNested ＰＣ
Ｒに用いられるプライマーをも提供するものである。Ne
sted ＰＣＲは一般にＰＣＲ法による検査の検出感度を
上昇させるために用いられる手段である。例えば、検体
の１回目の増幅生産物が一定量より少ないために、その
増幅生産物のＤＮＡ断片（バンド）はアガロースゲルを
エチジウムブロマイドで染色する方法では観察されず、
陰性と判定される。そこで、１回目のＰＣＲ生産物を鋳
型として、２回目のＰＣＲを行い、エチジウムブロマイ
ド染色で観察できる量とし検出感度を上げるためにNest
ed ＰＣＲが行われる。
【００１５】本発明でプライマーとして使用するＣＴＭ
−１、ＣＴＭ−４、ＣＴＭ−７、ＣＴＭ−８のヌクレオ
チドはクラミジア・トラコマチスの外膜蛋白遺伝子の一
部をなすものである。ＣＴＭ−１およびＣＴＭ−４プラ
イマーは順方向のプライマーであり、ＣＴＭ−１はＣＴ
Ｍ−４より外側のプライマーである。ＣＴＭ−８および
ＣＴＭ−７は逆方向プライマーであり、ＣＴＭ−７はＣ
ＴＭ−８より内側のプライマーである。ＰＣＲ反応に用
いられ得るペアプライマーは、（イ）（ＣＴＭ−１と
８）、（ロ）（ＣＴＭ−１と７）、（ハ）（ＣＴＭ−４
と８）および（ニ）（ＣＴＭ−４と７）である。Nested
ＰＣＲに用いられるプライマーは、一般に１回目のプ
ライマーがアニーリングするよりも、標的配列の内側の
配列にアニーリングするプライマーが用いられる。１回
目のＰＣＲにペアプライマー（イ）を用いれば、Ｎeste
d ＰＣＲには、（ロ）、（ハ）または（ニ）のいずれで
も用いることができるが、１回目のＰＣＲに（ロ）また
は（ハ）を用いれば、Ｎested ＰＣＲには(ニ)を用いる
ことになる。これらのプライマーは、例えばＤＮＡ合成
機を用いて、当技術で知られた方法により合成すること
ができる。合成したプライマーは、例えば高速液体クロ
マトグラフィーのような精製手段により精製するのが好
ましい。
−１、ＣＴＭ−４、ＣＴＭ−７、ＣＴＭ−８のヌクレオ
チドはクラミジア・トラコマチスの外膜蛋白遺伝子の一
部をなすものである。ＣＴＭ−１およびＣＴＭ−４プラ
イマーは順方向のプライマーであり、ＣＴＭ−１はＣＴ
Ｍ−４より外側のプライマーである。ＣＴＭ−８および
ＣＴＭ−７は逆方向プライマーであり、ＣＴＭ−７はＣ
ＴＭ−８より内側のプライマーである。ＰＣＲ反応に用
いられ得るペアプライマーは、（イ）（ＣＴＭ−１と
８）、（ロ）（ＣＴＭ−１と７）、（ハ）（ＣＴＭ−４
と８）および（ニ）（ＣＴＭ−４と７）である。Nested
ＰＣＲに用いられるプライマーは、一般に１回目のプ
ライマーがアニーリングするよりも、標的配列の内側の
配列にアニーリングするプライマーが用いられる。１回
目のＰＣＲにペアプライマー（イ）を用いれば、Ｎeste
d ＰＣＲには、（ロ）、（ハ）または（ニ）のいずれで
も用いることができるが、１回目のＰＣＲに（ロ）また
は（ハ）を用いれば、Ｎested ＰＣＲには(ニ)を用いる
ことになる。これらのプライマーは、例えばＤＮＡ合成
機を用いて、当技術で知られた方法により合成すること
ができる。合成したプライマーは、例えば高速液体クロ
マトグラフィーのような精製手段により精製するのが好
ましい。
【００１６】好ましい実施方法の一例を示すと次の通り
である。 (１)０.５mlの遠心管に下記組成の反応液を入れる。必
要ならば、ミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５
１６)で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.５μＭの順方向プライマー ０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl2 ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えば
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大腸
菌で発現させたもの]が適当である。
である。 (１)０.５mlの遠心管に下記組成の反応液を入れる。必
要ならば、ミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５
１６)で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.５μＭの順方向プライマー ０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl2 ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えば
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大腸
菌で発現させたもの]が適当である。
【００１７】(２)自動増幅装置（好ましくは、ミネラル
・オイルを用いなくとも反応溶液の蒸発を防げるものが
よい。）をセットし、熱変性段階、アニーリング段階お
よび伸長段階からなるサイクルを２０サイクル以上、好
ましくは３０サイクル以上行なう。これを１回のＰＣＲ
反応または増幅という。熱変性温度は通常９０−９５
℃、アニーリング温度は通常４０−６０℃、伸長温度は
通常７０〜７５℃が適当であるが、アニーリング温度は
プライマーの長さとＧＣ含量により異なる。アニーリン
グ温度は、通常Ｔm℃[但し、Ｔm℃＝４×(Ｇ＋Ｃ)＋２
×(Ａ＋Ｔ)]からＴm−２０℃が適当であり、Ｔm−５℃
前後が好ましい。自動増幅装置は、例えばパーキン・エ
ルマー・シータス社から販売されている。
・オイルを用いなくとも反応溶液の蒸発を防げるものが
よい。）をセットし、熱変性段階、アニーリング段階お
よび伸長段階からなるサイクルを２０サイクル以上、好
ましくは３０サイクル以上行なう。これを１回のＰＣＲ
反応または増幅という。熱変性温度は通常９０−９５
℃、アニーリング温度は通常４０−６０℃、伸長温度は
通常７０〜７５℃が適当であるが、アニーリング温度は
プライマーの長さとＧＣ含量により異なる。アニーリン
グ温度は、通常Ｔm℃[但し、Ｔm℃＝４×(Ｇ＋Ｃ)＋２
×(Ａ＋Ｔ)]からＴm−２０℃が適当であり、Ｔm−５℃
前後が好ましい。自動増幅装置は、例えばパーキン・エ
ルマー・シータス社から販売されている。
【００１８】増幅生産物は、例えばアガロースゲル電気
泳動法のような分離手段により分離し、ＤＮＡ断片であ
るバンドとして検出される。アガロースゲルは０.２〜
０.６％のものを使用するが、好ましくは、０.４％アガ
ロースゲルを用いる。また、生産物はマーカーとのバン
ドの長さの比較によりクラミジア・トラコマチス由来の
ＤＮＡ断片であるか確認することができる。なお、電気
泳動後のＤＮＡ断片は、エチジウム・ブロマイドで染色
し、紫外線照射することにより観察できる。
泳動法のような分離手段により分離し、ＤＮＡ断片であ
るバンドとして検出される。アガロースゲルは０.２〜
０.６％のものを使用するが、好ましくは、０.４％アガ
ロースゲルを用いる。また、生産物はマーカーとのバン
ドの長さの比較によりクラミジア・トラコマチス由来の
ＤＮＡ断片であるか確認することができる。なお、電気
泳動後のＤＮＡ断片は、エチジウム・ブロマイドで染色
し、紫外線照射することにより観察できる。
【００１９】さらに、この発明によると、増幅生産物を
異なる制限酵素により消化すると、クラミジア・トラコ
マチス微生物の血清型に応じて異なる消化物を生じ、そ
れによって血清型の鑑別が可能である。例えば、生産物
を、Ａlu Ｉで消化すると、クラミジア・トラコマチス
微生物の血清型Ａ／Ｋ、Ｂ／Ｄ、Ｂａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ／Ｉ／Ｌ３、Ｊ、Ｌ１、Ｌ２の１１パターンに電
気泳動パターンが分かれ各血清型の鑑別が可能である
（図１）。制限酵素ＡluＩで識別できない血清型ＢとＤ
は制限酵素ＥcoＲ Ｖの処理でＢは消化されないがＤが
消化されることにより識別される（図２）。また、血清
型Ａ／ＫおよびＨ／Ｉ／Ｌ３は制限酵素Ａlu Ｉにより
消化された断片の一番大きいものが前群のほうがわずか
に大きいことで識別できる。しかし、非常に似たパター
ンを示す。これら５つの血清型の識別は、制限酵素Ｈin
d III、ＴaqＩとＨhaＩによる消化パターンの比較によ
り識別できる（図３および表１）。以上の操作により、
上記の制限酵素を用いＰＣＲ産物を処理し、その消化パ
ターンを観察することにより、これらクラミジア・トラ
コマチス微生物の１５血清型を鑑別することができる。
異なる制限酵素により消化すると、クラミジア・トラコ
マチス微生物の血清型に応じて異なる消化物を生じ、そ
れによって血清型の鑑別が可能である。例えば、生産物
を、Ａlu Ｉで消化すると、クラミジア・トラコマチス
微生物の血清型Ａ／Ｋ、Ｂ／Ｄ、Ｂａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ／Ｉ／Ｌ３、Ｊ、Ｌ１、Ｌ２の１１パターンに電
気泳動パターンが分かれ各血清型の鑑別が可能である
（図１）。制限酵素ＡluＩで識別できない血清型ＢとＤ
は制限酵素ＥcoＲ Ｖの処理でＢは消化されないがＤが
消化されることにより識別される（図２）。また、血清
型Ａ／ＫおよびＨ／Ｉ／Ｌ３は制限酵素Ａlu Ｉにより
消化された断片の一番大きいものが前群のほうがわずか
に大きいことで識別できる。しかし、非常に似たパター
ンを示す。これら５つの血清型の識別は、制限酵素Ｈin
d III、ＴaqＩとＨhaＩによる消化パターンの比較によ
り識別できる（図３および表１）。以上の操作により、
上記の制限酵素を用いＰＣＲ産物を処理し、その消化パ
ターンを観察することにより、これらクラミジア・トラ
コマチス微生物の１５血清型を鑑別することができる。
【００２０】上記の鑑別法を実施するには、実施に必要
な試剤および器具をまとめてキットにしておくのが便利
である。このようなキットは、下記のものの中から選ば
れたものを含むことができる。(１)順方向プライマー、
(２)逆方向プライマー、(３)緩衝液、(４)ＫＣl、(５)
ＭgＣl2、(６)ゼラチン、(７)４種類のdＮＴＰ、(８)Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、(９)遠心管、(１０)発色試薬(例え
ばエチジウム・ブロマイド)、(１１)制限酵素(４種)、
等。検体としては、細胞、組織、粘膜、これらの破砕
物、粘液、血液、滲出液、培地等を挙げることができ
る。
な試剤および器具をまとめてキットにしておくのが便利
である。このようなキットは、下記のものの中から選ば
れたものを含むことができる。(１)順方向プライマー、
(２)逆方向プライマー、(３)緩衝液、(４)ＫＣl、(５)
ＭgＣl2、(６)ゼラチン、(７)４種類のdＮＴＰ、(８)Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、(９)遠心管、(１０)発色試薬(例え
ばエチジウム・ブロマイド)、(１１)制限酵素(４種)、
等。検体としては、細胞、組織、粘膜、これらの破砕
物、粘液、血液、滲出液、培地等を挙げることができ
る。
【００２１】
【実施例】以下、この発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、実施例はこの発明を制限するものではな
い。 実施例１(プライマーの合成) アプライド・バイオシステムズ・ジャパン株式会社モデ
ル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ ＥＰＮＤＡシンセサイザー
を使用し、同社のオペレーターズマニュアルに従って塩
基の結合と脱保護を行い、プライマーＣＴＭ−１（配列
番号：１）、ＣＴＭ−８（配列番号：２）、ＣＴＭ−４
（配列番号：３）およびＣＴＭ−７（配列番号：４）を
合成した。
に説明するが、実施例はこの発明を制限するものではな
い。 実施例１(プライマーの合成) アプライド・バイオシステムズ・ジャパン株式会社モデ
ル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ ＥＰＮＤＡシンセサイザー
を使用し、同社のオペレーターズマニュアルに従って塩
基の結合と脱保護を行い、プライマーＣＴＭ−１（配列
番号：１）、ＣＴＭ−８（配列番号：２）、ＣＴＭ−４
（配列番号：３）およびＣＴＭ−７（配列番号：４）を
合成した。
【００２２】実施例２(クラミジア・トラコマチス微生
物) 使用したクラミジア・トラコマチス微生物１５血清型細
胞は、国立予防衛生研究所において継代培養されている
標準株、Ａ／Ｇ−１７／ＯＴ，Ｂ／ＴＷ−５／ＯＴ，Ｂ
ａ／ＡＰ−２／ＯＴ，Ｃ／ＴＷ−３／ＯＴ，Ｄ／ＵＷ−
３／Ｃx，Ｅ／ＵＷ−５／Ｃx，Ｆ／ＵＷ−６／Ｃx，Ｇ
／ＵＷ−５７／Ｃx，Ｈ／ＵＷ−４／Ｃx，Ｉ／ＵＷ−１
２／Ｕr，Ｊ／ＵＷ−３６／Ｃx，Ｋ／ＵＷ−３１／Ｃ
x，Ｌ１／４４０／Ｂubo，Ｌ２／４３４／Ｂubo，Ｌ３
／４０４／Ｂuboである。
物) 使用したクラミジア・トラコマチス微生物１５血清型細
胞は、国立予防衛生研究所において継代培養されている
標準株、Ａ／Ｇ−１７／ＯＴ，Ｂ／ＴＷ−５／ＯＴ，Ｂ
ａ／ＡＰ−２／ＯＴ，Ｃ／ＴＷ−３／ＯＴ，Ｄ／ＵＷ−
３／Ｃx，Ｅ／ＵＷ−５／Ｃx，Ｆ／ＵＷ−６／Ｃx，Ｇ
／ＵＷ−５７／Ｃx，Ｈ／ＵＷ−４／Ｃx，Ｉ／ＵＷ−１
２／Ｕr，Ｊ／ＵＷ−３６／Ｃx，Ｋ／ＵＷ−３１／Ｃ
x，Ｌ１／４４０／Ｂubo，Ｌ２／４３４／Ｂubo，Ｌ３
／４０４／Ｂuboである。
【００２３】実施例３（クラミジア・トラコマチス感染
ＨｅＬａ細胞および検体からのＤＮＡ抽出） 実施例２に記載した１５種類のクラミジア・トラコマチ
スに感染した各々のＨｅＬａ細胞を、ラバーポリスマン
で剥がし、ウログラフィン不連続密度勾配法によりクラ
ミジア基本小体を粗精製した。その粗精製液および検体
溶液を、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む緩
衝液［１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.５％
ＳＤＳ］中に加え、５５℃６０分間反応させた。その
後、フェノール／クロロホルム抽出を施行し、エタノー
ル沈殿を行い滅菌水に再懸濁させた。その溶液の一部を
実施例４記載のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ試料とした。
ＨｅＬａ細胞および検体からのＤＮＡ抽出） 実施例２に記載した１５種類のクラミジア・トラコマチ
スに感染した各々のＨｅＬａ細胞を、ラバーポリスマン
で剥がし、ウログラフィン不連続密度勾配法によりクラ
ミジア基本小体を粗精製した。その粗精製液および検体
溶液を、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む緩
衝液［１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.５％
ＳＤＳ］中に加え、５５℃６０分間反応させた。その
後、フェノール／クロロホルム抽出を施行し、エタノー
ル沈殿を行い滅菌水に再懸濁させた。その溶液の一部を
実施例４記載のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ試料とした。
【００２４】実施例４(ＰＣＲ反応) クラミジア・トラコマチス検出のために、ペアプライマ
ーＣＴＭ−１（配列番号:１）およびＣＴＭ−８（配列
番号:２）を使用した。ＰＣＲの反応は、タカラ・ジー
ン・アンプ（商標）ＰＣＲ試薬キット、アンプリタック
（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴaＫaＲa Ｇene Ａmp
（商標）ＲeagentＫit with ＡmpliＴaq（商標）ＤＮＡ
（Ｐolymerase）を使用して行った。ＰＣＲ混合液とし
ては、１×反応緩衝液[１０mＭ トリス・ＨＣl(pＨ８.
３)、５０mＭ ＫＣl;１.５mＭ ＭgＣl2、０.００１％
ゼラチン]、２５０μＭずつのデオキシヌクレオシド３
−リン酸混合液（dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴ
Ｐ）、０.５μＭのＣＴＭ−１およびＣＴＭ−８、１.２
５単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼを含ませた全量５０
μlとした。鋳型ＤＮＡとしては、クラミジア培養物ま
たは実施例３の溶液を用いた。ＰＣＲ温度条件は、９４
℃で３分間の長い変性過程の後、９４℃の変性３０秒、
５５℃のアニーリング３０秒、７２℃の伸長６０秒を３
５サイクル行った。最終サイクルの後、７２℃の長い伸
長を７分間行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ生産物を
分析するまで４℃で保存した。
ーＣＴＭ−１（配列番号:１）およびＣＴＭ−８（配列
番号:２）を使用した。ＰＣＲの反応は、タカラ・ジー
ン・アンプ（商標）ＰＣＲ試薬キット、アンプリタック
（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴaＫaＲa Ｇene Ａmp
（商標）ＲeagentＫit with ＡmpliＴaq（商標）ＤＮＡ
（Ｐolymerase）を使用して行った。ＰＣＲ混合液とし
ては、１×反応緩衝液[１０mＭ トリス・ＨＣl(pＨ８.
３)、５０mＭ ＫＣl;１.５mＭ ＭgＣl2、０.００１％
ゼラチン]、２５０μＭずつのデオキシヌクレオシド３
−リン酸混合液（dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴ
Ｐ）、０.５μＭのＣＴＭ−１およびＣＴＭ−８、１.２
５単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼを含ませた全量５０
μlとした。鋳型ＤＮＡとしては、クラミジア培養物ま
たは実施例３の溶液を用いた。ＰＣＲ温度条件は、９４
℃で３分間の長い変性過程の後、９４℃の変性３０秒、
５５℃のアニーリング３０秒、７２℃の伸長６０秒を３
５サイクル行った。最終サイクルの後、７２℃の長い伸
長を７分間行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ生産物を
分析するまで４℃で保存した。
【００２５】実施例５（Ｎested ＰＣＲ） １回目のＰＣＲ生産物を実施例６で述べるアガロース電
気泳動に供し十分なＰＣＲ生産物が得られていない場合
（バンドが薄いとき）、制限酵素処理後の切断断片の観
察が不可能となることが多い。そこで、ＰＣＲ生産物の
増量をはかるために、実施例４で得られたＰＣＲ産物を
鋳型ＤＮＡとしプライマーＣＴＭ−４（配列番号３）と
ＣＴＭ−７（配列番号４）を用いnested ＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲ反応液組成および反応条件はＰＣＲサイクル
を２５とした以外は実施例４と同じ条件で行った。
気泳動に供し十分なＰＣＲ生産物が得られていない場合
（バンドが薄いとき）、制限酵素処理後の切断断片の観
察が不可能となることが多い。そこで、ＰＣＲ生産物の
増量をはかるために、実施例４で得られたＰＣＲ産物を
鋳型ＤＮＡとしプライマーＣＴＭ−４（配列番号３）と
ＣＴＭ−７（配列番号４）を用いnested ＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲ反応液組成および反応条件はＰＣＲサイクル
を２５とした以外は実施例４と同じ条件で行った。
【００２６】実施例６（アガロースゲル電気泳動） ＰＣＲ、nested ＰＣＲ反応液（ＰＣＲ産物）および実
施例７で行う制限酵素処理反応液の一部に全体の６分の
１量の６×ゲル・ローディング緩衝液［０.２５％（w/
v）プロモフェノールブルー、０.２５％（w/v）キシレ
ンシアノール、３０％（w/v）グリセリン］を混合し、
４％アガロースゲル［ＮuＳieve（商標）３：１アガロ
ース］に負荷した。電気泳動［条件：１００Ｖ、４０〜
６０分泳動（Ｍuｐid−２（商標）、コスモバイオ）］
後、エチジウム・プロマイド染色しＵＶトランスイルミ
ネーターを使用してＤＮＡ断片を観察し、ポラロイドカ
メラにより写真を撮った。
施例７で行う制限酵素処理反応液の一部に全体の６分の
１量の６×ゲル・ローディング緩衝液［０.２５％（w/
v）プロモフェノールブルー、０.２５％（w/v）キシレ
ンシアノール、３０％（w/v）グリセリン］を混合し、
４％アガロースゲル［ＮuＳieve（商標）３：１アガロ
ース］に負荷した。電気泳動［条件：１００Ｖ、４０〜
６０分泳動（Ｍuｐid−２（商標）、コスモバイオ）］
後、エチジウム・プロマイド染色しＵＶトランスイルミ
ネーターを使用してＤＮＡ断片を観察し、ポラロイドカ
メラにより写真を撮った。
【００２７】実施例７（クラミジア・トラコマチス微生
物血清型の鑑別） 得られたクラミジア・トラコマチスのＰＣＲ生産物を５
種の制限酵素によって消化することにより、その血清型
の鑑別ができた。制限酵素Ａlu Ｉ、ＥcoＲ Ｖ、Ｈind
III、Ｔaq ＩおよびＨhaＩを使用した。ＰＣＲ産物１０
μｌを取り、それぞれの酵素の緩衝液を加え、至適温度
(３７℃および６５℃)で反応させた。その後、２μlの
６×ゲル・ローデイング緩衝液を加え、電気泳動により
分析を行った。
物血清型の鑑別） 得られたクラミジア・トラコマチスのＰＣＲ生産物を５
種の制限酵素によって消化することにより、その血清型
の鑑別ができた。制限酵素Ａlu Ｉ、ＥcoＲ Ｖ、Ｈind
III、Ｔaq ＩおよびＨhaＩを使用した。ＰＣＲ産物１０
μｌを取り、それぞれの酵素の緩衝液を加え、至適温度
(３７℃および６５℃)で反応させた。その後、２μlの
６×ゲル・ローデイング緩衝液を加え、電気泳動により
分析を行った。
【００２８】標準株のＤＮＡを鋳型にしてＣＴＭ−１
（配列番号：１）およびＣＴＭ−８（配列番号：２）を
用いて実施例４に記載と同様にして１回目のＰＣＲ反応
を行い、そのＰＣＲ産物の１μｌをNested ＰＣＲの鋳
型としてプライマーＣＴＭ−４（配列番号：３）および
ＣＴＭ−７（配列番号：４）を用いて実施例５に記載と
同様にしてNested ＰＣＲを行い、得られた生産物を制
限酵素Ａlu Ｉで消化すると、クラミジア・トラコマチ
ス微生物の血清型Ａ／Ｋ、Ｂ／Ｄ、Ｂａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ／Ｉ／Ｌ３、Ｊ、Ｌ１、Ｌ２の１１パターンに電
気泳動パターンが分かれ各血清型の鑑別が可能である
（図１）。制限酵素ＡluＩで識別できない血清型ＢとＤ
は制限酵素ＥcoＲ Ｖの処理でＢは消化されないがＤが
消化されることにより識別される（図２）。また、血清
型Ａ／ＫおよびＨ／Ｉ／Ｌ３は制限酵素Ａlu Ｉにより
消化された断片の一番大きいものが前群のほうがわずか
に大きいことで識別できる。しかし、非常に似たパター
ンを示す。これら５つの血清型の識別は、制限酵素Ｈin
d III、ＴaqＩとＨhaＩによる消化パターンの比較によ
り識別できた（図３および表１）。以上の分析結果を図
１、図２、図３および表１に示す。
（配列番号：１）およびＣＴＭ−８（配列番号：２）を
用いて実施例４に記載と同様にして１回目のＰＣＲ反応
を行い、そのＰＣＲ産物の１μｌをNested ＰＣＲの鋳
型としてプライマーＣＴＭ−４（配列番号：３）および
ＣＴＭ−７（配列番号：４）を用いて実施例５に記載と
同様にしてNested ＰＣＲを行い、得られた生産物を制
限酵素Ａlu Ｉで消化すると、クラミジア・トラコマチ
ス微生物の血清型Ａ／Ｋ、Ｂ／Ｄ、Ｂａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ／Ｉ／Ｌ３、Ｊ、Ｌ１、Ｌ２の１１パターンに電
気泳動パターンが分かれ各血清型の鑑別が可能である
（図１）。制限酵素ＡluＩで識別できない血清型ＢとＤ
は制限酵素ＥcoＲ Ｖの処理でＢは消化されないがＤが
消化されることにより識別される（図２）。また、血清
型Ａ／ＫおよびＨ／Ｉ／Ｌ３は制限酵素Ａlu Ｉにより
消化された断片の一番大きいものが前群のほうがわずか
に大きいことで識別できる。しかし、非常に似たパター
ンを示す。これら５つの血清型の識別は、制限酵素Ｈin
d III、ＴaqＩとＨhaＩによる消化パターンの比較によ
り識別できた（図３および表１）。以上の分析結果を図
１、図２、図３および表１に示す。
【表１】 血清型Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｌ３の鑑別 制限酵素Ｈind III、ＴaqＩ、ＨhaＩによる切断の有無 Ｈind III ＴaqＩ ＨhaＩ Ａ − − Ｋ − ＋ Ｈ ＋ ＋ Ｉ ＋ − ＋ Ｌ３ ＋ − −
【００２９】実施例８（臨床検体からのクラミジア・ト
ラコマチス微生物血清型の鑑別） クラミジア感染症が疑われた患者から実際にクラミジア
・トラコマチスが分離培養され、モノクローナル抗体に
より血清型が決定された臨床検体から直接実施例３記載
の方法によりＤＮＡを抽出した。次いで、実施例４およ
び５記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、実施例７の方
法により血清型の鑑別を行った結果、マイクロトラック
法の結果と良く一致していた。
ラコマチス微生物血清型の鑑別） クラミジア感染症が疑われた患者から実際にクラミジア
・トラコマチスが分離培養され、モノクローナル抗体に
より血清型が決定された臨床検体から直接実施例３記載
の方法によりＤＮＡを抽出した。次いで、実施例４およ
び５記載の方法によりＰＣＲ反応を行い、実施例７の方
法により血清型の鑑別を行った結果、マイクロトラック
法の結果と良く一致していた。
【００３０】
【００３１】配列番号:１ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：TTGCGATCCTTGCACCACTT 20
【００３２】配列番号:２ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：GCTCGAGACCATTTAACTCC 20
【００３３】配列番号:３ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：GGTGACTTTGTTTTCGACCG 20
【００３４】配列番号:４ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：CTCCAATGTAGGGAGTGAAC 20
【図１】 制限酵素ＡluＩによる切断パターンを示す実
施例７の電気泳動写真である。
施例７の電気泳動写真である。
【図２】 制限酵素ＥcoＲＶによる切断パターンを示す
実施例７の電気泳動写真である。
実施例７の電気泳動写真である。
【図３】 制限酵素Ｈind III、ＴaqＩ、ＨhaＩによる
切断パターンを示す実施例７の電気泳動写真である。
切断パターンを示す実施例７の電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 岸 雄一郎 大阪府大阪市城東区森之宮二丁目３番30 号 扶桑薬品工業株式会社研究開発セン ター内 (72)発明者 吉田 洋 大阪府大阪市城東区森之宮二丁目３番30 号 扶桑薬品工業株式会社研究開発セン ター内 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, 1992，Ｖｏｌ．30，Ｎｏ．５，ｐ．1098 −1104 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔ ｙ，1989，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ．４，ｐ. 1040−1049 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12Q 1/04 C12N 15/09 C12N 15/31 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 クラミジア・トラコマチスの全血清型の
主要外膜蛋白遺伝子の検出方法であって、クラミジア属
微生物を含む疑のある試料について、上記微生物の主要
外膜蛋白遺伝子の一部をポリメラーゼ連鎖反応にて増幅
可能である下記プライマー１を用いて増幅し増幅生産物
を得、ついで上記増幅生産物の一部をポリメラーゼ連鎖
反応にて増幅可能である下記プライマー２を用いて増幅
し最終増幅生産物を得、上記最終増幅生産物を検索する
こと、および、上記プライマー１が、 下記配列（配列番号：１） ５'−ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＴＴ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に (イ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
と、 (ロ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
または端に−Ｇもしくは−ＧＧを付加すること、 (ハ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
ら選ばれた他の塩基に置き換えることの少なくとも１つ
の変更を加えて得られる誘導体；および 下記配列（配列番号：２） ５'−ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＴ ＣＣ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に (イ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
と、 (ロ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
または端に−Ａもしくは−ＡＡを付加すること、 (ハ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
ら選ばれた他の塩基に置き換えることの少なくとも１つ
の変更を加えて得られる誘導体からなり、 上記プライマー２が、 下記配列（配列番号：３） ５'−ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＡＣ ＣＧ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に (イ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
と、 (ロ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
または端に−Ｔもしくは−ＴＧを付加すること、 (ハ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
ら選ばれた他の塩基に置き換えることの少なくとも１つ
の変更を加えて得られる誘導体；および 下記配列（配列番号：４） ５'−ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＧＡ ＡＣ−３' で示されるヌクレオチドまたは上記配列に (イ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
と、 (ロ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
または端に−Ａもしくは−ＡＴを付加すること、 (ハ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
ら選ばれた他の塩基に置き換えることの少なくとも１つ
の変更を加えて得られる誘導体からなることを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 クラミジア・トラコマチスの血清型を鑑
別する方法であって、請求項１に記載の最終増幅生産物
を、制限酵素Ａlu Ｉ、ＥcoＲ Ｖ、Ｈind III、Ｔaq Ｉ
およびＨhaＩを用いて消化し、その消化物を相互に比較
することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04911694A JP3264579B2 (ja) | 1994-03-18 | 1994-03-18 | クラミジア・トラコマチス血清型の鑑別法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04911694A JP3264579B2 (ja) | 1994-03-18 | 1994-03-18 | クラミジア・トラコマチス血清型の鑑別法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255499A JPH07255499A (ja) | 1995-10-09 |
| JP3264579B2 true JP3264579B2 (ja) | 2002-03-11 |
Family
ID=12822100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04911694A Expired - Fee Related JP3264579B2 (ja) | 1994-03-18 | 1994-03-18 | クラミジア・トラコマチス血清型の鑑別法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3264579B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6649618B2 (en) | 2000-07-18 | 2003-11-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted amidoalkyl-uracils and their use |
| US7348341B2 (en) | 2000-05-31 | 2008-03-25 | Astrazeneca Ab | Chemical compounds |
| US8334295B2 (en) | 2007-06-29 | 2012-12-18 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Pyrimidine derivatives as HIV reverse transcriptase inhibitors |
| US8354421B2 (en) | 2007-06-29 | 2013-01-15 | Korea Research Insitute Of Chemical Technology | HIV reverse transcriptase inhibitors |
-
1994
- 1994-03-18 JP JP04911694A patent/JP3264579B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９８９，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４，ｐ．１０４０−１０４９ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．５，ｐ．１０９８−１１０４ |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7348341B2 (en) | 2000-05-31 | 2008-03-25 | Astrazeneca Ab | Chemical compounds |
| US6649618B2 (en) | 2000-07-18 | 2003-11-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted amidoalkyl-uracils and their use |
| US8334295B2 (en) | 2007-06-29 | 2012-12-18 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Pyrimidine derivatives as HIV reverse transcriptase inhibitors |
| US8354421B2 (en) | 2007-06-29 | 2013-01-15 | Korea Research Insitute Of Chemical Technology | HIV reverse transcriptase inhibitors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07255499A (ja) | 1995-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baily et al. | Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification | |
| JP2607496B2 (ja) | カンピロバクター検出用プローブ | |
| JPH11503921A (ja) | 種の同定のための普遍的標的 | |
| Kahane et al. | Evidence that the novel microorganism ‘Z’may belong to a new genus in the family Chlamydiaceae | |
| EP0336412A2 (en) | Synthetic oligonucleotides useful for the determination of Chlamydia trachomatis in a biological sample | |
| CN112094847B (zh) | 幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途 | |
| CA2553286C (en) | Method for detecting pathogenic mycobacteria in clinical specimens | |
| WO2010062897A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| Fries et al. | Detection of untreated mycobacteria by using polymerase chain reaction and specific DNA probes | |
| JP3264579B2 (ja) | クラミジア・トラコマチス血清型の鑑別法 | |
| EP0739987A2 (en) | Oligonucleotides for detecting Salmonella species and detection process using the same | |
| LISBY et al. | Search for Mycobacterium paratuberculosis DNA in tissue from patients with sarcoidosis by enzymatic gene amplification | |
| JPS6188900A (ja) | 媒質中の所定微生物、特にレギオネラの検出用プロ−ブおよび検出方法 | |
| JP3264514B2 (ja) | クラミジアの検出法 | |
| JP3525259B2 (ja) | ペクチネータス属菌の検出 | |
| JPH05276999A (ja) | カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット | |
| US6518020B1 (en) | Haemobartonella PCR methods and materials | |
| CN105154438B (zh) | 对蜂房哈夫尼亚菌g5907，g5908，g5913，g5916特异的核苷酸及其应用 | |
| JP2007159533A (ja) | ウエルシュ菌検出用プライマーおよび方法 | |
| CN105112406B (zh) | 对蜂房哈夫尼亚菌g5897，g5898，g5900特异的核苷酸及其应用 | |
| JP3264608B2 (ja) | クラミジア属微生物種の同定法 | |
| Kaltwasser et al. | Enzymatic DNA amplification (PCR) in the diagnosis of extrapulmonary Mycobacterium tuberculosis infection | |
| RU2289627C2 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК БАКТЕРИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛАЙМСКОГО БОРРЕЛИОЗА-Borrelia burgdorferi | |
| JP2004081054A (ja) | 腸管出血性大腸菌ベロトキシン検出のためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法 | |
| JP2902054B2 (ja) | ヒト型結核菌の検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081228 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091228 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091228 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101228 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101228 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111228 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121228 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |