KR101149875B1 - 가금티푸스균 감별 동정용 유전자 진단법 - Google Patents

가금티푸스균 감별 동정용 유전자 진단법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가금티푸스균 또는 가금티푸스 백신용 생균의 glgC 유전자에 존재하는 특이 염기서열, 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균의 speC 유전자에 존재하는 특이 염기서열, 가금티푸스 백신용 생균 중 9R 균주의 DNA에 존재하는 특이 염기서열 또는 가금티푸스 백신용 생균 중 SR2-N6 균주의 rfaL 유전자에 존재하는 특이 염기서열을 포함하는 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 생물학적 시료로부터 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 가금티푸스균 및 근연의 추백리균을 신속하게 검출할 수 있고 아울러 가금티푸스 백신용 생균 또한 구별하여 검출할 수 있기 때문에, 가금티푸스의 신속 정밀한 진단을 통한 농장 방역처치 효과의 증대로 양계농가의 생산성 향상을 기대할 수 있다.
가금티푸스, 가금티푸스균, 추백리균, 가금티푸스 백신용 생균

Description

가금티푸스균 감별 동정용 유전자 진단법{Differential identification of Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum, Pullorum and biovar Gallinarum live vaccine strains}
본 발명은 가금티푸스균 감별 동정용 유전자 진단법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 가금티푸스균 또는 가금티푸스 백신용 생균의 glgC 유전자에 존재하는 특이 염기서열, 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균의 speC 유전자에 존재하는 특이 염기서열, 가금티푸스 백신용 생균 중 9R 균주의 DNA에 존재하는 특이 염기서열 또는 가금티푸스 백신용 생균 중 SR2-N6 균주의 rfaL 유전자에 존재하는 특이 염기서열을 포함하는 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 생물학적 시료로부터 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
가금티푸스(fowl typhoid)는 1992년 국내 산란계에서 처음 공식적인 발생보고가 있었으며, 이후 전국적으로 다양한 계종에 전파되어 국내 양계산업에서 큰 피해를 야기하고 있는 질병이다. 이러한 피해의 최소화를 위하여 산란계를 대상으로 2종의 생균백신(9R, SR2-N6)이 적용되고 있으며, 전반적인 발생피해는 감소하였으 나, 아직도 산란계, 종계, 육용계 등에서 지속적인 피해를 야기하고 있는 실정이다.
가금티푸스의 진단은 임상증상, 병변, 혈청반응 등을 통하여 추정진단이 가능하나 확진에는 원인균인 가금티푸스균(Salmonella Gallinarum)의 분리 동정이 필수적이다. 가금티푸스균은 혈청학적으로 추백리균(Salmonella Pullorum) 및 기타 Salmonella D군의 균과 감별이 되지 않고 유전적으로 매우 상동성이 높아 감별 동정에 생화학적 검사법이 일반적으로 사용되고 있다. 이러한 생화학적 동정법은 많은 시간과 노동력을 요하는 단점이 있으며, 그나마도 백신주와의 감별 동정에는 불완전한 것으로 알려져 있다. 일부 유전자 진단법에 준한 동정법이 보고되어 있으나 일반 진단실험실에서 사용하기에 다소 번거로운 방법들이며, 백신주와의 감별이 되지 않는 단점이 있다.
유전자 진단법은 빠른 시간 내에 질병의 감염을 진단하기 위한 기법으로 많이 사용되고 있으나, 양계산업에서 매우 중요한 세균성 질병인 가금티푸스의 경우, 원인균에 대한 효율적인 유전자 진단법은 아직 미비한 실정이다. 현재까지 보고된 가금티푸스균에 대한 유전자 감별동정법은 단일 염기서열의 차이에 근거하여 근연의 추백리균과 감별 동정하는 방법으로서, 일반 PCR(polymerase chain reaction) 반응 수행 후 제한효소 처리(RFLP, restriction fragment length polymorphism)를 하거나 이중의 PCR 반응을 수행하여 근연의 추백리균과 감별 동정하는 번거로운 과정을 거쳐야 한다. 또한, 현재 국내 양계분야에 적용되고 있는 가금티푸스 생균백신과의 감별이 불가능하여 진단실험실에서 일반적으로 사용하기 위한 목적에 부합 하지 않아, 보다 편리하며 백신주와의 감별이 가능한 일반적인 PCR법의 개발이 요구되는 실정이다.
가금티푸스균은 근연의 추백리균 및 기타 D군의 살모넬라균과 유전적으로 매우 유사하여 일반적인 PCR법을 수행하기 위한 표적유전자를 찾는 것이 매우 어렵다. 따라서 상기와 같이 기존의 PCR법은 단일 염기서열의 차이를 이용하여 근연의 추백리균과 감별 동정하는 방법이 주를 이루고 있다. 그러나 이러한 단일 염기서열 차이를 이용한 방법은 PCR만으로는 감별이 어려워 제한효소를 이용한 단편화 과정을 거쳐야 감별이 가능하거나, 또는 비특이 반응이 많을 수밖에 없는 단일 염기서열의 차이를 보이는 부위를 프라이머 부착부위로 하여 2회의 PCR로 추백리균과 감별 동정하는 과정으로 이루어진다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 국내 양계현장과 같이 가금티푸스 생균백신이 적용되는 상황에서는 이러한 감별법만으로는 백신주와의 감별이 되지 않아 불완전한 진단이 될 수밖에 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 가금티푸스균, 추백리균 및 가금티푸스 백신용 생균들을 근연의 기타 살모넬라균 및 장내세균들로부터 신속하고 정확하게 동시에 감별 동정해낼 수 있는 특이 유전자 부위들을 찾았으며, 이를 토대로 multiplex PCR을 수행할 경우, 단 1회의 단순한 PCR 반응으로 가금티푸스균, 추백리균 및 가금티푸스 백신용 생균을 동시에 검출할 수 있으며 아울러 기타 근연의 장내세균들과도 정확히 구분하여 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 생물학적 시료로부터 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균을 손쉽게 구별하여 검출할 수 있는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균의 검출 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균의 검출을 위한 특정 염기서열을 포함하는 프라이머를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; b) 상기 DNA를 주형으로 하고, 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; c) 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 분석하는 단계를 포함하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법에 있어서,
상기 프라이머가
1) 서열번호 1의 염기서열 중 409 번째 내지 459 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 1 프라이머 쌍,
2) 서열번호 1의 염기서열 중 458 번째 내지 508 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 2 프라이머 쌍,
3) 서열번호 2의 염기서열 중 1,219 번째 내지 1,269 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 3 프라이머 쌍,
4) 서열번호 2의 염기서열 중 1,268 번째 내지 1,318 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 4 프라이머 쌍,
5) 서열번호 3의 염기서열 중 99 번째 내지 178 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 하나가 99 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 99 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머이고, 다른 하나가 178번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 178 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 5 프라이머 쌍,
6) 서열번호 4의 염기서열 중 308 번째 내지 358 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구 성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 6 프라이머 쌍,
7) 서열번호 4의 염기서열 중 357 번째 내지 407 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 7 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법에 있어서, 상기 제 1 프라이머 쌍은 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법에 있어서, 상기 제 4 프라이머 쌍은 서열번호 7의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법에 있어서, 상기 제 5 프라이머 쌍은 서열번호 9의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법에 있어서, 상기 제 7 프라이머 쌍은 서열번호 11의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 409 번 째 내지 459 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 가금티푸스균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 한쪽 프라이머가 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머이며, 다른 한쪽 프라이머가 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 458 번째 내지 508 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 1,219 번째 내지 1,269 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 1,268 번째 내지 1,318 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍.
본 발명의 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 한쪽 프라이머가 서열번호 7의 염기서열로 구성된 프라이머이며, 다른 한쪽 프라이머가 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열 중 99 번째 내지 178 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 하나가 99 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 99 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머이고, 다른 하나가 178번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 178 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 한쪽 프라이머가 서열번호 9의 염기서열로 구성된 프라이머이며, 다른 한쪽 프라이머가 서열번호 10의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열 중 308 번째 내지 358 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열 중 357 번째 내지 407 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 가금티푸스 백신용 생균 검출용 프라이머 쌍에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 한쪽 프라이머가 서열번호 11의 염기서열로 구성된 프라이머이며, 다른 한쪽 프라이머가 서열번호 12의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 가금티푸스균과 가금티푸스 백신용 생균에 특이적으로 존재하는 glgC 유전자의 특정 부위 염기서열, 가금티푸스균, 추백리균 및 가금티푸스 백신용 생균에 특이적으로 존재하는 speC 유전자의 특정 부위 염기서열, 가금티푸스 백신용 생균 9R에 특이적으로 존재하는 DNA 특정 부위 염기서열 또는 가금티푸스 백신 용 생균 SR2-N6에 특이적으로 존재하는 rfaL 유전자의 특정 부위 염기서열을 표적으로 한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응법(PCR, polymerase chain reaction)을 수행함으로써, 생물학적 시료로부터 가금티푸스균 표준균주 및 야외 분리주, 추백리균 표준균주 및 야외 분리주, 가금티푸스 백신용 생균 9R 및 SR2-N6을 각각 구분하여 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같이 특정 균주의 DNA에만 존재하는 특정 염기서열을 프라이머로 사용할 경우, 특정 균주 이외에 상기 특정 염기서열을 갖고 있지 않은 균주의 DNA와 PCR을 수행하게 되면 DNA의 증폭이 이루어지지 않는다는 것을 이용한 것이다.
4개의 Salmonella enterica 표준균주인 Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum ATCC 9184(가금티푸스균주), Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum ATCC 19945(추백리균주), Salmonella enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 및 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028의 glgC 및 speC 유전자의 염기서열을 비교하였을 때, 가금티푸스균의 glgC 유전자 염기서열 중 다른 세 가지 균의 glgC 유전자와 다른 부분이 존재하는 것으로 확인되었고(도 1 B의 빨간색 테두리), 가금티푸스균 및 추백리균의 speC 유전자 염기서열 중 다른 두 가지 균의 speC 유전자와 다른 부분이 존재하는 것 역시 확인할 수 있었다(도 2 A의 빨간색 테두리).
가금티푸스 백신용 생균 9R은 클론 9R22C9의 염기서열 일부가 다른 관련 균주들의 염기서열과 다른 것으로 확인되었으며(도 3 A 및 B의 빨간색 테두리), 가금티푸스 백신용 생균 SR2-N6은 rfaL 유전자의 염기서열 일부가 다른 관련 균주들의 염기서열과 다른 것으로 확인되었다(도 4 A의 빨간색 테두리).
따라서, 상기에 기재한 염기서열이 다른 부분들을 프라이머로 사용하여 생물학적 시료의 DNA와 PCR 반응을 수행할 경우, 시료내의 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균을 검출할 수 있게 된다.
제 1 프라이머 쌍 및 제 2 프라이머 쌍은 상기 가금티푸스균의 glgC 유전자 염기서열(서열번호 1) 중 458 번째 염기 및 459 번째 염기 또는 이의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 이에 인접하며 연속적인 염기서열로 구성된 프라이머 A와 glgC 유전자 염기서열 중 프라이머 A 이 외 부분의 염기서열로 구성된 프라이머 B로 이루어지며, 상기 제 1 프라이머 쌍 및 제 2 프라이머 쌍을 사용하여 가금티푸스균의 염색체 DNA와 PCR을 수행할 경우, 가금티푸스균의 glgC 유전자의 일부를 증폭할 수 있어야 한다.
제 3 프라이머 쌍 및 제 4 프라이머 쌍은 상기 가금티푸스균 및 추백리균의 speC 유전자 염기서열(서열번호 2) 중 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기 또는 이의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 이에 인접하며 연속적인 염기서열로 구성된 프라이머 C와 speC 유전자 염기서열 중 프라이머 C 이 외 부분의 염기서열로 구성된 프라이머 D로 이루어지며, 상기 제 3 프라이머 쌍 및 제 4 프라이머 쌍을 사용하여 가금티푸스균 또는 추백리균의 염색체 DNA와 PCR을 수행할 경우, 가금티푸스균 또는 추백리균의 speC 유전자의 일부를 증폭할 수 있어야 한다.
제 5 프라이머 쌍은 상기 가금티푸스 백신용 생균의 클론 9R22C9 염기서열(서열번호 3) 중 99 번째 염기를 포함함과 동시에 이에 인접하며 연속적인 염기서 열로 구성된 프라이머 E와 클론 9R22C9 염기서열 중 178번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 이에 인접하며 연속적인 염기서열로 구성된 프라이머 F로 이루어지며, 상기 제 3 프라이머 쌍을 사용하여 가금티푸스 백신용 생균 9R의 염색체 DNA와 PCR을 수행할 경우, 가금티푸스 백신용 생균 9R의 클론 9R22C9의 일부를 증폭할 수 있어야 한다.
제 6 프라이머 쌍 및 제 7 프라이머 쌍은 상기 가금티푸스 백신용 생균 SR2-N6의 rfaL 유전자 염기서열(서열번호 4) 중 357 번째 염기 및 358 번째 염기 또는 이의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 이에 인접하며 연속적인 염기서열로 구성된 프라이머 G와 rfaL 유전자 염기서열 중 프라이머 G 이 외 부분의 염기서열로 구성된 프라이머 H로 이루어지며, 상기 제 6 프라이머 쌍 및 제 7 프라이머 쌍을 사용하여 가금티푸스 백신용 생균 SR2-N6의 염색체 DNA와 PCR을 수행할 경우, 가금티푸스 백신용 생균 SR2-N6의 rfaL 유전자의 일부를 증폭할 수 있어야 한다.
상기 제 1 프라이머 쌍 내지 제 7 프라이머 쌍은 사용 목적에 따라서 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 프라이머 쌍을 모두 사용하는 것이 생물학적 시료로부터 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균을 동시에 감별적으로 검출할 수 있기 때문에 가장 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 프라이머 제작을 위한 염기서열 선정 및 프라이머 제작
4개의 Salmonella enterica 표준균주인 Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum ATCC 9184(가금티푸스균주), Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum ATCC 19945(추백리균주), Salmonella enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 및 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028의 glgC 및 speC 유전자의 염기서열(도 1 및 도 2)과 가금티푸스균 백신용 생균주 9R(Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum 9R)의 특이클론 9R22C9(도 3) 및 가금티푸스균 백신용 생균주 SR2-N6의 rfaL 유전자(도 4)의 염기서열을 결정하였으며, 아울러 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 및 Wellcome Trust Sanger Institute의 동일 유전자 염기서열을 수집하여 다중 염기서열 배열 및 유전적 상동성 분석을 실시하였다. 이를 토대로 균주 감별용으로 유용한 염기서열 부위를 확인한 다음 이러한 부위를 표적으로 하여 가금티푸스 감별 동정용 PCR을 위한 프라이머를 제작하였다(표 1 내지 표 4, 도 1 내지 도 4).
[표 1] glgC 유전자 부위에 대한 프라이머(제 1 프라이머 쌍의 예)
명칭 염기서열(5'- 3') 서열번호 PCR산물(bp)
SG-L GATCTGCTGCCAGCTCAA 5 174
SG-R GCGCCCTTTTCAAAACATA 6
[표 2] speC 유전자 부위에 대한 프라이머(제 4 프라이머 쌍의 예)
명칭 염기서열(5'- 3') 서열번호 PCR산물(bp)
SGP-L CTGGGCATTGACGCAAA 7 252
SGP-R CGGTGTACTGCCCGCTAT 8
[표 3] 클론 9R22C9에 대한 프라이머(제 5 프라이머 쌍의 예)
명칭 염기서열(5'- 3') 서열번호 PCR산물(bp)
9R-L CTTTACGGGCAAACCACAGT 9 119
9R-R TGAGATGGAAAAAGAGCAGCA 10
[표 4] rfaL 유전자 부위에 대한 프라이머(제 7 프라이머 쌍의 예)
명칭 염기서열(5'- 3') 서열번호 PCR산물(bp)
SR2-L CCGTAGCCCTTGATCGGAGTAT 11 361
SR2-R TCCATGGTTTTCTTATTTCCAGCA 12
실시예 2. 가검균의 DNA 준비
PCR에 사용할 주형 DNA로 상기 실시예 1에 기재된 균주들 및 Escherichia coli ATCC 35218의 DNA를 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
상기 균주들을 각각 한천평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 순수한 집락을 무균적으로 채취하여 100㎕의 TE(Tris-EDTA) buffer에 현탁시켰다. 상기 현택액을 100℃에서 5분간 끓인 후 원심분리하여 균체성분을 제거하였고, 그 상청액 1㎕를 하기 실시예의 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였다.
실시예 3. 제 1 프라이머 쌍 및 제 4 프라이머 쌍을 이용한 가금티푸스균 및 추백리균의 검출
상기 실시예 2의 가검균 DNA를 주형 DNA로 사용하였고, 실시예 1의 SG-L 및 R, SGP-L 및 R로 구성된 2쌍의 프라이머를 이용하여 하기 표 5 및 표 6에 기재한 조건으로 duplex PCR을 수행하였고, agarose gel에서 전기영동을 실시하였다(도 5).
[표 5] PCR 반응 혼합물 조성
시 약 첨가량(㎕) 최종농도
물 11.8
5× Taq buffer 5 1×
MgCl2(25mM) 1.5 1.5mM
dNTPs(10mM) 0.5 0.2mM
Primer SGP-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1 0.4μM
Primer SGP-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1 0.4μM
Primer SG-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Primer SG-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Taq pol(5U/㎕) 0.2 1U
주형 DNA(boiled lysate) 1
합계 25
[표 6] PCR 수행 조건
PCR 단계 온도 시간
1 cycle Predenaturation 94℃ 5분
30 cycles

 Denaturation 94℃ 30초
Annealing 65℃ 30초
Extension 72℃ 30초
1 cycle Final extension 72℃ 7분
이의 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 가금티푸스균주의 DNA를 주형 DNA로 사용하였을 경우에는 약 252bp 및 약 174bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었고, 추백리균의 DNA를 주형 DNA로 사용하였을 경우에는 약 252bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었으며, 다른 균주의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 DNA의 증폭이 확인되지 않았다.
이는 상기 제 1 프라이머 쌍 및 제 4 프라이머 쌍을 이용하여 본 발명의 가금티푸스균 검출용 유전자 진단 방법을 적용하게 되면, 생물학적 시료로부터 가금티푸스균 및 추백리균을 동시에 구별하여 검출할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4. 제 1 프라이머 쌍, 제 4 프라이머 쌍 및 제 5 프라이머 쌍을 이용한 가 금티푸스균, 추백리균 및 가금티푸스 백신용 생균주 9R의 검출
상기 실시예 2의 가검균 DNA를 주형 DNA로 사용하였고, 실시예 1의 SG-L 및 R, SGP-L 및 R, 9R-L 및 R로 구성된 3쌍의 프라이머를 이용하여 표 7 및 표 8에 기재된 조건으로 triplex PCR을 수행하였으며, agarose gel에서 전기영동을 실시하였다(도 6).
[표 7] PCR 반응 혼합물 조성
시 약 첨가량(㎕) 최종농도
물 6.8
5× Taq buffer 5 1×
MgCl2(25mM) 1.5 1.5
dNTPs(10mM) 0.5 0.2
Primer SGP-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1 0.4μM
Primer SGP-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1 0.4μM
Primer SG-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Primer SG-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Primer 9R-L (10pmol/㎕ = 10μM) 2.5 1μM
Primer 9R-R (10pmol/㎕ = 10μM) 2.5 1μM
Taq pol(5U/㎕) 0.2 1U
주형 DNA(boiled lysate) 1
합계 25
[표 8] PCR 수행 조건
PCR 단계 온도 시간
1 cycle Predenaturation 94℃ 5분
30 cycles

 Denaturation 94℃ 30초
Annealing 64℃ 30초
Extension 72℃ 30초
1 cycle Final extension 72℃ 7분
이의 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 가금티푸스균주의 DNA를 주형 DNA로 사용하였을 경우에는 약 252bp 및 약 174bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었고, 백신용 생균 9R의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 약 252bp, 약 174bp 및 약 119bp, 추백리균의 DNA를 주형 DNA로 사용하였을 경우에는 약 252bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었으며, 다른 균주의 DNA를 주형으로 사용 하였을 경우에는 DNA의 증폭이 확인되지 않았다.
이는 상기 제 1 프라이머 쌍, 제 4 프라이머 쌍 및 제 5 프라이머 쌍을 이용하여 본 발명의 가금티푸스균 검출용 유전자 진단 방법을 적용하게 되면, 생물학적 시료로부터 가금티푸스균, 추백리균 및 백신용 생균 9R을 동시에 구별하여 검출할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 5. 제 1 프라이머 쌍, 제 4 프라이머 쌍, 제 5 프라이머 쌍 및 제 7 프라이머 쌍을 이용한 가금티푸스균, 추백리균, 가금티푸스 백신용 생균주 9R 및 백신용 생균주 SR2-N6의 감별
상기 실시예 2의 가검균 DNA를 주형 DNA로 사용하였고, 실시예 1의 SG-L 및 R, SGP-L 및 R, 9R-L 및 R, SR-L 및 R로 구성된 4쌍의 프라이머를 이용하여 표 9 및 표 10에 기재된 조건으로 multiplex PCR을 수행하였으며, agarose gel에서 전기영동을 실시하였다(도 7).
[표 9] PCR 반응 혼합물 조성
시 약 첨가량(㎕) 최종농도
물 3.8
5× Taq buffer 5 1×
MgCl2(25mM) 1.5 1.5
dNTPs(10mM) 0.5 0.2
Primer SGP-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1 0.4μM
Primer SGP-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1 0.4μM
Primer SG-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Primer SG-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Primer 9R-L (10pmol/㎕ = 10μM) 2.5 1μM
Primer 9R-R (10pmol/㎕ = 10μM) 2.5 1μM
Primer SR2-L (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Primer SR2-R (10pmol/㎕ = 10μM) 1.5 0.6μM
Taq pol(5U/㎕) 0.2 1U
주형 DNA(boiled lysate) 1
합계 25
[표 10] PCR 수행 조건
PCR 단계 온도 시간
1 cycle Predenaturation 94℃ 5분
30 cycles

 Denaturation 94℃ 30초
Annealing 64℃ 30초
Extension 72℃ 1분
1 cycle Final extension 72℃ 7분
이의 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 추백리균의 DNA를 주형 DNA로 사용하였을 경우에는 약 252bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었고, 가금티푸스균주의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 약 252bp 및 약 174bp, 백신용 생균주 9R의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 약 252bp, 약 174bp 및 약 119bp, 백신용 생균주 SR2-N6의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 약 361bp, 약 252bp 및 약 174bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었으며, 다른 균주의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 DNA의 증폭이 확인되지 않았다.
이는 상기 제 1 프라이머 쌍, 제 4 프라이머 쌍, 제 5 프라이머 쌍 및 제 7 프라이머 쌍을 이용하여 본 발명의 가금티푸스균 검출용 유전자 진단 방법을 적용하게 되면, 생물학적 시료로부터 가금티푸스균, 추백리균, 백신용 생균 9R 및 백신용 생균 SR2-N6을 동시에 구별하여 검출할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 5. 다양한 균주를 이용한 가금티푸스 감별동정법 타당성 입증
본 발명 유전자 진단 방법의 민감성 및 특이성을 조사하기 위하여, 표 11에 나타난 바와 같이 총 132주의 표준균주 및 야외분리균주를 대상으로 상기 실시예 5와 동일한 방법을 사용하여 multiplex PCR을 수행하였다.
이의 결과, 가금티푸스균 53주와 추백리균 21주 그리고 백신용 생균주 9R 및 SR2-N6은 정확히 감별 동정되었으며(민감성 100%), 기타 살모넬라균 및 장내세균 등과의 교차반응이 나타나지 않았다(특이성 100%).
[표 11] 가금티푸스 감별 동정용 유전자 진단법 개발 및 검증에 사용된 균주
Species or serovar Strain designation Sourceα
Salmonella enterica
serovar Gallinarum
biovar Gallinarum ATCC 9184 ATCC
ATCC 98252 ATCC
9R NVRQS
SR2-N6 NVRQS
biovar Pullorum ATCC 10398 ATCC
ATCC 19945 ATCC
4 NVRQS
11 NVRQS
296 NVRQS
serovar Enteritidis ATCC 13076 ATCC
serovar Typhimurium ATCC 14028 ATCC
serovar Agona S595 NVRQS
serovar Blockley S597 NVRQS
serovar Heidelberg S560 NVRQS
serovar Montevideo S336 NVRQS
serovar Muenchen S364 NVRQS
serovar Mbandaka S426 NVRQS
serovar Newport S371 NVRQS
serovar Senftenberg S182 NVRQS
serovar Tennessee S591 NVRQS
serovar Virchow S492 NVRQS
Escherichia coli ATCC 10536 ATCC
ATCC 35218 ATCC
αNVRQS : National Veterinary Research and Quarantine Service in Korea.
* Additional field isolate tested were 50 biovars Gallinarum isolates, 16 biovar Pullorum isolates, 13 serovar Enteritidis isolates, 2 serovar Typhimurium isolates, 19 E. coli isolate, 5 Proteus mirabilis isolates, 3 Enterobacter cloacae isolates and Morganella morganii isolate.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 가금티푸스균 및 근연의 추백리균을 신속하게 검출할 수 있고 아울러 가금티푸스 백신용 생균 또한 구별하여 검출할 수 있기 때문에, 가금티푸스의 신속 정밀한 진단을 통한 농장 방역처치 효과의 증대로 양계농가의 생산성 향상을 기대할 수 있다.
도 1은 가금티푸스균에 특이적인 glgC 유전자 부위의 염기서열 및 SG-L과 SG-R 프라이머(표 1)의 부착부위를 나타낸 것이다.
도 2는 가금티푸스균과 추백리균에 특이적인 speC 유전자 부위의 염기서열 및 SGP-L과 SGP-R 프라이머(표 2)의 부착부위를 나타낸 것이다.
도 3은 가금티푸스 백신용 생균 9R에 특이적인 클론 9R22C9의 염기서열 및 9R-L과 9R-R 프라이머(표 3)의 부착부위를 나타낸 것이다.
도 4는 가금티푸스 백신용 생균 SR2-N6에 특이적인 rfaL 유전자 부위의 염기서열 및 SR2-L과 SR2-R 프라이머(표 4)의 부착부위를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3의 PCR 증폭 산물을 전기영동한 사진이다.
도 6은 실시예 4의 PCR 증폭 산물을 전기영동한 사진이다.
도 7은 실시예 5의 PCR 증폭 산물을 전기영동한 사진이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Differential identification of Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum, Pullorum and biovar Gallinarum live vaccine strains <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1285 <212> DNA <213> Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum ATCC 9184 <400> 1 atggtgagtt tagagaagaa cgatcgtgta atgttggcgc gccagctgcc attgaaatct 60 gttgccctaa tcctggccgg cggccgtggc acgcgtctaa aagatttaac gaacaaacgc 120 gccaaaccag ccgtccactt tggtgggaag ttccgcatca tcgatttcgc cttatctaat 180 tgtctgaact ccgggattcg ccgtatcggc gtgatcactc agtatcagtc ccatacgctg 240 gtgcagcata ttcagcgcgg ctggtcactg tttagcgaag agatgaacga atttgtcgat 300 ctgctgccag ctcaacagcg tatgaagggc gaaaactggt atcgcggcac ggcagacgcg 360 gtgacccaga acctggatat tattcgtcgc tataaagcgg aatatgtcgt catcctggca 420 ggcgatcata tctacaagca ggactactcg cgtatgtttt gaaaagggcg cgcgttgcac 480 ggtggcctgt atgccggtgc cgatcaaaga ggcgacggcg ttcggcgtga tggcggtcga 540 tgaaagcgac aagattattg 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360 agcgtcatcg cgggacatct ggctcaggct accggttagt 400 <210> 4 <211> 1202 <212> DNA <213> Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum SR2-N6 <400> 4 ttatctattt cttagcgcca acagaaaacc agtaatgata ccaatttgag caatatcgac 60 ctgttcaaaa ttgccacgaa cgatataaaa accgacgaaa gataaaaata gcaagagatg 120 agcattgtag gggcttatct ctactttcct gaaggtagag ctggctgttt ccctgatgat 180 agcgccatat aaataggcca ggctcgccag acccaatatg cctgcactaa accagatgta 240 cagaatggta ttatgcggac cgatagattc tttaaaggtc cacgttggat aatcgacaac 300 gcgtttatta taaacaccat catacacatc attaccatag ccgtagccct tgatcggagt 360 atccacgcgg tgccctgggt tccgttagta taacgatatg agctatctgt ctgctgtaat 420 ttatacagta aatgttctgg gtctggtttg ttattatgtt gagtgataac caaagcgccg 480 ataatggcta ataaaatggc accaactcct attaacttcc attggcggtt cagtattgcc 540 cacagaacac ctactataag caccgccaac catgcccctc gcgatagggt tcccaggata 600 aagaaaaggt agatggcgct aagcaccaaa aaaaccaact taattgcatt ttttctaaac 660 agccaaatat tcaataatgc tggaaataag aaaaccatgg aatcggacat atgtcgatgc 720 gcatagctta tgaatggcat aatcccttta ttatagtcct cgatatacag aatactctct 780 gcaaggcagc gaagtcctaa acttgttaaa aaggagaaaa gtactatttt cgcaaccgtt 840 tcttttgttt catcttttaa tagtacggga attaataaag tatataataa gaaaccctcc 900 agtaccgtat tttcaaattc cttgaagctt tctttcatat ctggcgatat gagtatggaa 960 taaacaagga ttaatgataa tactgctacg ctataaaata cgctattttt gaaaagaggg 1020 gggaaacttt tcggtgagcg tgagacctga taaatcgcgg tgataaccat aagtatgatt 1080 atcaaatgtt tataacgcgt aataccatcc agaaaatacg tggcaacaaa aagaaaaacc 1140 agcgctttat tccagatcgg tttccatttc tctttattta acgttaatga tgtggttagc 1200 at 1202 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SG-L <400> 5 gatctgctgc cagctcaa 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SG-R <400> 6 gcgccctttt caaaacata 19 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGP-L <400> 7 ctgggcattg acgcaaa 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGP-R <400> 8 cggtgtactg cccgctat 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9R-L <400> 9 ctttacgggc aaaccacagt 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9R-R <400> 10 tgagatggaa aaagagcagc a 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SR2-L <400> 11 ccgtagccct tgatcggagt at 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SR2-R <400> 12 tccatggttt tcttatttcc agca 24

Claims (22)

  1. a) 생물학적 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; b) 상기 DNA를 주형으로 하고, 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; c) 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 분석하는 단계를 포함하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법에 있어서,
    상기 프라이머가
    서열번호 1의 염기서열 중 409 번째 내지 459 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 1 프라이머 쌍; 및
    서열번호 1의 염기서열 중 458 번째 내지 508 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 2 프라이머 쌍; 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하고,
    서열번호 2의 염기서열 중 1,219 번째 내지 1,269 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 3 프라이머 쌍; 및
    서열번호 2의 염기서열 중 1,268 번째 내지 1,318 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 4 프라이머 쌍; 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 프라이머 쌍은 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제 4 프라이머 쌍은 서열번호 7의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 주형으로 하고, 프라이머로 PCR을 수행하여, PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 분석함으로써 시료로부터 균주를 검출하는 키트에 있어서,
    서열번호 1의 염기서열 중 409 번째 내지 459 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 1 프라이머 쌍; 및
    서열번호 1의 염기서열 중 458 번째 내지 508 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 458 번째 염기 및 459 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 2 프라이머 쌍; 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하고,
    서열번호 2의 염기서열 중 1,219 번째 내지 1,269 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 3 프라이머 쌍; 및
    서열번호 2의 염기서열 중 1,268 번째 내지 1,318 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 적어도 어느 하나가 1,268 번째 염기 및 1,269 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 4 프라이머 쌍; 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 가금티푸스균, 추백리균 또는 가금티푸스 백신용 생균 검출용 키트.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 제 1 프라이머 쌍은 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 6항에 있어서, 상기 제 4 프라이머 쌍은 서열번호 7의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머가
    서열번호 3의 염기서열 중 99 번째 내지 178 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 하나가 99 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 99 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머이고, 다른 하나가 178번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 178 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 5 프라이머 쌍;
    서열번호 4의 염기서열 중 308 번째 내지 358 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 6 프라이머 쌍; 및
    서열번호 4의 염기서열 중 357 번째 내지 407 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 7 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 제 5 프라이머 쌍은 서열번호 9의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 제 7 프라이머 쌍은 서열번호 11의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  20. 제 6항에 있어서,
    서열번호 3의 염기서열 중 99 번째 내지 178 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 하나가 99 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 99 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머이고, 다른 하나가 178번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 178 번째 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 5 프라이머 쌍;
    서열번호 4의 염기서열 중 308 번째 내지 358 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기의 상보적인 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 6 프라이머 쌍; 및
    서열번호 4의 염기서열 중 357 번째 내지 407 번째 염기서열을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있으며, 한쪽이 357 번째 염기 및 358 번째 염기를 포함함과 동시에 상기 염기에 인접하며 연속적인 10 내지 50개의 연속 DNA로 구성되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 제 7 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 제 5 프라이머 쌍은 서열번호 9의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 제 7 프라이머 쌍은 서열번호 11의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 구성된 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
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