JP2008536518A - 標的ゲノムの分画による生物の核酸ベースの検出の感度の増大 - Google Patents

Abstract

試料を試料における目的の生物の存否を検出するために分析する方法であって、（ａ）試料を得る工程；（ｂ）試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および（ｃ）試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなる、方法。検出工程（ｃ）は、試料においてプライマー依存型増幅（好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、増幅結果を生成する工程、および増幅結果を増幅産物について分析する工程を含んでなり、増幅産物の存否が、試料における目的の生物の存否の指標である。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２００５年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／６７２，９２２号明細書、および２００５年８月１２日出願された米国仮特許出願第６０／７０７，８８６号明細書（それぞれが、全体として本願明細書に援用される）の利益を主張する。

本発明の分野は、生物の核酸ベースの検出、および特に、試料中の生物を検出するための核酸増幅方法および技術に関する。

生物、または生物群の検出は、その生物または生物群の特異的核酸配列特徴の検出によって、行われ得る。特異的核酸配列の存在は、特異的ハイブリダイゼーションにより、あるいは特異的核酸配列を増幅するプライマーを用いた増幅により直接検出され得る。

増幅が検出方法の一端として用いられる場合では、増幅されるべき特異的核酸配列の少なくとも１コピーが、増幅反応に置かれた試料中に存在することが重要である。生物が、低濃度で、および／または増幅を進めるため希釈を必要とする複合マトリックス中に存在する場合、感度は、特異的核酸配列の少なくとも１コピーを反応に確保する必要により制限され得る。

真菌特異的ＰＣＲアッセイが、非特許文献１において開示されている。この文献には、芽胞の破壊および真菌のＤＮＡ放出をもたらす最も効率的な方法として、ＰＣＲ増幅に先立ち試料をビーズ・ビーティングする方法が開示されている。具体的には、０．１ｍＬの試料が、およそ同量のビーズを含有する０．５ｍＬチューブに直接添加される、「均質化−第１」手法が開示されている。チューブは、ゴムバンドによってボルテックス上に固定され、３〜５分間激しくボルテックスされるか、あるいは「ミニ−ビーズ撹拌器（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ）に入れられ、３分間均質化され、次に、沸騰したウォーターバスにて５〜１０分間加熱されて、放出されたヌクレアーゼが失活される。文献には、２０％の栄養培地および均質化−第１手法を用いたとき、阻害が少なくなり、ＰＣＲ増幅効率が高まることが報告されている。

Ｇ．チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、「屋内環境における低レベルの真菌を検出するための真菌特異的ＰＣＲアッセイの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｆｕｎｇｕｓ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｆｕｎｇｉ ｉｎ ａｎ ｉｎｄｏｏｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」、モレキュラー・アンド・セルラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、（２０００年）、１４、３３９−３４８頁

本発明は、以下を含む：
試料を試料における目的の生物の存否を検出するために分析する方法であって、（ａ）試料を得る工程；（ｂ）試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および（ｃ）試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなる、方法。

試料を試料における目的の生物の存否を検出するために分析する方法であって、（ａ）試料を得る工程；（ｂ）試料において以下のプロセス：（１）濃縮、（２）試料からの細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡの抽出の少なくとも１つを行うことにより、試料を調製する工程；（ｃ）試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および（ｄ）試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなる、方法。好ましくは、調製工程は、前記工程（ｃ）に先立ち、細菌の濃縮および試料からの細菌細胞の分離を行う工程；または、前記工程（ｃ）に先立ち、細菌の濃縮、試料からの細菌細胞の分離、および細胞溶解を行う工程を含んでなる。別の好ましい実施形態において、前記調製工程において、細胞溶解は、前記工程（ｃ）と同時あるいは後に行われる。

試料を試料における目的の生物の存否を検出するために分析する方法であって、（ａ）試料を得る工程；（ｂ）試料を濃縮する工程；（ｃ）工程（ｂ）の濃縮試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および（ｄ）試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなり、前記工程（ｂ）が、試料を容器中で濃縮する工程を含んでなり、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）の濃縮試料を、工程（ｂ）と同じ容器中で、濃縮試料をそこから除去することなく前記破壊処理に供する工程を含んでなる、方法。

好ましくは、破壊処理は、物理的対象物（例えば、シリコンまたはジルコニウムなどのビーズ）を試料に添加する工程、および物理的対象物を含有する試料を攪拌する工程を含んでなる。より好ましくは、破壊処理は、任意の物理的、機械的、化学的、または酵素的破壊処理を含んでなる。

前述の方法のいずれかにおける検出工程は、好ましくは、プライマー依存型増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を試料において行い、増幅結果を生成すること、および増幅結果を増幅産物について分析することを含んでなり、増幅産物の存否が、試料における目的の生物の存否の指標である。

なおより好ましくは、検出工程は：（ｉ）目的の生物のゲノムの代表的核酸配列領域内に位置する標的配列を増幅するよう設計された増幅プライマー対セットを少なくとも１種類得る工程；（ｉｉ）前記少なくとも１種類の増幅プライマー対セットを用いて、試料のプライマー依存型増幅を行い、増幅結果を生成する工程；および（ｉｉｉ）前記増幅結果を分析して、前記標的配列の増幅産物の存否を検出する工程を含んでなり、増幅産物の存否が、試料における目的の生物の存否の指標である。好ましくは、検出工程は、前記工程（ｂ）を行わない検出と比較して、目的の生物についての検出における感度が少なくとも１０倍増大する。

好ましくは、増幅結果の分析工程は、プライマー依存型増幅の実施と同時に行われる。好ましくは、分析工程は、５’−ヌクレアーゼ検出法を利用する。

本明細書で説明される各参考文献の開示は、全体として本願明細書に援用される。

定義
本開示において、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が提供される。

「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。

「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸フラグメント」は互換して用いられ、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する、１本鎖または２本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ヌクレオチド（通常、それらの５’−一リン酸の形態で見出される）は、次のそれらの１文字標記により言及される：アデニル酸またはデオキシアデニル酸について「Ａ」（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡについて）、シチジル酸またはデオキシシチジル酸について「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸について「Ｇ」、ウリジル酸について「Ｕ」、デオキシチミジン酸について「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）について「Ｙ」、ＧまたはＴについて「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」、そして任意のヌクレオチド「Ｎ」。

用語「増幅産物」は、プライマー依存型増幅反応中に生成される核酸フラグメントをいう。プライマー依存型増幅の典型的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含む。ＰＣＲ方法論が選択されるなら、複製組成物は、核酸複製のための成分、例えば：ヌクレオチド三リン酸、適当な配列を有する２種類（またはそれ以上）のプライマー、熱安定性ポリメラーゼ、バッファー、溶質およびタンパク質を含んでなってもよい。これらの試薬および核酸を増幅する際のそれらの使用方法を記載した詳細は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７年、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら）および米国特許第４，６８３，１９５号明細書（１９８６年、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら）において提供されている。ＬＣＲ方法論が選択されると、次に、核酸複製組成物は、例えば：熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔ．アクティクス（ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、近接するオリゴヌクレオチドの２つのセット（各セットの１メンバーが、各標的鎖に相補的である）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイトールおよびサケ精子ＤＮＡを含んでなってもよい。例えば、タボール（Ｔａｂｏｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１０７４ １０７８頁（１９８５年））を参照されたい。

用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチド（合成または天然に存在する）を指し、それは、相補鎖の合成がポリメラーゼにより触媒される条件下に置かれたとき、核酸合成または相補鎖に沿った複製の開始点として働くことができる。

本明細書で用いられる標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野においてよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「モレキュラー・クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）、（１９８９年）（以下、「マニアティス」）；およびグリーン出版協会（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．）およびウィリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）により出版された、「モレキュラー・バイオロジーにおける最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、により記載されている。

ここで、好ましい実施形態に変化させる：
好ましい実施形態において、試料を試料における目的の生物の存否を検出するために分析する方法は、試料を得る工程；試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなる。

別の好ましい実施形態において、試料中の目的の生物の検出の感度を増大させる方法は：試料を得る工程；試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなり、前記検出工程における感度は、試料を破壊処理の対象にする前記工程を行わないものと比較して、好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも１１〜１００倍の任意の整数、より好ましくは、１０倍から、１１〜１００の任意の整数、より好ましくは、１０〜９９倍の任意の整数から１００倍、またはより好ましくは、１０〜１００倍の任意の整数から、１００〜１０倍の任意の整数、増大される。

好ましくは、検出工程は、試料において、プライマー依存型増幅（好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、増幅結果を生成する工程、および増幅結果を増幅産物について分析する工程を含んでなり、増幅産物の存否が、試料における目的の生物の存否の指標である。なおより好ましくは、検出工程は、目的の生物のゲノムの代表的核酸配列領域内に位置する標的配列を増幅するよう設計された増幅プライマー対セットを少なくとも１種類得る工程；少なくとも１種類の増幅プライマー対セットを用いて、試料のプライマー依存型増幅を行い、増幅結果を生成する工程；および増幅結果を標的配列の増幅産物の存否を分析する工程を含んでなり、増幅産物の存否が、試料における目的の生物の存否の指標である。

より好ましくは、増幅結果の分析工程は、前記プライマー依存型増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）の実施と同時に行われる。なおより好ましくは、増幅産物の分析工程は、５’−ヌクレアーゼ検出法を利用する。

別の好ましい実施形態において、本発明の方法のいずれかにおいて、濃縮工程は、試料を破壊処理に供する工程に先立ち、試料において行われる。試料の濃縮は、容器中で行われ、好ましくは、試料を破壊処理に供する工程は、試料が濃縮されたのと同じ容器内で濃縮試料において行われる（すなわち、濃縮および破壊処理の両方が、同じ容器内で試料において行われる）。好ましくは、容器はサンプルチューブであるが、容器は、当該技術分野で知られた任意の適当な容器または入れ物、例えば、試験管、ビーカー、フラスコ、ビン、バイアル、アンプル、またはマイクロチューブであってもよい。

好ましい目的の試料および生物
好ましくは、試料は、目的の生物による汚染が疑われる、動物、環境または食物源由来である。

目的の生物は、任意の生きているものであってもよい。好ましくは、目的の生物は微生物である。本発明の方法により検出され得る、特異的な目的の生物は、好ましくは、細菌および真菌を含む。

特に好ましい目的の生物は、真菌生物である。特に好ましくは、真菌のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖａｓｉａｅ）である。

本発明の方法は、試料中の真菌生物の検出感度を増大させる際に特に利点があると思われる。

真菌生物ゲノムは、典型的には、それぞれ約１０，０００塩基対の繰り返し単位において、１００〜２００コピーの縦列に整列されたそれらのリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）遺伝子を含有するので、特定の理論および機序と結びつけられることなく、特に、真菌生物で感度の増大が達成されると思われる。

典型的なプライマー依存型核酸増幅ストラテジーにおいて、試験される材料の４μＬ当量が、増幅反応に置かれる。１ｍＬ当たり２０個の一倍体真菌、ひいては平均して１つの染色体が存在する場合、ｒＲＮＡ遺伝子における標的増幅領域を有するのが、５０μＬ当たり（＝１ｍＬ／２０）に分配される。それゆえ、４μＬを試料採取することは、プライマー依存型核酸増幅が４μＬの試料において行われたとき存在する標的増幅領域を生じることはないようである。

しかしながら、本発明をふまえて、真菌生物を含有する試料を破壊処理（以下で説明される）に供することにより、ひいては２０個の一倍体真菌を含有する１ｍＬの試料において、破壊処理が行われ、真菌ゲノム由来の核酸配列がおよそ１０，０００塩基対に分画されると、ここで、１ｍＬの試料は、１ｍＬ当たり平均２，０００〜４，０００個の標的（１００〜２００個のｒＲＮＡ遺伝子由来）、または４μＬ当たり平均８〜１６個の標的を有し、それにより、特に、プライマー依存型核酸増幅が利用されたときに、検出感度が増大される。

従って、なおより好ましくは、別の好ましい実施形態において、本発明の方法を利用して、ゲノム（代表的核酸配列が存在し、プライマー依存型増幅の標的領域として機能する）を有する任意の目的の生物が検出されるか、あるいはその検出において感度が増大され得る。感度は、本発明をふまえて、破壊処理を行わない場合と比較して、好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも１１〜１００倍の任意の整数、より好ましくは、１０倍から、１１〜１００倍の任意の整数、より好ましくは、１０〜９９倍の任意の整数から１００倍、またはより好ましくは、１０〜１００倍の任意の整数から、１００〜１０倍の任意の整数、増大される。

好ましい破壊処理
試料が得られると、次の工程は、試料を試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供することである。好ましくは、核酸配列は、目的の生物のゲノム由来であり、それについて試料が分析される。

破壊処理は、試料における核酸配列を分画するため、特に、目的の生物のゲノム由来の核酸配列（それについて試料が分析される）を分画する任意の方法またはプロトコールを含んでなってもよい。破壊処理は、物理的、化学的、または酵素的アプローチを利用してもよく、そしてそれは、これらの特定のアプローチに限定されない。当業者によく知られた、あるいは容易に解明可能な任意の核酸分画アプローチが利用され得、そしてそれは、本発明範囲に含まれる。破壊処理は、試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な時間行われ、そして当業者は、試料および目的の生物（それについて試料が分析される）に依存して、この時間の長さを容易に決定することができる。

好ましい物理的破壊処理は、試料の攪拌と組み合わせた、ビーズなどの物理的対象物の使用を含む。攪拌条件は、ＤＮＡをより短いフラグメントに破壊する剪断力を生じるのに十分であるべきである。他の物理的破壊処理は、超音波処理、噴霧、またはＤＮＡ含有試料のオリフィスの通過を含む。

好ましい化学的破壊処理は、水酸化ナトリウムでの処理、ジメチルスルフェート、次に、ピペリジンでの処理、ギ酸ピペラジン、次に、ピペリジンスでの処理、またはヒドラジン、次に、ピペリジンでの処理を含む。

好ましい酵素的破壊処理は、ＤＮａｓｅ １などの非特異的ヌクレアーゼでの消化またはＥｃｏＲ１などの制限エンドヌクレアーゼでの消化を含む。

特に好ましい実施形態において、破壊処理は、物理的対象物を試料に添加する工程、および物理的対象物を含有する試料を攪拌する工程を含
んでなる。攪拌は、試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な時間行われ得、そして当業者は、試料および目的の生物（それについて、試料が試験される）に依存して、この時間の長さを容易に決定することができる。攪拌は、好ましくは、少なくとも６分間、より好ましくは、少なくとも６〜２０分の任意の整数の間、より好ましくは、６分から、６〜２０分の任意の整数の間、より好ましくは、６〜１９分の任意の整数から２０分間、またはより好ましくは、６〜２０分の任意の整数から、２０〜６分の任意の整数の間行われる。特に好ましい実施形態において、攪拌は、少なくとも１５分間行われる。別の好ましい実施形態において、攪拌は、１５〜２０分間行われる。攪拌を行うのに特に好ましい器具は、ディスラプター・ジェニー（Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ Ｇｅｎｉｅ（登録商標））（ニューヨーク州ボヘミアのサイエンティフィック・インダストリーズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）から入手可能）である。好ましくは、物理的対象物は、ビーズ、なおより好ましくは、シリコンまたはジルコニウムビーズを含む。物理的対象物は、ガラスビーズも含み得る。

本発明による方法は、試料の調製を全く必要とすることなく、任意の適当な臨床または環境試料で直接用いられ得る。しかしながら、より高い感度を、時間が制限因子ではない状況において達成するために、試料が予め処理されることが好ましい。

それゆえ、別の好ましい実施形態において、試料中の目的の標的生物についての検出に先立ち、試料を調製する工程が行われてもよい。好ましくは、この調製工程は、次のプロセス：成長培地における（例えば、標的生物の）濃縮、（例えば、標的生物の）試料からの細胞の分離、細胞溶解、およびＤＮＡ抽出の少なくとも１つを含んでなり得る。より好ましくは、この調製工程は、試料を破壊処理に供する工程に先立ち、濃縮および分離を行う工程を含んでなる。なおより好ましくは、この調製工程は、試料を破壊処理に供する工程に先立ち、濃縮、分離、および細胞溶解を行う工程を含んでなる。別の好ましい実施形態において、細胞溶解は、破壊処理と同時または後に行われる。本発明の方法と組み合わせて行われる試料調製工程の例は、以下の実施例１において説明される。

典型的な濃縮方法は、標的生物の成長および健康を増強し、また任意のバックグラウンドおよび存在する非標的微生物の成長を阻害する培地を利用する。選択培地は、種々の生物について開発されており、当業者は、濃縮されるべき特定の生物に適当な培地を選択することを理解している。非選択培地の一般的考察および処方は、２２２０１−３３０１バージニア州アーリントン、ウィルソン大通り２２００、スィート４００の分析化学会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｕｉｔｅ ４００， ２２００ Ｗｉｌｓｏｎ Ｂｌｖｄ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ ２２２０１−３３０１）により出版され、頒布されたＦＤＡ細菌分析マニュアル（ＦＤＡ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ）（１９９８年）に開示されている。

成長後、複合混合物の試料が、さらなる分析のため取り出される。この試料採取手法は、当業者によく知られた種々の手段により達成され得る。

好ましい実施形態において、２０μＬの濃縮培養物が取り出され、２００μＬのプロテアーゼ含有溶解溶液に添加される。デラウェア州ウィルミントンのクオリコン社（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）のバックス・システム・ユーザーガイド（ＢＡＸ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ）に記載の通り、溶解溶液は、３７℃にて２０分間加熱され、次に、９５℃にて１０分間プロテアーゼが失活される。

あるいは、より好ましい実施形態において、本発明の方法のいずれかにおいて、濃縮工程は、試料を破壊処理に供する工程に先立ち、試料において行われ、試料の濃縮が、容器内で行われ、そして試料を破壊処理に供する工程が、試料が濃縮されたのと同じ容器内で濃縮試料において行われる（すなわち、濃縮および破壊処理の両方が同じ容器内で試料において行われる）。好ましくは、容器はサンプルチューブであるが、容器は当該技術分野で知られた任意の適当な容器または入れ物（例えば、試験管、ビーカー、フラスコ、ビン、バイアル、アンプル、またはマイクロチューブ）であってもよい。

好ましい検出および分析
種々の核酸ベースの検出方法が、目的の標的生物の検出のために利用され得る。種々のプライマー依存型核酸増幅方法が当該技術分野において知られており、それは、熱サイクリング法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲ）、ならびに等温法および鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、および自律的配列複製（３ＳＲ）および「Ｑレプリカーゼ増幅」を含む。

好ましい方法はＰＣＲである。

好ましくは、本発明の任意の方法において、検出工程は、試験されるべき試料における目的の生物のゲノムの代表的核酸配列内に位置する標的配列を増幅するよう設計された増幅プライマー対セットを利用する。

任意のフォーマットの任意の適当な核酸複製組成物（「複製組成物」）が用いられ得る。

ＰＣＲ増幅用の典型的な複製組成物は、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマーおよび適当なポリメラーゼを含み得る。

複製組成物が液体形態であるなら、当該技術分野で知られた適当なバッファーが用いられてもよい（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、１９８９年、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。

あるいは、複製組成物がタブレット形態に含有されるなら、次に、典型的なタブレット試薬は、安定剤および結合剤などを含んでもよい。好ましいタブレット化技術は、米国特許第４，７６２，８５７号明細書および同第４，６７８，８１２号明細書（それぞれが、全体として本願明細書に援用される）において説明されている。

別の好ましい実施形態において、複製組成物は、内部陽性対照を含有する。ＰＣＲ反応において含有される内部陽性対照の利点は、既に記載されており（米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第９７／１１１９７号パンフレット（それぞれ、全体として本願明細書に援用される）、そしてそれは、（ｉ）対照が単一のプライマーを用いて増幅され得ること；（ｉｉ）対照増幅産物の量が、試料に含有される任意の標的ＤＮＡまたはＲＮＡから独立であること；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡが、手動および自動試験手法の両方で使用の容易さおよび高度な再現性のため他の増幅試薬を用いてタブレット化され得ること；（ｉｖ）対照は一様な検出（すなわち、産物ＤＮＡを反応物から分離することなく）で用いられ得ること；および（ｖ）内部対照は、反応物中の他の可能性のある増幅産物と区別する融解プロファイルを有することを含む。

対照ＤＮＡは、プライマー依存型増幅反応における増幅を可能にする適当なサイズおよび塩基組成であろう。対照ＤＮＡ配列は、目的の生物のゲノムから、あるいは別の供給源から得られてもよいが、標的増幅産物の増幅を可能にする同じ条件下で再現可能な方法で増幅されなければならない。

対照反応は増幅反応の検証に有用である。対照ＤＮＡの増幅は、試験される試料と同じ反応チューブ内で生じ、それゆえ、試料が標的陰性、すなわち、標的増幅産物が全く生成されていない場合、成功した増幅反応を示す。増幅反応の有意な検証を達成するために、対照ＤＮＡの適当な数のコピーが各増幅反応に含まれていなければならない。

ある場合では、さらなる陰性対照複製組成物を含むことも有用であり得る。陰性対照複製組成物は、複製組成物と同じ試薬を含むが、ポリメラーゼを含まない。かかる対照の第一の機能は、方法が蛍光検出手段を利用する場合、一様なフォーマットの偽バックグラウンド蛍光をモニターすることである。複製組成物は、それらが、標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するために用いられるよう設計されているかどうかに依存して、改変されてもよい。

標的ＤＮＡを増幅する複製組成物（試験複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に、熱安定性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能なプライマー対および（ｉｉｉ）増幅反応が進むためのバッファーを含み得る。

対照ＤＮＡを増幅する複製組成物（陽性対照、または陽性複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に、熱安定性）；（ｉｉ）対照ＤＮＡ；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡにハイブリダイズ可能な少なくとも１種類のプライマー；および（ｉｖ）増幅反応が進むためのバッファーを含み得る。

当業者は、任意の一般的に許容可能なＰＣＲ条件が、目的の標的生物を首尾よく検出するために用いられ得、試験されるべき試料および他の実験室条件に依存して、ＰＣＲ条件の定期的最適化が、最適な感度および特異性を達成するために必要とされ得ることを理解するだろう。最適には、それらは、意図される特異的標的の全てからのＰＣＲ増幅産物を、他の非標的種についてＰＣＲ産物を全く生じることなく達成する。

好ましい実施形態において、次の試薬およびサイクル条件が用いられ得る。５０μｌの溶解物を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、サイバー・グリーン（ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ）（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、バッファー成分、およびプライマーを含有する、１個のバックス（ＢＡＸ（登録商標））試薬タブレット（デラウェア州ウィルミントンのクオリコン社（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）により製造）を含有するＰＣＲチューブに添加し、ＰＣＲにおいて各プライマーについて０．１５０μｍｏｌの最終濃度が達成される。好ましいＰＣＲサイクル条件：９４℃で２分間の最初のＤＮＡ変性、次に、９４℃で１５秒間変性、５６℃で４５秒間アニーリング、および７０℃で２分間伸長を３８サイクル、次に、７０℃で１回の最終維持。

プライマー依存型増幅結果は、種々の方法を用いて分析され、増幅産物の存否が検出され得る。

一様な検出は、増幅産物のテンプレートまたはプライマーからの分離（例えば、ゲル電気泳動による）を全く必要としない、増幅産物の好ましい検出方法を指す。典型的には、一様な検出は、蛍光色素の存在下で反応混合物の蛍光レベルを測定することにより、達成される。

好ましい実施形態において、ＤＮＡ融解曲線分析を用いて、特に、クオリコン社（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）のバックス・システム（ＢＡＸ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ）ハードウェアおよび試薬タブレットでの一様な検出が行われる。システムの詳細は、米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ特許出願公開国際公開第９７／１１１９７号パンフレットおよび同第００／６６７７７号パンフレット（それぞれが、全体として本願明細書に援用される）において提供されている。

融解曲線分析は、選択された時点での各増幅サイクル中の標的増幅産物（「標的単位複製配列」）の蛍光をモニターすることにより、２本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出し、定量する。

当業者によく知られているように、ｄｓＤＮＡの２本の鎖は、温度がその融解温度より高いと、分離するか、あるいは融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解はプロセスであり、所定の溶液条件下で、融解が温度（以下、Ｔ_ＭＳと称する）で開始し、別の温度（以下、Ｔ_ＭＥと称する）で完了する。よく知られている用語のＴｍは、融解が５０％完了する温度を称する。

典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解される変性相、温度が、プライマーがいまや１本鎖の標的に結合するのに最適である、プライマーアニーリング相、および温度が、ＤＮＡポリメラーゼが機能するのに最適である、鎖伸長相（温度Ｔ_Ｅにて）を含む。

本発明により、Ｔ_ＭＳはＴ_Ｅより高くなければならず、そしてＴ_ＭＥは、ＤＮＡポリメラーゼが熱失活される温度より低く（しばしば実質的に低い）なければならない。融解特徴は、デオキシヌクレオチドの組成およびｄｓＤＮＡの長さなどの、所定のｄｓＤＮＡ分子固有の特性により影響される。

挿入色素は、２本鎖ＤＮＡに結合する。色素／ｄｓＤＮＡ複合体は、適当な励起波長の光（色素依存性である）に曝露されたとき、蛍光を発し、蛍光強度は、ｄｓＤＮＡの濃度に比例し得る。ＤＮＡ挿入色素の使用を活かして、ｄｓＤＮＡを検出し、定量する方法は、当該技術分野において知られている。多くの色素が知られており、これらの目的のため当該技術分野において用いられる。本方法もかかる関係の利点を生かす。

かかる色素の例は、挿入色素を含む。かかる色素の例は、サイバー・グリーンＩ（ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（登録商標））、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、トト（ＴＯＴＯ（登録商標））１｛キノリニウム、１ １’［１，３ プロパンジイルビス［（ジメチルイミノ）−３，１−プロパンジイル］］ビス［４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］］−，テトラヨード｝、およびヨプロ（ＹｏＰｒｏ（登録商標））｛キノリニウム、４［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）−プロピル］，ジヨード｝を含むが、これらに限定されない。本発明に最も好ましいのは、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））により製造される、サイバー・グリーン−Ｉ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標））などの非不斉シアン化色素である。

融解曲線分析は、温度の上昇に伴った、蛍光の変化をモニターすることにより、達成される。温度が標的単位複製配列に特異的なＴ_ＭＳに達すると、ｄｓＤＮＡは変性し始める。ｄｓＤＮＡが変性すると、挿入色素は、ＤＮＡから解離し、蛍光が減少する。温度に対してプロットされた温度の変化で除した、蛍光の対数値の変化の負の数理分析から、融解曲線として知られたグラフピークが得られる（一般的な融解曲線分析を説明する、図１を参照）。

図１に示されるデータ変換プロセスは、以下：
１．均一な間隔のデータポイントを得るためデータを補間する
２．蛍光（Ｆ）の対数をとる
３．ｌｏｇＦを平滑化する
４．−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴを計算する
５．データを、１度間隔の１１〜１３データポイントまで減らす（標的生物に依存する）
を含む。

この一様な検出方法を用いて、標的ｄｓＤＮＡが検出され、定量され得、それから、標的生物の存在およびレベルが決定され得る。この方法は非常に特異的かつ高感度である。検出可能な標的ｄｓＤＮＡの最小数は、典型的な反応条件および容量下で１から１０の間である。

一様な検出を利用して、本発明のプライマー対を用いた、「リアルタイム」プライマー依存型核酸増幅（例えば、「リアルタイム」ＰＣＲおよび「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲ）が行われ得る。好ましい「リアルタイム」方法は、例えば、米国特許第６，１７１，７８５号明細書および同第５，９９４，０５６号明細書（それぞれが、全体として本願明細書に援用される）において説明されている。

別の検出方法は、例えば、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、同第５，５３８，８４８号明細書、同第５，４８７，９７２号明細書、および同第５，２１０，０１５号明細書（それぞれが、全体として本願明細書に援用される）において説明される、５’−ヌクレアーゼ検出方法である。

種々の他のＰＣＲ検出方法が当該技術分野において知られており、それは、標準的非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドまたはアガロース）、変性勾配ゲル電気泳動、および温度勾配ゲル電気泳動を含む。標準的非変性ゲル電気泳動は、ＰＣＲ検出の単純かつ迅速な方法であるが、全ての適用に適当でない可能性がある。

変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、低分子ＤＮＡフラグメント（２００〜７００ｂｐ）の変性挙動における相違を検出する分離方法である。分離の原理は、フラグメント長およびヌクレオチド配列の両方に基づく。同じ長さのフラグメントでは、１つの塩基対ほどの小ささの相違が検出され得る。これは、非変性ゲル電気泳動と対照的であり、ＤＮＡフラグメントは、サイズによってのみ分けられる。ＤＮＡ分子間の電荷密度の相違が天然に近く、それらの分離においてほとんど機能しないので、非変性ゲル電気泳動のこの制限が生じる。ＤＮＡフラグメントのサイズが増大するにつれ、ゲルを通る速度が低減する。

ＤＧＧＥは、第一に、それらの変性プロファイルおよび配列に基づき、同じサイズのＤＮＡフラグメントを分離するために用いられる。ＤＧＧＥを用いると、加熱または化学的変性が適用されるとき、ＤＮＡ分子の２本の鎖が分離されるか、あるいは融解する。ＤＮＡ２本鎖の変性は、２つの因子：１）相補塩基対間で形成される水素結合（ＧＣリッチな領域は、ＡＴリッチな領域より高い変性条件で融解するため）；および２）同じ鎖の近接塩基間の誘引、または「スタッキング」により影響される。結果として、ＤＮＡ分子は、それらのヌクレオチド配列により決定される、それぞれの、それらの個々の特徴的変性条件を有するいくつかの融解ドメインを有し得る。ＤＧＧＥは、特異的変性ドメイン内の１個のみのヌクレオチドを例外として、同じ長さおよびＤＮＡ配列を有するその他の同一のＤＮＡ分子が、異なる温度またはＴｍにて変性するという性質を利用する。従って、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡフラグメントが、増加勾配の化学変性剤を通って電気泳動されると、変性し始め、構造変化および移動度変化の両方を受ける。分子の１本鎖部分の分枝構造はゲルマトリックスにおいてもつれるので、ｄｓＤＮＡフラグメントは、変性１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡフラグメントより速く移動する。変性環境が増大するにつれ、ｄｓＤＮＡフラグメントは完全に解離し、そしてゲルを通る分子の移動は、ＤＮＡ鎖の特定の低変性ドメインが解離する変性濃度で遅れる。実際、電気泳動は一定温度（およそ６０℃）で行われ、そして化学変性剤は、変性されるＤＮＡ分子の１００％となる濃度で用いられる（すなわち、４０％のホルムアミドおよび７Ｍの尿素）。この可変変性勾配は、各ＤＧＧＥゲルの組成が０％の変性剤から１００％の変性剤まで漸進的に変化するよう、勾配マーカーを用いて創出される。もちろん、低減された範囲の変性剤（例えば、３５％〜６０％）を含有する勾配も、ＤＮＡの分離の増大のためかけられてもよい。

ＤＧＧＥにおいて用いられる原理は、化学的変性剤勾配の代わりに温度勾配を用いる第２の方法にも適用され得る。この方法は、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）として知られている。この方法は、ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの構造変化を誘導し、異なる配列を有する等しい大きさのフラグメントを分離するために温度勾配を使用する。ＤＧＧＥでのように、異なるヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメントは、ゲルの異なる位置で固定される。プライマーデザインにおけるバリエーションは、ＰＣＲ産物の特徴決定および同定のためのＤＧＧＥの有用性を増大させる際に有利となるため用いられ得る。プライマーデザインのバリエーションを用いるこれらの方法および原理は、「ＰＣＲテクノロジー原理および適用（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ヘンリー（Ｈｅｎｒｙ）Ａ．エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）編、Ｍ．ストックトン出版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、７１〜８８頁（１９８８年）に記載されている。

本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。本発明の好ましい実施形態を示す本実施例は、あくまでも例示の目的で与えられることが理解されるべきである。

実施例１
ポテトデキストロースブロスにおける真菌サッカロマイセス・セレビシエの一晩培養物を、２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む１％ トリピトン溶液中で５倍連続希釈した。各希釈液を、次の３つの方法のそれぞれに従い、同時に分析した：
１．希釈液をポテトデキストロース寒天上にプレーティングし、Ｓ．セレビシエの密度を決定した。
２．試料の一部を、化学的細胞溶解、次に、バックス（ＢＡＸ（登録商標））系酵母およびカビアッセイ検出キット（デラウェア州ウィルミントンのデュポン・クオリコン（ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から入手可能）を用いたＰＣＲ増幅に供したが、それは、バックス（ＢＡＸ（登録商標））システム装置（デラウェア州ウィルミントンのデュポン・クオリコン（ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から入手可能）において、１８ｓリボソームＲＮＡ遺伝子の一部を増幅し、単位複製配列を検出する真菌特異的プライマーを用いる。
３．試料の一部を、０．５ｍＭのシリカ−ジルコニウムビーズを含むチューブに配置し、ディスラプター・ジェニー（Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ Ｇｅｎｉｅ（登録商標））において１５分間攪拌し、次に、アリコートを、化学的細胞溶解、次に、バックス（ＢＡＸ（登録商標））システム酵母およびカビアッセイ検出キットを用いた反応においてＰＣＲ増幅に供したが、それは、バックス（ＢＡＸ（登録商標））系装置において、１８ｓリボソームＲＮＡ遺伝子の一部を増幅し、単位複製配列を検出する真菌特異的プライマーを用いる。

上記方法２および３に従い、出発入力値と異なる量のＳ．セレビシエコロニー形成単位を有する試料を用いて実行した。結果を以下の表１において表す。以下に示す通り、方法３は、２ＣＦＵ未満のレベルでの検出感度を増大させる。

融解曲線分析のプロセスを示す。標的ＤＮＡの蛍光変化を、融解中にとらえる。温度に対してプロットした温度変化で割った蛍光の対数の変化の負の数理解析は、融解曲線として知られたグラフピークとなる。

Claims (17)

1. 試料における目的の生物の存否を検出するための試料の分析方法であって、
   （ａ）試料を得る工程；
   （ｂ）前記試料を前記試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および
   （ｃ）前記試料における目的の生物の存否を検出する工程
   を含んでなる、方法。
2. 前記工程（ｂ）において、前記破壊処理が、物理的対象物を前記試料に添加する工程、および前記物理的対象物を含有する前記試料を攪拌する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. 前記物理的対象物がビーズを含んでなる、請求項２に記載の方法。
4. 前記ビーズがシリコンまたはジルコニウムを含んでなる、請求項３に記載の方法。
5. 前記工程（ｂ）において、前記破壊処理が、物理的、化学的、または酵素的破壊処理を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記工程（ｃ）に先立ち、前記試料において以下のプロセス：（１）濃縮、（２）前記試料からの細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出の少なくとも１つを行うことにより、前記試料を調製する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
7. 前記調製工程が、前記工程（ｂ）に先立ち、細菌の濃縮および前記試料からの細胞の分離を行う工程を含んでなる、請求項６に記載の方法。
8. 前記調製工程が、前記工程（ｂ）に先立ち、細菌の濃縮、前記試料からの細胞の分離、および細胞溶解を行う工程を含んでなる、請求項６に記載の方法。
9. 前記調製工程において、前記細胞溶解が、前記工程（ｂ）と同時あるいは後に行われる、請求項６に記載の方法。
10. 前記検出工程（ｃ）が、プライマー依存型増幅を前記試料において行い、増幅結果を生成する工程、および前記増幅結果を増幅産物について分析する工程を含んでなり、前記増幅産物の存否が、前記試料における目的の生物の存否の指標である、請求項１に記載の方法。
11. 前記検出工程（ｃ）が、
    （ｉ）目的の生物のゲノムの代表的核酸配列領域内に位置する標的配列を増幅するよう設計された増幅プライマー対セットを少なくとも１種類得る工程；
    （ｉｉ）前記少なくとも１種類の増幅プライマー対セットを用いて、前記試料のプライマー依存型増幅を行い、増幅結果を生成する工程；および
    （ｉｉｉ）前記工程（ｃ）（ｉｉ）の前記増幅結果を分析し、前記標的核酸の増幅産物の存否を検出する工程を含んでなり、前記増幅産物の存否が、前記試料における目的の生物の存否の指標である、
    請求項１に記載の方法。
12. 前記工程（ｃ）において、前記プライマー依存型増幅がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記増幅結果の分析が、前記ポリメラーゼ連鎖反応の実施と同時に行われる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記工程（ｃ）において、前記増幅結果の分析が、５’−ヌクレアーゼ検出法を利用する、請求項１２に記載の方法。
15. 前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）を行わない検出と比較して、前記目的の生物についての検出における感度の少なくとも１０倍の増大を有する、請求項１１に記載の方法。
16. 試料を前記試料中の目的の生物の存否を検出するために分析する方法であって、
    （ａ）試料を得る工程；
    （ｂ）前記試料を濃縮する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）の前記濃縮試料を前記試料中に存在する任意の核酸配列を分画するのに十分な破壊処理に供する工程；および
    （ｄ）前記試料における目的の生物の存否を検出する工程を含んでなり、前記検出工程が：
    （ｉ）前記目的の生物のゲノムの代表的核酸配列領域内に位置する標的配列を増幅するよう設計された増幅プライマー対セットを少なくとも１種類得る工程；
    （ｉｉ）前記少なくとも１種類の増幅プライマー対セットを用いて、前記試料のプライマー依存型増幅を行い、増幅結果を生成する工程；および
    （ｉｉｉ）前記工程（ｄ）（ｉｉ）の前記増幅結果を分析して、前記標的配列の増幅産物の存否を検出する工程を含んでなり、前記増幅産物の存否が、前記試料における目的の生物の存否の指標である、方法。
17. 前記工程（ｂ）が、前記試料を容器中で濃縮する工程を含み、前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）の前記濃縮試料を、工程（ｂ）と同じ容器内で、前記濃縮試料をそこから除去することなく前記破壊処理に供する工程を含んでなる、請求項１６に記載の方法。

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