CN117721228A - mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法 - Google Patents

mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法 Download PDF

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CN117721228A
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Abstract

本申请涉及mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法。本发明提供包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对作为用于实现灵敏度高的甲氧西林耐药性基因检测的甲氧西林耐药性基因检测用引物。

Description

mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检 测方法
本申请是申请日为2018年10月12日、发明名称为“mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法”的中国发明专利申请No.201880065280.0(PCT申请号为PCT/JP2018/038072)的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于简便、迅速且以高灵敏度检测作为甲氧西林耐药性的特异性遗传元件的mecA基因的引物对、试剂盒及检测方法。
背景技术
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，以下简称为“MRSA”)是全世界院内感染的主要致病菌，在许多国家作为最主要的临床耐药菌而受到重视。作为与MRSA的甲氧西林耐药性相关的基因的mecA编码PBP(青霉素结合蛋白，Penicillin Binding Protein)-2’(也被称为PBP-2a)。通常，金黄色葡萄球菌主要产生4种PBP。PBP是参与细胞壁的肽多糖合成的蛋白，具有转肽酶活性。β-内酰胺类抗生素通过与PBP的活性部位结合从而抑制转肽酶活性、抑制肽多糖合成来发挥作用。但是，PBP-2’通过降低与β-内酰胺类抗生素的亲和性来避免抑制肽多糖合成的效果(非专利文献1)。
对于金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌而言，有无甲氧西林耐药性在感染患者的诊断和治疗方针的确定中是非常重要的信息。虽然金黄色葡萄球菌的病原性强，因此较之其他凝固酶阴性葡萄球菌而言更受重视，但是对于获得了甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌而言，对易感宿主的感染还是大问题。因此，作为应对甲氧西林耐药性葡萄球菌的院内感染的对策，一直以来期望甲氧西林耐药性的迅速检测，以实现迅速的诊断、治疗。
作为测试甲氧西林耐药性的方法，可实施药物敏感性试验、免疫分析、利用PCR(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)的检测这样的方法(非专利文献2)。
在药物敏感性试验中，需要将从患者采集的血液培养一天以上来增加葡萄球菌。另外，免疫分析也需要培养葡萄球菌的工序，因此，直至能得到甲氧西林耐药性试验的结果为止需要一天以上。
与上述相比，PCR等核酸扩增检查的灵敏度非常高，因此无需培养的过程，能够利用患者血液直接进行试验。因此，能够在患者血液检体到达后数小时内提交试验结果(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/097323号
非专利文献1：Journal of Bacteriology,May 1980p.275
非专利文献2：Journal of Clinical Microbiology,July 1992,p.1685
发明内容
发明所要解决的课题
虽然已报道了数种利用PCR等核酸扩增检测甲氧西林耐药性基因的方法，但多数报道没有明确记载具体的检测灵敏度。仅有报道虽然明确记载了检测灵敏度、但并未达成足以在临床现场使用的检测灵敏度(非专利文献2)。
另一方面，甲氧西林耐药性基因的检测对于患者的诊断、治疗方针影响较大，因此开发迅速、正确且可靠地进行检测的方法是临床上的当务之急。因此，本发明将迅速、正确且可靠地检测甲氧西林耐药性基因作为课题。尤其将提供用于实现灵敏度高的甲氧西林耐药性基因检测的引物对作为课题。
用于解决课题的手段
本发明是通过使用核酸扩增方法来从患者检体直接迅速地鉴定甲氧西林耐药性基因、并且以比以往方法更高的检测灵敏度可靠地进行检测的方法。本申请发明人以确立高灵敏度且迅速的甲氧西林耐药性基因的检测方法为目标，着眼于PCR法。尤其是为了以高灵敏度检测甲氧西林耐药性基因，针对PCR法中使用的引物进行了研究。
设计引物使用如下条件。
在不降低扩增效率的范围内，增加被扩增的DNA片段的大小。具体而言，DNA片段的大小设为150bp以上且700bp以下。通过增加被扩增的DNA片段的大小，使得PCR反应时的扩增曲线的荧光强度提高，熔解分析(Melting analysis)中得到的峰的高度也变高。
验证mecA同源物(homologue)的序列，仅在保守性高的部分设计引物对的碱基序列。具体而言，排除在自引物的3’末端起5个碱基以内包含保守性低的序列的情况，修正碱基序列使其成为保守性高的序列。
基于上述理念，制备特定的Fwd、及Rev引物各32条，将它们进行组合，制备认为可行的313个引物对，从其中研究最合适的组合，从而筛选出能达成比作为在先申请的专利文献1更高的检测灵敏度的引物对。
即，本发明涉及的引物对为用于检测mecA基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，其特征在于，
所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的1个引物对，
(a)包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1～2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
本发明涉及的mecA基因检测试剂盒的特征在于包含选自由上述的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对。
本发明涉及的检体中的mecA的检测方法的特征在于具有下述工序：
PCR工序，使用从检体制备的DNA、和用于扩增DNA的引物对实施PCR；和
通过检测利用所述PCR工序得到的扩增产物中的mecA基因、或通过分析所述扩增产物，来实施所述检体中的mecA基因的检测的工序，
所述PCR工序中使用的引物对为选自由上述的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对。
本申请涉及下述项：
1、用于检测mecA基因的引物对，其是用于检测mecA基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，
其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的1个引物对，
(a)包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
2、如项1所述的引物对，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
3、包含引物对的mecA基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对，
(a)包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
4、如项3所述的试剂盒，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
5、如项3或4所述的试剂盒，其包含用于PCR的酶、用于PCR的试剂及用于PCR的器具中的至少1种。
6、mecA基因的检测方法，其特征是检体中的mecA的检测方法，包括：
PCR工序，使用从检体中制备的DNA、和用于扩增DNA的引物对实施PCR；和
通过检测利用所述PCR工序得到的扩增产物中的mecA基因、或通过分析所述扩增产物，来实施所述检体中的mecA基因的检测的工序，
所述PCR工序中使用的引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对，
(a)包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
7、如项6所述的检测方法，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
发明效果
根据本发明，可提供用于高灵敏度的mecA基因检测的PCR用引物对及mecA基因检测试剂盒、以及mecA基因的检测方法。因此，根据本发明，能够较之以往的检查试剂盒而言以高灵敏度、高精度实施对医疗领域、食品领域等中的检体中的微量mecA基因的检测。
附图说明
[图1]为示出甲氧西林耐药性株与甲氧西林敏感株中的测定结果的比较的图。图1(a)示出使用了来自甲氧西林耐药性株的样品的情况下的扩增曲线和Tm值的测定结果，图1(b)示出使用了来自甲氧西林敏感株的样品的情况下的扩增曲线和Tm值的测定结果。
具体实施方式
＜引物＞
本发明中，引物是指在PCR法中作为DNA复制时的起点的DNA。本说明书中，只要没有另行说明，则引物指DNA引物。
本发明的发明点在于能够享受提高检测灵敏度的效果的特定引物对。
专利文献1中记载的由序列号45的碱基序列组成的引物和由序列号46的碱基序列组成的引物的配对，具有与甲氧西林耐药性基因(mecA)的结构基因内的序列杂交的DNA序列。需要说明的是，专利文献1中记载的序列号45的碱基序列及序列号46的碱基序列在本说明书中分别记为序列号13及14。
但是，即使是上述的引物对，在使用了PCR的检测方法中也不具有充分的检测灵敏度，无法检测低浓度的mecA(后述实施例5及表2)。在分析含有低浓度的MRSA的检体时，其存在由于检测灵敏度不足而显示假阴性的可能性。
mecA基因的结构基因由约2100bp构成，发现通过分别使用本申请发明人以与结构基因内杂交的方式设计的、以下a组所含的各引物对来实施PCR，能够以更高的灵敏度检测mecA基因。
(a)组：
(a1)包含包含序列号3的引物、和包含序列号7的引物的组合的引物对。
(a2)包含包含序列号2的引物、和包含序列号9的引物的组合的引物对。
(a3)包含包含序列号1的引物、和包含序列号8的引物的组合的引物对。
(a4)包含包含序列号1的引物、和包含序列号9的引物的组合的引物对。
(a5)包含包含序列号4的引物、和包含序列号11的引物的组合的引物对。
(a6)包含包含序列号5的引物、和包含序列号12的引物的组合的引物对。
(a7)包含包含序列号6的引物、和包含序列号10的引物的组合的引物对。
(a8)包含包含序列号6的引物、和包含序列号12的引物的组合的引物对。
只要在能够享受本发明的效果的范围内，则也可应用包含修饰碱基序列的修饰引物，所述修饰碱基序列是改变了构成上述各引物的DNA片段(寡核苷酸)所具有的碱基序列中的一部分碱基而得到的。原则上，修饰引物只要能与上述各引物的互补DNA链杂交，则视为与各引物等价。并且，该被视为等价的修饰引物优选为具有与原引物的互补DNA链杂交的引物的功能、且具有在原引物的碱基序列中添加、缺失或取代1个或2个碱基的修饰碱基序列的引物。
因此，以下的(b)组所含的引物对也可用作mecA基因检测用引物对。
(b)组：
(b1-1)包含包含序列号3的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号7的引物的组合的引物对。
(b1-2)包含包含序列号3的引物、和包含序列号7的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b1-3)包含包含序列号3的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号7的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b2-1)包含包含序列号2的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号9的引物的组合的引物对。
(b2-2)包含包含序列号2的引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b2-3)包含包含序列号2的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b3-1)包含包含序列号1的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号8的碱基序列的引物的组合的引物对。
(b3-2)包含包含序列号1的引物、和包含序列号8的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b3-3)包含包含序列号1的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号8的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b4-1)包含包含序列号1的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号9的引物的组合的引物对。
(b4-2)包含包含序列号1的引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b4-3)包含包含序列号1的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b5-1)包含包含序列号4的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号11的引物的组合的引物对。
(b5-2)包含包含序列号4的引物、和包含序列号11的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b5-3)包含包含序列号4的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号11的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b6-1)包含包含序列号5的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号12的引物的组合的引物对。
(b6-2)包含包含序列号5的引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b6-3)包含包含序列号5的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b7-1)包含包含序列号6的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号10的引物的组合的引物对。
(b7-2)包含包含序列号6的引物、和包含序列号10的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b7-3)包含包含序列号6的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号10的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b8-1)包含包含序列号6的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号12的引物的组合的引物对。
(b8-2)包含包含序列号6的引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
(b8-3)包含包含序列号6的修饰碱基序列的修饰引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的修饰引物的组合的引物对。
此外，互补引物的配对也可用作mecA基因检测用引物对，所述互补引物包含构成上述各引物对的引物的互补序列。即，以下的(c)组所含的引物对也可用作mecA基因检测用引物对。
(c)组：
(c1-1)包含包含序列号3的互补序列的引物、和包含序列号7的互补序列的引物的组合的引物对。
(c1-2)包含包含序列号3的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号7的互补序列的引物的组合的引物对。
(c1-3)包含包含序列号3的互补序列的引物、和包含序列号7的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c1-4)包含包含序列号3的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号7的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c2-1)包含包含序列号2的互补序列的引物、和包含序列号9的互补序列的引物的组合的引物对。
(c2-2)包含包含序列号2的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号9的互补序列的引物的组合的引物对。
(c2-3)包含包含序列号2的互补序列的引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c2-4)包含包含序列号2的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c3-1)包含包含序列号1的互补序列的引物、和包含序列号8的互补序列的引物的组合的引物对。
(c3-2)包含包含序列号1的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号8的碱基序列的互补序列的引物的组合的引物对。
(c3-3)包含包含序列号1的互补序列的引物、和包含序列号8的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c3-4)包含包含序列号1的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号8的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c4-1)包含包含序列号1的互补序列的引物、和包含序列号9的互补序列的引物的组合的引物对。
(c4-2)包含包含序列号1的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号9的互补序列的引物的组合的引物对。
(c4-3)包含包含序列号1的互补序列的引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c4-4)包含包含序列号1的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号9的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c5-1)包含包含序列号4的互补序列的引物、和包含序列号11的互补序列的引物的组合的引物对。
(c5-2)包含包含序列号4的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号11的互补序列的引物的组合的引物对。
(c5-3)包含包含序列号4的互补序列的引物、和包含序列号11的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c5-4)包含包含序列号4的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号11的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c6-1)包含包含序列号5的互补序列的引物、和包含序列号12的互补序列的引物的组合的引物对。
(c6-2)包含包含序列号5的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号12的互补序列的引物的组合的引物对。
(c6-3)包含包含序列号5的互补序列的引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c6-4)包含包含序列号5的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c7-1)包含包含序列号6的互补序列的引物、和包含序列号10的互补序列的引物的组合的引物对。
(c7-2)包含包含序列号6的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号10的互补序列的引物的组合的引物对。
(c7-3)包含包含序列号6的互补序列的引物、和包含序列号10的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c7-4)包含包含序列号6的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号10的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c8-1)包含包含序列号6的互补序列的引物、和包含序列号12的互补序列的引物的组合的引物对。
(c8-2)包含包含序列号6的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号12的互补序列的引物的组合的引物对。
(c8-3)包含包含序列号6的互补序列的引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
(c8-4)包含包含序列号6的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物、和包含序列号12的修饰碱基序列的互补序列的修饰引物的组合的引物对。
这些引物对中，优选引物对(a7)、以及、引物对(b7-1)～(b7-3)、(c7-1)～(c7-4)的引物对。
需要说明的是，上述的(a)组～(c)组所含的各引物对在与mecA基因所具有的结构基因内特异性杂交从而扩增mecA基因的特异性DNA片段这一点上具有共同的功能。
应注意的是，本发明的引物对是基于各种引物的可观数量的组合来确认有无效果的基础上首次发现的，而不是仅在追认效果的水平就能实现的。另外，应注意的是，序列检索的结果确认了作为mecA基因检测用引物对而言是新的组合。
本发明不妨碍除了本发明的引物对以外还合用多种针对细菌、真菌、病毒的已知引物的情况。
PCR中的引物浓度没有特别限定，一般而言可在0.05μM～1.0μM的范围内根据研究而适当地设定。
＜用于PCR的酶＞
本发明中使用的用于PCR的酶优选为来源于具有耐热性的生物的耐热性DNA聚合酶，更优选为来源于产甲烷菌、嗜热嗜酸菌、嗜热菌、超嗜热菌等原核生物的耐热性DNA聚合酶。
作为本发明中使用的耐热性DNA聚合酶的具体例，可举出来源于栖热水生菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、蛇发女怪高温球菌(Thermococcus gorgonarius)、鹿儿岛高温球菌KOD1(Thermococcus kodakaraensis KOD1)、沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、东工大硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、热液口火裂片菌(Pyrolobus fumarii)、或坎氏甲烷嗜高热菌(Methanopyrus kandleri)的耐热性DNA聚合酶。
另外，耐热性DNA聚合酶也可以是基因工程中人工合成的耐热性DNA聚合酶。
＜其他试剂＞
除引物对以外，本发明中用于PCR分析的试剂可使用已知试剂的已知组合。测定所需的试剂可举出用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、Mg2+源、灭菌水等。另外，实时PCR分析中，除了上述试剂外，还需要荧光色素等标记物质。
pH缓冲液用于将供PCR分析的试样调节至pH＝7.0～10.0(更优选为pH8.0～9.0)。具体而言，可举出Tris盐酸缓冲液等。例如，在Tris盐酸缓冲液的情况下，以5mM～100mM使用。
dNTP是用于经由PCR的DNA扩增的核苷源，需要dATP、dCTP、dGTP、dTTP这4种类型。另外，dNTP可使用为了用于热启动法而进行了化学修饰的dNTP，例如TriLinkBioTechnologies,Inc.制的CleanAmpTM dNTP。使用量是dATP、dCTP、dGTP、dTTP各使用0.1～0.2mM左右的浓度。
在经由PCR的DNA扩增中，Mg2+是必需的。作为Mg2+源，可举出MgCl2、MgSO4等。优选为MgCl2，其使用量在0.5mM～5.0mM的范围内根据研究而适当地使用。
荧光色素用于经由实时PCR检测DNA扩增产物、以及测定被扩增的DNA片段的Tm值的目的，例如，可举出使用具有标记功能的嵌入剂的方法。作为嵌入剂，可举出溴化乙锭、SYBR GreenI和Resolight(Roche公司制)、EvaGreen(Biotium公司制)、BOXTO(tataabiocenter制)等。优选的嵌入剂是EvaGreen和Resolight。使用量依照所使用的荧光色素的制造销售商的推荐。
除此以外，试剂盒中可包含作为PCR的阳性对照使用的细菌基因组DNA、或作为阴性对照使用的灭菌水。
作为本发明中所使用的PCR分析测定用容器(例如分析测定用管)，可选择使用具有与测定设备相对应的形状、结构的容器。只要是使用由测定设备的供货方推荐的容器，没有特别的问题且可以用于测定。
作为在实施本发明时需要的其他器具，可举出移液器、移液器用吸头、1.5ml微量管(microtube)等分子生物学实验中广泛使用的器具类，作为装置类，可举出PCR、超净工作台、管用离心机等分子生物学实验中广泛使用的设备。
＜试剂盒的形式＞
本发明的mecA基因检测试剂盒是通过分析用本发明的引物对扩增的DNA片段来检测mecA基因的试剂盒。作为扩增产物的DNA片段的分析可通过已知的方法实施。例如，通过DNA片段的分子量分析、Tm值测定(熔解曲线分析)等，可实施作为扩增产物的DNA片段的分析。也可组合2种以上的分析方法。优选为Tm值的测定，出于该目的合适地使用实时PCR。分子量的分析可利用电泳、质谱仪等实施。
本发明涉及的mecA基因检测试剂盒包含一个或多个上述(a)组～(c)组的引物对。除上述引物以外，还可根据需要而包含选自用于PCR的酶、pH缓冲液、MgCl2、dNTP(或CleanAmpTM dNTP)及灭菌水等试剂、PCR分析测定用容器(例如分析测定用管)和其他需要的器具等部件中的至少1种试剂及/或部件。此外，使用实时PCR的分析中，可添加荧光色素作为成分。另外，可根据PCR法的各种形式，还可向试剂盒添加除上述成分以外的、所用PCR法需要的成分。上述的各试剂或各部件可以任何形式进行包装，如单独包装、或者分部分包装、或者全部一体包装等。具体而言，有例如以下这样的形式。
1)分开所使用的每种试剂。
2)分成以下三类，即各自分开包装：将pH缓冲液、MgCl2、dNTP(或CleanAmpTMdNTP)、实时PCR的分析中的荧光色素预先混合的混合物；一个引物对；及用于PCR的酶。
3)分成以下两类，即各自分开包装：将pH缓冲液、MgCl2、dNTP(或CleanAmpTMdNTP)、实时PCR的分析中的荧光色素、一个引物对预先混合的混合物；及用于PCR的酶。
4)将pH缓冲液、MgCl2、dNTP(或CleanAmpTM dNTP)、实时PCR的分析中的荧光色素、一个引物对及用于PCR的酶全部预先混合而成的混合物封装。
需要说明的是，试剂盒具有多个引物对的情况下，将多个引物对分别分开包装。针对包含不同引物对的多种混合物构成试剂盒的情况，将各混合物各自分开包装。
＜用途领域·检体＞
本发明的mecA基因检测试剂盒可用于在医疗领域、食品领域、环境分析等各种领域中检测mecA基因。另外，可与专利文献1中的感染症致病菌的迅速鉴定方法组合使用，用于同时且迅速地实施致病菌鉴定和mecA基因检测。
作为供检查的检体，没有特别限定，可应用于广大范围的检体。具体而言，医疗领域中可举出血液、脑脊液、泪液、眼房水、羊水、关节液(synovial fluid)、唾液、鼻腔拭液、尿、其他体液、导管等医疗器具的附着物等。食品领域中，可举出食品自身、生产中途的液体、或固体饲料、制造工序内的设备附着物等。
＜DNA提取处理＞
使用本发明的mecA基因检测试剂盒实施检体中的mecA基因检测的情况下，需要从假定存在于检体中的细菌中预先提取DNA。作为DNA提取方法，目前，已知碱裂解法、煮沸法、酚提取法、微珠破碎法等，另外，各制造商也贩售各种DNA提取试剂盒。
本发明中的DNA提取方法没有特别限定，由于最合适的方法因检体而异，因此理想的是选择适合对象检体的方法。
＜PCR分析＞
本发明的引物对可在PCR法中使用。作为PCR法，只要是用于为了检测mecA基因而进行的目的基因扩增的PCR法即可，可利用各种PCR法。作为优选的分析方法，有实时PCR，更优选为实时PCR和用于Tm值测定的熔解曲线分析的组合。这种情况下，使用的实时PCR设备没有特别限定。需要说明的是，本申请实施例中使用的株式会社QIAGEN生产的Rotor GeneQ是合适地使用的实时PCR设备的一个例子。
PCR及实时PCR中，可以使用通常已知的装置、方法。
PCR中的温度循环的条件(温度、时间、升降温速度、循环数)没有特别限定，可以根据使用的引物、用于PCR的酶、模板等的性质、PCR后的DNA检测方法的灵敏度适当地设定。关于这样的条件的设定，已知有许多文献。
PCR中，一般而言，重复模板双链DNA的热变性步骤、引物的退火步骤、利用用于PCR的酶的DNA延伸步骤。热变性的步骤为模板双链DNA解离为单链的温度和时间即可，例如设定于90℃～98℃数秒～数分钟。另外，大多在PCR开始时仅在其第1次循环中追加数分钟～10分钟的热变性的过程。引物的退火步骤根据引物的碱基序列、碱基数量进行设定，大多设定于40℃～72℃数秒～数十秒。DNA延伸步骤中，对于温度而言，根据用于PCR的酶的最适温度等性质，一般是例如58℃～76℃，对于DNA延伸步骤的时间而言，由想扩增的DNA的链长度和用于PCR的酶的DNA合成速度估算需要的时间而设定。通过重复热变性、退火、延伸的步骤从而使目标DNA扩增，该重复次数可根据模板DNA的量、用于PCR的酶的量、PCR后的DNA检测方法的灵敏度而适当地变更，作为一般性例子可示例10～50次。另外，退火温度和DNA延伸的温度大致相同的情况下，也可同时实施这两个步骤。
实时PCR中，关于DNA扩增所需要的热变性、退火、DNA延伸的条件设定、以及这些步骤的重复次数与关于上述PCR的记载相同。实时PCR中，在DNA延伸步骤的前后等，测定来源于嵌入剂的荧光强度，可以定量或估计被扩增的DNA的量。就测定荧光强度的温度而言，在例如使用嵌入剂实施的情况下，可以保持为DNA延伸时的温度，另外，当被扩增的目标DNA的链长度较长、其Tm值较高时，引物二聚体等链长度较短的被非特异性扩增的非目标DNA(也称为非特异性扩增DNA)的Tm值较低，利用这一点，也可以设定为目标DNA的Tm值与非特异性扩增DNA的Tm值之间的温度，以中间值为代表。如此，尤其在使用嵌入剂的实施中，仅引物二聚体等非特异性扩增DNA从双链解离为单链，能够使由荧光强度定量或估计的DNA量成为针对目标DNA的量。
此外，在实时PCR中，在DNA扩增工序结束后，通过熔解曲线分析，能够测定被扩增的DNA的Tm值。熔解曲线分析中，观察与温度变化相应的DNA从双链向单链的解离，其温度及检测条件没有特别限定。一般而言，经过热变性(Denaturation)(90℃至98℃)、双链形成(Annealing)(40℃至80℃)、熔解(Melting)(从双链形成的温度缓缓升温至98℃左右)的阶段，监控熔解的步骤中的荧光强度的变化，得到熔解曲线，并能够从中得到Tm值。这样的测定可在实时PCR装置的多种机型中实现，可按照设备的使用方法实施。
＜检测方法＞
作为本发明涉及的检体中的mecA基因检测方法，可使用具有以下工序的方法。
(1)使用从前述检体制备的细菌的基因组DNA、用于得到包含mecA基因的扩增产物的引物对、和以耐热性DNA聚合酶为代表的PCR用试剂，实施PCR的工序。
(2)检测前述PCR的扩增产物中的mecA基因、或通过该扩增产物的分析，检测前述检体中的mecA基因的工序。
需要说明的是，使用多个引物对的情况下，按多个引物对分别地实施PCR工序(1)。即，向用于PCR的1个反应液中添加1个引物对，分别单独使用添加有不同引物对的多个反应液，来实施PCR工序(1)。
通过使用至少1种本发明涉及的引物对作为用于得到包含mecA基因的扩增产物的引物对，能够实施高灵敏度的甲氧西林耐药性基因(mecA)的检测。
该检测方法中，优选在抑制作为目的基因的mecA基因以外的基因(非目的基因)的扩增的情况下实施扩增工序。抑制该非目的基因的扩增可利用热启动法PCR。作为一例，可举出使用抗DNA聚合酶抗体的热启动法。此时，优选针对耐热性DNA聚合酶1U使用过量的抗DNA聚合酶抗体。另外，也可合适地利用如专利文献1及国际公开第2010/082640号说明书中公开的那样，针对DNA聚合酶施以可逆性化学修饰而进行的热启动法。此外，也可合适地利用使用了经化学修饰的dNTP、或使用了如美国专利申请公开第20070281308号说明书(US2007/0281308A1)中记载的那样进行了化学修饰的引物的热启动法。另外，利用加热融解的蜡等，也可合适地使用经由物理隔离DNA聚合酶与利用DNA聚合酶的DNA扩增所必需的构成成分(例如，引物、dNTP、Mg2+盐)的热启动法。
在扩增产物的检测工序中检测扩增产物中的目的基因可通过使用具有用于检测的荧光标记的嵌入剂的实时PCR测定Tm值来实施。优选的嵌入剂为Cyber GreenI、EvaGreen、Resolight、BOXTO、更优选为EvaGreen、Resolight。
在使用实时PCR测定Tm值的检测工序中，能够检测目的基因的扩增产物，并且不检测除此以外的非目的基因的扩增产物。作为用于该目的的方法，优选是通过
(1)选择使目的基因扩增产物的熔解温度(TmA)高于非目的基因的扩增产物的熔解温度(TmB)的引物，
(2)于TmA与TmB之间的温度实施扩增产物的检测，
设定能够检测目的基因的扩增产物、并且不检测除此以外的非目的基因的扩增产物的条件，从而仅检测目的基因的扩增产物的方法。
此外，可使用这样的方法，所述方法通过使用显示扩增产物的量的显示装置的实时PCR来实施扩增工序和检测工序，在所述显示装置中不显示非目的基因的扩增产物。
检测工序中的扩增产物的分析可通过将扩增产物在凝胶等上电泳展开，分析可视化的扩增产物来实施。另外，扩增产物的分析也可经由解读扩增产物的碱基序列来分析扩增产物而实施。此外，扩增产物的分析也可通过使用质谱仪测定扩增产物的分子量的分析方法来实施。
实施例
(实施例1)一次筛选
将从MRSA(RIKEN CORPORATION转让株，JCM31453)的培养液使用High pure PCRtemplate preparation试剂盒(Roche)提取的基因组DNA作为模板，使用序列号15和序列号16的引物，使用表1所示的反应液组成实施PCR，扩增mecA ORF全长。然后，制备mecA的扩增产物的梯度稀释(serial dilution)，使用由序列号13组成的正向引物和由序列号14组成的反向引物的比较用引物对，使用表1所示的反应液组成实施PCR，确定上升循环数为约20个循环的mecA的扩增产物的浓度，用作模板。需要说明的是，甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌JCM31453可通过微生物材料开发室(〒305-0074，茨城县筑波市高野台3-1-1、国立研究开发法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(RIKEN BRC-JCM))公开获得。
然后，为了评估制得的引物，针对313个引物对使用表1所示的反应液组成实施PCR。实时PCR装置使用了Rotor-Gene Q MDx5plex HRM(QIAGEN)。PCR的反应条件为：于95℃加热5分钟后，将94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒重复40次。就评估而言，针对上升循环数、高分辨率熔解分析(HRM)中的峰的形状、电泳中的条带的强度、电泳中有无非特异性产物，筛选了88对被确认与比较用引物对的结果相比改善的引物对。
(实施例2)二次筛选
使用50μg/ml人基因组DNA溶液(invirogen)，将从MRSA(RIKEN CORPORATION转让株，JCM31453)的培养液使用High pure PCR template preparation试剂盒(Roche)提取的基因组DNA的浓度调节至上升循环数为约20个循环的溶液，作为模板。
针对88个引物对，使用表1所示的反应液组成实施PCR，进行评估。实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)。PCR的反应条件为：于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒重复40次。就评估而言，针对上升循环数、HRM中的峰的形状、电泳中的条带的强度、电泳中有无非特异性产物，筛选了57对被确认与比较用引物对的结果相比改善的引物对。
(实施例3)三次筛选
使用50μg/ml人基因组DNA溶液(invirogen)，将从MRSA(RIKEN CORPORATION转让株，JCM31453)的培养液使用High pure PCR template preparation试剂盒(Roche)提取的基因组DNA的浓度调节至10.4分子/反应液的溶液，作为模板。针对57个引物对，通过使用了表1所示的反应液组成的三重测定实施PCR，进行评估。实时PCR装置使用了Rotor-Gene QMDx 5plex HRM(QIAGEN)。PCR的反应条件为：于95℃加热5分钟后，将94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒重复40次。就评估而言，筛选了9对在三重测定中都观察到扩增，针对HRM中的dF/dT的高度(通道A)、有无引物二聚体、有无非特异性产物的峰，被确认与比较用引物对的结果相比改善的引物对。
(实施例4)最终筛选
使用50μg/ml人基因组DNA溶液(invirogen)，将从MRSA(RIKEN CORPORATION转让株，JCM31453)的培养液使用High pure PCR template preparation试剂盒(Roche)提取的基因组DNA调节为各浓度(拷贝数/反应液：表2中显示为拷贝/反应)的溶液，作为模板。针对9个引物对，使用了表1所示的反应液组成、以三重测定实施PCR，由此进行评价。实时PCR装置使用了Rotor-Gene QMDx 5plex HRM(QIAGEN)。PCR的反应条件为：于95℃加热5分钟后，将94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒重复40次。将在三重测定中都能观察到扩增的最低浓度作为检测限。需要说明的是，通过Tm值的测定确认是否得到了目标扩增产物。
结果，筛选了较之使用作为在先申请的专利文献1中示出的比较用引物对实施检测的情况而言观察到检测限提高的8对。该结果示于表2。另外，比较用的引物对所具有的序列号13、14、筛选得到的8对所具有的各碱基序列示于表3。
(实施例5)甲氧西林耐药性株、甲氧西林敏感株中的比较
将从金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感性RIKEN CORPORATION转让株，JCM2151)及MRSA(甲氧西林耐药性RIKEN CORPORATION转让株，JCM16555)的培养液使用High pure PCRtemplate preparation试剂盒(Roche)提取的基因组DNA溶液用作模板。针对序列号6和序列号10的引物对，在表1所示的反应液组成中实施PCR，由此进行评价。实时PCR装置使用了Rotor-Gene Q MDx5plex HRM(QIAGEN)。PCR的反应条件为：于95℃加热5分钟后，将94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒重复40次。需要说明的是，通过Tm值的测定、基于在81℃附近有无峰确认是否得到了目标扩增产物。甲氧西林耐药性株的结果示于图1(a)，甲氧西林敏感株的结果示于图1(b)。
[表1]
表1反应液组成
(DW:去离子水)
[表2]
表2：
[表3]
表3
序列(5’→3’)
序列号1 CTGCTATCCACCCTCAAACAG
序列号2 ACTGCTATCCACCCTCAAAC
序列号3 GAAGATGGCTATCGTGTCAC
序列号4 ATCTTGGGGTGGTTACAACG
序列号5 TAGCACTCGAATTAGGCAGTAAG
序列号6 AGCTGATTCAGGTTACGGAC
序列号7 AATCTGGAACTTGTTGAGCAG
序列号8 AACGTTGTAACCACCCCAAG
序列号9 TGTAACGTTGTAACCACCCC
序列号10 GATTTTGGCATTGTAGCTAGCC
序列号11 ACCACCCAATTTGTCTGCC
序列号12 GTACCGGATTTGCCAATTAAG
序列号13 CAAACTACGGTAACATTGATCGC
序列号14 ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGC
序列号15 ATGAAAAAGATAAAAATTGTTC
序列号16 TTATTCATCTATATCGTAT
产业上的可利用性
由表2中记载的试验结果可知，使用本发明的引物对的本发明的检测方法能够检测在1个反应中为10拷贝以下的极其微量的mecA基因。本发明的检测方法能够高灵敏度、高精度、且迅速地检测极少量的检体中的极稀少的mecA基因，因此具备充分的实用性和广泛的应用性。本发明的引物对、检测方法及检测试剂盒可用于医疗领域、食品领域、环境分析中产生的、各种检体中的微量的mecA基因的检测。

Claims (7)

1.用于检测mecA基因的引物对，其是用于检测mecA基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，
其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的1个引物对，
(a)包含序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
2.如权利要求1所述的引物对，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
3.包含引物对的mecA基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对，
(a)包含序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其包含用于PCR的酶、用于PCR的试剂及用于PCR的器具中的至少1种。
6.选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对在检体中的mecA基因的检测试剂盒的制造中的用途，所述检测包括：
PCR工序，使用从检体中制备的DNA、和用于扩增DNA的引物对实施PCR；和
通过检测利用所述PCR工序得到的扩增产物中的mecA基因、或通过分析所述扩增产物，来实施所述检体中的mecA基因的检测的工序，
(a)包含序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
7.如权利要求6所述的用途，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
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