JP6156824B2 - ヨーネ菌検出用プライマー及びそれを用いたヨーネ菌の検出方法 - Google Patents
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そこで本発明では、上記非特許文献1記載のヨーネ病遺伝子検査とは異なるIS900上のDNA配列をターゲットとし、かつ、ヨーネ菌DNAを特異的に増幅できる、新規のヨーネ菌検出用プライマー、及びそれを用いたヨーネ病遺伝子検査法の開発を目的とした。
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
請求項2に係る本発明は、核酸増幅法によるヨーネ菌検出用プライマー対であって、以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(d)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対である:
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
請求項3に係る本発明は、核酸を含む検体について、請求項1及び/又は2に記載のプライマー対を用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物が検出された場合には、検体中にヨーネ菌(Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis)が存在すると判定する、ヨーネ菌の検出方法である。
請求項4に係る本発明は、さらに、以下の(e)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(f)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う、請求項3に記載のヨーネ菌の検出方法である:
(e)配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
請求項5に係る本発明は、核酸を含む検体が、複数の被検体由来の核酸を含む検体をプールして調製されたプール検体である、請求項3又は4に記載のヨーネ菌の検出方法である。
請求項6に係る本発明は、請求項1及び/又は2に記載のプライマー対を含む、ヨーネ菌検出用のキットである。
請求項7に係る本発明は、さらに、以下の(e)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(f)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対を含む、請求項6に記載のヨーネ菌検出用のキットである:
(e)配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
本発明は、核酸増幅法によるヨーネ菌検出用プライマー対であって、(a)配列番号1に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー(以下、「プライマーNo.3」と称する場合がある。)と(b)配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー(以下、「プライマーNo.32」と称する場合がある。)、或いは、(c)配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー(以下、「プライマーNo.15」と称する場合がある。)と(d)配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー(以下、「プライマーNo.36」と称する場合がある。)、を含むプライマー対を提供するものである。
本発明は次に、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法によるヨーネ菌の検出方法を提供する。この方法は、核酸を含む検体について、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、ヨーネ菌特異的増幅産物が検出された場合には、検体中にヨーネ菌が存在すると判定するものである。
本発明において‘核酸を含む検体’としては、被検体である牛、水牛、山羊、めん羊、鹿といった反芻獣の糞便、組織(腸管、リンパ節等)、その培養物、それらの希釈溶液などが挙げられる。なお、糞便や組織の培養は、マイコバクチン、卵黄液添加Middlebrook 7H10寒天培地、マイコバクチン添加ハロルド培地などヨーネ菌の培養に適した培地を用いて公知の方法で行うことができる。
すなわち、(e)配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー(以下、「MP10-1」と称する場合がある。)と(f)配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマー(以下、「プライマーMP11-1」と称する場合がある。)を含むプライマー対を用いることができる。
この非特許文献1記載のプライマーは、本発明に係る上記オリゴヌクレオチドプライマーとはターゲットとする塩基配列が異なる上に、他の抗酸菌DNAに対して非特異的増幅を起こさないことが知られているため、好適である。
本発明における核酸増幅反応は、上記2種の本発明に係るプライマー対を反応液中に共存させて行うマルチプレックスPCRにより行っても良い。また、本発明の1種又は2種のプライマー対と、非特許文献1のプライマー対と、を組み合わせて用いる場合には、マルチプレックスPCRで行うこともできる。
上記プライマー対はヨーネ菌のIS900を特異的に増幅し、他のヨーネ菌IS900類似の塩基配列を有する抗酸菌DNAを増幅しないことから、増幅産物がヨーネ菌特異的なものか否かを判定する必要が無いからである。
一方、増幅産物が検出されなかった場合には、検体中にヨーネ菌が存在しない(陰性)と判定することができる。
本発明においては、上述の検出方法をプール検体に対して適用することで‘スクリーニング検査’を実施することもできる。
すなわち、上述の検出方法において、‘核酸を含む検体’として‘プール検体’を用いたものが、本発明のスクリーニング検査方法である。
‘核酸を含む検体’としては、被検体の糞便、組織(腸管、リンパ節等)、その培養物、それらの希釈溶液などが挙げられる。なお、糞便や組織の培養方法については前述の通りである。
プール検体の具体的な調製方法については、増幅産物の検出が可能である限りにおいて、特に限定されない。具体的な調製方法としては、複数の検体の混合物から一部分を抽出して核酸増幅反応に供する方法や、各検体から一部分ずつ抽出して混合して核酸増幅反応に供する方法、複数の検体の混合物を濃縮(例えば遠心分離後に上清を廃棄)して核酸増幅反応に供する方法、各検体の濃縮物(例えば遠心分離後に上清を廃棄したもの)を混合して核酸増幅反応に供する方法、などが挙げられる。
検査工程のどの段階でDNA抽出を行うかは、核酸増幅反応を行う前であれば特に限定されず、プール検体を調製した後にDNA抽出を行っても良いし、プールする前に各検体についてそれぞれDNAを抽出することもできる。しかし、工程の簡素化やコスト節約の観点から、プール検体調製後にDNA抽出を行うのが好ましい。
なお、DNAの抽出方法については前述の通りである。
この非特許文献1記載のプライマーは、本発明に係る上記オリゴヌクレオチドプライマーとはターゲットとする塩基配列が異なる上に、他の抗酸菌DNAに対して非特異的増幅を起こさないことが知られているため、好適である。
上記プライマー対はヨーネ菌のIS900を特異的に増幅し、他のヨーネ菌IS900類似の塩基配列を有する抗酸菌DNAを増幅しないことから、増幅産物がヨーネ菌特異的なものか否かを判定する必要が無いからである。
一方、増幅産物が検出されなかった場合には、プール検体中にヨーネ菌が存在しない(陰性)と判定することができる。
なお、増幅産物の具体的な検出方法については前述の通りである。
なお、当該確定検査は、上述した本発明の検出方法や、従来行われているヨーネ病遺伝子検査(非特許文献1参照)等と同様に行うことができる。
本発明はまた、前述のヨーネ菌検出用プライマー対を含むヨーネ菌検出用のキットも提供する。
すなわち、当該キットは、上記(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと上記(b)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含むプライマー対、及び/又は、上記(c)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと上記(d)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含むプライマー対、を含むヨーネ菌検出用キットである。
従来公知のヨーネ菌検出用プライマーとしては、例えば、上述の非特許文献1記載のヨーネ菌検出用プライマー、すなわち、上記(e)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと上記(f)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含むプライマー対、を用いることができる。
当該キットは、本発明に係る‘ヨーネ菌の検出方法’、‘ヨーネ菌のスクリーニング検査方法’及びそれに続く‘確定検査’において、非常に便利に用いることができる。
ヨーネ菌IS900の塩基配列(1,541bp)のうち、比較的多様性に富む領域である450-1072番目の塩基からなる領域に含まれる塩基配列をターゲットとするリアルタイムPCR系を構築する為に、76種類のプライマーの組み合わせ(図1)について、ヨーネ菌DNAとヨーネ菌類似の抗酸菌DNAを用いて検討した。
1. 抗酸菌及びDNAの調製法
供試抗酸菌として、ヨーネ菌と遺伝学的に類似性の高い抗酸菌を中心として48菌株を使用した。Mycobacterium avium subsp. aviumとMycobacterium avium subsp. hominissuisは鳥型結核菌群の抗酸菌であり、Mycobacterium sp. 2333株はIS900と高い相同性を有する挿入配列を有することが知られており、Mycobacterium intracellulareとMycobacterium scrofulaceumはヨーネ菌と遺伝学的に類似性の高い抗酸菌とされている。
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (ヨーネ菌)42-13-1株、ATCC 19698株
Mycobacterium avium subsp. avium P-18株、S-1株、S-2株、S-3株、Ac-1株、Ac-3株
Mycobacterium avium subsp. hominissuis S-4株、S-5株、S-6株、S-8株、S-9株、S-10株、S-11株、OIT-2株
Mycobacteroum avium complex Ac-21株、Ac-22株、Ac-24株、Ac-28株
Mycobacterium sp. 2333株
Mycobacterium intracellulare S-7株、S-12株、S-13株、S-14株、S-15株、S-16株、S-17株、S-20株、Ac-20株、Ac-23株、Ac-25株、Ac-27株
Mycobacterium scrofulaceum AC-41株、AC-42株、AC-43株、S-41株、S-42株、S-43株
Mycobacterium marseillense S-18株
Mycobacterium chimaera S-19株、Ac-19株
Mycobacterium smegmatis 155株
Mycobacterium terrae AOM-1株
Mycobacterium fortuitum Mie-8株
Mycobacterium thermoresistibile NLBC 9-H株
Mycobacterium hassiacum MYZ-19株
Mycobacterium porcinum MYZ-1株
培養後の各菌株のDNAを、ヨーネ菌DNA抽出・精製キット「ヨーネスピン(登録商標)」(ファスマック社)を用いて抽出し、約400ng/mlのDNA濃度となるようにTE緩衝液を用いて調製した。DNA濃度は、分光光度計を用いて波長260nmと280nmの吸光度より算出した。
ヨーネ菌IS900(1,541bp)の塩基配列と94%の相同性を有するISを保有するMycobacterium sp. 2333株の塩基配列を比較検討し、相同性が比較的低いIS900の中央部領域、450-1072番目までのDNA配列を標的として、リアルタイムPCR用のプライマーを選択した。
フォワードプライマーとしては、図1に示すように、IS900の450番目-897番目の塩基からなる領域から選択された15種類のプライマーを用いた。リバースプライマーとしては、これも図1に示すように、IS900の601番目-1072番目の塩基からなる領域から選択された24種類のプライマーを用いた。
PCR産物のサイズが300bp以下となるように、種々のプライマーの組み合わせを設定し、最終的に76種類のプライマーの組み合わせ(図1)を比較検討した。
プライマーの合成は他社に委託し、精製は逆相カラムにより行った。
SYBR Green インターカレーション法によるリアルタイムPCRは、「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」(キアゲン社)または「GeneAce SYBR qPCR Mix」(ニッポンジーン社)を用いて実施した。プライマーの選択試験には主にキアゲン社のキットを使用し、そこで比較的特異性と感度が高いことが明らかとなったプライマーの組み合わせについては、ニッポンジーン社のキットを用いる試験も同時に実施した。
いずれのキットを用いる場合も、PCR反応液は以下の表1に示す様に調製した。
また、リアルタイムPCR装置として、ロシュダイアグノスティクス社製LightCycler 480、あるいはタカラバイオ社製Dice TP800を使用した。
ヨーネ菌IS900の塩基配列の中央部をターゲットとするリアルタイムPCR用フォワードプライマー15種類、リバースプライマー24種類について、76種類のプライマーの組み合わせ(図1)について検討した結果、以下の2種類のプライマーの組み合わせを用いるリアルタイムPCRが、特に高い特異性とDNA増幅効率を示すことが明らかとなった。
フォワードプライマーNo.3:GCCGGGCAGCGGCTGCTTTATA(配列番号1)
リバースプライマーNo.32:GCGCGCAGAGGCTGCAAGTCGT(配列番号2)
2. リアルタイムPCR15-36
フォワードプライマーNo.15:CCAGCCGACGTTCCGATCTGGTG(配列番号3)
リバースプライマーNo.36:TCGGGAGTTTGGTAGCCAGTAAGCAGGAT(配列番号4)
Maa: Mycobacterium avium subsp. avium
Mah: Mycobacterium avium subsp. hominissuis
Mac: Mycobacterium avium complex
+: DNA増幅有り、 −: DNA増幅無し
前述の特許文献1に記載のヨーネ菌検出用プライマーの塩基配列(配列番号7、8)は、図4に示すように、本発明のフォワードプライマーNo.3とリバースプライマーNo.36の塩基配列と部分的に一致していた。
上記実施例1の3.で試験したプライマーNo.3(配列番号1)とプライマーNo.32(配列番号2)、プライマーNo.15(配列番号3)とプライマーNo.36(配列番号4)の組み合わせを用いて、実験感染牛の糞便又は組織乳剤を対象としたリアルタイムPCR試験を行った。
また、ヨーネ菌実験感染牛の腸管組織を生理食塩液で懸濁して5%腸管乳剤を調製し、次いで上記の糞便からの方法と同様にして当該腸管乳剤からDNAを抽出・精製し、DNA液を得た。
プライマーNo.3-32及びプライマーNo.15-36の組み合わせによるリアルタイムPCRは、「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」(キアゲン社)を用いて、上記実施例1の3.と同様にして実施した。
ヨーネ菌精製DNAを標準として用いて上記リアルタイムPCRを行い、DNA増幅が見られた検体中のヨーネ菌DNA濃度を算出した。
各検体のヨーネ菌DNA濃度(pg/2.5μL)の計算結果を表3に示す。
ヨーネ菌実験感染牛及び健康牛の糞便を用いてプール糞便(プール検体)を模擬的に調製し、プライマーNo.3-32、プライマーNo.15-36、及び、従来のヨーネ病遺伝子検査(非特許文献1参照)で用いられるプライマー、の組み合わせを用いて、スクリーニング検査を行った。
1. 陽性糞便:ヨーネ菌実験感染牛由来の糞便を用いた。ヨーネ菌を含み、従来のヨーネ病遺伝子検査(非特許文献1参照)では、本糞便の20倍(W/V)希釈液1mlから調製されたDNA液中にヨーネ菌DNAが約0.001pg/2.5μl程度検出される。
3頭の健康牛糞便を用いて、同一個体の糞便希釈液量を増やすことにより模擬プール糞便を調製した。すなわち、上記糞便をそれぞれ常法により20倍(W/V)希釈して、陽性糞便液及び健康牛糞便液とした。次に、陽性糞便液1ml(1頭分)と健康牛糞便液4ml(4頭分)とを混合したものを5頭プール糞便、陽性糞便液1ml(1頭分)と健康牛糞便液9ml(9頭分)とを混合したものを10頭プール糞便として、各プール糞便からヨーネスピン(登録商標、ファスマック社)を用いてDNAを抽出・精製し、DNA液を得た。
SYBR Green インターカレーション法によるリアルタイムPCRは、「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」(キアゲン社)を用いて、上記実施例1の3.と同様にして実施した。
プライマーとしては、プライマーNo.3(配列番号1)とNo.32(配列番号2)、あるいはプライマーNo.15(配列番号3)とNo.36(配列番号4)の組み合わせに加え、従来のヨーネ病遺伝子検査(非特許文献1参照)で用いられるMP10-1(配列番号5)とMP11-1(配列番号6)の組み合わせも用いた。
リアルタイムPCR装置としては、ロシュダイアグノスティクス社製LightCycler 480を使用した。
判定は、陽性コントロールとして用いたヨーネ菌精製DNAと同様なTm値を示すPCR増幅産物が検出された場合、陽性と判定した。
ヨーネ菌DNAが0.001pg/2.5μl程度検出される陽性牛糞便液と、健康牛3頭の糞便液を用いてサンプル量を増やすことにより調製した模擬プール糞便を用いてスクリーニング試験を実施した結果を表4に示す。
その結果、5頭プールあるいは10頭プール糞便液から抽出されたDNAを用いるリアルタイムPCR検査の判定は全て陽性となった。このことから、上記のプライマーを用いるリアルタイムPCRは、複数頭の糞便を混合して試験する、所謂プール糞便試験(スクリーニング検査)にも応用可能であることが明らかとなった。
陽性糞便のみ(1頭分、1ml)からDNAを抽出・精製しリアルタイムPCRを行った場合、そのCt値は約32〜33サイクルであったが、プール糞便の場合はCt値が約33〜37に上昇した。このCt値の上昇は、プール糞便ではDNA抽出に用いる糞便量が大幅に増える為、糞便に含まれるPCR阻害物質の量も増えたことに起因するものと考えられる。
配列番号2:プライマーNo.32
配列番号3:プライマーNo.15
配列番号4:プライマーNo.36
配列番号5:プライマーMP10−1
配列番号6:プライマーMP11−1
配列番号7:特開2006−25606のフォワードプライマー
配列番号8:特開2006−25606のリバースプライマー
Claims (7)
- 核酸増幅法によるヨーネ菌検出用プライマー対であって、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(b)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対:
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 核酸増幅法によるヨーネ菌検出用プライマー対であって、以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(d)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対:
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 核酸を含む検体について、請求項1及び/又は2に記載のプライマー対を用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物が検出された場合には、検体中にヨーネ菌(Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis)が存在すると判定する、ヨーネ菌の検出方法。
- さらに、以下の(e)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(f)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う、請求項3に記載のヨーネ菌の検出方法:
(e)配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 核酸を含む検体が、複数の被検体由来の核酸を含む検体をプールして調製されたプール検体である、請求項3又は4に記載のヨーネ菌の検出方法。
- 請求項1及び/又は2に記載のプライマー対を含む、ヨーネ菌検出用のキット。
- さらに、以下の(e)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、以下の(f)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーと、を含むプライマー対を含む、請求項6に記載のヨーネ菌検出用のキット:
(e)配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
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