KR102142473B1

KR102142473B1 - 락토바실러스 속 중에서 특정 종을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 조성물 및 이를 이용한 판별방법

Info

Publication number: KR102142473B1
Application number: KR1020190040986A
Authority: KR
Inventors: 남영도; 정원형; 신지희; 강지수; 박용수
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2020-08-07

Abstract

본 발명은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 프라이머(primer) 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 빠르고 간편하게 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 확인할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 속 중에서 특정 종을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 조성물 및 이를 이용한 판별방법{A primer composition for specifically identifying a specific species in the Lactobacillus genus and method for determination thereof}

본 발명은 락토바실러스 속 중에서 특정 종을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 빠르고 정확하게 다양한 락토바실러스 속 중에서 애시도필러스 종을 특이적으로 판별 및 동정할 수 있는 범용 프라이머(universal primer) 조성물 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.

젖산균(Lactic acid bacteria) 또는 유산균은 물질대사에 의해 탄수화물을 젖산으로 분해시키는 세균으로, 요거트, 유산균 음료 및 김치 등의 식품을 발효시키는데 사용된다.

유산균은 균주에 따라 다양한 효과를 나타내며, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 및 페디오코커스(Pediococcus)의 5개 속으로 구분할 수 있다. 이 중, 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이며, 쌍구균인 루코노스탁 속 미생물은 이형 발효를 하며 채소류의 발효에 주로 관여한다.

이러한 락토바실러스 속 미생물 중에서 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 미생물은 주로 사람의 소장에 정착능이 강하고 내산성이 뛰어나 위산이나 담즙산에 견디는 능력이 있으며, 콜레스테롤 저하작용, 설사와 변비의 개선 및 면정증강 등 프로바이오틱(probiotics) 젖산균으로서의 기본적 특성을 고루 갖추고 있기 때문에 실제로 여러 가지 제품들에 활용되고 있다. 게다가 프로바이오틱(probiotics)로의 활용 가능성, 유용산물의 생산관련 연구, 유해 미생물의 생육억제, 다른 젖산균과 효모균과의 혼합배양, 장내균총변화, 항생제 적응성, 콜레스테롤 자화성여부 등 폭넓은 연구를 통해 유용성이 입증되고 있으므로, 더 많은 기능성식품 첨가제나 위생 용품, 화장품 등의 개발 및 활용이 기대되고 있다.

따라서, 락토바실러스 속 중에서 애시도필러스 종의 미생물을 특이적으로 판별할 수 있는 검출, 판별, 동정 방법에 대한 중요성이 점차 높아지고 있는 추세에 있다.

현재까지 개발된 미생물 종(species)을 판정하는 방법은 대표적으로 16S rRNA 유전자 염기서열 정보를 분석하는 것이 있다. 상기 방법은 일부 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주에서 16S rRNA 유전자 염기서열의 판정기준을 따르지 않는 예외가 존재할 뿐만 아니라, 많은 시간과 노동력이 필요하다는 단점이 있다.

최근에는 영국 GENESIG 사에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)의 Recombinase A(recA)유전자의 염기서열에 기반한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 키트를 개발하였으나, NCBI상에 존재하는 95%의 락토바실러스 애시도필러스 균주(Lactobacillus acidophilus strain)에 대해서만 검출이 가능하다는 한계점을 갖는다. 게다가 미생물이 가지는 특정 유전자는 진화과정 중에 많은 변이가 생길 수 있으므로, 특정 유전자를 타겟하는 상기와 같은 방법들은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 다수 미생물을 검출하는데 한계가 분명하다.

또한 NGS 분석방법은 미생물이 가지는 전체 게놈 분석 결과를 바탕으로 특정 미생물 종(species)을 판별할 수 있었으나, 일일이 게놈 정보를 분석하여 유전체를 비교하고 각 균주간의 계통도를 그려 종을 확인해야하는 번거로움과 많은 시간과 노동력이 필요하다는 큰 단점을 갖는다. 또한 상기 방법은 다수의 균종을 동시에 검출하는데 한계가 있다.

이에 본 발명자들은 인체에 유용한 효과를 갖는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에서 CRISPR 영역이 다른 종의 미생물들과 구분되는 특징을 찾음으로써, 상기 CRISPR 영역을 분석하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 명확하게 검출할 수 있는 종(species) 특이적인 범용 프라이머(universal primer) 조성물을 개발하고자 노력한 바, 본 발명을 완성하게 되었다.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-1997-7002930호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7 내지 12로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 프라이머 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 키트를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 조성물을 이용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 판별하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1 내지 6로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7 내지 12로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 프라이머 조성물을 제공한다.

상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, a) 판별 대상 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및

b) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 대상 시료로부터 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 미생물을 간편하고 신속, 정확하게 판별, 검출, 동정할 수 있으므로, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 균주를 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 원료 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1을 통해 확인한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 균주(21종)들의 CRISPR 구조 분석 결과이다.
도 2는 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트와 상기 프라이머 세트로 PCR하였을 때, 인 실리코 분석(in silico)을 통해 분석한 해당 균주의 PCR 산물 크기를 도시화한 것이다.
도 3은 인 실리코(in silico)에서, 본 발명의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트를 NCBI 사이트로부터 제공되는 데이터베이스와 대조하여, Primer-BLAST란 서열검색 프로그램으로 시퀀스를 분석한 결과이다.
도 4는 비교예 1-1)을 통해 확인한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM과 97% 이상의 유사도를 갖는 총 414 종의 16S rRNA 서열의 계통도이다. 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 이외의 종에 해당하는 서열은 도 4에서 붉은색 및 우측상단 별표(*)로 표기하였다.
도 5는 본 발명의 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여, 각각의 균주(Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus acidophilus CB_LA1, Lactobacillus acidophilus YT1)에 대해 PCR을 수행하여 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여, 대표로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주에 대해 PCR을 수행하여 얻은 PCR 증폭산물을 정제한 후 이를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하는 과정을 두 번 반복(Uni-a, Uni-b)한 결과이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명에서 프라이머(primer)란, 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 핵산서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍(base pair)를 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 프라이머 세트(primer set)란 특정 서열 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 조합을 의미하고 하나의 프라이머 세트에는 통상 2가지 프라이머(정방향 프라이머, 역방향 프라이머 혹은 Left primer, Right primer)가 포함되나 이를 초과하는 경우도 있다.

본 발명에서 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)란 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않는 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1 내지 6로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7 내지 12로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 프라이머 조성물에 관한 것이다.

상기 프라이머 조성물은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 모든 균주를 특이적으로 탐지할 수 있는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 7 내지 12로 표시되는 프라이머를 포함하는 범용 프라이머 세트이다.

본 발명의 프라이머 조성물은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종과 유사하거나 동일한 종 및 속을 갖는 유사 균주들과 혼합되어 있는 시료에서도, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 프라미어 조성물은 후술하는 실험예에서 확인된 바와 같이, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 제외한 다른 종의 균주에 대해서는 전혀 PCR 산물을 합성하지 않으며, 대상이 되는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 'CRISPR' 영역 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성하므로, 상기 프라이머 조성물을 사용하여 시료로부터 명확하게 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 균주 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다.

상기 프라이머 조성물을 적용할 경우, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 특이적으로 확인할 수 있다. 예컨대, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 조성물을 사용할 경우, 시료 내에 락토바실러스 애시도필러스 종의 균주가 존재한다면 200 내지 300 bp, 바람직하게는 267 bp의 크기를 갖는 PCR 산물이 검출된다. 따라서 각 프라이머 조성물에 따른 PCR 산물의 검출 여부 및 PCR 산물의 크기를 통해 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다. 진단 대상이 되는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 'CRISPR' 영역 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성하게 된다.

서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 조성물의 경우, PCR 검출시 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주에 대해 200 내지 300 bp의 PCR 산물, 바람직하게는 267 bp의 PCR 산물이 검출되게 된다.

즉, 본 발명의 프라이머 조성물은 락토바실러스 속 중에서 특정 종(애시도필러스)를 특이적으로 판별할 수 있다.

상기 본 발명의 프라이머 조성물에 포함되어 있는 프라이머 길이는 각각 20 내지 30 bp일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 정방향 프라이머는 24 내지 26 bp, 서열번호 7 내지 12로 표시되는 역방향 프라이머는 20 내지 22 bp일 수 있다. 상기 프라이머들을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. Melting temperature(Tm)는 55℃ 내지 65℃이며, 프라이머 간의 최대 Tm 차이는 3 내지 5℃ 이내인 것이 바람직하며, GC%가 33% 내지 55%일 수 있다

상기 프라이머 조성물에 포함되어 있는 프라이머 세트는 범용(universal) 프라이머 세트로, 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 특이적으로 판별, 동정, 검출할 수 있다.

상기 표적 서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Q? 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR 이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7 내지 12로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들은 동일한 어닐링 온도 및 시간을 갖는 하나의 조건에서, 다른 종속의 균주들(Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620)에 대해서는 전혀 PCR 산물을 합성하지 않는데 반해, 동일한 종속의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종들에 대해서는 모두 같은 크기의 PCR 산물이 합성됨을 확인하였다. 이를 통해 시료 내에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주가 존재하는지 여부를 판별하는데 필요한 시간 및 노력을 절감할 수 있음을 알 수 있다.

상기 정방향 프라이머 혹은 역방향 프라이머의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 결합된 어떠한 화학적 모이어티를 의미할 수 있으며, 상기 결합은 공유결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하며, 본 발명의 실험자에게 검출될 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 퀀칭제(quenching agent), 색깔 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한, 임의의 유용한 링커 분자(예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni²⁺, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어. 알칼라인 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제), 전자 공여체(donor)/수용체(acceptor), 아크리디늄 에스테르, 염료(dye) 및 열량 측정 기질(calorimetric substrate)를 포함한다. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우와 같이, 질량의 변화(a change in mass)를 나타내는데 검출가능한 표지가 고려될 수 있다. 당업자는 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지에 대해서도 용이하게 인식할 수 있을 것이며, 이들 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 프라이머 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있고, 예를 들어 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수 등을 포함할 수 있으며, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소 등이 제한없이 사용될 수 있다. 또한 상기 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기 완충용액(buffer)은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소를 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 본 발명의 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H 절단 활성과 양립할 수 있다. 완충용액은 구체적으로, HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산) 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 또한, PCR 완충용액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl₂, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물을 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 오염된 효소의 불활성화, 단백질 접힘의 안정화, 및/또는 응집의 감소에 영향을 미친다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl₂, MgOAc, MgCl₂, NaCl, NH₄OAc, NaI, Na(CO₃)₂, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(DTT), 피로포스파타제(Thermoplasma acidophilum 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase, TAP)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.), 우혈청 알부민(BSA), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 퍼콜(Percoll), 아우린트리카르복실산, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO(N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, E. Coli SSB, RecA, 닉킹 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-디아자G, dUTP, 음이온 디터전트(anionic detergent), 양이온 디터전트(cationic detergent), 비-이온 디터전트(nonionic detergent), zwittergent, 스테롤, 삼투조절물질(osmolyte), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화합물, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 일 구체예에서, 2 이상의 첨가물이 증폭 반응에 포함된다. 상기 첨가물이 RNase H의 활성을 방해하지 않는다면, 첨가물은 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.

본 발명자들은 시료 내에 존재하는 미생물들 중에서, 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종들의 CRISPR 영역 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트(정방향 프라이머와 역방향 프라이머 혹은 Left primer와 Right primer)를 개발하였고, 상기 증폭된 CRISPR 영역의 염기서열들의 길이를 비교 분석함으로써, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 정확하고, 신속하게 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 구체적으로 상기 증폭된 CRISPR 영역의 염색체 중에서도 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 균주가 모두 가지고 있는 spacer 1 내지 spacer 5의 영역 중에서 선택되는 하나 이상의 영역을 증폭하는 프라이머를 이용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 범용적으로 판별할 수 있다. 실제 PCR 분석에 서열번호 1 및 서열번호 7의 프라이머 조성물을 이용할 경우, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 균주는 200 내지 300 bp, 바람직하게는 267 bp의 PCR 산물 크기를 갖고 있는 것으로 확인되었고, 이는 프라이머 세트로 증폭된 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 균주의 CRISPR 구간에 대한 PCR 산물(spacer 1~5) 223 bp와 서열번호 1 및 7의 프라이머 세트 서열(44 bp)가 합해져서 측정된 것이므로, PCR 분석시 PCR 산물 크기 267 bp에 속한다면 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주라 판별할 수 있다.

상기 프라이머 조성물은 다른 균주에서는 PCR 산물을 생성하지 않고 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주에 대해서만 PCR 산물(예컨대, 서열번호 1 및 7의 프라이머 조성물의 경우 200 내지 300 bp, 구체적으로 267bp의 PCR 산물)이 생성되므로, PCR 산물의 시퀀싱을 통한 검증 없이 명확하고 확연하게 구별가능하다.

본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 상기 프라이머 조성물을 이용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 판별하는 방법에 관한 것이다.

a) 판별 대상 시료로부터 DNA를 분리하고, 상기 프라이머 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여, PCR 산물을 얻는 단계; 및

b) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함한다.

우선 a) 판별 대상 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여, PCR 산물을 얻는다.

상기 시료로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으나, 상기 DNA 추출법은 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method), 열수추출법, 컬럼(Column) 추출법 또는 페놀/클로로포름(Phenol/Chloroform) 추출법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method)일 수 있다.

상기 판별 대상 시료는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주의 존재유무를 검출하고자 하는 다양한 시료를 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이 프라이머가 설계되고, 판별 대상 시료로부터 DNA가 준비되면, 이의 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 및 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으나, 상기 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 특이적인 표적 DNA 서열을 증폭하는데 가장 일반적이고, 바람직하다.

또한 상기 PCR은 실시간(real-time) PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"란, 일반적으로 원하는 표적 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭하는 방법을 말하는 것으로, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 과정이라면 특별히 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 상기 PCR 과정은 2배 몰농도 이상 과량의, 상기 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에 넣는 단계로 이루어져 있다. 상기 반응 혼합물은 DNA 중합효소의 존재 하에 온도 싸이클링(thermal cycling) 프로그램에 적용하여, 상기 DNA 프라이머 세트 사이의 원하는 표적 서열을 증폭하도록 한다.

또한, 상기 과정을 통해 얻은 PCR 산물은 "PCR 절편(PCR fragment)" 또는 "역전사 효소-PCR 절편(reverse transcriptase-PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)"이라고도 하며, 특정한 표적 핵산의 증폭에 따라 생성되는 폴리뉴클레오티드 분자(또는 집합적으로 분자의 다수)를 의미한다. PCR 절편은 일반적으로, DNA PCR 절편을 의미하나, 이에 한정하는 것은 아니다. PCR 절편은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 임의의 농도비에 따른 그의 혼합물일 수 있다. PCR 절편 또는 역전사 효소-PCR 절편은 100-500개의 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.

상기 증폭된 PCR 산물을 분석하여, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 존재를 확인 및 판별할 수 있다. 상기 분석을 위한 방법으로는 PCR 산물의 염기서열을 분석하거나 증폭산물의 크기를 확인분석하여(예컨대 서열번호 1 및 7의 프라이머 조성물의 경우 PCR 산물의 크기가 200 내지 300 bp, 바람직하게는 260 내지 280 bp, 가장 바람직하게는 267bp로 확인됨) 분류함으로써 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에서는 증폭된 PCR 산물의 생성 유무를 분석하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종의 균주를 검출하거나, 판별할 수 있다.

즉, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 특이적으로 나타나는 PCR 산물에 대한 정보를 축적하고, 특이적으로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 높은 신뢰도로 정확하고 빠르게 판별 및 분석할 수 있다.

이때 상기 PCR 산물은 100 내지 300 bp에서 관찰된다면, 시료 내에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주가 존재한다고 분명하게 판별할 수 있다.

구체적으로 시료 내에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주가 존재한다면, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 7의 역방향 프라이머를 사용할 경우에는 267 bp의 PCR 산물이, 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 사용할 경우에는 208 bp의 PCR 산물이, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 9의 역방향 프라이머를 사용할 경우에는 147 bp의 PCR 산물이, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 사용할 경우에는 207 bp의 PCR 산물이, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머를 사용할 경우에는 148 bp의 PCR 산물이, 서열번호 6의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 사용할 경우에는 146 bp의 PCR 산물이 관찰된다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예 1. 락토바실러스 애시도필러스( Lactobacillus acidophilus) 의 CRISPR 구조 분석 및 프라이머 세트 설계.

유전체 정보가 알려진 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 21개 균주들의 게놈을 비교 분석하였다. 구체적으로 상기 21종의 균주는 다음과 같다(반복되는 기재를 생략하기 위해, 하기에서는 균주 표기 중 국문을 생략하기로 한다): L. acidophilus YT1, L. acidophilus NCFM(GCA 000011985.1), L. acidophilus ATCC 4796(GCA 000159715.1), L. acidophilus La-14 (GCA 000389675.2), L. acidophilus DSM 20242(GCA 000442825.1), L. acidophilus CIRM-BIA 442(GCA 000442865.1), L. acidophilus DSM 9126(GCA 000469745.1), L. acidophilus CIRM-BIA 445(GCA 000469765.1), L. acidophilus CFH(GCA 000497795.1), L. acidophilus JCM 1132(GCA 000615165.1), L. acidophilus ATCC 4356(GCA 000786395.1), L. acidophilus FSI4(GCA 000934625.1), L. acidophilus DSM 20079(GCA 001433895.1), L. acidophilus NBRC 13951(GCA 001591845.1), L. acidophilus WG-LB-IV(GCA 001639165.1), L. acidophilus KLDS 1.0901(GCA 001868765.1), L. acidophilus L-55(GCA 001950045.1), L. acidophilus ATCC 53544(GCA 002224305.1), L. acidophilus LA1(GCA 002286215.1), L. acidophilus P2(GCA 002406675.1), L. acidophilus LMG P-21904(GCA 002914945.1).

이러한 21종 균주의 게놈을 NCBI Genome 사이트 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/1099) 에서 확보하였다. 각 균주의 게놈 정보에서, 진화적 히스토리를 알 수 있는 CRISPR 지역을 CRISPRCasFinder(version 1.0) 통해 분석하였고, 각 균주의 CRISPR 구성을 비교하여 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)가 공유하는 서열위치를 확인하였다.

도 1은 실시예 1을 통해 확인한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 균주(21종)들의 CRISPR 구조 분석 결과이다.

이를 살펴보면, CRISPR 지역에서, 21종의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주들이 spacer 1번 부터 5번까지의 영역을 공통으로 포함하고 있음을 확인하였다.

따라서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주들이 공통적으로 갖는 CRISPR spacer 1번 내지 spacer 5번을 이용하여, 상기 균주들 중에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주들을 특이적으로 검출할 수 있는 마커(프라이머 세트)를 설계하고자 하였고, 그 결과 서열번호 1 및 7의 프라이머 세트와 서열번호 2 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 9의 프라이머 세트, 서열번호 4 및 10의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 11의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 12의 프라이머 세트를 최종 디자인하였다.

상기 프라이머 세트 중에서 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트 설계와 이를 통해 얻을 수 있는 PCR 증폭산물 크기를 도 2에 나타내었다. 보다 상세하게는 도 2는 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트와 상기 프라이머 세트로 PCR하였을 때, 인 실리코 분석(in silico)을 통해 분석한 해당 균주의 PCR 산물 크기를 도시화한 것이다.

상기 프라이머 세트는 도 2에서와 같이 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머를 포함한다. 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 첫 번째 CRISPR 영역에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주들이 공통적으로 갖는 spacer 들을 포함하는 프라이머를 개발함으로써, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 마커를 제작하였다. 구체적으로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 1번 spacer 지역의 10번째 위치부터 24 bp를 left primer로, 5번 spacer 지역의 20번째 위치부터 20bp 를 right primer로 제작하여, 이를 통해 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주에 대해 범용적으로 적용이 가능하며, 다른 속 종의 균주들과 확실히 구별할 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명을 통해 설계된 프라이머 세트를 이용하여, PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻을 경우, PCR 산물의 길이를 인실리코 모델링(in silico modeling)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 3의 하단에 표기하였다. 분석 결과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주들의 PCR 산물의 길이는 267 bp로 확인되었다.

즉, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용할 경우, 시료에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주의 존재 유무를 검출할 수 있다.

본 발명에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주 판별용 프라이머 세트를 제조하기 위하여, 가장 중요하게 여긴 것은 전체 프라이머의 길이로, 20 내지 30 bp를 가지도록 디자인하였다. 바람직하게 상기 프라이머 세트는 각각의 프라이머 길이가 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머는 24 bp, 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머는 20 bp일 수 있다. 또한 상기 프라이머는 Melting temperature(Tm)이 57℃ 내지 63℃, 바람직하게는 60 ℃로 디자인하였고, 프라이머 간의 최대 Tm 차이는 3~5℃ 이내로 한정하였다. 또한, GC%가 50% 내지 37.5%로 설계하였다.

이렇게 제작된 서열번호 1 및 7의 프라이머 세트 조성물이 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주에 대하여 특이성을 가지는지 여부를 in silico 분석 및 현존 NCBI DB상의 sequence match를 통해 분석하였고, 그 결과를 살펴보면(도 3), 본 발명을 통해 설계된 프라이머 세트 조성물은 NCBI에 등록된 서열 중 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주 이외에는 증폭할 수 있는 균주가 없음을 확인하였다.

도 3은 인 실리코(in silico)에서, 본 발명의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트를 NCBI 사이트로부터 제공되는 데이터베이스와 대조하여, Primer-BLAST란 서열검색 프로그램으로 시퀀스를 분석한 결과이다. 구체적으로는 Primer-BLAST 웹서비스 ()에 접속하여 PCR Template 로 CP000033.3(L. acidophilus NCFM 유전체의 Accession No.), forward primer의 범위 1,541,067 ~ 1,541,099(spacer 1 의 유전체 상 위치), reverse primer 의 범위 1,541,311 ~ 1,541,343(spacer 5 의 유전체 상 위치) 로 지정한 후 Primer Parameters의 forward primer 서열에 CRISPR_LA_uni_F(서열번호 1)을, reverse primer 서열에 CRISPR_LA_uni_R(서열번호 7)을 입력한 후 데이터베이스를 "nr" (또는 Nucleotide collection)로, 대상 Organism은 없음으로 지정했다. 나머지 설정은 기본설정을 유지한 상태로 프로그램을 실행했다.

그 결과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주 판별용 범용 프라이머 세트는 NCBI에 현존하는 서열에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) YT1, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) DSM 20079, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LA1, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) ACTC 53544, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FSI14, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) La-14, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM을 증폭한다는 분석결과를 얻었다. 구체적으로는 도 3의 "Specificity of primers" 항목에서 다음과 같이 표시되었다. "Primer may not be specific to the input PCR template as targets were found in selected database: Nucleotide collection(nt)". 이는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주 중 특정한 균주(strain)을 증폭하지는 않으나 검색된 항목이 모두 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주에 속하므로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 범용적인 프라이머로 사용될 수 있음을 시사한다.

비교예 1. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석방법

1) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 근연종의 16S 유전자 유사도 비교

락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)는 종 내에서도 유사도가 높은 종으로 보고되어 있고, NCBI 에 보고된 서열 중에서도 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 60 종의 균주들의 16S rRNA 간의 유사도는 97.5 ~ 100%이다. 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) EMBS082는 유사도가 97.5%로 가장 큰 차이를 보이는 것으로 확인되었다.

일반적으로 16S rRNA 판별방법은, 97% 이상의 유사도를 가지면 같은 종으로 판단한다. 이에 따라 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 유전체의 대표인 NCFM(Accession No. CP000033.3)의 16S rRNA 유전자 정보를 기준으로 NCBI에 보고된 16S 유전자 중 유사한 유전자의 검색 및 비교를 수행하였다. NCBI NT 데이터베이스에 BLASTN 검색을 수행하고 결과 중 97% 이상의 유사성을 가진 서열 중 Uucultured strain을 제외한 414 개의 서열이 검색되었다.

즉, 16S rRNA 염기서열을 단순히 비교하는 종래의 기술만으로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종이 아닌 354개의 균주 역시 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로 오판될 수 있는 가능성이 높음을 알 수 있다.

계통학적 비교를 하기 전에 유사도만으로 분석한 결과, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 균주(60 종)를 제외하고도, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM와 97% 이상의 유사도를 갖는 균주로 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주 252종, 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) 균주 33종, 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) 균주 18종, 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 균주 16종, 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 균주 9종, 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 균주 8종, 락토바실러스 선토리우스(Lactobacillus suntoryeus) 균주 6종, 락토바실러스 키타사토니스(Lactobacillus kitasatonis) 균주 4종, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 1종, 락토바실러스 울투넨시스(Lactobacillus ultunensis), 락토바실러스 소브리우스(Lactobacillus sobrius), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 박테리움(Lactobacillaceae bacterium), 박테리움 ic1256(Bacterium ic1256), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus)가 확인되었다(총 414종).

2) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 근연종의 16S 유전자 계통도 비교

도 4는 비교예 1-1)을 통해 확인한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM과 97% 이상의 유사도를 갖는 총 414 종의 16S rRNA 서열의 계통도 분석을 수행한 결과이다. 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 이외의 종에 해당하는 서열은 도 4에서 붉은색 및 우측상단 별표(*)로 표기하였다.

즉, 단순히 16S rRNA의 염기서열 유사도만을 비교하는 것이 아닌, 각 염기서열의 위치 및 배열을 함께 고려하여, 도 4와 같이 계통학적 비교를 수행한 결과, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종과 구분이 불가능한 균주는 5개로 각각 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 균주 3종과 락토바실러스 키타사토니스(Lactobacillus kitasatonis) 균주 2종이 확인되었다(7.7%의 오판율).

구체적으로 도 4에서와 같이 계통학적 군집분석결과, 계통나무 상에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 60개의 균주가 하나의 계통으로 분류되는 가지 "A"내에는 락토바실러스(Lactobacillus sp.)(Accession No. EU600905.1, KF952776.1, MH782151.1)와 락토바실러스 키타사토니스(Lactobacillus kitasatonis) 균주(Accession No. AB186333.1, AB186339.1)가 존재하고 있음을 확인할 수 있다.

따라서, 16S rRNA 유전자 정보에 기반한 현재의 미생물 계통분류만으로는 락토바실러스 속 중에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종만을 특이적으로 검출, 판별 및 동정할 수 없음을 확인하였다.

즉 16S rRNA 판별방법만으로는 공지된 균주조차 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종외에 다른 속종의 균주들을 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종으로 구별하고 있으므로, 미지의 시료로부터 해당 종의 균주를 명확히 검출, 판별하는데 사용에 제한이 있음을 알 수 있다. 만일 상기 방법으로 판별할 경우, 보다 정확한 검출, 판별을 위해서 이차적 단계 혹은 검증 단계가 요구됨을 알 수 있다.

실험예 1. 락토바실러스 애시도필러스( Lactobacillus acidophilus ) 종 판별용 조성물의 PCR 분석

도 2에서 제작된 본 발명의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 조성물이 특이적으로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 특이적으로 판별하는지를 확인하고자 하였다.

우선, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 13866, 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) ATCC 33620, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) ATCC 4356, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LA1 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주들을 각각 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 18 시간동안 배양하였다. 이후 상기 각각의 균주의 배양액으로부터 균체를 회수하여 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)으로 Genomic DNA를 추출하였다.

추출한 DNA 30 ng에 대하여 thermal cycling(PCR)을 실시하였다. PCR 반응시 총 반응액은 30 ㎕이고, 2.0 mM dNTP(Fermentas, USA), 1.0 unit의 내열성 DNA 중합효소(e-taq polymerase, Solgent), 20 pmol CRISPR_LA_uni_F(서열번호 1), 20 pmol CRISPR_LA_uni_R 프라이머(서열번호 2), 20 ng 각각의 균주 DNA 및 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴)을 완전히 혼합한 용액을 준비한다.

PCR반응은 Dyad(Bio-rad)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 초기 95 ℃에서 300초간 유지한 뒤, 95 ℃에서 30초간 처리하여 DNA를 변성시키고, 60 ℃에서 30초간 어닐링한 후, 72 ℃에서 90초간 증폭(extension)(DNA 중합)하였고, 이러한 과정을 28회 반복(95 ℃, 30초(변성) → 60 ℃, 30초(재결합) → 72 ℃, 90초(DNA 중합))하고, 72 ℃ 300 초간 마지막 합성을 실시하였다.

PCR 반응 용액	함량(㎕)
SP taq.	0.5
10x SP taq buffer	2.5
dNTPs	2.0
Tuning Buffer	5.0
Template(균주 DNA)	1.0
Forward primer (5 uM) CRISPR_LA_uni_F 프라이머(서열번호 1)	1.0
Reverse primer (5 uM) CRISPR_LA_uni_R 프라이머(서열번호 2)	1.0
D.W	12

상기 과정으로 증폭된 증폭산물(PCR 산물)을 1.2%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도 5에 나타내었다.

도 5는 본 발명의 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여, 각각의 균주(Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus acidophilus CB_LA1, Lactobacillus acidophilus YT1)에 대해 PCR을 수행하여 분석한 결과이고, 도 6은 본 발명의 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여, 대표로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주에 대해 PCR을 수행하여 얻은 PCR 증폭산물을 정제한 후 이를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하는 과정을 두 번 반복(Uni-a, Uni-b)한 결과이다.

이때, M은 DNA 크기 표준 마커(Sizer^™ 100bp DNA Marker(cat.No,24073)이고, 1은 Lactobacillus helveticus ATCC 13866이고, 2는 Lactobacillus amylovorus ATCC 33620이며, 3은 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356이며, 4는 Lactobacillus acidophilus NCFM 균주이고, 5는 Lactobacillus acidophilus LA1(CB_LA1이라고도 한다), 6은 Lactobacillus acidophilus YT1이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 조성물은 약 267bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰음을 확인하였다.

게놈분석을 통해 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종은 특이적으로 CRISPR 영역 중 spacer 1번 부터 5번까지를 공통으로 갖고 있음을 확인하였고, spacer 1번 내지 5번을 증폭할 수 있는 범용 프라이머(서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 7의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트)(도 2 참조)를 설계 및 제작하여 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 판별할 수 있는 프라이머 조성물을 완성하였다.

본 발명에 따른 상기 프라이머 조성물을 이용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주의 표적 서열(CRISPR 영역)을 증폭하면, 회수된 267bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다.

전기영동 겔(gel electrophoresis) 상에서 미세한 차이(전기영동이 1base단위 정밀한 resolution을 보여주지 않음)를 고려하면, PCR 산물이 200 내지 300 bp(바람직하게는 260 내지 280 bp)에서 검출되었다 하더라도, 증폭된 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주의 CRISPR 구간에 대한 PCR 산물 267 bp를 근간으로 도출된 결과이므로, 본 발명의 범주에 속하는 결과라 할 것이다.

따라서, PCR 산물은 정확하게는 267 bp 인 것이 바람직하나, 상술한 다양한 조건들을 고려하였을 때, 실제 적용하여 도출된 PCR 산물이 200 내지 300 bp, 바람직하게는 260 내지 280 bp에 해당한다면 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)인 것으로 판별할 수 있다(마커로 측정가능한 영역에도 영향을 받음).

이를 증명하기 위하여 본 실시예에서 회수된 상기 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)의 PCR 산물에 대해서만 DNA 염기서열을 확인하였다.

이에 반해 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)와는 다른 Lactobacillus helveticus ATCC 13866, Lactobacillus amylovorus ATCC 33620에 대해서는 전혀 증폭된 DNA 단편이 발견되지 않았다.

따라서, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 대해서만 앰플리콘(amplicon)을 생성하기에 신속, 정확하게 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 조성물로 활용가능하다.

도 6은 본 발명에 따른 프라이머 조성물을 사용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 그 산물(amplicon)을 정제하고, 이에 대하여 시퀀스를 분석한 것으로, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에서만 확인된 증폭산물의 크기는 프라이머(primer)를 포함하여 267 bp 인 것으로 측정되었고, 증폭서열은 다음과 같다.

[서열번호 13]

TAAAAGCTACAGAGTTACCATCGAGGATCACCTCCACTTTCGTGGAGAAAATTGGAATCTCATCGTAAGAAATAAGTCGCATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCCTTTTCCTAGGATCTTCATAAGCTTCTCGCCAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATATCGTAGTCAATCTCGTACTTAAAACCACCCTGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCCAGGTTGACTTGCGCTAGGTGTTGCATCAAT

락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 모든 균주는 CRISPR 영역 중 spacer 1번 부터 5번까지를 공통으로 가지고 있으므로, 인 실리코(in silico) 상에서, 본 발명에 따른 프라이머 조성물을 이용하여 증폭하였을 때, 동일한 앰플리콘(amplicon)이 만들어진다. 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 조성물을 사용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 그 산물(amplicon)을 정제하였을 때, 실제 게놈상에 존재하는 시퀀스와 동일한지를 재-시퀀싱(re-sequencing)한 결과, 일치하는 것으로 확인하였다.

특히, 실질적으로 증폭된 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 대한 PCR 산물의 염기서열 해독 길이가 267 bp이며, 게놈상에서 예측된 염기서열과 100% 일치함을 확인하였다. 즉, 전기영동 시 육안으로 약 270 bp에 가까운 것으로 보였으나, 실질적으로 증폭된 서열의 길이는 267 bp로, 예측길이와 완벽하게 일치하고 염기서열 또한 동일함을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명에 따른 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 조성물은 모든 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 균주를 다른 종 균주들과 명백히 구별가능함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 에서만 앰플리콘(amplicon)을 생성하기에 신속, 정확하게 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 조성물로 활용가능함을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

실험예 2. 락토바실러스 애시도필러스( Lactobacillus acidophilus ) 종 판별용 조성물의 인 실리코 분석

비교예 1에서 계통학적 분석에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NCFM과 유사도가 높아 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로 동정되었던, 균주들 중에서 NCBI에 공개된 락토바실러스 키타사토니스(Lactobacillus kitasatonis) 균주 DSM 16761(Genbank accession: GCA_001434435.1)와 JCM 1039(Genbank accession: GCA_000615285.1)를 준비하였다.

상기 균주들을 대상으로 실시예 1에서 설계된 서열번호 1, 7로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 더불어 서열번호 2, 8의 프라이머 세트; 서열번호 3, 9의 프라이머 세트; 서열번호 4, 10의 프라이머 세트; 서열번호 5, 11의 프라이머 세트 및 서열번호 6, 12의 프라이머 세트에 대해서 결합 부위를 갖는지, 혹은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종이 공통적으로 지니고 있는 CRISPR 영역의 spacer 1번부터 5번까지의 영역 중 어느정도 일치하는지를 인 실리코(in-sillico) 분석을 통해 확인하고자 하였다.

그 결과, NCBI에 공개된 락토바실러스 키타사토니스(Lactobacillus kitasatonis) DSM 16761(Genbank accession: GCA_001434435.1)와 JCM 1039(Genbank accession: GCA_000615285.1)의 유전체를 대상으로, 본 발명에서 설계한 프라이머 세트(서열번호 1 및 7, 서열번호 2 및 8, 서열번호 3 및 9, 서열번호 4 및 10, 서열번호 5 및 11, 서열번호 6 및 12)로 탐색한 결과, 상기 프라이머 세트와 결합 부위가 관찰되지 않았으며, 따라서 PCR 산물의 생성 가능성이 없음을 확인하였다. 또한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에서 얻은 약 100 내지 300 bp의 PCR 증폭산물(각각 267 bp, 209 bp, 147 bp, 207 bp, 148 bp, 146 bp)의 서열 중 일치하는 부분도 발견되지 않았다.

게다가, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종이 공통적으로 지니고 있는 CRISPR 영역의 spacer 1번부터 5번까지의 영역 중 어느 하나라도 일치하는 부분이 전혀 없음을 확인하였다.

종합하면, 16S rRNA 유전자 정보 판별방법으로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로 판별되던, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)와 매우 유사한 16S rRNA 유전자를 가지고 있는 락토바실러스 키타사토니스(Lactobacillus kitasatonis)마저도 본 발명의 프라이머 조성물은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하지 않음을 분명히 구별 및 판별할 수 있음을 알 수 있다. 종래 16S rRNA 유전자 판별방법보다 본 발명에 따른 프라이머 조성물이 정확히 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종에 속하는 균주와 속하지 않는 균주를 정확히 판별, 구별, 검출이 가능함을 알 수 있으며, 본 발명의 프라이머 조성물을 사용한다면 제품이나 시료 상에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)가 존재하는지 여부를 비롯하여, 미분류된 균주가 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 균주인지를 정확히 동정할 수 있음을 알 수 있다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> A primer composition for specifically identifying a specific species in the Lactobacillus genus and method for determination thereof <130> HPC8502 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_F <400> 1 taaaagctac agagttacca tcga 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S1-S4_F <400> 2 ggctctaaaa gctacagagt tacca 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S1-S3_F <400> 3 ggctctaaaa gctacagagt tacca 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S2-S5_F <400> 4 tcatcgtaag aaataagtcg cata 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S2-S4_F <400> 5 tctcatcgta agaaataagt cgcata 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S3-S5_F <400> 6 ccttttccta ggatcttcat aagc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_R <400> 7 attgatgcaa cacctagcgc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S1-S4_R <400> 8 cagggtggtt ttaagtacga ga 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S1-S3_R <400> 9 tggcgagaag cttatgaaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S2-S5_R <400> 10 caacacctag cgcaagtcaa 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S2-S4_R <400> 11 cagggtggtt ttaagtacga ga 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR_LA_uni_S3-S5_R <400> 12 atgcaacacc tagcgcaagt c 21 <210> 13 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplicon <400> 13 taaaagctac agagttacca tcgaggatca cctccacttt cgtggagaaa attggaatct 60 catcgtaaga aataagtcgc atataggatc acctccacat acgtggagaa aatccttttc 120 ctaggatctt cataagcttc tcgccaggat cacctccaca tacgtggaga aaatatcgta 180 gtcaatctcg tacttaaaac caccctggga tcacctccac atacgtggag aaaatccagg 240 ttgacttgcg ctaggtgttg catcaat 267

Claims

서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 프라이머 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 프라이머 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종 판별용 키트.
a) 판별 대상 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및
b) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 종을 판별하는 방법.