CN103237892A

CN103237892A - 用于检测李斯特氏菌的寡核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN103237892A
Application number: CN201180042101XA
Authority: CN
Inventors: 李俊
Original assignee: Samsung Techwin Co Ltd
Current assignee: Hanwha Techwin Co Ltd
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2013-08-07
Also published as: WO2012030136A3; WO2012030136A2; KR20120035101A; US20120052492A1

Abstract

提供了一种特异性结合到李斯特氏菌的23S rRNA基因的寡核苷酸以及通过使用该寡核苷酸有效地检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒和方法。

Description

用于检测李斯特氏菌的寡核苷酸及其应用

本申请要求在2010年8月30日提交的第61/378,072号美国临时专利申请的权益，通过引用将该美国临时专利申请的全部内容包含于此。

技术领域

公开了用于检测李斯特氏菌（Listeria spp.）的寡核苷酸组和试剂盒以及通过使用该寡核苷酸组和试剂盒检测样品中李斯特氏菌的方法。

背景技术

李斯特氏菌（Listeria spp.）的细菌为革兰氏阳性、无芽孢且为运动杆菌，并且可以在大约-4℃至大约45℃的宽的温度范围内以及大约≤5.5至大约9.5的宽的pH范围内生长。李斯特氏菌属（Listeria genus）包含六个种，包括Listeria monocytogenes（单核细胞增生性李斯特氏菌）、L.innocua（英诺克李斯特氏菌）、L.welshimeri（威尔斯李斯特氏菌）、L.seeligeri（西尔李斯特氏菌）、L.ivanovii（伊氏李斯特氏菌）和L.grayi（格氏李斯特氏菌）。在李斯特氏菌的这些种中，L.monocytogenes是大部分人类李斯特氏菌病病例的病源。免疫力低下者、孕妇、老年人、新生儿易被这些种感染。李斯特氏菌病的典型症状包括败血病、脑膜炎和流产。

食用被污染的食物是李斯特氏菌感染的主要原因。已经存在由食用诸如未经高温消毒的牛奶、污染的奶酪、凉拌卷心菜等污染的食物导致的各种由李斯特氏菌引起的感染的流行病。

因此，日益需要快速、灵敏并准确地检测诸如食物、表面拭样（surfacewipe）或医学样品的样品中的李斯特氏菌的方法。

发明内容

技术问题

总结

公开了一种适于快速、灵敏并准确地检测李斯特氏菌的组合物。组合物包括：第一寡核苷酸，序列为SEQ ID NO:19：X₁CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAX₂（SEQ ID NO:19），其中，位置1处的X₁是T或者空缺，位置22处的X₂是G或者空缺；以及第二寡核苷酸，序列为SEQ ID NO:20：X₁X₁GACAGCGTGAAATCAGGX₃X₃X₄（SEQ ID NO:20），其中，位置1和2处的X₁均为T或者空缺，位置20和21处的X₃是A或者空缺，位置22处的X₄是C或空缺。

在一个实施例中，SEQ ID NO:19的第一寡核苷酸中的核苷酸残基的数目可以是20或21，SEQ ID NO:20的第二寡核苷酸中的核苷酸残基的数目是18-21。

在另一个实施例中，第一寡核苷酸是从SEQ ID NO:1-3：CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAG（SEQ ID NO:1）、CCAAGCAGTGAGTGTGAGAA（SEQ ID NO:2）和TCCAAGCAGTGAGTGTGAGAA（SEQ ID NO:3）的寡核苷酸的组中选择的一种或多种。

在实施例中，第二寡核苷酸是从SEQ ID NO:5-9：TGACAGCGTGAAATCAGGAAC（SEQ ID NO:5）、TTGACAGCGTGAAATCAGG（SEQ ID NO:6）、TGACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:7）、TGACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:8）和GACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:9）的寡核苷酸的组中选择的一种或多种。

根据实施例，组合物还可以包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的探针寡核苷酸：TGAGCTGrUrGATGG（SEQ ID NO:21），其中，分别在位置8和9处的“rU”和“rG”中的至少一个是核糖核苷酸；以及CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO.22），其中，分别在位置11、12、13、14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸。在一个实施例中，探针寡核苷酸具有DNA序列和RNA序列，并且是从由SEQID NO:10-14的寡核苷酸组成的组中选择的一种或多种：TGCGAAGCrATGAGCTGTGATGG（SEQ ID NO:10），其中，位置9处的“rA”是核糖核苷酸；TGCGAAGrCATGAGCTGTGATGG（SEQ ID NO:11），其中，位置8处的“rC”是核糖核苷酸；CCATCACAGCTCArUGCTTCGC（SEQ IDNO:12），其中，位置14处的“rU”是核糖核苷酸；CCATCACAGCTrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO:13)，其中，分别在位置12、13和14处的“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸；以及CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO:14），其中，分别在位置11、12、13和14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸。探针寡核苷酸用例如荧光共振能量转移（FRET）对的可检测标记物标记。

在另一个实施例中，提供了用于检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒，该试剂盒包含上面的组合物。试剂盒还可以包括扩增活性和RNA酶H。在实施例中，试剂盒还可以包括用于靶李斯特氏菌RNA序列的反转录的逆转录酶活性。

在另一个实施例中，提供了检测样品中的李斯特氏菌的方法。该方法包括：（a）扩增样品中的李斯特氏菌的靶核酸，以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ ID NO:19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到样品中的靶核酸以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；（b）使靶核酸与能够杂交到靶核酸的至少一种探针寡核苷酸杂交，以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，探针包含DNA序列和RNA序列并结合到可检测标记物；（c）使靶核酸:探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从靶核酸分离；以及（d）检测可检测标记物。探针寡核苷酸可以是SEQ ID NO:21或22的寡核苷酸。探针寡核苷酸可以是SEQ ID NO:10-14的寡核苷酸中的一种。探针寡核苷酸可以用例如荧光共振能量转移对的可检测标记物标记。

在另一个实施例中，提供了检测样品中的李斯特氏菌的靶RNA序列的方法。该方法包括：（a）在逆转录酶活性和逆扩增引物的存在下逆转录李斯特氏菌的靶RNA，以产生靶RNA的靶cDNA；（b）扩增靶cDNA序列以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ ID NO:19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到靶cDNA以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；（c）使靶核酸杂交到基本上与靶cDNA互补的至少一种探针寡核苷酸以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包含DNA序列和RNA序列并结合到可检测标记物；（d）使靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针；以及（e）检测来自探针上的可检测标记物的信号发射的增加，其中，信号的增加表示样品中存在李斯特氏菌的靶RNA。

可以通过使用诸如聚合酶链式反应（第4,683,195号、第4,683,202号和第4,800,1590号美国专利）的任何核酸扩增方法，或者通过使用诸如连接酶链式反应（Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193）、自主维持序列复制（Self-Sustained Sequence Replication）（Guatelli等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878）、链替代扩增（第5,270,184号、第5,455,166号美国专利）、转录扩增系统（Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177）、Q-β复制酶（Lizardi等人,1988,Bio/Technology6:1197）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、切割片段长度多态性（第5,719,028号美国专利）、等温和嵌合引物起始的核酸扩增（Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplificationof Nucleic Acid）（第6,951,722号美国专利）、分支延伸扩增法（Ramification-extension Amplification Method）（第5,719,028号和第5,942,391号美国专利）或用于核酸扩增的其他的合适的方法的扩增反应来执行样品中的靶序列的扩增。

可以同时或顺序地执行扩增、杂交和接触的步骤。

在实施例中，可以在扩增之前在富集培养基中培养包含李斯特氏菌的样品，以增强李斯特氏菌的生长。这样的富集培养基可以包含每1L蒸馏水大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth）、大约1g至大约10g的酵母提取物以及大约1g至大约10g的氯化锂。富集培养基还可以包含从由以下组分组成的组中选择的至少一种组分：大约1g至大约10g的牛肉膏（beefextract）和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸；以及大约0.01g至大约1g的柠檬酸铁铵。富集培养基还可以包含例如3-(N-吗啉基)丙磺酸（MOPS）及其钠盐的缓冲化合物。

在另一个实施例中，富集培养基可以包含每1L蒸馏水大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约10mg至大约30mg的头孢他啶。例如，富集培养基可以包含每1L蒸馏水：大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约1g至大约10g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约1g至大约10g的牛肉膏和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0.1g至大约1g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸（MOPS）和大约7.1g的MOPS钠；以及大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约10mg至大约30mg的头孢他啶。在实施例中，富集培养基不包含七叶苷和蛋白胨中的一种或两种。

在另一个实施例中，富集培养基可以包含每1L蒸馏水：大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约6g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约5g的牛肉膏和/或包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；大约2g的丙酮酸钠；大约0.2g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸（MOPS）和大约7.1g的MOPS钠；以及大约5mg的吖啶黄、大约10mg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他啶。

在另一个实施例中，富集培养基可以是脑心浸出肉汤（brain-heart infusionbroth）或者含有0.6%的酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤。

样品可以是食物样品、医学样品或表面拭样。

技术方案

除非另有说明，否则这里描述的实施例的实践采用本领域内常规的分子生物学技术。这样的技术对本领域技术人员来讲是公知的，并且在文献中被充分地解释。参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons公司，NY，N.Y.（1987-2008），包括所有增刊；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989）。

除非另有定义，否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的意思相同的意思。本说明书也提供了对术语的定义，以有助于解释本申请的公开内容和权利要求书。如果定义与别处的定义不一致，则将以本申请中所阐述的定义为准。

这里使用的术语“扩增”是指增加核苷酸序列的拷贝数的任何过程。核酸扩增描述了核苷酸由此包含到例如DNA或RNA的核酸中的过程。

这里使用的术语“核苷酸”是指碱基-糖-磷酸的结合体。核苷酸是核酸的单体单元，例如，DNA或RNA。术语“核苷酸”包括诸如rATP、rCTP、rGTP或rUTP的核糖核苷三磷酸和诸如dATP、dCTP、dGTP或dTTP的脱氧核糖核苷三磷酸。

这里使用的术语“核苷”是指碱基-糖的结合体，即，缺少磷酸配基的核苷酸。术语“核苷”和“核苷酸”在本领域中可交换地使用。例如，脱氧尿苷核苷酸-dUTP是脱氧核苷三磷酸。它用作DNA单体，例如，在被插入到DNA中之后成为dUMP或脱氧尿苷酸。就这一点而言，即使在得到的DNA中不存在dUTP配基，也可以认为dUTP已经被插入。

术语“聚合酶链式反应（PCR）”通常是指增加样品中靶核酸的拷贝数目的扩增方法。在第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号和第4,965,188号美国专利中详细地描述了该程序，它们内容全部包含于此。样品可以包括一种核酸或多种核酸。通常，PCR包括将至少两种可延伸的引物核酸混合到包含靶核酸的反应混合物中。引物与双链靶序列的相反链互补。在核酸聚合酶和核酸单体的存在下，例如，在dNTP和/或rNTP的存在下，对反应混合物进行热循环以通过引物的延伸扩增靶核酸。通常，热循环可以包括：退火以杂交引物和靶核酸；使用核酸聚合酶延伸引物；以及使杂交的引物延伸产物和靶核酸变性。术语“逆转录-PCR（RT-PCR）”是使用RNA模板以及逆转录酶或具有逆转录酶活性的酶在依赖DNA的DNA聚合酶引物延伸的多个循环之前首先产生单链cDNA分子的PCR。术语“多重PCR”是指在单一反应中产生多于两种的扩增目标产物的PCR，典型地通过包含两种以上的引物。

这里使用的术语“核酸”是指包括两个以上的核苷酸的聚合物。术语“核酸”与“多核苷酸”或“寡核苷酸”可交换地使用。核酸包括DNA和RNA。核酸的结构可以是双链和/或单链。

这里使用的术语“核酸类似物”是指包含至少一种核苷酸类似物和/或至少一种磷酸酯类似物和/或至少一种戊糖类似物的核酸。核酸类似物的示例包括其中磷酸酯和/或糖磷酸酯键被诸如N-(2-氨乙基)-甘氨酰胺和其他酰胺的其他类型的键取代的核酸。核酸类似物是指包含至少一种核苷酸类似物和/或至少一种磷酸酯类似物和/或至少一种戊糖类似物并且可以通过杂交形成双螺旋的核酸。

这里使用的术语“退火”和“杂交”是可交换的，并且指一个核酸与另一个核酸的碱基对的相互作用，导致形成双链体、三链体或其他更高级的结构。在某些实施例中，主要的相互作用是通过沃森/克里克以及胡斯坦型氢键的碱基特异性，例如，A/T和G/C。在某些实施例中，碱基堆积和输水相互作用也可以有助于双链体的稳定。

这里使用的术语“探针”是指具有与靶核酸序列互补的序列并且能够与靶核酸杂交形成双链体的核酸。探针的序列可以与靶核酸序列充分或完全互补。可以标记探针使得可以使用PCR同时检测靶核酸。

这里使用的术语“靶核酸”或“靶序列”包括可以被扩增和/或检测的靶核酸的全长或片段。靶核酸可以存在于用于扩增的两个引物之间。

就寡核苷酸而言，这里使用的术语“杂交寡核苷酸”指在单个分子内包含DNA部分和RNA部分的寡核苷酸分子。杂交寡核苷酸可以包含一个以上的DNA部分和一个RNA部分，例如DNA-RNA、RNA-DNA或DNA-RNA-DNA寡核苷酸。

在实施例中，用于检测李斯特氏菌的寡核苷酸组包括：至少一个第一引物，从由SEQ ID NO.1-3组成的组中选择；至少一个第二引物，从由SEQ IDNO.5-9组成的组中选择；以及至少一个探针，从由SEQ ID NO.10-14组成的组中选择。

包含从SEQ ID NO.1-3中选择的至少一种第一引物和从SEQ ID NO.5-9中选择的至少一种第二引物的引物对具有与靶核酸的各个相反链互补的序列，并且可以限定靶核酸。引物对与李斯特氏菌的23S rRNA基因互补，并且可以用于特异性地扩增23S rRNA基因中的靶核酸。23S rRNA基因的长度可以是大约3000bp。当用于扩增时，引物对可以扩增李斯特氏菌属的任何李斯特氏菌种的靶核酸序列，但不扩增非李斯特氏菌的靶核酸序列。因此，引物对特异性地扩增李斯特氏菌的靶核酸，并具有单拷贝灵敏度。

在一个实施例中，探针可以具有DNA-RNA-DNA的杂交结构。探针可以是核酸或核酸类似物。探针也可以是被保护的核酸。例如，探针的DNA或RNA部分可以被部分地甲基化，以抵抗被例如RNA酶H的RNA-特异酶降解。

可以修饰探针。例如，可以将探针的碱基部分部分地或完全地甲基化。这样的修饰可以抑制酶或化学降解。可以封闭核酸探针的5'端或3'端-OH基。可以封闭核酸探针的3'端OH基，由此导致不能通过依赖模板的核酸聚合酶延伸。

探针可以具有可检测标签。可检测标签可以是通过本领域内已知的任何方法可检测的任何化学配基。可检测标签的示例包括通过光谱学、光化学或者通过生物化学、免疫化学或化学的方法可检测的任何配基。可以根据标签的类型以及标签和探针的位置来选择标记核酸探针的合适方法。标签的示例包括酶、酶底物、放射性物质、荧光染料、发色团、化学发光标签、电化学发光标签、具有特异性结合部分的配体以及相互作用以增加、改变或减小检测信号强度的其他标签。这些标签在PCR热循环的整个过程中始终是稳定的。

可检测标签可以是荧光共振能量转移（FRET）对。可检测标签是包括通过合适距离分开的荧光供体和荧光受体的FRET对，其中，供体的荧光发射通过受体淬灭。然而，当供体-受体对通过切割分离时，供体的荧光发射增强。当供体-受体对接近时，处于其激发态的供体发色团可以将能量转移给受体发色团。这种转移常常是非辐射的，并通过偶极-偶极结合发生。充分地增加发色团之间的距离的任何过程将降低FRET的效率，从而可以辐射地检测供体发色团的发射。供体发色团的示例包括FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5和德克萨斯红。选择受体发色团使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的供体-受体对的示例是FAM-TAMRA。另外，可检测标签的示例是将淬灭宽范围供体的非荧光受体。合适的供体-受体FRET对的其他示例对本领域技术人将是已知的。

在实施例中，寡核苷酸探针在溶液中可以以可溶性形式或自由形式存在。在一个实施例中，寡核苷酸探针可以附着到固体支撑。不同的探针可以附着到固体支撑并且可以用于同时检测样品中不同的靶序列。可以在不同的探针上使用具有不同荧光波长的报告分子，因此能够杂交到不同的探针以单独地检测。

用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固体支撑的示例包括聚苯乙烯、抗生物素蛋白涂覆聚苯乙烯珠纤维素（avidin coated polystyrene beads cellulose）、尼龙、丙烯酰胺凝胶和激活右旋糖酐、可控孔度玻璃（CPG）、玻璃板和高度交联的聚苯乙烯。由于这些固体支撑化学稳定、易于功能化且表面积好限定，所以它们优选用于杂交和诊断研究。考虑到它们与寡核苷酸合成的兼容性，特别优选的是诸如可控孔度玻璃

和非膨胀高度交联聚苯乙烯

的固体支撑。

寡核苷酸探针可以以各种方式附着到固体支撑。例如，探针可以通过将探针的3'端或5'端核苷酸附着到固体支撑而附着到固体支撑。然而，探针可以通过用于使探针与固体支撑分开的连接物附着到固体支撑。连接物最优选地是至少30个原子长，更优选地是至少50个原子长。

固定到固体支撑的探针的杂交通常需要探针与固体支撑分开至少30个原子，更优选至少50个原子。为了实现这种分开，连接物通常包括位于连接物和3'核苷酸之间的空间。对于寡核苷酸的合成，通常通过酯键将连接臂附着到3'核苷酸的3'-OH，可以使用碱性试剂切割酯键以从固体支撑释放寡核苷酸。

可以用于将寡核苷酸探针附着到固体支撑的各种连接物在本领域内是已知的。连接物可以由不显著干扰靶序列和附着到固体支撑的探针的杂交的任何化合物形成。连接物可以由能够通过自动合成而容易地添加到连接物上的同聚物寡核苷酸形成。可选择地，诸如功能化聚乙二醇的聚合物可以被用作连接物。与同聚物寡核苷酸相比，优选这样的聚合物，这是由于它们不显著干扰探针与靶寡核苷酸的杂交。特别优选聚乙二醇，因为其可以购得、在有机介质和水介质中都可溶、易于功能化并且在寡核苷酸合成和合成之后的条件下完全稳定。

固体支撑、连接物和探针之间的键优选地在高温下在碱性条件下除去碱基保护基团的过程中不被切割。优选的键的示例包括氨基甲酸酯键和酰胺键。探针的固定在本领域内是公知的，本领域技术人员可以确定固定条件。

根据本方法的一个实施例，将杂交探针固定在固体支撑上。在有利于杂交的条件下，将寡核苷酸探针与核酸的样品接触。在未杂交的状态下，受体淬灭荧光标签。在与目标杂交时，荧光标签与淬灭剂分离而使荧光发射增强。

杂交探针固定到固体支撑也能够使与探针杂交的靶序列容易地从样品分离。在后面的步骤中，可以将分离出的靶序列与固体支撑分开，并且可以基于研究者的具体需求根据本领域公知的方法（例如，纯化、扩增）处理靶序列。

在实施例中，适于检测李斯特氏菌的寡核苷酸组可以包括SEQ ID NO.3的引物、SEQ ID NO.7的引物以及SEQ ID NO.12的探针。

寡核苷酸组可以用于靶核酸的扩增和检测。扩增可以包括使用依赖模板的聚合酶来延伸引物，从而形成PCR片段或扩增子。可以通过从由聚合酶链式反应组成的组中选择的任何方法或者通过使用诸如连接酶链式反应、自主维持序列复制、链替代扩增、转录扩增系统、Q-β复制酶、基于核酸序列的扩增（NASBA）、切割片段长度多态性、等温和嵌合引物起始的核酸扩增、分支延伸扩增法或用于核酸扩增的其他的合适方法的扩增反应来实现扩增。扩增可以包括靶核酸的同步实时检测。

术语“PCR片段”或“扩增子”指特定的靶核酸扩增之后产生的多核苷酸分子（或多个分子的集合）。PCR片段典型地是但不限于DNA PCR片段。PCR片段可以是单链或双链或者它们任意浓度比的混合物。PCR片段可以是100-500个核苷酸长或更长。

扩增“缓冲液”是添加到扩增反应中的化合物，它通过调节扩增反应来改变扩增反应的一种或多种组分的稳定性和/或活性。本发明的缓冲剂与PCR扩增和RNA酶H的切割活性兼容。缓冲液的示例包括但不限于HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、MOPS（3-(N-吗啉基)-丙磺酸）以及含有缓冲液的乙酸或磷酸等。另外，PCR缓冲液可通常包含高达大约70mM KCl和大约1.5mM或更高的MgCl₂以及大约50-200μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种。本发明的缓冲液可以包含添加剂以优化逆转录PCR或PCR反应的效率。

添加剂是加入组合物的化合物，其改变组合物的一种或多种组分的稳定性和/或活性。在某些实施例中，组合物是扩增反应组合物。在某些实施例中，添加剂使污染物酶失活、稳定蛋白质折叠和/或减少聚集。在扩增反应中可以包含的示例性添加剂包括但不限于三甲铵乙内酯、甲酰胺、KCl、CaCl₂、MgOAc、MgCl₂、NaCl、NH₄OAc、NaI、Na(CO₃)₂、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲基亚砜（“DMSO”）、丙三醇、乙二醇、二硫苏糖醇（“DTT”）、焦磷酸酶（包括但不限于嗜酸热原体无机焦磷酸酶（Thermoplasmaacidophilum inorganic pyrophosphatase）（“TAP”））、牛血清白蛋白（“BSA”）、丙二醇、甘氨酰胺、CHES、Percoll、金精三羧酸、Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween85、Brij30、NP-40、Triton X-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、LDAO（N-十二烷基-N,N-二甲胺-N-氧化物）、两性洗涤剂3-10、Xwittergent3-14、Xwittergent SB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、大肠杆菌SSB、RecA、切口内切酶（nicking endonuclease）、7-deazaG、dUTP、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性洗涤剂、固醇、渗透剂、阳离子以及任何其他可以改变扩增效率的化学制品、蛋白质或辅因子。在某些实施例中，两种或多种添加剂包括在扩增反应中。如果添加剂不干扰RNA酶H的活性，则可以选择地添加该添加剂以改善引物退火的选择性。

如这里所使用，应用于酶的术语“热稳定”是指在升高的温度下（例如，在55℃或更高）保持其生物活性或者在加热和冷却的重复循环之后保持其生物活性的酶。热稳定的多核苷酸聚合酶特别适用于PCR扩增反应。

如这里所使用，“热稳定聚合酶”是对热相对稳定并且不需要在每个PCR循环之前添加的酶。热稳定聚合酶的非限制性示例可以包括从Thermusaquaticus（栖热水生菌）（Taq聚合酶）、Thermus thermophilus（嗜热栖热菌）（Tth聚合酶）、Thermococcus litoralis（嗜热高温球菌）（Tli或VENT聚合酶）、Pyrococcus furiosus（Pfu或DEEPVENT聚合酶）、Pyrococcus woosii（Pwo聚合酶）和其他火球菌种、Bacillus stearothermophilus（嗜热脂肪芽孢杆菌）（Bst聚合酶）、Sulfolobus acidocaldarius（嗜酸热硫化叶菌）（Sac聚合酶）、Thermoplasma acidophilum（嗜酸热原体）（Tac聚合酶）、Thermus rubber（Tru聚合酶）、Thermus brockianus（DYNAZYME聚合酶）、Thermotoga neapolitana（新阿波罗栖热袍菌）（Tne聚合酶）、Thermotoga maritime（海栖热袍菌）（Tma）和Thermotoga属的其他种（Tsp聚合酶）以及Methanobacteriumthermoautotrophicum（甲烷杆菌）（Mth聚合酶）的嗜热细菌分离的聚合酶。PCR反应可以包含多于一种的具有互补性质的热稳定聚合酶，以对靶序列进行更有效的扩增。例如，具有高持续合成性（复制大核苷酸片段的能力）的核苷酸聚合酶可以与具有校正功能（在靶核酸序列延伸过程中改正错误的能力）的另一种核苷酸聚合酶互补，因此产生能够高保真地复制长的靶序列的PCR反应。热稳定聚合酶可以以其原型形式使用。可选择地，可以修改聚合酶以包含酶的片段或者包含提供有利于PCR反应的有益性质的突变。在一个实施例中，热稳定聚合酶可以是Taq聚合酶。已知许多性质提高的Taq聚合酶的变异体，包括AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel片段、SuperTaq、SuperTaq plus、LA Taq、LApro Taq和EX Taq。

研究基因表达的最广泛使用的技术之一是利用mRNA序列的第一链cDNA作为模板进行通过PCR的扩增。该方法通常被称作逆转录-PCR，其利用了PCR程序的高灵敏度和高特异性并被广泛用于RNA的检测和定量。

执行为终点测定或实时测定的逆转录-PCR程序包括两个独立的分子合成：（i）从RNA模版合成cDNA；以及（ii）通过PCR扩增复制新合成的cDNA。为试图解决经常与逆转录-PCR相关的技术问题，考虑到该程序的三个基本步骤，已经形成了一些操作规程：（a）RNA的变性和反向引物的杂交；（b）cDNA的合成；以及（c）PCR扩增。在所谓的“未结合”逆转录-PCR程序（例如，两步逆转录-PCR）中，使用对逆转录酶活性来讲最佳的缓冲液条件，作为单独的步骤来执行逆转录。合成cDNA之后，稀释反应物以将MgCl₂和脱氧核苷三磷酸（dNTP）的浓度降低到对Taq DNA聚合酶活性来讲最佳的条件，根据标准条件执行PCR（参见第4,683,195号和第4,683,202号美国专利）。相反，“结合”逆转录PCR方法使用对于逆转录酶和Taq DNA聚合酶的活性来讲通用的缓冲液。在一种情况下，反向引物的退火是加酶之前的单独步骤，然后将酶加到单独的反应器中。在另一种情况下，逆转录酶活性是热稳定TthDNA聚合酶的组成部分。在Mn²⁺的存在下执行退火和cDNA合成，然后，在通过螯合剂除去Mn²⁺之后，在Mg²⁺的存在下执行PCR。最后，“连续”方法（例如，一步逆转录-PCR）将三个逆转录-PCR步骤整合为单个连续反应，避免了为加入组分或酶而打开反应管。连续逆转录-PCR已经被描述为使用热稳定Taq DNA聚合酶和Tth聚合酶的逆转录酶活性的单酶体系以及使用AMV逆转录酶和Taq DNA聚合酶的二酶体系，其中，省略了初始的65℃RNA变性的步骤。

实时逆转录PCR的第一步是使用模板特异DNA引物中的一个来产生互补DNA链。在传统PCR反应中，将该产物变性，将第二模板特异引物键合到cDNA，并延伸以形成双链DNA。在后续的温度循环中扩增该产物。为了维持最高的灵敏度，重要的是在cDNA合成之前使RNA不被降解。由于在该程序的第一步中形成的RNA:DNA杂交物可以用作RNA酶H的底物，所以在反应缓冲液中存在RNA酶H将导致在该程序的第一步中形成的RNA:DNA杂交物被不希望地降解。防止该问题有两种主要的方法。一种方法是使用诸如蜡的屏障将RNA酶H与其余的逆转录反应物物理地隔开，其中，蜡将在开始的高温DNA变性步骤中熔化。第二种方法是改进RNA酶H，使其在典型地为45℃-55℃的逆转录温度下失活。本领域内已知的几种方法包括使RNA酶H与抗体反应或者进行可逆的化学修饰。例如，如这里所使用的热启动RNA酶H活性可以是在碱性条件下RNA酶H与顺式乌头酸酐反应之后产生的具有可逆化学修饰的RNA酶H。当将改进的酶用在利用Tris基缓冲液的反应中并将温度升高至95℃时，溶液的pH下降并且RNA酶H活性恢复。该方法允许在逆转录开始之前将RNA酶H包含于反应混合物中。

Walder等人的第2009/0325169号美国专利申请中描述了可以在本发明中使用的RNA酶H酶和热启动RNA酶H酶的另外的示例，通过引用将该美国专利申请的内容全部包含于此。

一步逆转录-PCR相比于未结合逆转录-PCR具有几点优点。一步逆转录-PCR对反应混合试剂和核酸产物的处理比未结合逆转录-PCR（例如，在两个反应步骤之间为了加入组分或酶打开反应管）更少，因此劳动强度更小，减少了所需的人时（person hour）数。一步逆转录-PCR还降低了被污染的风险。已经证明一步逆转录-PCR的灵敏度和特异性非常适合研究给定样品中的一个到若干个基因的表达水平或病原体RNA的检测。典型地，这种程序已经被限于使用基因特异引物来开始cDNA合成。

结合这些逆转录-PCR技术通过实时检测来测量PCR反应动力学的能力使得能够以高灵敏度准确且精确地确定RNA的拷贝数。通过在扩增过程中通过荧光双重标记杂交探针技术（例如，下面讨论的5'荧光核酸酶测定（“Taq-Man”）或核酸内切酶测定（有时被称作“CataCleave”））荧光监测和测量PCR产物来检测逆转录PCR产物，使以上技术变得可能。

后扩增扩增子的检测费时费力。已经开发了实时方法来对PCR程序中的扩增进行监测。这些方法典型地使用键合到新合成DNA的荧光标记探针或在插入双链DNA时荧光发射增加的染料。

通常将探针设计成在没有目标的情况下，通过两个发色团之间的荧光共振能量转移（FRET）使供体发射淬灭。当供体发色团和受体发色团非常接近时，处于激发态的供体发色团可以将能量转移给受体发色团。这种转移常常是非辐射的，并通过偶极-偶极结合发生。充分地增加发色团之间的距离的任何过程将降低FRET的效率，从而可以辐射地检测到供体发色团的发射。常见供体发色团包括FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5和德克萨斯红。选择受体发色团使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的供体发色团和受体发色团的示例是FAM-TAMRA。也存在将淬灭宽范围供体的非荧光受体。合适的供体-受体FRET对的其他示例对本领域技术人将是已知的。

能够用于PCR实时检测的FRET探针的常见示例包括分子信标（例如，第5,925,517号美国专利）、TaqMan探针（例如，第5,210,015号和第5,487,972号美国专利）和CataCleave探针（例如，第5,763,181号美国专利）。分子信标是单链寡核苷酸，其被设计成使得在未结合状态下探针形成供体发色团和受体发色团非常接近并且供体发射减少的二级结构。在合适的反应温度下，信标展开并特异性地结合到扩增子。一旦展开，供体发色团和受体发色团之间的距离增加，从而FRET反转并且可以使用专用设备来监测供体的发射。TaqMan和CataCleave技术与分子信标不同之处在于：使用的FRET探针被切割，从而供体发色团和受体发色团变得充分分开以使FRET反转。

TaqMan技术使用5'端标记有供体发色团并且3'端标记有受体发色团的单链寡核苷酸探针。用于扩增的DNA聚合酶必须包含5'->3'的核酸外切酶活性。TaqMan探针结合到扩增子的一条链，同时引物结合。随着DNA聚合酶延伸引物，聚合酶将最终与结合的TaqMan探针相遇。这时，聚合酶的核酸外切酶活性将从5'端开始顺序地降解TaqMan探针。随着探针被消化，包含探针的单核苷酸被释放到反应缓冲液中。供体扩散离开受体，而FRET被反转。监测来自供体的发射以确定探针的切割。由于TaqMan的作用方式，对于每个PCR循环，只可以监测到一次特异扩增子。引物通过TaqMan靶位点的延伸产生了双链产物，其防止了TaqMan探针的再次结合，直到扩增子在下一个PCR循环中被变性。

第5,763,181号美国专利描述了另一实时检测方法（称作“CataCleave”），通过引用将该美国专利的内容包含于此。CataCleave技术与TaqMan不同之处在于：由不具有聚合酶活性的第二酶完成探针的切割。CataCleave探针在分子内具有作为诸如限制酶或RNA酶的核酸内切酶的目标的序列。在一个实施例中，CataCleave探针具有嵌合结构，其中，探针的5'端和3'端由DNA构成并且切割位点包含RNA。探针的DNA序列部分在端部或内部标记有FRET对。PCR反应包括将RNA-DNA双链体的RNA序列部分特异性切割的RNA酶H酶。切割之后，探针的两段在反应温度下从靶扩增子分离下来并扩散到反应缓冲液中。随着供体和受体分开，FRET以与TaqMan探针相同的方式反转，并可以监测供体的发射。切割和分离再次产生用于CataCleave再次结合的位点。以这种方式，单个扩增子能够用作探针切割的多次循环或目标，直到引物延伸通过CataCleave探针结合位点。

在实施例中，本方法中使用的探针是CataCleave探针。合适的CataCleave探针的示例包括包含SEQ ID NO:21、22、10、11、12、13和14中一个序列的寡核苷酸。

在实施例中，用于检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒包括上述寡核苷酸。

试剂盒还可以包括用于核酸扩增的试剂。该试剂还可以包括从由dNTP、rNTP、核酸聚合酶、尿嘧啶N-糖基化（UNG）酶、缓冲液和辅因子（例如，Mg²⁺）组成的组中选择的至少一种。核酸聚合酶可以选自于由DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶组成的组。核酸聚合酶可以是热稳定的。核酸聚合酶可以在升高的温度下，例如在95℃或更高的温度下维持其活性。热稳定DNA聚合酶可以从由Thermus aquaticus、Thermus flavus、Thermus ruber、Thermusthermophilus、Bacillus stearothermophilus、Thermus lacteus、Thermus rubens、Thermotoga maritima、Thermococcus littoralis和Methanothermus fervidus组成的组中选择的耐热细菌中分离。热稳定DNA聚合酶的示例是Taq聚合酶。已知Taq聚合酶在大约70℃具有最佳活性。

当探针与靶DNA杂交时，李斯特氏菌检测试剂盒还可以包括特异性切割DNA-RNA杂交体的RNA部分的因子。切割因子可以是RNA酶H。切割因子可以特异性或非特异性切割RNA部分。特异性RNA切割因子可以是RNA酶HI。非特异性RNA切割因子可以是RNA酶HII。RNA酶H可以水解RNA-DNA杂交体中的RNA。对RNA酶H活性而言，需要二价离子（例如，Mg²⁺、Mn²⁺）。RNA酶H切割RNA3'-O-P键以产生3'-羟基端和5'-磷酸端的产物。RNA酶H可以选自于由Pyrococcus furiosus RNA酶HII、Pyrococcushorikoshi RNA酶HII、Thermococcus litoralis RNA酶HI和Thermusthermophilus RNA酶HI组成的组。Pyrococcus furiosus RNA酶HII可以具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列。RNA酶H可以是热稳定的。例如，RNA酶H可以在PCR的变性程序中保持其活性。切割因子可以是热稳定RNA酶HII的可逆的修饰形式，其处于其修饰形式时失活，而处于其未修饰形式时具有活性，其中，修饰是RNA酶HII与配体的结合、RNA酶HII的交联或RNA酶HII中的氨基酸残基的化学反应，其中，通过加热包含RNA酶HII的样品或者调节包含RNA酶HII的样品的pH使修饰的RNA酶HII的酶活性恢复。

当包含DNA序列和RNA序列的探针的RNA部分被切割因子切割时，可以发生分离。这样的分离可以由于切割的复合体的解链温度的降低而自然发生，或者可以通过诸如温度升高的因素促进这样的分离。可以通过本领域内已知的任何方法检测分离的片段。

在实施例中，检测样品中的李斯特氏菌的方法包括：（a）扩增样品中李斯特氏菌的靶核酸以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ ID NO:19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到样品中的靶核酸以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；（b）使靶核酸与能够杂交到靶核酸的至少一种探针寡核苷酸杂交，以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包含RNA序列和DNA序列并结合到可检测标记物；（c）使靶核酸:探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从靶核酸分离；以及（d）检测可检测标记物。

可以通过使用诸如聚合酶链式反应的任何核酸扩增方法或者通过使用诸如连接酶链式反应、自主维持序列复制、链替代扩增、转录扩增系统、Q-β复制酶、基于核酸序列的扩增（NASBA）、切割片段长度多态性、等温和嵌合引物起始的核酸扩增、分支延伸扩增法或用于核酸扩增的其他的合适方法的扩增反应来执行样品中靶序列的扩增。

在实施例中，本方法包括：扩增李斯特氏菌的靶核酸片段，扩增包括将从SEQ ID NO:1-3中选择的至少一种引物和从SEQ ID NO:5-9中选择的至少一种引物杂交到样品中的靶核酸以获得杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的引物以产生延伸的引物产物；将靶核酸片段杂交到从由SEQ ID NO:10-14的寡核苷酸组成的组中选择的至少一种探针，以获得杂交产物；使来自靶核酸片段与探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从杂交产物分离；以及检测可检测标记物。

现在将在下文中更详细地描述本方法。本方法包括扩增李斯特氏菌的靶核酸片段，扩增包括：将从SEQ ID NO:1-3中选择的至少一种引物和从SEQID NO:5-9中选择的至少一种引物杂交到样品中的靶核酸以获得杂交产物；以及使用依赖模板的核酸聚合酶基于模板延伸杂交产物的引物以产生延伸的引物产物。

杂交可以在液体介质中进行。可以根据需要选择合适的液体介质。例如，液体介质可以是水、缓冲液或PCR混合物。缓冲液的非限制性示例包括PBS、Tris、MOPS和三甲基甘氨酸（Tricine）。可以在有助于引物与靶核酸结合的条件下，例如在低温和低盐浓度下进行杂交。有助于杂交的那些条件在本领域内已知。靶核酸可以是单链核酸或双链核酸。例如，双链靶核酸可以变性成为分离的单链。靶核酸可以是DNA或RNA。

引物基于模板的延伸是指本领域内已知的聚合。核酸聚合酶可以是热稳定的。

检测李斯特氏菌的方法包括将靶核酸片段杂交到从由SEQ ID NO:10-14的寡核苷酸组成的组中选择的至少一种探针以获得杂交产物。可以使用如上所述的探针。可以用诸如光学可检测标记物的可检测标记物来标记探针。可检测标记物在本领域内已知，并且可以合适地选择可检测标记物。例如，在本发明的实施例中，FRET对可以用于检测靶序列的目的。

可以在液体介质中进行杂交。可以根据需要选择合适的液体介质。例如，液体介质可以是水、缓冲液或PCR混合物。缓冲液的非限制性示例包括PBS、Tris、MOPS（3-(N-吗啉基)丙磺酸）和三甲基甘氨酸。可以在有助于单链核酸探针与靶核酸结合的条件下，例如在低温和低盐浓度下进行杂交。有助于杂交的那些条件在本领域内已知。靶核酸可以是单链核酸或双链核酸。例如，如上所述，双链靶核酸可以变性成为分离的单链。靶核酸可以是DNA或RNA。

检测李斯特氏菌的方法包括使来自靶核酸片段与探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从杂交产物分离。杂交产物和RNA酶H可以在液体介质中彼此接触。可以根据需要选择合适的液体介质。例如，液体介质可以是水、缓冲液或PCR混合物。缓冲液的非限制性示例包括PBS、Tris、MOPS（3-(N-吗啉基)丙磺酸）和三甲基甘氨酸。可以在与PCR条件基本相同的条件下或在PCR混合物中进行接触。RNA酶H可以是RNA酶HI或RNA酶HII。RNA酶H可以水解RNA-DNA杂交体中的RNA。对RNA酶H活性而言，需要二价离子（例如，Mg²⁺、Mn²⁺）。RNA酶H切割RNA3'-O-P键以产生3'-羟基端和5'-磷酸端的产物。RNA酶H可以选自于由Pyrococcusfuriosus RNA酶HII、Pyrococcus horikoshi RNA酶HII、Thermococcus litoralisRNA酶HI和Thermus thermophilus RNA酶HI组成的组。Pyrococcus furiosusRNA酶HII可以具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列。RNA酶H可以是热稳定的。例如，RNA酶H可以在PCR的变性程序中保持其活性。RNA酶H可以是热稳定RNA酶HII的可逆修饰形式，其处于其修饰形式时失活，而处于其未修饰形式时具有活性，其中，修饰是RNA酶HII与配体的结合、RNA酶HII的交联或RNA酶HII的化学修饰，其中，通过加热包含RNA酶HII的样品或者调节包含RNA酶HII的样品的pH使修饰的RNA酶HII的酶活性恢复。

这样的分离可以是由于切割使链的结合力减弱而自然发生，或者可以通过诸如温度升高的因素促进这样的分离。例如，PCR混合物可以包括将特异性切割RNA-DNA双链体的RNA序列部分的RNA酶H。切割之后，探针的两段在反应温度下从靶扩增子分离下来并扩散到反应缓冲液中。由于供体和受体分开，FRET反转，并且可以监测供体的发射。切割和分离再次产生用于探针再次结合的位点。以这种方式，单个扩增子能够用作探针切割的多次循环或目标，直到引物延伸通过探针结合位点。

检测李斯特氏菌的方法包括检测探针核酸片段。可以通过根据可检测标记物合适地选择的各种方法中的任何方法进行探针核酸片段的检测。在整个说明书中，术语“可检测标记物”与“可检测标签”可交换地使用。例如，可以分析反应产物的尺寸来检测标记的探针片段。可以通过任何已知的方法，例如凝胶电泳、梯度沉降、尺寸排阻色谱法或同系层析法执行对探针核酸片段大小的分析。当使用的可检测标签是FRET对时，可以通过光谱学原位鉴定标记的探针片段，无需执行尺寸分析。因此可以实现标记的探针片段的实时检测。

检测李斯特氏菌的方法还可以包括在扩增程序之前，在富集培养基中培养包含李斯特氏菌种的样品以增强李斯特氏菌种的生长。

用于培养的富集培养基可以具有以下特征。富集培养基可以不包含从七叶苷和蛋白胨中选择的至少一种。在另一个实施例中，只要七叶苷不干扰根据本发明的实施例执行的任何步骤，例如，靶序列的扩增或通过切割标记探针检测靶序列以及检测切割的标记探针，则富集培养基可以包含七叶苷。富集培养基可以是用于增强李斯特氏菌种生长的培养基，其包含每1L蒸馏水大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、大约1g至大约10g的酵母提取物（YE）以及大约1g至大约15g的氯化锂。富集培养基还可以包含从由以下组分组成的组中选择的至少一种组分：大约1g至大约10g的牛肉膏（BE）或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；以及大约0.01g至大约1g的柠檬酸铁铵。富集培养基还可以包含缓冲化合物。缓冲化合物可以包括3-(N-吗啉基)丙磺酸（MOPS）游离酸及钠盐。例如，富集培养基可以包含大约4g的MOPS游离酸和大约7.1g的MOPS钠。可选择地，富集培养基可以包含大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约10mg至大约30mg的头孢他啶以及大约10mg至大约60mg的萘啶酸。

富集培养基可以是这样的培养基，其包含每1L蒸馏水：大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、大约1g至大约10g的酵母提取物（YE）、大约1g至大约10g的氯化锂；大约1g至大约10g的牛肉膏（BE）和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0.01g至1g的柠檬酸铁铵；大约4g的MOPS游离酸和大约7.1g的MOPS钠；以及大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约10mg至大约30mg的头孢他啶。例如，富集培养基可以是包含30g的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、6g的酵母提取物、1g的七叶苷、10g的LiCl、2g的丙酮酸钠、0.1g的柠檬酸铁铵、4g的MOPS游离酸、7.1g的MOPS钠、5g的牛肉膏以及包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的大约0.5%至大约3%的维生素混合物的培养基；或者可以是这样的培养基（有时称作A2.2培养基），其包含每1L蒸馏水：大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、大约6g的酵母提取物（YE）、大约1g至大约10g的氯化锂；5g的牛肉膏（BE）和/或包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；2g的丙酮酸钠；大约0.1g的柠檬酸铁铵；大约4g的MOPS游离酸和大约7.1g的MOPS钠；大约5mg的吖啶黄、大约10mg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他啶。使用这样的富集培养基可以消除或减少培养产物中的PCR抑制剂并且在抑制背景微生物群生长的同时促进李斯特氏菌种的生长，由此能够有效地检测样品中的李斯特氏菌。

富集培养基可以是BHI（脑心浸出）肉汤，BHI肉汤可以以其原成分使用或者补充有诸如氯化钠和/或磷酸二钠的微量成分。BHI可以在诸如

或

的不同的商品名下从不同的来源购得。富集培养基也可以是补充或未补充0.6%的酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。

检测靶李斯特氏菌序列的示例性方案可以包括以下步骤：提供食物样品或表面拭样，将样品或拭样与生长培养基混合并温育以增加李斯特氏菌的数量或种群（“富集”），破碎李斯特氏菌细胞（“裂解”），以及将获得的裂解物进行扩增并检测靶Salmonella（沙门氏菌）序列。食物样品可以包括但不限于诸如烟熏三文鱼的鱼、乳制品（例如，牛奶和奶酪）和液蛋、家禽、果汁、肉（例如，猪肉糜、猪肉、牛肉糜或牛肉）或熟肉、诸如菠菜的蔬菜或者诸如不锈钢、橡胶、塑料和陶瓷的环境表面。根据菌落形成单位（CFU）的数目描述食品污染物的检测极限（LOD），可以在25g固体食物或25mL液体食物中或者在限定面积的表面上检测CFU。根据定义，菌落形成单位是活菌数目的测量。与对死亡和存活的所有细胞计数的间接显微计数不同，CFU测量活细胞。一个CFU（一个细菌细胞）将在允许的条件下在琼脂板上生长形成单个菌落。美国食品检测检验部门（United States Food Testing InspectionService）将最小LOD限定为1CFU/25g固体食物或25mL液体食物或者1CFU/表面积。

在实践中，不可能用单个CFU再接种食物样品或表面并确保细菌在富集过程中存活。通过以一个或多个目标水平接种样品并使用称作最可能数（MNP）的污染物的统计学评估分析该结果来克服这个问题。作为示例，可以通过在分光光度计中测量吸光度使李斯特氏菌培养菌生长到特定细胞密度。将十倍连续稀释的对象涂布到琼脂培养基上并对活细菌计数。使用该数据绘制CFU/涂布量相对于细胞密度的标准曲线。为了使MPN有意义，分析多个接种水平的试样。富集和提取之后，取出少量的样品用于实时分析。最终目标是获得25%和75%之间的部分回收（fractional recovery）（即，在使用采用CataCleave探针的RT-PCR的测定中，样品测试阳性在25%和75%之间，这将在下面进行描述）。选择这些部分回收百分比的原因在于，这些部分回收百分比转换为对于25g固体食物样品、25mL液体食物样品或表面的限定面积而言在0.3CFU和1.375CFU之间的MPN值。这些MPN值涵盖了所需的1CFU/样品的LOD。通过实践，能够评估稀释接种物的量（基于标准曲线）以获得这些部分回收。

附图说明

图1是示出了对于李斯特氏菌核酸的浓度的实时聚合酶链式反应（PCR）的结果的曲线图；

图2是示出了实时PCR扩增产物的Cp值与李斯特氏菌核酸的浓度的相关性的曲线图；

图3是对于扩增内标（IAC）靶核酸的浓度的实时PCR扩增结果的曲线图；

图4是示出了实时PCR扩增产物的Cp值与IAC靶核酸的浓度的相关性的曲线图；

图5是示出了对92株李斯特氏菌种的实时PCR结果（包容性测试）的曲线图；

图6是示出了对非李斯特氏菌种的实时PCR结果（排他性测试）的曲线图；

图7是示出了实时PCR产物与L.monocytogenes（单核细胞增生性李斯特氏菌）的细胞数目的相关性的曲线图；

图8是示出了在不同的缓冲液中通过使用RNA酶H的一步RT-PCR扩增李斯特氏菌23S rRNA的结果的曲线图；

图9是示出了使用Tfi缓冲液和AgPath缓冲液执行RT-PCR的结果的曲线图；

图10（A）-图10（C）示出了当通过在RT-PCR之前对样品进行培养而使其富集时检测靶RNA的敏感度的增加。

具体实施方式

将参照以下示例更详细地描述各种实施例。这些示例仅为了说明性目的而不意图限制本发明的范围。

示例1：使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针对李斯特氏菌（Listeria spp.）进行的实时PCR扩增

使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针根据实时PCR扩增对样品中的李斯特氏菌的靶核酸进行扩增和检测。

（1）标准曲线和检测极限

确定使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针对李斯特氏菌进行的实时PCR扩增与李斯特氏菌的浓度的相关性。

在PCR中将用缓冲液从10⁴倍至10¹⁰倍连续10倍稀释的包括Listeriamonocytogenes（单核细胞增生性李斯特氏菌）的23S rDNA的10¹³拷贝/ml的质粒用作模板。在RNA酶H的存在下执行PCR以在PCR过程中引起探针的切割。实时测量得到的探针片段。

PCR混合物的组分和PCR条件如下。表1是反应混合物的组分：

表1

组分	μL，每25μL反应物中
		10×ICAN PCR缓冲液	2.5

正向引物（20μM）	0.5
		反向引物（20μM）	0.5
CataCleave探针（5μM）	1
		dN/UTP,2/4mM	1
Taq聚合酶（5单位/L）	0.5
		UNG（10单位/L）	0.1
RNA酶H II（5单位/L）	0.2
		DNA模板	2
水	16.70

在表1中，1×ICAN PCR缓冲液表示包含32mM HEPES（pH7.8，用浓缩KOH滴定）、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、1%DMSO和0.11%BSA的缓冲液；正向引物和反向引物表示SEQ ID NO.3和7的引物；CataCleave探针表示5'端标记有FAM并且3'端标记有用于短波长发射的Iowa Black FQ（黑洞淬灭剂）的SEQ ID NO.12的探针。将作为模板DNA的纯化的质粒与引物混合。Pfu RNA酶HII表示来自于Pyrococcus furiosus的RNA特异性热稳定的RNA酶HII酶。表2是反应条件：

表2

图1和图2中示出了结果。图1是示出了用SEQ ID NO:3和7的引物对以及SEQ ID NO:12的CataCleave探针的实时PCR能够在40个或更少的扩增循环内检测李斯特氏菌基因组DNA的信号拷贝的曲线图。图2是示出了实时PCR扩增产物的Cp值与靶核酸浓度的相关性的曲线图。

（2）包容性测试

对于包容性测试，在35℃于脑心浸出培养基中过夜培养代表全部6种李斯特氏菌种（Listeria species）的92个李斯特氏菌菌株。于45μL CZ裂解溶液（0.3125mg/ml NaN₃、12.5mM Tris（pH8）、0.25%CHAPS和1mg/ml蛋白酶K）中在55℃提取5μL的测试细胞悬液15min，随后在95℃提取10min。使用2μL得到的裂解物作为模板。下面的表3列出了一些测试菌株的名字。表3是用于包含性测试的一些李斯特氏菌菌株的列表。

表3

李斯特氏菌种	血清型	菌株
			Listeria monocytogenes	1/2c	CDL36
Listeria monocytogenes	1/2c	CDL37
			Listeria monocytogenes	1/2c	CDL38
Listeria monocytogenes	3a	CDL39
			Listeria monocytogenes	3a	CDL41
Listeria monocytogenes	3b	CDL42
			Listeria monocytogenes	3b	CDL43
Listeria monocytogenes	3b	CDL45
			Listeria monocytogenes	3c	CDL47
Listeria monocytogenes	3c	CDL48
			Listeria monocytogenes	3c	CDL49
Listeria monocytogenes	3c	CDL50
			Listeria monocytogenes	4a	CDL51
Listeria monocytogenes	4a	CDL111
			Listeria monocytogenes	1/2b	CDL112
Listeria monocytogenes	1/2c	CDL113
			Listeria monocytogenes	3b	CDL114
Listeria monocytogenes	3b	CDL115
			Listeria monocytogenes	1/2a	CDL116
Listeria monocytogenes	4a	CDL117
			Listeria monocytogenes	4b	CDL118
Listeria monocytogenes	4d/e	CDL120
			Listeria monocytogenes	7	CDL122
Listeria monocytogenes	4b	CDL123
			Listeria monocytogenes	1/2b	CDL125
Listeria monocytogenes	1/2b	CDL128

Listeria monocytogenes	1/2b	CDL131
			Listeria monocytogenes	1/2b	CDL132
Listeria monocytogenes	4b	CDL136
			Listeria monocytogenes	4b	CDL137
Listeria monocytogenes	4b	CDL138
			Listeria monocytogenes	4b	CDL139
Listeria monocytogenes	4b	CDL140
			Listeria monocytogenes	1/2b	CDL142
Listeria monocytogenes	1/2b	CDL143
			Listeria monocytogenes	1/2a	CDL144
Listeria monocytogenes	1/2a	CDL145
			Listeria monocytogenes	1/2b	CDL147
Listeria monocytogenes	3b	CDL149
			Listeria monocytogenes	1/2c	ATCC19112、CWD106
Listeria monocytogenes	4c	ATCC19116、CWD108
			Listeria monocytogenes	4b	CWD1559
Listeria monocytogenes	3b	CWD1591
			Listeria monocytogenes	1/2b	CWD1597
Listeria monocytogenes	3b	CWD1600
			Listeria monocytogenes	1/2a	CWD1609
Listeria monocytogenes	4b	ATCC51414、CWD104
			Listeria monocytogenes	4d	ATCC19117、CWD109
Listeria monocytogenes	4e	ATCC19118、CWD110
			Listeria monocytogenes	1/2a	CWD72
Listeria innocua	6a	CDL191
			Listeria innocua	4ab	CDL192
Listeria innocua	6b	CDL236
			Listeria innocua	6a	CDL237
Listeria innocua	6a	CDL240
			Listeria innocua	6b	CDL241
Listeria innocua	4ab	CDL259
			Listeria innocua		L80/20

Listeria innocua		L80/22
			Listeria innocua		L80/24
Listeria innocua		L82/14
			Listeria innocua		L82/16
Listeria innocua		L82/18
			Listeria innocua	6a	DA-20、CWD181
Listeria welshimeri	6a	CDL209
			Listeria welshimeri	6b	CDL243
Listeria welshimeri		L82/2、LFD5121
			Listeria welshimeri		L82/10、LFD5125
Listeria welshimeri		L21/44、LFD782
			Listeria welshimeri		L21/46、LFD783
Listeria welshimeri		L21/40、LFD860
			Listeria welshimeri	6a	ATCC35897、CWD114
Listeria seeligeri	1/2b	CDL84
			Listeria seeligeri	4c	CDL98
Listeria seeligeri	1/2b	ATCC35967、CWD166
			Listeria ivanovii	5	L45/74、LFD2949
Listeria ivanovii		L24/6
			Listeria ivanovii		L24/22、LFD891
Listeria ivanovii	5	ATCC19119、CWD164
			Listeria grayi		ATCC25400、CWD671
Listeria grayi		ATCC25401、CWD673
			Listeria grayi		ATCC25402、CWD20
Listeria grayi		ATCC25403、CWD672
			Listeria grayi		ATCC19120、CWD2091

在SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的存在下进行实时PCR。PCR条件和PCR混合物组分分别与表1和表2中相同。

实验中共使用了92株李斯特氏菌种：59株L.monocytenges以及33株包括L.innocua（英诺克李斯特氏菌）、L.ivanovii（伊氏李斯特氏菌）、L.welshimeri（威尔斯李斯特氏菌）、L.seeligeri（西尔李斯特氏菌）和L.grayi（格氏李斯特氏菌）的其他李斯特氏菌种。使用未包含DNA模板的PCR混合物作为阴性对照组。

图5是示出了对92株李斯特氏菌种的实时PCR结果的曲线图。参照图5，5个L.grayi菌株中仅一个具有高的Cp值，其他菌株在使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的实时PCR中被有效地检测到。该结果表明使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的实时PCR测定对李斯特氏菌菌株是高度特异的。

（3）排他性测试

对于排他性测试，在脑心浸出培养基中将非李斯特氏菌种培养至它们的最大密度。于45μL CZ裂解溶液（0.3125mg/ml NaN₃、12.5mM Tris（pH8）、0.25%CHAPS和1mg/ml蛋白酶K）中在55℃提取5μL的测试细胞悬液15min，随后在95℃提取10min。使用2μL得到的裂解物作为模板。除了使用非李斯特氏菌种之外，PCR条件和PCR混合物组分分别与表1和表2中相同。

实验中使用的非李斯特氏菌种包括以下细菌：Bacillus mycoides（蕈状芽胞杆菌）、Brochothrix campestris、Carnobacterium divergens（广布肉杆菌）、Carnobacterium malaroma、Enterobacter aerogenes（产气肠杆菌）、Enterobactercancerogenus（生癌肠杆菌）、Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）、Enterobacterintermedia、Enterobacter sakazkii（阪崎肠杆菌）、Escherichia coli（大肠杆菌）、Escherichia coli O157:H7、Klebsiella pneumoniae（肺炎杆菌）、Kurthia zopfii（左氏库特氏菌）、Lactococcus lactis（乳酸乳球菌）、Proteus hauseri（豪式变形菌）、Proteus mirabilis（奇异变形杆菌）、Proteus vulgaris（普通变形杆菌）、Rhodococcus aqui、Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）、Staphylococcsaprophyticus（腐生葡萄球菌）、Streptococcus agalactiae（无乳链球菌）、Streptococcus dysgalactiae（停乳链球菌）和Streptococcus sanguinis（血红链球菌）。使用包含靶基因片段的质粒作为阳性对照。表4是用于排他性测试的被测微生物的列表。

表4

微生物	来源（菌株）	起源	生长温度（℃）
				Bacillus mycoides	ATCC10206	未知	30

Brochothrix campestris	ATCC43754	土壤	26
				Carnobacterium divergens	ATCC35677	牛肉	30
Carnobacterium gallinarum	ATCC49517	鸡肉	26
				Carnobacterium maltaromaticum	ATCC43224	牛肉	26
Enterobacter aerogenes	ATCC13048	唾液	37
				Enterobacter cancerogenus	ATCC35317	人类	37
Enterobacter cloacae	ATCC13047	脊髓液	37
				Enterobacter intermedia	ATCC33110	水	37
Enterobacter sakazakii	ATCC BAA-894	人类	37
				Erysipelothrix rhusiopathiae	ATCC19414	猪肉	37
Escherichia coli	ATCC11303		37
				Escherichia coli O157:H7	ATCC43895	肉类	37
Klebsiella pneumoniae	ATCC13883		37
				Kurthia zopfii	ATCC33403	火鸡	26
Lactobacillus casei	ATCC393	奶酪	37
				Lactobacillus plantarum	ATCC10012	未知	37
Lactococcus lactis	ATCC11454	未知	37
				Micrococcus aurantiacus	ATCC11731	未知	37
Propionibacterium freudenreichii	ATCC13673	未知	30
				Proteus hauseri	ATCC13315		37
Proteus mirabilis	ATCC35659		37
				Proteus vulgaris	ATCC33420	临床分离	37
Rhodococcus equi	ATCC10146	马	37
				Staphylococcus aureus	ATCC10832	未知	37
Staphylococcus epidermidis	ATCC12228	未知	37
				Staphylococcus saprophyticus	ATCC15305	尿	37
Streptococcus agalactiae	ATCC12386	未知	37
				Streptococcus dysgalactiae	ATCC12388	人类	37
Streptococcus sanguinis	ATCC10556	人类	37

图6是示出了对非李斯特氏菌种的实时PCR结果的曲线图。参照图6，非李斯特氏菌种在使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的实时PCR中无一被扩增。然而，阳性对照组被扩增。这些结果表明使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的实时PCR对李斯特氏菌种是高度特异的。

（4）检测极限测试

确定实时PCR扩增产物与包含靶DNA的细胞的浓度的相关性。

首先，在35℃于脑心浸出（BHI）培养基中过夜培养L.monocytogenes。在新BHI培养基中十倍地连续稀释得到的培养产物。在TZ裂解缓冲液中溶解每种稀释物。得到的溶液用于PCR。使用平板计数确定细胞浓度。在对李斯特氏菌种的23S rDNA特异的SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的存在下，对每种李斯特氏菌种进行PCR扩增。PCR条件和PCR混合物组分与表1和表2中相同。

图7是示出了实时PCR产物与L.monocytogenes的细胞数目的相关性的曲线图。通过Cp值对使用平板计数测量的细胞浓度的标准化确定检测极限。结果，对李斯特氏菌的检测极限（LOD）是大约3cfu/μL。

图7的结果表明，使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的实时PCR扩增和检测适于高灵敏度地检测样品中的李斯特氏菌种。

示例2：污染样品中李斯特氏菌的特异性检测

在SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的存在下对被李斯特氏菌污染的样品进行实时PCR以扩增李斯特氏菌的靶核酸，由此检测样品中的李斯特氏菌。

（1）污染的液蛋和全脂牛奶中李斯特氏菌的特异性检测

用L.innocua接种液蛋以分别达到大约1cfu/25ml和大约4cfu/25ml的浓度。在4℃温育样品24小时之后，将每种样品在35℃于富集培养基A2.2（合适的配方包含30g/L的TSB、6g/L的酵母提取物、1g/L的七叶苷、10g/L的LiCl、2g/L的丙酮酸钠、0.1g/L的柠檬酸铁铵、8g/L的MOPS游离酸、14.2g/L的MOPS钠、5g/L的牛肉膏和1%的维生素混合物（包含大约0.1mg/L的核黄素、大约1.0mg/L的硫胺素和大约1.0mg/L的生物素）、10mg/L的多粘菌素B以及20mg/L的头孢他啶和5mg/L的吖啶黄）中培养22小时。将每个MPN（最可能数）管在30℃于富集UVM-1培养基（5g/L的示蛋白胨、5g/L的胰蛋白胨/酪蛋白消化物、5g/l的牛肉膏、5g/L的酵母提取物、20g/L的NaCl、12g/L的Na₂HPO₄2H₂O、1.35g/L的KH₂PO₄、1g/L的七叶苷、0.012g/L的吖啶黄以及0.02g/L的萘啶酸）中培养24小时。在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。PCR结果在表5中示出。

用L.ivanovii接种全脂牛奶以达到大约1cfu/25ml和大约5cfu/25ml的浓度。在4℃温育样品24小时之后，将每种样品在35℃于富集培养基A2.2（合适的配方包含30g/L的TSB、6g/L的酵母提取物、1g/L的七叶苷、10g/L的LiCl、2g/L的丙酮酸钠、0.1g/L的柠檬酸铁铵、8g/L的MOPS游离酸、14.2g/L的MOPS钠、5g/L的牛肉膏和1%的维生素混合物（包含大约0.1mg/L的核黄素、大约1.0mg/L的硫胺素和大约1.0mg/L的生物素）、10mg/L的多粘菌素B以及20mg/L的头孢他啶和5mg/L的吖啶黄）中培养22小时。将每个MPN（最可能数）管在30℃于富集UVM-1培养基（5g/L的示蛋白胨、5g/L的胰蛋白胨/酪蛋白消化物、5g/l的牛肉膏、5g/L的酵母提取物、20g/L的NaCl、12g/L的Na₂HPO₄2H₂O、1.35g/L的KH₂PO₄、1g/L的七叶苷、0.012g/L的吖啶黄以及0.02g/L的萘啶酸）中培养24小时。在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。将每个MPN管在30℃于富集UVM-1培养基中培养24小时。

表5中示出了PCR结果。表5是污染的液蛋和牛奶中李斯特氏菌的检测。

表5

N/D：未检测到

这些结果表明在SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的存在下，实时PCR测定能够检测污染的液蛋和牛奶中的微量水平（典型地接近1cfu/25g或ml的食物）的李斯特氏菌种。

（2）污染的熟火鸡肉中以及不锈钢表面和聚丙烯表面上的李斯特氏菌的特异性检测

用L.seeligeri接种熟火鸡（火腿）以达到大约2cfu/25g和大约4cfu/25g的浓度。在4℃温育样品24小时之后，将每种样品在35℃于富集培养基A2.2中培养24小时。将每个MPN管在30℃于富集UVM-1培养基中培养24小时。

如下来制备污染的不锈钢表面样品。用0.5%的脱脂牛奶将L.welshimeri稀释至2cfu和10cfu的浓度。将1mL的每种稀释物接种到4英寸×4英寸的不锈钢表面上并在室温下过夜风干。用磷酸缓冲盐水（PBS）浸泡过的海绵收集每个样品表面上的污染物，然后在35℃于富集培养基A2.2中培养24小时。

用0.5%的脱脂牛奶将L.grayi稀释至1cfu和10cfu的浓度。将1mL的每种稀释物接种到4英寸×4英寸的聚丙烯膜表面上并在室温下过夜风干。用磷酸缓冲盐水（PBS）浸泡过的海绵收集每个样品表面上的污染物，然后在35℃于富集培养基A2.2中培养24小时。

在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。表6中示出了PCR结果。表6是污染的火腿中和环境表面上的李斯特氏菌的检测。

表6

N/D：未检测到

这些结果表明在SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的存在下，实时PCR测定能够以高灵敏度检测在污染的火腿中以及像不锈钢和聚丙烯的污染的环境表面上的李斯特氏菌种的存在。

（3）污染的陶瓷砖、橡胶和牛肉糜上的李斯特氏菌的特异性检测

用0.5%的脱脂牛奶将L.monocytogene稀释至1cfu/mL和10cfu/mL的浓度。将1mL的每种稀释物接种到10×1平方英寸的陶瓷砖表面上并在室温下过夜风干。用磷酸缓冲盐水（PBS）浸泡过的海绵收集每个样品表面上的污染物，然后在35℃或30℃于10mL的富集培养基A2.2或UVM-1培养基中培养24小时。

用0.5%的脱脂牛奶将L.innocua稀释至3.3cfu/mL和33cfu/mL的浓度。将1mL的每种稀释物接种到10×1平方英寸的橡胶表面上并在室温下过夜风干。用磷酸缓冲盐水（PBS）浸泡过的海绵收集每个样品表面上的污染物，然后在35℃或30℃于10mL的富集培养基A2.2或UVM-1培养基中培养24小时。

在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。表7中示出了PCR结果。表7是污染的环境表面上的李斯特氏菌的检测。

表7

参照表7，证实了在根据本发明实施例的引物组和探针的存在下，实时PCR测定以高灵敏度检测在污染的陶瓷砖和橡胶中的李斯特氏菌种的存在。另外，结果表明，在李斯特氏菌生长效率提高方面，A2.2培养基比UVM-1培养基更好。

用L.monocytogenes接种牛肉糜以达到大约2cfu/25g（A组）和大约4cfu/25g（B组）的浓度，然后在4℃温育30小时。然后，将每个样品在35℃于富集培养基A2.2中培养24小时。将每个MPN管在30℃于富集UVM-1培养基中培养24小时。在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。表8中示出了PCR结果。表8是污染的牛肉糜中的李斯特氏菌的检测。

表8

N/D：未检测到

参照表8，证实了在根据本发明实施例的引物组和探针的存在下，实时PCR测定以高灵敏度检测在污染的牛肉糜中的李斯特氏菌种的存在。另外，发现未污染的牛肉糜为阴性（未示出）。

（4）污染的烟熏火腿中的李斯特氏菌的特异性检测

用L.monocytogenes接种烟熏火腿以达到大约3cfu/25g的浓度，然后在4℃温育48小时。然后，将样品在35℃于富集培养基A2.2中培养24小时。将每个MPN管（0.1g、1g和10g）在30℃于富集UVM-1培养基中培养24小时。以污染的样品与未污染的样品之间1:5（20μl:80μl）和1:10（10μl:90μl）的稀释比稀释每个样品。在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。表9中示出了PCR结果。表9是污染的火腿中的李斯特氏菌的检测。

表9

样品	未稀释	1:5稀释	1:10稀释
				1	30.08	30.95	31.85
2	28.15	29.1	29.97
				3	31.07	32.47	32.61
4	39.74	30.46	31.56
				5	N/D	N/D	N/D
6	N/D	N/D	N/D
				7	N/D	N/D	N/D
8	29.66	29.95	30.75
				MPN（/25g）	0.75cfu/25g

N/D：未检测到

参照表9，证实了在根据本发明实施例的引物组和探针的存在下，实时PCR测定以高灵敏度检测在污染的火腿中的李斯特氏菌种的存在。该测定检测稀释样品中的李斯特氏菌种的能力证明其适于混合样品。

（5）被李斯特氏菌和E.coli（大肠杆菌）污染的橡胶中的李斯特氏菌的特异性检测

用0.5%的脱脂牛奶将L.monocytogenes稀释至1cfu/100μl和10cfu/100μl的浓度。这些稀释物分别包含每100μl中8cfu和80cfu的E.coli。将1000μl的每种悬浮液接种到10×1平方英寸的橡胶表面上并在室温下过夜风干。用DE浸泡过的海绵收集每个样品表面上的污染物，然后在35℃或30℃于10mL的富集培养基A2.2或UVM-1培养基中培养24小时。在与表1和表2中相同的条件下执行PCR。表10中示出了PCR结果。

使用的DE肉汤的组分如下：

表10是污染的橡胶表面上的李斯特氏菌的检测。

表10

N/D：未检测到

参照表10，证实了在根据本发明实施例的引物组和探针的存在下，实时PCR测定以高灵敏度检测在被L.monocytogenes和E.coli污染的橡胶中的李斯特氏菌种的存在。表10中的结果还表明，在李斯特氏菌生长效率提高方面A2.2培养基比UVM-1培养基更好。

示例3：通过RT-PCR对污染样品中的李斯特氏菌进行的特异性检测

（1）被L.monocytogene污染的陶瓷砖表面

用0.5%的脱脂牛奶将L.monocytogene稀释至16cfu/100μl的浓度。将80μl的悬浮液接种到10×1平方英寸的陶瓷砖表面上并在室温下过夜风干。用PBS或DE浸泡过的海绵收集样品表面上的污染物，然后在35℃于8mL预温的脑心浸出（BHI）培养基中培养6小时。然后，将1mL培养产物接种到9ml的UVM-1培养基中，并在30℃进一步温育18小时。另外地，将1ml培养产物接种到9ml的BHI培养基上，在35℃培养6小时。

将在BHI培养基中培养6小时的培养产物用于逆转录（RT）反应（700μl富集培养产物+100μl1×ZAC（1%CHAPS、2.5mg/mL叠氮化钠和100mM Tris（pH8））+10μl蛋白激酶K）。TZ裂解缓冲液（每1ml0.1M Tris-HCl缓冲液中2.5mg叠氮化钠和2.0%Triton X-100，pH8.0）用于其他样品。

如下来引发逆转录反应。将7.9μl DEPC-水、0.1μl20μM的反向引物、1μl10mM的dNTP以及1μl裂解物混合。所使用的反向引物是SEQ ID NO:7。在65℃温育混合物5分钟，然后置于冰上2分钟。

将2μl10×RT缓冲液、4μl25mM的MgCl₂、2μl0.1M的DTT、1μl RNA酶HII（40U/ml）以及1μl Superscript III（1U/μl，逆转录酶）加入混合物。

在50℃温育50分钟之后，在85℃进一步温育混合物5分钟，然后冷却至4℃。将2μl的RT产物与PCR混合物混合以用于PCR。PCR条件和PCR混合物的组分与表1和表2中相同。表11和表12分别表示从RT-PCR和PCR获得的Cp值。

表11是李斯特氏菌（用PBS浸泡过的海绵收集）的检测。

表11

N/D：未检测到

表12是李斯特氏菌（用DE浸泡过的海绵收集）的检测。

表12

如从表11和表12中明显的，与传统的24小时富集方案相比，可以通过更短的富集方案的RT-PCR快速且灵敏地检测李斯特氏菌。

（2）被L.monocytogene污染的橡胶表面

用0.5%的脱脂牛奶将L.monocytogene稀释至2.25cfu/100μl的浓度，并以相同的方式将E.coli稀释至23cfu/100μl的浓度。将100μl的悬浮液接种到1英寸×1英寸的橡胶表面上并在室温下过夜风干。用DE浸泡过的棉签收集样品表面上的污染物，然后在35℃于8mL预热的富集BHI培养基中培养6小时，在30℃于10ml的UVM-1培养基中培养24小时或者在35℃于10ml的A2.2培养基中培养24小时。

将在BHI培养基中培养6小时的培养产物用于逆转录（RT）反应（700μl富集培养产物+100μl1×ZAC+10μl蛋白激酶K）。TZ裂解缓冲液（每1ml0.1MTris-HCl缓冲液中2.5mg叠氮化钠和2.0%Triton X-100，pH8.0）用于其他样品。

对于20μl样品的RT反应，将7.9μl DEPC-水、0.1μl20μM的反向引物、1μl10mM的dNTP以及1μl裂解物混合。所使用的正向引物和反向引物分别是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7。将混合物在65℃温育5分钟，然后置于冰上2分钟。将2μl10×RT缓冲液、4μl25mM的MgCl₂、2μl0.1M的DTT、1μl RNA酶HII（40U/ml）以及1μl Superscript III（200U/μl，逆转录酶）加入混合物。在50℃温育50分钟之后，在85℃进一步温育混合物5分钟，然后冷却至4℃。将2μl的RT产物与PCR混合物混合以用于PCR。PCR条件和PCR混合物的组分与表1和表2中相同。表13表示从RT-PCR获得的Cp值。

表13是李斯特氏菌（用DE浸泡过的海绵收集）的检测。

表13

N/D：未检测到

如从表13中明显的，可以通过RT-PCR高灵敏度地快速检测李斯特氏菌。

示例4：通过一步RT-PCR对污染样品中的李斯特氏菌进行的特异性检测

（1）从2×10⁷拷贝/μl至20拷贝/μl10倍地连续稀释李斯特氏菌的合成靶23S RNA。使用RNA分子作为模板执行一步RT-PCR。25μl反应混合物的组分和RT-PCR的条件分别与表14和表15中相同。

表14是RT-PCR混合物的组分（在每个孔中，μl）。

表14

在表14中，缓冲液6包含4mM乙酸镁、50mM乙酸钾、50mM Tris-乙酸（pH8.6）、1mM DTT。正向引物、反向引物和CC探针分别是SEQ ID NO.3、7和12的寡核苷酸。使用被可逆地修饰并且是热稳定的RNA酶HII的热启动Pfu RNA酶HII，RNA酶HII在RT温度下开始变性并且在高温下变得具有活性。通过可逆的甲醛交联实现修饰。两种缓冲液用于交联：包含20mMHEPES、pH7.9的200mM KC和1mM EDTA的交联缓冲液；以及包含100mMTris-HCl（pH8.0）、200mM NaCl和0.2mM EDTA的2×RNA酶HII储存缓冲液。

为了制备热启动Pfu RNA酶HII的目的，用47μl的交联缓冲液（1.25mg/ml，大约2.5OD）稀释2μl的Pfu RNA酶HII（25mg/ml，大约50OD）。将10mL稀释的Pfu RNA酶HII（1.25mg/ml，在冰上大约2.5OD）、7.25ml水和0.75ml13.8%的甲醛（在水中）混合以制备18mL的最终反应混合液（最终甲醛浓度是0.58%）。然后，在37℃温育反应混合物30分钟。将反应混合物置于冰上，并将2μl2M的Tris-HCl（pH8.0）加入反应混合物。反应完成之后，使用用2×RNA酶HII储存缓冲液预平衡的G50微型纯化柱（microspincolumn）纯化反应混合物，然后用等量丙三醇稀释并在-20℃储存。

修饰的RNA酶HII在50℃失去其活性，但是当加热到95℃时被再激活。

表15是PCR反应条件。

表15

图8中示出了结果。

作为RT-PCR的结果，在反应I和反应II的条件下，每个反应检测到低至10拷贝的李斯特氏菌。然而，反应I中的荧光强度大大高于反应II中的荧光强度，表明反应I中的探针切割动力学更高。

（2）不同的RT-PCR缓冲液

除了采用下面表16中示出的用于RT-PCR的缓冲液之外，通过相同的程序执行RT-PCR。

表16是每个孔中的RT-PCR配方（μl）。

表16

含有合适配方的AgPath一步RT-PCR试剂盒和Tfi一步RT-PCR从LifeTech获得。

图9示出了分别使用Tfi缓冲液和AgPath缓冲液进行的RT-PCR的结果。图9的结果表明使用SEQ ID NO.3和7的引物对以及SEQ ID NO.12的探针的一步RT-PCR适于以每反应10拷贝的灵敏度有效地检测样品中的李斯特氏菌。

示例5：通过富集培养增加灵敏度

用PBS将过夜生长的L.monocytogenes10倍地稀释至大约1cfu/100μl的浓度。然后，将100μl或1mL稀释的L.mono加入15mL新鲜的BHI肉汤并在不震荡的条件下在35℃温育6小时。对每个稀释水平测试4个复制品。

在6小时之后，裂解700μl的富集物，并根据制造商的规程将1μl的裂解物用作Invitrogen SUPERSCRIPT III^TM反应中的模板。在PCR/CataCleave反应中测试2μl的cDNA。PCR的条件和PCR混合物的组分与表1和表2中相同。

同时，涂布100μl的富集物，第二天的细胞计数为10cfu/mL。

这表明本测定能够以39.47±0.92的Cp检测10cfu/mL的细胞浓度。另外，观察到在逆转录（RT）反应之前对裂解物进行的1:10的稀释有助于增加测试的灵敏度。

图10（A）-图10（C）中示出了结果。图10（A）示出了分离的靶RNA分子的扩增曲线，这表明当在RT-PCR之前富集样品时，可以检测到低至20个拷贝的靶RNA分子。图10（B）示出了富集的样品细胞悬液的扩增曲线。富集培养使细胞悬液中的靶RNA分子的检测灵敏度增加大约300-500倍。另外，当在进行RT-PCR之前用水稀释富集的培养物时，富集对RT-PCR表现出最小的抑制（图10（C））。

产业上的可利用性

因此，在RNA提取之前富集培养大约6小时能够实现对李斯特氏菌非常快速的检测。在实施例中，从样品的收集至完成测试总共大约8小时。

通过引用将说明书中确定的任何专利、专利申请、公布或其他公开的材料全部包含于此。仅将通过引用包含于此的但与这里阐述的已存在的定义、论述或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分包含至在包含的材料与本公开的材料之间不产生冲突的程度。

序列表自由文本

SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:22作为计算机可读文件附于此，并形成本申请的说明书的一部分。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包括：

第一寡核苷酸，序列为SEQ ID NO:19：X₁CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAX₂（SEQ ID NO:19），其中，位置1处的X₁是T或者空缺，位置22处的X₂是G或者空缺；

第二寡核苷酸，序列为SEQ ID NO:20:X₁X₁GACAGCGTGAAATCAGGX₃X₃X₄（SEQ ID NO:20），其中，位置1和2处的X₁均为T或者空缺，位置20和21处的X₃是A或者空缺，位置22处的X₄是C或者空缺。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，第一寡核苷酸是从SEQ ID NO:1-3的寡核苷酸的组中选择的一种或多种：

CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAG（SEQ ID NO:1），

CCAAGCAGTGAGTGTGAGAA（SEQ ID NO:2），以及

TCCAAGCAGTGAGTGTGAGAA（SEQ ID NO:3）。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，第二寡核苷酸是从SEQ ID NO:5-9的寡核苷酸的组中选择的一种或多种：

TGACAGCGTGAAATCAGGAAC（SEQ ID NO:5），

TTGACAGCGTGAAATCAGG（SEQ ID NO:6），

TGACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:7），

TGACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:8）以及

GACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:9）。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括具有DNA序列和RNA序列的第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸的序列是SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22：

TGCGAAGACTGAGCTGTGATGG（SEQ ID NO:21），其中，位置8和9处的核苷酸中至少有一个是核糖核苷酸，以及

CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO.22），其中，分别在位置11、12、13和14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸。

5.根据权利要求6所述的组合物，其中，第三寡核苷酸是从由SEQ ID NO:10-14的寡核苷酸组成的组中选择的一种或多种：

TGCGAAGCrATGAGCTGTGATGG（SEQ ID NO:10），其中，位置9处的“rA”是核糖核苷酸，

TGCGAAGrCATGAGCTGTGATGG（SEQ ID NO:11），其中，位置8处的“rC”是核糖核苷酸，

CCATCACAGCTCArUGCTTCGC（SEQ ID NO:12），其中，位置14处的“rU”是核糖核苷酸，

CCATCACAGCTrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO:13)，其中，分别在位置12、13和14处的“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸，以及

CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO:14），其中，分别在位置11、12、13和14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸。

6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，第三寡核苷酸标记有可检测标记物。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物包括SEQ ID NO.3的第一寡核苷酸、SEQ ID NO.7的第二寡核苷酸和SEQ ID NO.12的第三寡核苷酸。

8.一种检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

（a）序列为SEQ ID NO:19：X₁CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAX2（SEQID NO:19）的第一引物，其中，位置1处的X₁是T或者空缺，位置22处的X₂是G或者空缺；

（b）序列为SEQ ID NO:20：X₁X₁GACAGCGTGAAATCAGGX₃X₃X₄（SEQ ID NO:20）的第二引物，其中，位置1和2处的X₁均为T或者空缺，位置20和21处的X₃是A或者空缺，位置22处的X₄是C或空缺；以及

（c）包括RNA序列和DNA序列的探针，所述RNA序列和DNA序列与靶李斯特氏菌基因基本上互补并结合到可检测标签，其中，探针包括SEQID NO:21或SEQ ID NO:22的序列：

TGCGAAGACTGAGCTGTGATGG（SEQ ID NO:21），其中，位置8和9处的核苷酸中的至少一个是核糖核苷酸，以及

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：

（d）扩增活性，用于靶DNA序列的PCR扩增，以产生李斯特氏菌PCR片段；以及

（e）RNA酶H活性。

10.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，探针在其3'端和5'端结合到可检测标签。

11.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，RNA酶H活性是热稳定RNA酶H的活性。

12.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，第一引物是从SEQ ID NO:1-3的寡核苷酸的组中选择的一种或多种：

CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAG（SEQ ID NO:1），

CCAAGCAGTGAGTGTGAGAA（SEQ ID NO:2），以及

TCCAAGCAGTGAGTGTGAGAA（SEQ ID NO:3）。

13.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，第二引物是从SEQ ID NO:5-9的寡核苷酸的组中选择的一种或多种：

TGACAGCGTGAAATCAGGAAC（SEQ ID NO:5），

TTGACAGCGTGAAATCAGG（SEQ ID NO:6），

TGACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:7），

TGACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:8），以及

GACAGCGTGAAATCAGGA（SEQ ID NO:9）。

14.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，探针是从由SEQ ID NO:10-14的寡核苷酸组成的组中选择的一种或多种：

15.一种检测样品中的李斯特氏菌的方法，所述方法包括：

（a）扩增样品中的李斯特氏菌的靶核酸以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ ID NO:19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到样品中的靶核酸以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；

（b）使靶核酸与能够杂交到靶核酸的至少一种探针寡核苷酸杂交，以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包括DNA序列和RNA序列并结合到可检测标签，探针包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列：

CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC（SEQ ID NO.22），其中，分别在位置11、12、13和14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸；

（c）使靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针；以及

（d）检测来自探针上的标签的信号发射的增加，其中，信号的增加表示样品中存在李斯特氏菌的靶核酸。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，探针寡核苷酸选自于由SEQ IDNO:10-14的寡核苷酸组成的组。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，可检测标记物是荧光共振能量转移对。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述方法还包括在扩增之前在富集培养基中培养包含李斯特氏菌的样品以增强李斯特氏菌的生长。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约1g至大约10g的酵母提取物以及大约1g至大约10g的氯化锂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述富集培养基还包括从以下组分组成的组中选择的至少一种组分：大约1g至大约10g的牛肉膏和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；以及大约0.01g至大约1g的柠檬酸铁铵。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述富集培养基还包括缓冲化合物，缓冲化合物包括3-(N-吗啉基)丙磺酸及其钠盐。

22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约10mg至大约30mg的头孢他啶。

23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水：大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约1g至大约10g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约1g至大约10g的牛肉膏和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0.1g至大约1g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7.1g的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约10mg至大约30mg的头孢他啶。

24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水：大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约6g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约5g的牛肉膏和/或包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；大约2g的丙酮酸钠；大约0.2g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7.1g的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约5mg的吖啶黄、大约10mg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他啶。

25.一种检测样品中的李斯特氏菌的方法，所述方法包括：

（a）在逆转录酶活性和逆扩增引物的存在下逆转录李斯特氏菌的靶RNA以产生靶RNA的靶cDNA；

（b）扩增靶cDNA序列以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQID NO:19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到靶cDNA以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；

（c）使靶核酸杂交到基本上与靶cDNA互补的至少一种探针寡核苷酸以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包含DNA序列和RNA序列并结合到可检测标签，探针包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列：

（d）使靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针；以及

（e）检测来自探针上的标签的信号发射的增加，其中，信号的增加表示样品中存在李斯特氏菌的靶RNA。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，探针寡核苷酸选自于由SEQ IDNO:10-14的寡核苷酸组成的组。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，可检测标记物是荧光共振能量转移对。

28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述方法还包括在扩增之前在富集培养基中培养包含李斯特氏菌的样品以增强李斯特氏菌的生长。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约1g至大约10g的酵母提取物以及大约1g至大约10g的氯化锂。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述富集培养基还包括从以下组分组成的组中选择的至少一种组分：大约1g至大约10g的牛肉膏和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；以及大约0.01g至大约1g的柠檬酸铁铵。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述富集培养基还包括缓冲化合物，缓冲化合物包括3-(N-吗啉基)丙磺酸及其钠盐。

32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约10mg至大约30mg的头孢他啶。

33.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水：大约10g至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约1g至大约10g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约1g至大约10g的牛肉膏和/或包含大约0.01mg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.01mg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0.1g至大约1g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7.1g的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约10mg至大约30mg的头孢他啶。

34.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水：大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约6g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约5g的牛肉膏和/或包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；大约2g的丙酮酸钠；大约0.2g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7.1g的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约5mg的吖啶黄、大约10mg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他啶。