JPH0690793A - ラクトバチルス属細菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ラクトバチルス属細菌に特異的な遺伝子を提
供し、それを用いて該細菌を迅速、且つ高感度に検出す
る方法及びキットを提供する。 【構成】 ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコ
ードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の
間にあるスペーサー領域の遺伝子を検出する該細菌の検
出方法。該スペーサー領域の遺伝子。該遺伝子を増幅さ
せるための特定のプライマーを含有する該細菌の検出キ
ット。特に火落菌の検出に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラクトバチルス( Lact
obacillus ) 属細菌の検出方法に関し、更に詳細には１
６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の遺伝子領域を用
いた迅速かつ高感度な火落菌等の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】清酒の火落ちを起こす微生物（火落菌）
に関する研究は、北原や野白、百瀬によって分類学的研
究を行われている（日本醸造協会雑誌、第６５巻、第７
１５〜８０３頁、（１９７０）〕。火落菌はラクトバチ
ルス属に属し、メバロン酸の要求性から真性火落菌と火
落性乳酸菌に分類される。真性火落菌には、ラクトバチ
ルス ヘテロヒオチイ( Lactobacillus heterohiochii
) とラクトバチルス ホモヒオチイ( Lactobacillus h
omohiochii ) があり、火落性乳酸菌には、ラクトバチ
ルス ジャポニカス(Lactobacillus japonicus ) 、ラ
クトバチルス プランタルム( Lactobacillusplantarum
) 、ラクトバチルス カゼイ( Lactobacillus casei )
等が挙げられる。火落菌の検出は、火落菌検出培地Ｓ
Ｉ培地（日本醸造協会）が市販されており、本培地を用
いた培養法により検出が行われている。しかし、この検
出法には７日間以上の日数を要する。したがって、火落
菌の迅速高感度検出法が望まれている。微生物やウイル
スの迅速高感度検出法としてＰＣＲ法〔メソッズ イン
エザイモロジー( Methods in Enzymology ) 、第１５
５巻、第３３５〜３５０頁（１９８７）〕がある。ＰＣ
Ｒ法は、検出する生物の遺伝子の特異的配列を指数的に
増幅させる方法である。ＰＣＲ法を用いるには検出する
生物の遺伝子情報が必要である。

【０００３】ラクトバチルス属細菌のｒＲＮＡ遺伝子に
ついては、ラクトバチルス ブレビス( Lactobacillus
brevis )、ラクトバチルス デルブルエキイ( Lactobac
illus delbrueckii ) 、ラクトバチルス プランタル
ム、及びラクトバチルス ビリデセンス( Lactobacillu
s viridescens ) の５ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が明
らかにされており〔ジャーナル オブ モレキュラー
エボルーション(Journalof Molecular Evolution )、第
８巻、第１４３〜１５３頁（１９７６）、ヌクレイック
アシッズ リサーチ( Nucleic Acids Research )、第
１７巻、第４８７３頁（１９８９）、同第１６巻、第１
０９３８頁（１９８８）、同第８巻、第９７９〜９８７
頁（１９８０）〕、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバ
チルス カンドレリ( Lactobacillus kandleri )、ラク
トバチルス マイナー( Lactobacillus minor ) 、ラク
トバチルス コンフサス( Lactobacillus confusus )、
ラクトバチルス ビリデセンス、ラクトバチルス カテ
ナホルメ( Lactobacillus catenaforme ) 、及びラクト
バチルス ビツリナス( Lactobacillus vitulinus)の１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が明らかにされている
〔ジャーナル オブ バクテリオロジー( Journal of B
acteriology ) 、第１７１巻、第６４５５〜６４６７頁
（１９８９）、ヌクレイック アシッズ リサーチ 第
１８巻、第３４０１〜３４０２頁（１９９０）、システ
マティック アンド アプライド ミクロバイオロジー
( Systematic and Applied Microbiology ) 、第１２
巻、第１４５〜１４９頁（１９８９）〕。そして土屋ら
はラクトバチルス ブレビスの５ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩
基配列をもとにプライマーを作製し、ＰＣＲ法を用いた
ビール中のラクトバチルス ブレビスの検出方法を報告
している〔日本醸造協会雑誌、第８６巻、第７２０頁
（１９９１）〕。しかし、５ＳｒＲＮＡの塩基配列は微
生物の属を越えて極めて類似しているため、ラクトバチ
ルス ブレビス以外の微生物をも誤って検出してしまう
可能性がある。また、１６ＳｒＲＮＡについても同様
に、微生物の属を越えて極めて類似しているため、ラク
トバチルス属細菌を特異的に検出する目的には不適当で
ある。

【０００４】一方、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子の間に構成されているスペーサー領域の遺伝
子は、微生物種に特異的な塩基配列を有することが知ら
れているが、ラクトバチルス属細菌のスペーサー領域の
塩基配列は明らかにされていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ラク
トバチルス属細菌に特異的な塩基配列の遺伝子を提供
し、その配列を用いて、ラクトバチルス属細菌、特に火
落菌の迅速、且つ高感度な検出方法及びそれに用いるキ
ットを提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はラクトバチルス属細菌の検出方法に
関し、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコード
する遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間に
あるスペーサー領域の遺伝子を検出することを特徴とす
る。また、本発明の第２の発明は、第１の発明のスペー
サー領域の遺伝子に関する。また、本発明の第３の発明
は、第１の発明の方法を用いて検出を行うための検出キ
ットであって、ラクトバチルス属細菌のスペーサー領域
の遺伝子を増幅させるための特定のプライマーを含有し
ていることを特徴とする。

【０００７】ラクトバチルス（以下、Ｌ．と略称する）
属細菌のｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、１６ＳｒＲＮ
Ａ−スペーサー領域−２３ＳｒＲＮＡ−スペーサー領域
−５ＳｒＲＮＡの各ＤＮＡ配列で構成されている。本発
明者らは前記課題を解決するために表１に示した１３種
類のＬ．属細菌のｒＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列
の一部、すなわち１６ＳｒＲＮＡ−スペーサー領域−２
３ＳｒＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列の一部を明ら
かにし、次にＬ．属細菌一般に共通なＤＮＡ配列及びそ
れぞれの種に特異的なＤＮＡ配列を見出した。

【０００８】

【表１】 表 １ 菌 株 培地 培養温度 （真性火落菌） Ｌ．ヘテロヒオチイ IFO13118 SI 30℃ IFO13119 SI 30℃ JCM1198 SI 30℃ Ｌ．ホモヒオチイ IFO13120 SI 30℃ IFO13121 SI 30℃ JCM1199 SI 30℃ （火落性乳酸菌） Ｌ．ジャポニカス IAM10068 803 37℃ Ｌ．プランタルム IAM1216 803 37℃ Ｌ．カゼイ サブスピーシーズ ラムノサス (rhamnosus) IFO3532 804 37℃ Ｌ．カゼイ サブスピーシーズ カゼイ IFO3533 804 37℃ Ｌ．スピーシーズ IFO3954 804 37℃ （一般乳酸菌） Ｌ．ブレビス IFO13110 804 30℃ （火落菌単離株） F-1 SI 30℃

【０００９】培地組成： ＳＩ：ＳＩ培地（日本醸造協会）５ｇ、エタノール１０
ml、蒸留水９０ml ８０３：０．５％ポリペプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、０．５％グルコース、０．２％ラクトー
ス、０．０５％ツィーン(Tween) ８０、０．１％ＭｇＳ
Ｏ₄ ／７Ｈ₂ Ｏ、ｐＨ６．８〜７．０ ８０４：０．５％ペプトン、０．５％イーストエキスト
ラクト、０．５％グルコース、０．１％ＭｇＳＯ₄ ／７
Ｈ₂ Ｏ、ｐＨ６．６〜７．０

【００１０】次に、遺伝子検出方法として現在最も高感
度で簡便なＰＣＲ法を行うために、Ｌ．属細菌に共通な
ＤＮＡ配列及び種に特異的なＤＮＡ配列の特定領域ＤＮ
ＡをＰＣＲ法で増幅するためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを合成した。次に各Ｌ．属細菌ＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲ法を行い、Ｌ．属細菌ＤＮＡの特定領域が効率
よく増幅、検出されること、及び各細菌が特異的に検出
できることを見出し本発明を完成した。

【００１１】以下、具体的に本発明を説明する。１６Ｓ
ｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子は微生
物間でよく保存されていることが知られている（表２〜
表５）。

【００１２】

【表２】 表 ２ R16-1の配列：5'-C T T G T A C A C A C C G C C C G T C A-3' Ｌ．カゼイ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - バチルス ズブチリス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Bacillus subtilis) エシェリヒア コリ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Escherichia coli) マイコバクテリウム ボビス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Mycobacterium bovis) ハロバクテリウム ハロビ - - - - C - - - - - - - - - - - - - - - ウム(Halobacterium halobium) マイコプラズマ カプリコ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ラム(Mycoplasma capricolum) シュードモナス アエルギ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ノサ(Pseudomonus aeruginosa) サーマス サーモフィラス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Thermus thermophilus) ハロコッカス モールアエ - - - - C - - - - - - - - - - - - - - - (Halococcus morrhuae) ストレプトミセス リビダ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ンス(Streptomyces lividans) ヘリオバクテリウム クロ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ラム(Heliobacterium chlorum) フラボバクテリウム ヘパリ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ナム(Flabobacterium heparinum)

【００１３】

【表３】 表 ３ R16-2の配列：5'-G T G C G G C T G G A T C A C C T C C T-3' Ｌ．カゼイ N N N N N N N N N - - - - - - - - - - - バチルス ズブチリス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - エシェリヒア コリ C - - - - - T - - - - - - - - - - - - - マイコバクテリウム ボビス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ハロバクテリウム ハロビ C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ウム マイコプラズマ カプリコ - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - ラム シュードモナス アエルギ C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ノサ サーマス サーモフィラス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ハロコッカス モールアエ C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ストレプトミセス リビダ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ンス ヘリオバクテリウム クロ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ラム フラボバクテリウム ヘパリ - N N N N N N N N - - - - - - - - - - - ナム

【００１４】

【表４】

【００１５】

【表５】 表 ５ R23-2Rの配列：3'-C T T T G T A G A T T C A T G G G C C T-5' R23-2Rの相補配列：5'-G A A A C A T C T A A G T A C C C G G A-3' バチルス ズブチリス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - エシェリヒア コリ - - - - - - - - - - - - - - - - - C - - ハロバクテリウム ハロビ - - - G - - - - - C - - - - - G G C C - ウム シュードモナス アエルギ - - - - - - - - - - - - - - - - - T - - ノサ サーマス サーモフィラス - - - - - - - - - C - - - - - - - A - - ハロコッカス モールアエ - - - - - - - - - C - - - - - - G - C -

【００１６】上記表２〜表５は原核生物ｒＲＮＡ遺伝子
の保存されている塩基配列、及びそれらから選定したプ
ライマーの塩基配列を示すものであり、表２及び表３は
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の、表４及び表５は２３ＳｒＲＮ
Ａ遺伝子の、それぞれ保存されている塩基配列、及びそ
れらから選定したプライマーの塩基配列を表す。表２〜
表５ではいずれも、保存されている塩基を−で、異なる
塩基をその塩基の記号で、欠損している塩基を＊で、同
定されていない塩基をＮで示した。

【００１７】例えば、配列表の配列番号１で表されるＲ
１６−１プライマーと配列番号４で表されるＲ２３−２
Ｒプライマーの組合せ、配列番号２で表されるＲ１６−
２プライマーと配列番号３で表されるＲ２３−１Ｒの組
合せでＬ．属細菌のスペーサー領域をＰＣＲ法で増幅す
ることができる。

【００１８】これらのプライマーはＤＮＡ合成機により
合成することができ、ＨＰＬＣ等で適宜精製して使用す
ることができる。

【００１９】ＰＣＲ法については、タックＤＮＡポリメ
ラーゼを含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置
が宝酒造社から市販されている。ＰＣＲ法により増幅さ
れたスペーサー領域を含む断片を含む塩基配列を決定す
るためには、例えば増幅断片をＭ１３ファージベクター
にクローニングし、ファージＤＮＡを調製した後、サン
ガー法により決定することができる。

【００２０】このようにして決定したスペーサー領域の
塩基配列は、例えばＤＮＡＳＩＳシステム（宝酒造社）
を用いて解析することができ、Ｌ．属細菌のそれぞれの
種に特異的を領域、あるいは共通する領域を検索するこ
とができる。本発明者らは、１３種類のＬ．属細菌のス
ペーサー領域の塩基配列を明らかにし、配列表の配列番
号５〜１３に示されるＬ．属細菌に特異的な塩基配列を
決定した。配列表の配列番号５はＬ．ヘテロヒオチイ
ＪＣＭ１１９８とＬ．ホモヒオチイ ＪＣＭ１１９９、
配列番号６はＬ．ヘテロヒオチイ ＩＦＯ１３１１８、
Ｌ．ヘテロヒオチイ ＩＦＯ１３１１９、Ｌ．ホモヒオ
チイ ＩＦＯ１３１２０、及びＬ．ホモヒオチイ ＩＦ
Ｏ１３１２１、配列番号７はＬ．ジャポニカス ＩＡＭ
１００６８、配列番号８はＬ．プランタルム ＩＡＭ１
２１６、配列番号９はＬ．カゼイサブスピーシーズ ラ
ムノサス ＩＦＯ３５３２、配列番号１０はＬ．カゼイ
サブスピーシーズ カゼイ ＩＦＯ３５３３、配列番号
１１はＬ．スピーシーズＩＦＯ３９５４、配列番号１２
はＬ．ブレビス ＩＦＯ１３１１０、配列番号１３は清
酒より新たに分離した火落菌分離株Ｆ−１のｒＲＮＡを
コードしている遺伝子の塩基配列である。

【００２１】得られた塩基配列を基にＤＮＡＳＩＳシス
テム（宝酒造社）を用いてそれぞれのＬ．属細菌の特異
的な配列及び共通する配列を解析することができる。そ
の結果、配列表の配列番号１４〜２１に示される特異的
配列及び共通配列が得られた。これらの配列をＰＣＲ法
のプライマーとして用いれば、それぞれのＬ．属細菌Ｄ
ＮＡを特異的に増幅することができる。あるいは一対の
共通プライマーですべてのＬ．属細菌ＤＮＡを増幅する
ことができる。表６にそれぞれの菌株とスペーサー領域
を含む特異的配列、特異的プライマーの関係を示した。

【００２２】

【表６】

【００２３】具体的に説明すれば、配列表の配列番号２
０で表されるＬＡＵ１と配列番号１４で表されるＬＡＫ
４Ｒのプライマー対によりＬ．ヘテロヒオチイ ＪＣＭ
１１９８とＬ．ホモヒオチイ ＪＣＭ１１９９の遺伝子
が、ＬＡＵ１と配列番号１５で表されるＬＡＭ３Ｒのプ
ライマー対によりＬ．ヘテロヒオチイ ＩＦＯ１３１１
８、１３１１９とＬ．ホモヒオチイ ＩＦＯ１３１２
０、１３１２１の遺伝子が、ＬＡＵ１と配列番号１６で
表されるＬＡＪ３Ｒのプライマー対によりＬ．ジャポニ
カス ＩＡＭ１００６８とＬ．プランタルム ＩＡＭ１
２１６の遺伝子が、ＬＡＵ１と配列番号１７で表される
ＬＡＣ４Ｒのプライマー対によりＬ．カゼイ サブスピ
ーシーズ ラムノサス ＩＦＯ３５３２とＬ．カゼイ
サブスピーシーズ カゼイ ＩＦＯ３５３３の遺伝子
が、ＬＡＵ１と配列番号１８で表されるＬＡＢ４Ｒのプ
ライマー対によりＬ．スピーシーズ ＩＦＯ３９５４と
Ｌ．ブレビス ＩＦＯ１３１１０の遺伝子が、配列番号
１９で表されるＬＡＦ１と配列番号２１で表されるＬＡ
Ｕ３Ｒのプライマー対により単離株Ｆ−１の遺伝子が特
異的に増幅され、各菌を特異的に検出することができ
る。また、ＬＡＵ１とＬＡＵ３Ｒのプライマー対により
これらすべてのＬ．属細菌の遺伝子が増幅され、これら
の菌を検出することができる。なお、Ｌ．属細菌におい
てはスペーサー領域にｔＲＮＡをコードする領域が挿入
されている場合があるが、この場合でもこれらのプライ
マーを用いて増幅、検出できることに変りはなく、本発
明に含まれる。

【００２４】増幅後のＬ．属細菌ＤＮＡの検出は、例え
ばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動、スポット法、及びサザンブロット法を用いて行
うことができる。なお、スポット法、サザンブロット法
の際は増幅領域内でプローブＤＮＡを選択すればよい。

【００２５】また、本発明に従って、Ｌ．属細菌特定Ｄ
ＮＡ領域を増幅させるためのプライマー対をそろえてキ
ットしておくことにより、Ｌ．属細菌の検出を簡便に行
うことができる。なお、キットに用いる試薬は溶液状で
も良いし、凍結乾燥物でもよい。

【００２６】なおまた、未知の原核生物のスペーサー領
域をＰＣＲ法で増幅し、その塩基配列を決定することに
より、その原核生物を同定することができる。プライマ
ーとしては、例えば前述のＲ１６−１、Ｒ１６−２、Ｒ
２３−１Ｒ、Ｒ２３−２Ｒを使用することができる。

【００２７】以上ＰＣＲ法を用いたＬ．属細菌の高感度
検出法について詳細に説明してきたが、本発明はＰＣＲ
法に限定されるものではなく、特定のＤＮＡ及びその相
補鎖を高感度に検出する方法はすべて本発明に含まれる
ものであり、例えばＱβ−レプリケース アンプリフィ
ケーション システム〔バイオ／テクノロジー(Bio／te
chnology) 、第６巻、第１１９７頁（１９８８）〕によ
る方法が挙げられる。

【００２８】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

【００２９】実施例１ Ｌ．属細菌の１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の
クローニング及び塩基配列の決定 （１）Ｌ．属細菌のゲノムＤＮＡの調製 表１に示したＬ．属細菌をＳＩ、８０３、あるいは８０
４液体培地１５ml中で３０℃あるいは３７℃、４〜７日
間培養した。培養後、３５００rpm 、１０分間遠心し集
菌した。菌を０．５mlの５０mM Ｎａ−リン酸バッファ
ー（ｐＨ７）に懸濁し、５μｌの１０mg／ml Ｎ−アセ
チルムラミダーゼ（生化学工業社）を加え、３７℃、２
時間反応させた。続いて、５μｌの１０mg／mlプロテイ
ナーゼＫ及び５μｌの１０mg／mlプロナーゼＥを加え、
３７℃、２時間反応させた。更に、２５μｌの１０％Ｓ
ＤＳを加え３７℃、３０分間反応させた。反応後、０．
５mlのフェノール／クロロホルム（等量混合液）を加え
緩やかに混合し、１２０００rpm 、１０分間遠心し水層
（上層）を回収した。次に、０．５mlのクロロホルムを
加え緩やかに混合し、１２０００rpm 、１０分間遠心し
水層（上層）を回収した。最後に、１mlのエタノールを
加え、１２０００rpm 、１０分間遠心し沈殿を回収し
た。沈殿は８０％エタノールにて洗浄し、乾燥後、１０
０μｌのＴＥバッファー〔１０mMトリス（Tris) −ＨＣ
ｌ、（ｐＨ８．０）、１mM ＥＤＴＡ〕に溶解した。こ
の結果、それぞれの菌のゲノムＤＮＡ１０μｇが得られ
た。

【００３０】（２）オリゴヌクレオチドプライマーＤＮ
Ａの合成及び精製 表２〜表５に示したオリゴヌクレオチドプライマーＤＮ
ＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社）を
用いて合成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳ
Ｋゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム、東ソー社）セプ−パ
ック(Sep-pack)Ｃ１８（ウォターズ社）で精製、脱塩
し、各ＤＮＡ約５０μｇを得た。

【００３１】（３）ＰＣＲ法によるスペーサー領域の増
幅 実施例１−（１）で調製したそれぞれの菌株のゲノムＤ
ＮＡ０．１μｇを０．５ml用チューブ（バイオビック
社）に取り、９４℃、１０分間加熱処理した後、ジーン
アンプ キット( Gene Amp Kit )（宝酒造社）中の１
０μｌの１０×増幅用バッファー〔１００mMトリス−Ｈ
Ｃｌ、（ｐＨ８．３）、５００mMＫＣｌ、１５mM Ｍｇ
Ｃｌ₂ 、０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン〕、１６μｌの
１．２５mMｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μｌの５ユニット／μｌのタ
ック−ポリメラーゼ、１μｌの２０μＭ Ｒ１６−１プ
ライマー、１μｌの２０μＭ Ｒ２３−２Ｒプライマ
ー、あるいはＲ１６−１とＲ２３−２Ｒの代りに１μｌ
の２０μＭ Ｒ１６−２プライマー、１μｌの２０μＭ
Ｒ２３−１Ｒプライマーを加え、これに滅菌水を加えて
１００μｌの溶液にした。この反応液は上層に１００μ
ｌのミネラルオイル（シグマ社）を加えた後、自動遺伝
子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社）により増幅
反応を行った。反応条件は、９４℃、０．５分間の変性
→５５℃、２分間のプライマーのアニーリング→７２
℃、２分間の合成反応のサイクルを３０サイクル行っ
た。反応後１０μｌの反応液を取り、ヌシーブ( NuSiev
e ) ３：１アガロース（ＦＭＣ社）ゲル電気泳動を行
い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、増幅さ
れたＤＮＡを確認した。その結果、それぞれの菌株のゲ
ノムＤＮＡからＲ１６−１とＲ２３−２Ｒのプライマー
により約５７０〜５９０bpのＤＮＡが増幅され、Ｒ１６
−２とＲ２３−１Ｒのプライマーにより約２７０〜２９
０bpのＤＮＡが増幅された。

【００３２】（４）スペーサー領域のクローニング及び
シークエンシング 実施例１−（３）で得られた増幅ＤＮＡ反応液９０μｌ
を９０μｌのフェノール／クロロホルム（等量混合液）
を加え緩やかに混合し、１２０００rpm 、１０分間遠心
し水層（上層）を回収した。次に、９０μｌのクロロホ
ルムを加え緩やかに混合し、１２０００rpm 、１０分間
遠心し水層（上層）を回収した。最後に、９μｌの３Ｍ
酢酸ナトリウムと１８０μｌのエタノールを加え、１２
０００rpm 、１０分間遠心し沈殿を回収した。沈殿は８
０％エタノールにて洗浄し、乾燥後、８μｌのＴＥバッ
ファーに溶解した。この溶液にブランティングキット
（宝酒造社）に含まれる１μｌの１０×バッファーと１
μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加え、３７℃、５分間
反応させ、増幅ＤＮＡの末端平滑化を行った。反応は９
４℃、１０分間加熱処理し停止した。次に、この反応液
にメガラベルキット（宝酒造社）に含まれる２μｌの１
０×リン酸化バッファー、１μｌのＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ、２μｌの１０mM ＡＴＰ及び５μｌの蒸留
水を加え、３７℃、３０分間リン酸化反応を行った。反
応液は１％シープラーク( Sea Plaque )アガロース（Ｆ
ＭＣ社）電気泳動を行い、目的のＤＮＡを切り出した。
切り出したＤＮＡを含むゲルは０．５mlのＴＥバッファ
ーを加え、７０℃、５分間熱処理をしてゲルを溶解し
た。これに０．５mlのフェノールを加えよくかくはん
し、１２０００rpm 、１０分間遠心して上層を回収し
た。次に、０．５mlのフェノール／クロロホルム（等量
混合液）を加え混合し、１２０００rpm 、１０分間遠心
し水層を回収した。続いて、０．５mlのクロロホルムを
加え混合し、１２０００rpm 、１０分間遠心し水層を回
収した。最後に、５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと１ml
のエタノールを加え、１２０００rpm 、１０分間遠心し
沈殿を回収した。沈殿は８０％エタノールにて洗浄し、
乾燥後、５μｌのＴＥバッファーに溶解した。５μｇの
Ｍ13mp18ＲＦＤＮＡを１０ユニットの制限酵素HincIIで
３７℃、６０分間反応させた後、７０℃、１０分間熱処
理をして酵素を失活させた。この溶液に０．５ユニット
のアルカリホスファターゼを加え３７℃、６０分間反応
させた後、１００μｌのフェノール／クロロホルム（等
量混合液）を加え混合し、１２０００rpm 、１０分間遠
心し水層を回収した。次に、１００μｌのクロロホルム
を加え緩やかに混合し、１２０００rpm 、１０分間遠心
し水層を回収した。最後に、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと２００μｌのエタノールを加え、１２０００rpm
、１０分間遠心し沈殿を回収した。沈殿は８０％エタ
ノールにて洗浄し、乾燥後、１００μｌのＴＥバッファ
ーに溶解した。

【００３３】このようにして調製した５μｌの増幅ＤＮ
Ａに５０ngのＭ13mp18ＲＦＤＮＡを加え、ライゲーショ
ンキット（宝酒造社）に含まれる２４μｌのＡ液と６μ
ｌのＢ液を加えて１６℃、３０分間反応させた後、大腸
菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社）１００μｌ
に加え氷中、３０分間放置した後、４２℃、１分間熱処
理し大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。１．５
％アガロース２×ＹＴ培地プレートに１００μｌの形質
転換したＪＭ１０９、５０μｌの２％Ｘ−Gal、２０μ
ｌの１００mM ＩＰＴＧ及び３mlの０．７％アガロース
２×ＹＴ培地を加え３７℃、一晩培養した。現われた無
色半透明のプラークを５μｌのＪＭ１０９を含む２×Ｙ
Ｔ培地に接種し、３７℃、５時間振とう培養した。培養
後、培養液を８０００rpm 、１５分間遠心し上清を回収
した。この上清に１mlの２０％ＰＥＧ−２．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加え、室温、１５分間放置し、８０００rpm 、１
５分間遠心し沈殿したファージ粒子を回収した。これに
１００μｌのＴＥバッファーを加え、１００μｌのフェ
ノールを加えよくかくはん後、１２０００rpm 、１０分
間遠心し水層を回収した。次に、１００μｌのフェノー
ル／クロロホルム（等量混合液）を加え混合し、１２０
００rpm 、１０分間遠心し水層を回収した。次に、１０
０μｌのクロロホルムを加え緩やかに混合し、１２００
０rpm 、１０分間遠心し水層を回収した。最後に、１０
μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと２００μｌのエタノールを
加え、１２０００rpm 、１０分間遠心し沈殿を回収し
た。沈殿は８０％エタノールにて洗浄し、乾燥後、５０
μｌのＴＥバッファーに溶解し一本鎖ファージＤＮＡを
得た。

【００３４】得られた一本鎖ファージＤＮＡを鋳型とし
てサンガー法〔サンガーＦ.( Sanger,Ｆ.)、サイエンス
( Science ) 、第２１４巻、第１２０５頁（１９８
１）〕によりシーケナーゼ( Sequenase ) シーケンシン
グキット（ＵＳＢ社）を用いてシークエンシングを行っ
た。７μｌの一本鎖ファージＤＮＡに１μｌのシークエ
ンシングプライマーと２μｌの反応バッファーを加え、
６５℃、２分間加熱後３０分間かけてゆっくりと室温に
戻した。この反応液に１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、２μ
ｌの１／６希釈ラベリングミックス、０．５μｌの〔α
−³⁵Ｓ〕ｄＣＴＰ、及び２μｌの１／９希釈シーケナー
ゼを加え室温、５分間ラベリング反応を行った。あらか
じめそれぞれ２．５μｌのｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄ
ｄＴＴＰ、及びｄｄＣＴＰを加えた４本のチューブにそ
れぞれ３．５μｌのラベリング反応液を加え３７℃、５
分間ターミネーション反応を行った後、４μｌの反応停
止液を加えた。この反応液を６％ポリアクリルアミドゲ
ル中で４０ワット、１．５〜３時間電気泳動を行った。
泳動後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルム（コダック社）に
よりオートラジオグラムを得た。オートラジオグラムよ
り塩基配列を解析した。解析の結果、配列表の配列番号
５〜１３で表されるそれぞれのＬ．属細菌の特異的な塩
基配列が得られた。

【００３５】実施例２ ＰＣＲ法によるＬ．属細菌の検出 （１）Ｌ．属細菌検出のためのプライマーの選定と合成 実施例１から得られた塩基配列を基にＤＮＡＳＩＳシス
テム（宝酒造社）を用いてそれぞれのＬ．属細菌に特異
的な配列及び共通な配列を解析し、配列表の配列番号１
４〜１９に示す特異的プライマー、配列番号２０、２１
に示す共通プライマーを選定した。表６にそれぞれの菌
株とスペーサー領域を含む特異的配列、特異的プライマ
ーの関係を示した。これらのプライマーを実施例１−
（２）と同様の方法で合成及び精製した。

【００３６】（２）特異的プライマーを用いたＰＣＲ法
によるＬ．属細菌ＤＮＡの増幅 実施例１−（１）で得た１３種類のＬ．属細菌のゲノム
ＤＮＡを鋳型に用いて実施例１−（３）の方法でＰＣＲ
を行った。プライマーとしてそれぞれ１μｌの２０μＭ
ＬＡＵ１とＬＡＫ４Ｒ、ＬＡＵ１とＬＡＭ３Ｒ、ＬＡ
Ｕ１とＬＡＪ３Ｒ、ＬＡＵ１とＬＡＣ４Ｒ及びＬＡＵ１
とＬＡＢ４Ｒを用いた。その結果、ＬＡＵ１とＬＡＫ４
Ｒのプライマー対により２３２bpのＬ．ヘテロヒオチイ
ＪＣＭ１１９８とＬ．ホモヒオチイ ＪＣＭ１１９９
の遺伝子を、ＬＡＵ１とＬＡＭ３Ｒのプライマー対によ
り２００bpのＬ．ヘテロヒオチイ ＩＦＯ１３１１８、
１３１１９とＬ．ホモヒオチイ ＩＦＯ１３１２０、１
３１２１の遺伝子を、ＬＡＵ１とＬＡＪ３Ｒのプライマ
ー対により２１４bpのＬ．ジャポニカス ＩＡＭ１００
６８とＬ．プランタルム ＩＡＭ１２１６の遺伝子を、
ＬＡＵ１とＬＡＣ４Ｒのプライマー対により２３０bpの
Ｌ．カゼイ サブスピーシーズ ラムノサスＩＦＯ３５
３２とＬ．カゼイ サブスピーシーズ カゼイ ＩＦＯ
３５３３の遺伝子を、ＬＡＵ１とＬＡＢ４Ｒのプライマ
ー対により２２４bpのＬ．スピーシーズ ＩＦＯ３９５
４とＬ．ブレビス ＩＦＯ１３１１０の遺伝子を、ＬＡ
Ｆ１とＬＡＵ３Ｒのプライマー対により１５０bpの単離
株Ｆ−１の遺伝子を特異的に増幅することができた。

【００３７】（３）Ｌ．属細菌共通プライマーを用いた
ＰＣＲ法による増幅 それぞれ１μｌの２０μＭ ＬＡＵ１とＬＡＵ３Ｒを用
いて実施例１−（１）で得た１３種のＬ．属細菌のゲノ
ムＤＮＡを鋳型に用いて実施例１−（３）の方法でＰＣ
Ｒを行った。その結果、１６５bpのＬ．ヘテロヒオチイ
ＪＣＭ１１９８とＬ．ホモヒオチイ ＪＣＭ１１９９
の遺伝子を、２２２bpのＬ．ヘテロヒオチイ ＩＦＯ１
３１１８、１３１１９とＬ．ホモヒオチイ ＩＦＯ１３
１２０、１３１２１の遺伝子を、１５３bpのＬ．ジャポ
ニカス ＩＡＭ１００６８とＬ．プランタルム ＩＡＭ
１２１６の遺伝子を、１７５bpのＬ．カゼイ サブスピ
ーシーズ ラムノサス ＩＦＯ３５３２とＬ．カゼイ
サブスピーシーズ カゼイＩＦＯ３５３３の遺伝子を、
１６３bpのＬ．スピーシーズ ＩＦＯ３９５４とＬ．ブ
レビス ＩＦＯ１３１１０の遺伝子を、１７０bpの単離
株Ｆ−１の遺伝子をすべて増幅することができ、被検菌
すべての遺伝子の増幅が可能であり、電気泳動により、
タイピングを行うことができた。

【００３８】実施例３ Ｌ．属細菌共通プライマーを用いた清酒における火落菌
の検出 （１）サンプルの濃縮と前処理 あらかじめＳＩ培地（日本醸造協会）プレートテストに
より火落菌の有無及び菌数を調べた清酒サンプルを用い
て、３００ml清酒中に０、１、１０、１００個の火落菌
の菌数になるようにモデルサンプルを調製した。３００
mlのサンプルを直径４７mm、孔径０．４５μｍニトロセ
ルロースメンブランフィルター（アドバンテック社）を
用いて吸引ろ過した。このフィルターを１mlの滅菌水で
洗浄し、その０．４mlをフィルター付き遠心チューブ
スプレック( SUPREC )−０１に移し、３０００rpm 、１
０分間遠心し濃縮した。更に、残りの０．４mlを加え、
同じ操作で濃縮した。フィルター上に３５μｌの前処理
溶液〔１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０mM
ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．０１％（Ｗ／Ｖ）
ゼラチン、０．１mg／mlプロテイナーゼＫ〕を加えフィ
ルターを洗浄し、０．５ml用チューブに移した。これに
１００μｌのミネラルオイル（シグマ社）を上層し、３
７℃、１時間反応後、９４℃、１０分間熱処理を行っ
た。

【００３９】（２）ＰＣＲ法による増幅と検出 実施例３−（１）で前処理したサンプルに１５μｌのＰ
ＣＲ反応溶液〔１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．０１％
（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、０．６７mM ｄＮＴＰ混合液（ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．６７μ
Ｍ ＬＡＵ１、０．６７μＭ ＬＡＵ３Ｒ、０．０８ユ
ニット／μｌタックポリメラーゼ〕を加え、実施例１−
（３）と同様の方法でＰＣＲを行った。ＰＣＲのサイク
ルは３５サイクル行った。反応後、反応液の１０μｌを
ヌシーブ３：１アガロース（ＦＭＣ社）ゲル電気泳動を
行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、増幅
されたＤＮＡを検出した。その結果、火落菌が含まれて
いないサンプルでは増幅は認められなかったが、３００
ml中に、１０、１００個の火落菌が含まれているサンプ
ルでは約１５０〜２００bpの増幅が認められ火落菌が検
出できた。

【００４０】（３）死菌による偽陽性の回避方法 実施例３−（２）に示した３００ml中にそれぞれ１、１
０、１００個の火落菌生菌が含まれているサンプル（生
菌サンプル）及び３００ml中に１００個の火落菌が含ま
れているサンプルを加熱処理（６５℃、１０分）して火
落菌を死滅させたサンプル（死菌サンプル）を用意し
た。これらの各サンプル３００mlをそれぞれ実施例３−
（１）と同様にニトロセルロースメンブランフィルター
を用いて吸引ろ過した。一方、オートクレーブ処理後、
静置、放冷し、デカンテーションしてアガーの沈殿を除
去して、アガーを含まないＳＩ培地を調製した。このア
ガーを含まないＳＩ培地２mlで前述のフィルターを洗浄
した後、培地を試験管に移し、３０℃で２日間培養し
た。次にこの培養培地０．４mlをスプレック−０１に移
し、３０００rpm 、１０分間遠心し濃縮した。更に、
０．４mlの蒸留水を加えて３０００rpm 、１０分間遠心
した。次に、実施例３−（１）と同様にフィルター上に
３５μｌの前処理溶液を加え、実施例３−（１）の方法
で前処理を行った。続いて、実施例３−（２）の方法で
ＰＣＲを３０サイクル行った。その結果、いずれの生菌
サンプルの処理物においても増幅が認められたが、死菌
サンプルの処理物では増幅は認められなかった。すなわ
ち、本方法により死菌による偽陽性を回避することがで
き、且つ、生菌体１個の検出が可能であった。

【００４１】実施例４ 火落菌検出キットの作成 実施例３−（１）及び３−（２）に示した前処理溶液
（Ａ剤とする）、ＰＣＲ反応溶液（Ｂ剤とする）、ニト
ロセルロースメンブランフィルター（直径４７mm、孔径
０．４５μｍ）、フィルター付遠心チューブスプレック
−０１及びヌシーブ３：１アガロースを１組として、火
落菌検出キットを構築した（表７）。

【００４２】

【表７】 表７ 火落菌検出キット（５０回分） ──────────────────────────────────── ニトロセルロースメンブランフィルター ５０枚 （直径４７mm、孔径０．４５μｍ） スプレック−０１ ５０個 Ａ 剤 １７５０μｌ（35μｌ×50回分） Ｂ 剤 １７５０μｌ（35μｌ×50回分） ヌシーブ３：１アガロース １００ｇ ────────────────────────────────────

【００４３】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
りＬ．属細菌の１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域
の塩基配列が明らかになり、このスペーサー領域の塩基
配列を用いたＬ．属細菌、特に火落菌の迅速、且つ高感
度な検出方法が提供された。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA 20 配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： GTGCGGCTGG ATCACCTCCT 20 配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： CTCCTAGTGC CAAGSCATYC 20 配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： TCCGGGTACT TAGATGTTTC 20 配列番号：５ 配列の長さ：540 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス ヘテロヒオチイ (Lactobacil
lus heterohiochii) 株名：JCM 1198 生物名：ラクトバチルス ホモヒオチイ (Lactobacillu
s homohiochii) 株名：JCM1199 配列の特徴： 1-155 16SrRNA をコードする領域 156-371 スペーサー領域 220 tRNAをコードする領域の挿入位置 372-540 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGATA GTTTGTAACA CCCAAAGTCG GTTAGGTAAC 60 TTTTGGAGCC TGCCGCCTAA GGTGGGACAG ATGATTAGGG TGAAGTCGTA ACAAGGTAGC 120 CGTAGGAGAA CCTGCGGCTG GATCACCTCC TTTCTAAGGA AAAATTCGAA AACCCTACAC 180 AATTAAAGTC TTGTTTAGTT TTGAGAGTTT TACTCTCAAT ACTTTGTTCT TTGAAAACTA 240 GATAATATTA TTTTCTGTAT TAATTATATT TTAATTATAA TTTTAACCGA GAAATAACCA 300 CTACGTTATT TGAGTTTTTT AAAATAGTTT AAATCGCAAA TACTCAATAA CTTACATCAC 360 GAAGTGATGC AGGTTAAGTT ATTAAGGGCG CATGGTGAAT GCCTTGGTAC TAGGAGCCGA 420 TGAAGGACGG AACTAACACC GATATGTTTC GGGGAGCTGT ACGTAAGCTT TGATCCGGAG 480 ATTTCCGAAT GGGGAAACCC AATCATCTTA GTCGATGATT GCTCGACAGT GAATTCACTG 540 配列番号：６ 配列の長さ：585 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス ヘテロヒオチイ (Lactobacil
lus heterohiochii) 株名：IFO13118, IFO13119 生物名：ラクトバチルス ホモヒオチイ (Lactobacillu
s homohiochii) 株名：IFO13120, IFO13121 配列の特徴： 1-162 16SrRNA をコードする領域 163-370 スペーサー領域 277 tRNAをコードする領域の挿入位置 371-585 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGCCG GCCGGATAAC 60 CTAGTTTACT AGGAGTCAGC CGTCTAAGGT GGGACAAATG ATTAGGGTGA AGTCGTAACA 120 AGGTAGCCGT AGGAGAACCT GCGGCTGGAT CACCTCCTTT CTAAGGAAAA AAAGCGAACG 180 TGACGGAGAG TAGGAGACTA CTAAGAGAAG TCAGTGAAGC AAACGGAAGC ACACGAAAGA 240 GACTTTGTTT AGTTTTGAGG GTAGTACCTC AAGAAAAGTT AGTACATTGA AAACTGAATA 300 TAATCCAAAT AAAAACCGAG ACAATCATTG AAGAACAGAT TGTAGAGCGA CCGAGAAGAG 360 CGATCTTAAA GTAAGGTCAA GTAGACAAGG GCGCACGGTG AATGCCTAGG CACTAGCAGC 420 CGAAGAAGGA CGTGACGAAC TACGAAAAGC TTCGGGGAGT TGTAAGTAAA CTAAGATCCG 480 GAGATGTCCA AATGGGGAAA CCCAATGCAG TGATGCATTA TTACTAGCCG AATAGATAGG 540 CTGGTAAAGG AAGACGCAGT GAACTGAAAC ATCTAAGTAC CCGGA 585 配列番号：７ 配列の長さ：574 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス ジャポニカス (Lactobacillu
s japonicus) 株名：IAM10688 配列の特徴： 1-155 16SrRNA をコードする領域 156-358 スペーサー領域 224 tRNAをコードする領域の挿入位置 359-574 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGTCG GTGGGGTAAC 60 TTTTAGGAAC CAGCCGCCTA AGGTGGGACA GATGATTAGG GTGAAGTCGT AACAAGGTAG 120 CCGTAGAGAA CCTGCGGCTG GATCACCTCC TTTCTAAGGA ATATTACGGA AACCTACACA 180 CGCGTCGAAA CTTTGTTTAG TTTTGAGAGA TTTAACTCTC AAAACTTGTT CTTTGAAAAC 240 TAGATAATAT CAAATATATT TTTTCATAAT GAAACCGAGA ACACCGCGTT TTTTGAGTTT 300 TTTATTGAAG TTTAATTATC GCTAAACTCA TTAATCGCAT TTACCGTTAG GTAAATGAGG 360 TTAAGTTAAC AAGGGCGCAT GGTGAATGCC TTGGCACTAG GAGCCGATGA AGGACGGGAC 420 TAACACCGAT ATGCTTCGGG GAGCTGTACG TAAGCTATGA TCCGGAGATT TCCGAATGGG 480 GCAACCCAGC AGTTTTAATC AACTGTTACC ACTAGATGAA TTCATAGTCT AGTTGGAGGT 540 AAACGCTGTG AACTGAAACA TCTAAGTACC CGGA 574 配列番号：８ 配列の長さ：574 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス プランタルム (Lactobacillu
s plantarum) 株名：IAM1216 配列の特徴： 1-155 16SrRNA をコードする領域 156-358 スペーサー領域 224 tRNAをコードする領域の挿入位置 359-574 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGTCG GTGGGGTAAC 60 TTTTAGGAAC CAGCCGCCTA AGGTGGGACA GATGATTAGG GTGAAGTCGT AACAAGGTAG 120 CCGTAGAGAA CCTGCGGCTG GATCACCTCC TTTCTAAGGA ATATTACGGA AACCTACACA 180 CGCGTCGAAA CTTTGTTCAG TTTTGAGAGA TTTAACTCTC AAAACTTGTT CTTTGAAAAC 240 TAGATAATAT CAAATATATT TTTTCATAAT GAAACCGAGA ACACCGCGTT TTTTGAGTTT 300 TTTATTGAAG TTTAATTATC GCTAAACTCA TTAATCGCAT TTACCGTTAG GTAAATGAGG 360 TTAAGTTAAC AAGGGCGCAT GGTGAATGCC TTGGCACTAG GAGCCGATGA AGGACGGGAC 420 TAACACCGAT ATGCTTCGGG GAGCTGTACG TAAGCTATGA TCCGGAGATT TCCGAATGGG 480 GCAACCCAGC AGTTTTAATC AACTGTTACC ACTAGATGAA TTCATAGTCT AGTTGGAGGT 540 AAACGCTGTG AACTGAAACA TCTAAGTACC CGGA 574 配列番号：９ 配列の長さ：588 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス カゼイ サブスピーシーズ
カゼイ(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) 株名：IFO3532 配列の特徴： 1-158 16SrRNA をコードする領域 159-375 スペーサー領域 250 tRNAをコードする領域の挿入位置 376-588 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGCCG GTGGCGTAAC 60 CTTTTAGGGA GCGAGCCGTC TAAGGTGGGA CAAATGATTA GGGTGAAGTC GTAACAAGGT 120 AGCCGTAGGA GAACCTGCGG CTGGATCACC TCCTTTCTAA GGAAACAGAC TGAAAGTCTG 180 ACGGAAACCT GCACACACGA AACTTTGTTT AGTTTTGAGG GGATCACCCT CAAGCACCCT 240 AACGGGTGCG ACTTTGTTCT TTGAAAACTG GATATCATTG TATTAATTGT TTTAAATTGC 300 CGAGAACACA GCGTATTTGT ATGAGTTTCT GAAAAAGAAA TTCGCATCGC ATAACCGCTG 360 ACGCAAGTCA GTACAGGTTA AGTTACAAAG GGCGCACGGT GGATGCCTTG GCACTAGGAG 420 CCGATGAAGG ACGGAACTAA TACCGATATG CTTCGGGGAG CTATAAGTAA GCTTTGATCC 480 GGAGATTTCC GAATGGGGGA ACCCAGTACA CATCAGTGTG TTGCTTGTCA GTGAATACAT 540 AGCTGGCCGG CGGCAGACGC GGGGAACTGA AACATCTAAG TACCCGGA 588 配列番号：10 配列の長さ：588 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス カゼイ サブスピーシーズ
カゼイ(Lactobacillus casei subsp. casei) 株名：IFO3533 配列の特徴： 1-158 16SrRNA をコードする領域 159-375 スペーサー領域 250 tRNAをコードする領域の挿入位置 376-588 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGCCG GTGGCGTAAC 60 CTTTTAGGGA GCGAGCCGTC TAAGGTGGGA CAAATGATTA GGGTGAAGTC GTAACAAGGT 120 AGCCGTAGGA GAACCTGCGG CTGGATCACC TCCTTTCTAA GGAAACAGAC TGAAAGTCTG 180 ACGGAAACCT GCACACACGA AACTTTGTTT AGTTTTGAGG GGATCACCCT CAAGCACCCT 240 AGCGGGTGCG ACTTTGTTCT TTGAAAACTG GATATCATTG TATTAATTGT TTTAAATTGC 300 CGAGAACACA GCGTATTTGT ATGAGTTTCT GAAAAAGAAA TTCGCATCGC ATAACCGCTG 360 ACGCAAGTCA GTACAGGTTA AGTTACAAAG GGCGCACGGT GGATGCCTTG GCACTAGGAG 420 CCGATGAAGG ACGGAACTAA TACCGATATG CCTCGGGGAG CTATAAGTAA GCTTTGATCC 480 GGAGATTTCC GAATGGGGAA ACCCAGTACA CATCAGTGTA TTGCTTGTCA GTGAATACAT 540 AGCTGGCCGG CGGCAGACGC GGGGAACTGA AACATCTAAG TACCCGGA 588 配列番号：11 配列の長さ：414 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス スピーシーズ (Lactobacillu
s sp.) 株名：IFO3934 配列の特徴： 1-156 16SrRNA をコードする領域 157-370 スペーサー領域 225 tRNAをコードする領域の挿入位置 371-414 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGCCG GTGAGATAAC 60 CTTCGGGAGT CAGCCGTCTA AGGTGGGACA GATGATTAGG GTGAAGTCGT AACAAGGTAG 120 CCGTAGGAGA ACCTGCGGCT GGATCACCTC CTTTCTAAGG AATATACGGA GGCTACACAT 180 ACTTGTTGAA ACAATGTTCA GTTTTGAGGG GCTTACCTCT CTAAACTTGT TCTTTGAAAA 240 CTAGATATTA TCAATTATTT TCCTTTAATT ATTAAGATAA TTAAACCGAG AAACAACTGC 300 GTATTTTTGA GTTTTTTAAT TAGTTTATCG CTAATACTCA ATTAATTTGA CGATCACGAA 360 GTGACCGTTA GGTTAAGTTA TGAAGGGCGC ATGGTGGAGC CTTGGTACTA GGAG 414 配列番号：12 配列の長さ：585 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス ブレビス (Lactobacillus br
evis) 株名：IFO13110 配列の特徴： 1-156 16SrRNA をコードする領域 157-370 スペーサー領域 225 tRNAをコードする領域の挿入位置 371-585 23SrRNA をコードする領域 配列： CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGCCG GTGAGATAAC 60 CTTCGGGAGT CAGCCGTCTA AGGTGGGACA GATGATTAGG GTGAAGTCGT AACAAGGTAG 120 CCGTAGGAGA ACCTGCGGCT GGATCACCTC CTTTCTAAGG AATATACGGA GGCTACACAT 180 ACTTGTTGAA ACAATGTTCA GTTTTGAGGG GCTTACCTCT CTAAACTTGT TCTTTGAAAA 240 CTAGATATTA TCAATTATTT TCCTTTAATT ATTAAGATAA TTAAACCGAG AAACAACTGC 300 GTATTTTTGA GTTTTTTAAT TAGTTTATCG CTAATACTCA ATTAATTTGA CGATCACGAA 360 GTGACCGTTA GGTTAAGTTA TGAAGGGCGC ATGGTGGATG CCTTGGTACT AGGAGCCGAT 420 GAAGGACGGG ACTAACACCG ATATGCTTCG GGGAGCTGTA CGTAAGCTTT GATCCGGAGA 480 TTTCCGAATG GGGAAACCCA ATCATCTTTA CCGATGATTA CAACTTGATG AATACATAGT 540 CAAGTTGAGG CAGACGTGGG GAACTGAAAC ATCTAAGTAC CCGGA 585 配列番号：13 配列の長さ：286 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：ラクトバチルス (Lactobacillus) 株名：F-1 配列の特徴： 1-20 16SrRNAをコードする領域 21-241 スペーサー領域 86 tRNAをコードする領域の挿入位置 242-286 23SrRNA をコードする領域 配列： GGCTGGATCA CCTCCTTTCT AAGGAAAATT CGGAAACCTA CACAATGTCG AAAGTTTTGT 60 TCAGTTTTGA GAGGTCTACT CTCAAACTTG GTTCTTTGAA AACTAGATAA TATTAATTTT 120 CTGTAATTTA TTGAATTGGA TATAATCCAA TTTCAACCGA GAACACCGCG TTATTTTGAG 180 TTTGTTAACT AAGTAAAAAA TCGCAAATAC TCAATTAACT AAAGTATCCG TAGGATACTT 240 AGGTTAAGTT ATCAAGGGCG CATGGTGAAT GCCTTGGCAC TAGGAG 286 配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： CCTGCATCAC TTCGTGATGT 20 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GCTCTACAAT CTGTTCTTCA 20 配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： TTTACCTAAC GGTAAATGCG 20 配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GTACTGACTT GCGTCAGCGG 20 配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GGTCACTTCG TGATCGTCAA 20 配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： AATTCGGAAA CCTACACAAT 20 配列番号：20 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： ATCACCTCCT TTCTAAGGAA 20 配列番号：21 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： AAAAAACGCG GTGTTCTCGG 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 7823−4Ｂ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトバチルス属細菌の検出方法におい
   て、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードす
   る遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間にあ
   るスペーサー領域の遺伝子を検出することを特徴とする
   ラクトバチルス属細菌の検出方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載のスペーサー領域の遺伝
   子。
3. 【請求項３】 請求項１記載の方法を用いて検出を行う
   ための検出キットであって、ラクトバチルス属細菌の請
   求項２記載のスペーサー領域の遺伝子を増幅させるため
   の特定のプライマーを含有していることを特徴とするラ
   クトバチルス属細菌検出キット。