JP6671620B1 - ヨーネ菌検出用プローブ、それを用いたヨーネ菌の検出方法並びにヨーネ菌検出用キット - Google Patents

Abstract

【課題】従来技術のインターカレーション法とは異なり、標的遺伝子に特異的な蛍光標識プローブを用いて核酸増幅を検出する、ハイブリダイゼーション法（プローブ法）を用いたヨーネ病遺伝子検査法を開発すること。【解決手段】５’末端が蛍光物質で修飾され、且つ、３’末端がクエンチャー物質で修飾された、配列番号１〜５のいずれか一つに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるヨーネ菌検出用プローブ、並びに、核酸を含む検体について、ヨーネ菌由来の核酸を標的とした核酸増幅反応を行うヨーネ菌の検出方法において、前記ヨーネ菌検出用プローブを用いて、前記ヨーネ菌由来の核酸を特異的に検出することを特徴とするヨーネ菌の検出方法、を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヨーネ菌の核酸増幅法による検出に関し、具体的には、ヨーネ菌の挿入配列IS900を特異的に検出するプローブ、及びそれを用いたヨーネ菌の検出方法に関する。

ヨーネ病はMycobacterium avium subspecies paratuberculosis（ヨーネ菌）によって惹起される反芻獣の慢性肉芽腫性腸炎で、家畜伝染病予防法に規定された重要疾病である。ヨーネ菌は増殖速度が極めて遅いため、培養検査に代わる迅速診断法として、平成25年度よりリアルタイムPCRを用いて糞便中ヨーネ菌DNAを検出・定量する遺伝子検査法が導入されている（非特許文献１、２参照）。

非特許文献１、２に記載された現行のリアルタイムPCR検査では、ヨーネ菌の挿入配列（IS900）を標的とし、蛍光物質（SYBR green I）を用いたインターカレーション法により増幅するDNAを検出・定量している。インターカレーション法によるリアルタイムPCRは、二本鎖DNAに非特異的に結合する蛍光物質を用いて核酸増幅を検出する方法であり、その反応に特異性はない。

したがって、標的遺伝子が増幅したことを確認するには、PCR反応に続けて融解曲線解析を行い、融解温度を測定する必要があった。また、従来技術においては、非特異的な増幅が陽性と判定される事例や、標的遺伝子の定量結果へ影響を及ぼす事例が報告されており、改良が望まれていた。

「ヨーネ病検査マニュアル」、[online]、平成30年2月1日、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門、［平成31年3月26日検索］、インターネット（https://scms.naro.affrc.go.jp/laboratory/niah/disease/files/NIAH_yone_kensahou_180201.pdf） Satoko Kawajiら、Veterinary Microbiology、2007年、第125巻、p.36-48

本発明では、非特許文献１、２に記載のインターカレーション法とは異なり、標的遺伝子に特異的な蛍光標識プローブを用いて核酸増幅を検出する、ハイブリダイゼーション法（プローブ法）を用いたヨーネ病遺伝子検査法の開発を目的とした。

上記の従来技術で用いられているPCRプライマーは、IS900類似の塩基配列を有する種々の抗酸菌由来DNAを用いた交差試験において高い特異性が確認されている（非特許文献２参照）。そこで本発明者らは、当該従来技術と同じプライマーにより増幅される、ヨーネ菌IS900（1,451bp、Accession：X16293）の581〜763番目の領域に結合する蛍光標識プローブを様々検討した結果、リアルタイムPCRで高い蛍光強度を示し、標的遺伝子であるヨーネ菌DNAの増幅を効率良く検出できるプローブを複数特定した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、配列番号１〜５のいずれか一つに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。

上記オリゴヌクレオチドは、ヨーネ菌DNA（IS900）に対して特異的に結合するため、ヨーネ菌検出用プローブとして用いることができる。これらのプローブを蛍光標識してIS900を標的とした核酸増幅反応に用いることで、ヨーネ菌DNAの増幅を高精度で且つ効率良く検出することが可能となる。

本発明は、核酸を含む検体について、ヨーネ菌由来の核酸を標的とした核酸増幅反応を行うヨーネ菌の検出方法において、上記のヨーネ菌検出用プローブを用いてヨーネ菌由来の核酸を特異的に検出することを特徴とする、ヨーネ菌の検出方法に関する。
本発明はまた、上記ヨーネ菌検出用プローブを含むヨーネ菌検出用キットに関する。

本方法及びキットでは、上記のヨーネ菌検出用プローブを用いることにより、ヨーネ菌DNAを特異的に検出できるため、検出結果の信頼性が向上する。また、高い蛍光強度を示すため効率の良い検出が可能である。本方法及びキットをリアルタイムPCR検査に適用した場合には、ヨーネ菌DNAの正確な定量も可能となる。

本発明によれば、上記ヨーネ菌検出用プローブがヨーネ菌DNAの挿入配列IS900に対して特異的に結合し、また高い蛍光強度を示すことにより、迅速且つ正確にヨーネ菌を検出することができる。

実施例１において検討した、ヨーネ菌IS900の581〜763番目の領域に結合する10種類のプローブと、プライマーMP10-1、MP11-1を示す図である。 実施例１におけるリアルタイムPCR条件を示す図である。 実施例１における10種類のプローブを用いたリアルタイムPCRにおける蛍光増幅曲線を示す図である。図中、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を示す。No.6のプローブを用いた場合の増幅曲線を太い矢印で示す。 ヨーネ菌DNA 10〜0.001pgを鋳型とし、No.0又はNo.6のプローブを用いたリアルタイムPCRによる蛍光増幅曲線を比較した図である。図中、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を示す。また、プローブNo.6による増幅曲線を薄い色の矢印で示し、プローブNo.0による増幅曲線を濃い色の矢印で示す。（実施例２） 従来技術のインターカレーション法によるリアルタイムPCRにおける融解曲線解析の結果を示す図である。図中、検体の融解曲線を黒色の矢印で示し、陽性コントロールの融解曲線を灰色の矢印で示す。（比較例） 図５のリアルタイムPCRで得られた増幅産物についてのアガロースゲル電気泳動写真像図である。（比較例） 従来技術のインターカレーション法によるリアルタイムPCRにおける融解曲線解析の結果を示す図である。図中、検体の融解曲線（黒いライン）における非特異的増幅産物によるピークを黒色の矢頭で示し、陽性コントロールの融解曲線（灰色のライン）を灰色の矢印で示す。（比較例） 比較例におけるリアルタイムPCR条件を示す図である。

〔オリゴヌクレオチド（ヨーネ菌検出用プローブ）〕
以下において、本願に係るオリゴヌクレオチド又はヨーネ菌検出用プローブの実施形態について説明する。

従来技術のインターカレーション法によるリアルタイムPCR検査において用いられるプライマーMP10-1、MP11-1は、ヨーネ菌DNAに特徴的な挿入配列であるIS900（Accession：X16293）をターゲットとしているが、IS900の類似配列を有する他の抗酸菌DNAは増幅せず、高い特異性が確認されている（非特許文献１、２）。そこで、本発明者らは、当該プライマーMP10-1、MP11-1により増幅されるIS900の581〜763番目の領域に結合するオリゴヌクレオチドを種々検討し、リアルタイムPCRにおいて高い蛍光強度を示し、ヨーネ菌IS900の増幅を正確かつ効率よく検出できるヨーネ菌検出用プローブを特定した。

本実施形態のオリゴヌクレオチドは、ヨーネ菌IS900の581〜763番目（配列番号８）の塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドに対して特異的に結合するように設計、選択されたオリゴヌクレオチドであり、ヨーネ菌検出用プローブとして用いることができる。

すなわち、本実施形態のオリゴヌクレオチドは、配列番号８に示される塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドのうち、連続した22〜27塩基、好ましくは連続した22〜24塩基からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号８に示される塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドに対して特異的に結合するものであることができる。

より具体的には、本実施形態のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５のいずれか一つに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることができる。

上記オリゴヌクレオチドはさらに、５’末端が蛍光物質で修飾され、且つ、３’末端がクエンチャー物質で修飾された、ヨーネ菌検出用プローブとすることができる。なお、蛍光物質としては例えばＦＡＭなどが挙げられ、クエンチャー物質としては例えばＴＡＭＲＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。

かかる構成のプローブをハイブリダイゼーション法（プローブ法）によるリアルタイムPCRに用いると、アニーリングステップでヨーネ菌由来の核酸（具体的にはIS900の581〜763番目の領域）に特異的に結合するが、この段階ではプローブ上に蛍光物質とクエンチャー物質が近接しているために、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、DNA合成酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、ヨーネ菌由来の核酸に結合したプローブが分解されることにより、蛍光物質がプローブから遊離し、クエンチャー物質による抑制が解除されて蛍光を発するようになる。したがって、蛍光発光が検出されれば、プローブが結合するヨーネ菌由来の核酸が検出されたと言うことができ、すなわち検体中にヨーネ菌が含まれることが分かる。

また、リアルタイムPCR装置でこの蛍光を測定することにより、ヨーネ菌由来の核酸を定量することができる。ヨーネ病遺伝子検査においては、このようにして求められるヨーネ菌由来の核酸の定量値を、所定のヨーネ病の診断基準値（非特許文献１参照）と比較することによって、検体がヨーネ病に罹患しているかどうか判定することができる。

〔ヨーネ菌の検出方法〕
次に、本願に係るヨーネ菌の検出方法の実施形態について説明する。

本実施形態におけるヨーネ菌の検出方法は、上記のヨーネ菌検出用プローブを用いてヨーネ菌由来の核酸を特異的に検出することを特徴とするものである。この方法は、核酸を含む検体について、ヨーネ菌由来の核酸を標的とした核酸増幅反応を行い、上記のヨーネ菌検出用プローブを用いて、当該ヨーネ菌由来の核酸を特異的に検出するものである。

本実施形態に係る検出方法では、まず、核酸を含む検体からDNAを抽出することが好ましい。「核酸を含む検体」としては、牛、水牛、山羊、めん羊、鹿といった反芻獣の糞便、組織（腸管、リンパ節等）、その培養物、それらの希釈溶液などが挙げられる。ここで、検体は、個体ごとに採取した検体であってもよく、複数の個体から採取した検体を混合したプール検体であってもよい。なお、糞便や組織の培養は、マイコバクチン、卵黄液添加Middlebrook 7H10寒天培地、マイコバクチン添加ハロルド培地などヨーネ菌の培養に適した培地を用いて公知の方法で行うことができる。検体からのDNA抽出は、ヨーネ菌のゲノムDNAを抽出できる公知の方法、例えば「ヨーネスピン（登録商標）ver2」（ファスマック社）、「ヨーネ・ピュアスピン」（ファスマック社）など市販のヨーネ菌DNA抽出キットを用いて行うことができる。

次に、検体又は検体から抽出したDNAについて、ヨーネ菌由来の核酸を標的とした核酸増幅反応を行う。「核酸増幅反応」としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）や、それを応用したリアルタイムPCRなどが挙げられる。核酸増幅反応を行う際の反応液組成や温度サイクル条件の各温度及び反応時間等は、当業者であれば、使用する核酸増幅法、プライマーのTm値、サーマルサイクラーの仕様などに合わせて適宜定めることができる。例えばPCRの場合、95〜98℃で5〜30秒間の熱変性の後、55〜68℃で10〜60秒間及び68〜72℃で15〜60秒間のアニーリング及び伸長反応を１サイクルとして40〜50サイクル行う温度サイクル条件で核酸増幅反応を実施しても良い。

核酸増幅反応における標的遺伝子である「ヨーネ菌由来の核酸」としては、ヨーネ菌IS900の581〜763番目（配列番号８に示される塩基配列）からなるポリヌクレオチドが挙げられる。

核酸増幅反応において用いられるプライマー対は、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅できるものであれば良い。そのようなプライマー対としては、例えば、配列番号８に示される塩基配列の５’末端における連続した17〜30塩基、好ましくは18〜25塩基、より好ましくは21〜22塩基からなるオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）、並びに、配列番号８に示される塩基配列の相補配列の５’末端における連続した17〜30塩基、好ましくは18〜25塩基、より好ましくは21〜22塩基からなるオリゴヌクレオチド（リバースプライマー）、からなるものが挙げられる。

より具体的には、上記プライマー対としては、以下の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる。
（ａ）配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このプライマー対は、ヨーネ菌以外の抗酸菌DNAに対して非特異的増幅を起こさないことが知られているため、好適である。

本実施形態のヨーネ菌検出方法は、検体に含まれる核酸を鋳型とし、上記のヨーネ菌検出用プローブと上記のプライマー対の存在下で核酸増幅反応を行う工程と、当該核酸増幅反応の結果として得られる増幅産物（ヨーネ菌由来の核酸）を特異的に検出する工程と、を含むものである。

上記した核酸増幅反応の結果として得られるヨーネ菌由来の核酸増幅産物（具体的には、ヨーネ菌IS900の581〜763番目からなるポリヌクレオチド）は、上記のヨーネ菌検出用プローブを用いて特異的に検出することができる。そして、増幅産物が検出された場合には、直ちに検体中にヨーネ菌が存在する（陽性）と判定することができる。一方、増幅産物が検出されなかった場合には、検体中にヨーネ菌が存在しない（陰性）と判定することができる。当該ヨーネ菌検出用プローブは、ヨーネ菌特異的増幅産物（具体的には、ヨーネ菌IS900の581〜763番目からなるポリヌクレオチド）にのみ結合し、非特異的増幅産物には結合しないためである。

増幅産物の検出は、例えば、５’末端が蛍光物質で、３’末端がクエンチャー物質で、それぞれ修飾された上記のヨーネ菌検出用プローブを用いて核酸増幅反応を行い、一旦増幅産物にアニーリングした当該プローブが分解される際に発する蛍光を検出することにより、行うことができる。ここで、蛍光発光が検出されれば検体中にヨーネ菌が存在する（陽性）と判定でき、蛍光発光が検出されなければ検体中にヨーネ菌が存在しない（陰性）と判定できる。さらに、経時的に反応液の蛍光強度を測定するリアルタイムPCRを用いて検出を行えば、核酸増幅反応から増幅産物の検出までを閉鎖系で行えるため、コンタミネーションが起きる危険性が他の方法に比べて少ない点で優れている。

さらに、リアルタイムPCR法では、PCRにより標的遺伝子の増幅が指数関数的に起こる領域内に閾値を設定し、蛍光増幅曲線が閾値と交差する点をスレッショルド・サイクル値（Ct値）とし、Ct値から各検体中の標的遺伝子の初期濃度を算出することが可能である。そのため、検体中のヨーネ菌由来の核酸濃度を算出し、所定のヨーネ病判定基準値（非特許文献１参照）と比較することによって、検体がヨーネ病に罹患しているかどうか判定することができる。

また、例えば核酸増幅反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅産物の存在及びサイズを確認することもできる。そして、ヨーネ菌DNAを鋳型として用いた場合と比較することで、検体中にヨーネ菌が存在するか否か判定することができる。

〔ヨーネ菌検出用のキット〕
次に、本願に係るヨーネ菌検出用キットの実施形態について説明する。
本実施形態のヨーネ菌検出用キットは、前述のヨーネ菌検出用プローブを含むことを特徴とするものであり、前述のヨーネ菌検出方法において好適に用いることができる。

本実施形態のヨーネ菌検出用キットは、さらに、核酸増幅反応により上記のヨーネ菌由来の核酸（具体的には、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）を増幅できるプライマー対を含んでいても良い。当該プライマー対としては、例えば、上記の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる。

当該キットは、さらに、必要に応じて核酸増幅反応及び増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、酵素、dNTP、NTP、緩衝液、滅菌水、標品（ヨーネ菌標準菌株、ヨーネ菌標準DNAなど）等を含んでいても良い。

以下に実施例、および比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（ヨーネ菌IS900に結合するリアルタイムPCR用プローブの検討）
ヨーネ菌IS900の塩基配列（1,451bp、GenBank Accession no. X16293）のうち、従来技術（非特許文献１、２）と同じプライマー（MP10-1およびMP11-1）により増幅される581〜763番目の領域に結合する蛍光標識プローブ10種類（図１）を検討し、プローブ法によるリアルタイムPCR反応系を構築した。

〔材料と方法〕
1. ヨーネ菌及びDNAの調整法
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis（ヨーネ菌）42-13-1株を、マイコバクチンを含むMiddlebrook 7H10培地で培養し、ヨーネ菌DNA抽出・精製キット「ヨーネスピン（登録商標）」（ファスマック社）を用いてDNAを抽出した。分光光度計を用いて波長260 nmと280 nmの吸光度を測定し、DNA濃度を算出した。DNA濃度が約400 pg/mlとなるようにTris-EDTA緩衝液を用いて調整した。

2. ヨーネ菌IS900に結合するリアルタイムPCR用蛍光標識プローブの設計
ヨーネ菌IS900の581〜763番目の領域内で、センス鎖に結合するプローブ8種類とアンチセンス鎖に結合するプローブ2種類を選択した（図１）。
蛍光標識プローブの合成は他社に委託し、5’末端をFAM（蛍光物質）、3’末端をTAMRA（クエンチャー物質）で修飾し、HPLCにより精製を行った。

3. リアルタイムPCRによるDNAの検出・定量
上記プローブのうち１種類と、非特許文献１、２に記載された下記のプライマーセットを用いて、ヨーネ菌DNAを鋳型としたリアルタイムPCR（プローブ法）を実施した。プライマーの合成は他社に委託し、精製は逆相カラムにより行った。プライマーおよびプローブの希釈にはTris-EDTA緩衝液を用いた。

（プライマー）
MP10-1：ATGCGCCACGACTTGCAGCCT（配列番号６）
MP11-1：GGCACGGCTCTTGTTGTAGTCG（配列番号７）

反応容量は25μl/wellとし、プライマー各12.5 pmol、蛍光標識プローブ7.5 pmol、ヨーネ菌DNA 1 pg、を各ウェルに添加してリアルタイムPCRを実施した。リアルタイムPCRの条件は図２に示す通りとし、各プローブにつき２ウェルずつ行った。リアルタイムPCR装置として、LightCycler 480II（ロシュダイアグノスティックス社）、あるいはQuantStudio-3（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。

〔結果〕
ヨーネ菌IS900の塩基配列のうち、従来技術（非特許文献１、２）と同じプライマーにより増幅される領域に結合する蛍光標識プローブ10種類（図１）を検討した結果、プローブによってリアルタイムPCRの蛍光強度やスレッショルド・サイクル値（Ct値）が異なることが明らかとなった（図３）。図３は、10種類のプローブを用いたリアルタイムPCRにおける蛍光増幅曲線を示す図である。図３において、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数（Ct）を示す。また、No.6のプローブを用いた場合の増幅曲線を太い矢印で示す。

特に以下の5種類のプローブは高い蛍光強度を示し、標的遺伝子の増幅を効率良く検出することができた（表１）。したがって、これらの蛍光標識プローブをリアルタイムPCR（プローブ法）によるヨーネ菌検出方法に利用することで、迅速かつ効率良くヨーネ菌DNAを検出できることが示された。なお、PCR反応液の組成を変えて上記のリアルタイムPCRを実施した場合にも、図３、表１と同様の傾向が見られた。

No. 6：ATCGCCCGGGTCCGATCAGCCAC（配列番号１）
No. 2：AGCAGCTGGGCGCGCATTCGGT（配列番号２）
No. 9：CCAGCAGCTGGGCGCGCATTCGGTTCG（配列番号３）
No. 4：CCCGGGTCCGATCAGCCACCAGA（配列番号４）
No. 7：CCGGGTCCGATCAGCCACCAGA（配列番号５）

実施例２（リアルタイムPCRによるヨーネ菌DNAの検出）
実施例１に記載した蛍光標識プローブを用いて、リアルタイムPCR（プローブ法）によるヨーネ菌検出方法を実施した。ヨーネ菌DNAは、実施例１と同様にして調整したDNAを、Tris-EDTA緩衝液を用いて10倍段階希釈し、10〜0.001 pg/wellとなるように添加した。蛍光標識プローブは、実施例１のプローブNo.6又はプローブNo.0（比較例）を使用した。上記以外の条件については全て実施例１と同様にして、プローブ法によるリアルタイムPCRを実施した。

その結果、プローブNo.6はプローブNo.0に比べて検出される蛍光強度が強く、高いDNA増幅効率を示した（図４）。図４は、上記のリアルタイムPCRによる蛍光増幅曲線を示す図である。図４において、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を示す。また、プローブNo.6による増幅曲線を薄い色の矢印で示し、プローブNo.0による増幅曲線を濃い色の矢印で示す。したがって、プローブNo.6を用いたプローブ法によるリアルタイムPCRによって、ヨーネ菌DNAを迅速かつ効率よく検出できることが示された。

比較例（インターカレーション法によるリアルタイムPCRとの比較）
インターカレーション法によるリアルタイムPCRを用いてヨーネ菌DNAを検出・定量する方法が実用化され、ヨーネ病の法的診断法として採用されている（非特許文献１）。インターカレーション法によるリアルタイムPCRは、二本鎖DNAに非特異的に結合する蛍光物質を用いて核酸増幅を検出する方法である。本法ではプライマーダイマー等の非特異的な増幅も検出されるため、標的遺伝子（ヨーネ菌DNA）が増幅したことを確認するには、PCR反応に続けて融解曲線解析を行い、融解温度を測定する必要がある。しかしながら、従来技術においては、非特異的な増幅が陽性と判定される事例（図５、６）や、標的遺伝子の定量結果へ影響を及ぼす事例（図７）が報告されている。

図５は、インターカレーション法によるリアルタイムPCRにおける融解曲線解析の結果を示す図である。図５において、黒色の矢印で示す検体の融解温度は、灰色の矢印で示す陽性コントロールにおける融解温度に近似しており、リアルタイムPCRの結果は陽性と判定される。しかしながら、図５のリアルタイムPCRで得られた増幅産物についてのアガロースゲルを用いた電気泳動写真像図（図６）を見ると、183 bpの陽性コントロールと比べると検体のバンドのサイズが大きく（約600 bp）、非特異的な増幅産物であることが示された。

図７は、インターカレーション法によるリアルタイムPCRにおける融解曲線解析の結果を示す図である。図７において、黒いラインで示す検体の融解曲線解析のグラフは二峰性を示し、灰色のライン、灰色の矢印で示す陽性コントロールと一致するピークの他に、黒色の矢頭で示すピーク（非特異的増幅産物によるもの）が認められる。この検体についてリアルタイムPCRで定量したDNA量は、矢頭で示す非特異的増幅産物との合算となり、正確なヨーネ菌DNAの定量ができない。

リアルタイムPCRにおける蛍光検出方法には、従来技術で用いられているインターカレーション法の他に、標的遺伝子に特異的な蛍光標識プローブを用いて核酸増幅を検出するハイブリダイゼーション法（プローブ法）があり、本願に係るヨーネ菌検出方法はこの技術を利用するものである。以下において、本実施形態のヨーネ菌検出用プローブを用いたヨーネ菌検出方法と、従来技術を比較した。

〔材料と方法〕
1. 従来技術で検出される非特異的増幅産物をクローニングしたプラスミドDNAの調整
上記図５及び図７に示すインターカレーション法によるリアルタイムPCRにおいて非特異的に増幅したPCR産物（図５の黒色の矢印（以下、「偽陽性Ａ」と呼ぶ。）および図７の黒色の矢頭（以下、「非特異Ｂ」と呼ぶ。））を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、それぞれのDNA断片を切り出した。

次に、「Target Clone -Plus-」（東洋紡社）を用いてそれぞれのDNA断片をpTA2ベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換した後に、「QIAprep Spin Miniprep Kit」（キアゲン社）を用いてプラスミドDNAを精製した。分光光度計を用いて波長260 nmと280 nmの吸光度を測定し、偽陽性Ａは400 pg/ml、非特異Ｂは0.8 pg/mlにDNA濃度を調整した。

2. リアルタイムPCRによるDNAの検出
上記で調整したプラスミドDNAを鋳型DNAとして用いて、従来技術とプローブ法によるリアルタイムPCR（本実施形態）を実施した。偽陽性Ａは上記で調整したDNAをそのまま使用し、１ウェルあたり1 pg（2.5μl）を添加した。非特異Ｂは、同じ濃度のヨーネ菌DNA （0.8 pg/ml）と等量混合し、1ウェルあたり非特異Ｂおよびヨーネ菌DNAが各0.001 pg（合計で2.5μl）になるように添加した。

従来技術のインターカレーション法によるリアルタイムPCRは、「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」（キアゲン社）を用いて、図８に示す条件で実施した。プライマーは実施例１で用いたMP10-1およびMP11-1を使用した。１ウェルあたりのPCR反応液は以下の表２に示す様に調整し、各試験区につき２ウェルずつ実施した。また、標的遺伝子の定量のための検量線作成用の標準試料として、実施例１で調整したヨーネ菌DNAを10倍階段希釈（400〜0.4 pg/ml）したものを用いた。リアルタイムPCR装置として、QuantStudio-3（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。

一方、プローブ法によるリアルタイムPCR（本実施形態）は、蛍光標識プローブとして実施例１で作製したプローブNo.6のみを使用したことを除いては、実施例１と同様に実施した。

〔結果〕
従来技術で検出される非特異的増幅産物の断片をクローニングしたプラスミドDNAを鋳型DNAとして用いて、従来技術とプローブ法によるリアルタイムPCR（本実施形態）を比較した。その結果、偽陽性Ａは、従来技術では融解曲線解析により陽性と判定されたが、プローブ法では増幅産物は検出されなかった（陰性と判定された）。

また、非特異Ｂとヨーネ菌DNAの混合物は、従来技術では図７と同様の二峰性の融解曲線になることが示され、プローブ法でも増幅産物が検出された（陽性と判定された）。このとき、標準試料のCt値に基づいて算出したDNA定量結果を表３に示す。従来技術では非特異Ｂとヨーネ菌DNAの合計量である0.002 pgに近いDNA定量値（2.25×10^-3 pg）となったのに対し、プローブ法ではヨーネ菌DNAのみの量（0.001 pg）に近い1.28×10^-3 pgとなり、ヨーネ菌DNAのみを検出及び定量できることが示された（表３）。

以上の結果から、本実施形態のヨーネ菌検出用プローブ及びヨーネ菌検出方法によれば、従来技術に比べて極めて高い特異性をもってヨーネ菌DNAのみを検出可能であり、より迅速かつ正確なヨーネ病診断が可能であることが示された。

本発明は、ハイブリダイゼーション法（プローブ法）による特異性の高いヨーネ病遺伝子検査法を提供するものであり、畜産業における利用が大いに期待される。

配列番号１：プローブＮｏ．６
配列番号２：プローブＮｏ．２
配列番号３：プローブＮｏ．９
配列番号４：プローブＮｏ．４
配列番号５：プローブＮｏ．７
配列番号６：プライマーＭＰ１０−１
配列番号７：プライマーＭＰ１１−１
配列番号８：ヨーネ菌IS900の581〜763番目のポリヌクレオチド

Claims (3)

1. 配列番号１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端が蛍光物質で修飾され、且つ、３’末端がクエンチャー物質で修飾された、オリゴヌクレオチドからなる、リアルタイムPCRによるヨーネ菌検出用プローブ。
2. 核酸を含む検体について、リアルタイムPCRによりヨーネ菌由来の核酸を標的とした核酸増幅反応を行うヨーネ菌の検出方法において、
   前記核酸増幅反応が、以下の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いて行われ、かつ、
   請求項１記載のプローブを用いて前記ヨーネ菌由来の核酸を特異的に検出することを特徴とする、ヨーネ菌の検出方法。
   （ａ）配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
   （ｂ）配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
3. 請求項１記載のプローブ並びに以下の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を含む、リアルタイムPCRによるヨーネ菌検出用キット。
   （ａ）配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
   （ｂ）配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。