JP4797602B2 - 試料中の被破砕物の破砕方法 - Google Patents
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Description
本発明は、粉末状固形物を、被破砕物を含む試料に添加し、該試料を攪拌することにより試料中の被破砕物を破砕する方法において、該粉末状固形物の長径が32μm以下であり、その比重が3.5以上であり、その硬度(Hv10)が600以上である、被破砕物の破砕方法を提供する。
好適な態様において、該粉末状固形物は無定形である。さらに、該被破砕物は微生物又は生物組織であることができる。より好ましい態様において、該粉末状固形物はジルコニアである。
別の観点において、本発明は上記方法により破砕した被破砕物から核酸を抽出することを特徴とする核酸の抽出方法も提供する。
本発明における粉末状固形物質とは、長径が32μm以下であり、その比重が3.5以上であり、その硬度(Hv10)が600以上であるという条件を満たす物質であれば何でも良く、無機材料でも有機材料であってもよい。かかる粉末状固形物質の材料の限定でない例として、例えば、ジルコニア、ダイアモンド、鉄、合金、例えばタングステンカーバイド−コバルト合金(WC−Co合金)といった無機材料等が挙げられる。
板状ジルコニアTZ−8YS(東ソー社製、110mmX110mm、厚さ0.3mm、比重6.05)をニットー電動スタンプミルANS143(愛知電機株式会社製)により、120rpmで5分間破砕した。得られた粉末状のジルコニアをφ32μmのふるいにかけ、粒子の長径が32μm以下のジルコニア粉末を回収し、121℃で20分間滅菌処理し、無定形ジルコニア粉末(φ32μm以下)とした。該無定形ジルコニア粉末(φ32μm以下)の走査型電子顕微鏡写真を図1に示した。粒子の長径が32μm以下で、鋭利な角を持った不均一な形状の無定形粉末であることが示される。φ32μmのふるいにかけた残りのジルコニア粉末を同様にφ75μmのふるいにかけ、φ32μm以上φ75μm以下の粉末とφ75μm以上の粉末をそれぞれ回収し、121℃で20分間滅菌処理し、それぞれ無定形ジルコニア粉末(φ32μm以上φ75μm以下)、無定形ジルコニア粉末(φ75μm以上)とした。
MRSA(メシチリン耐性黄色ブドウ球菌)のPBP−2’をコードするmecA遺伝子(FEBS Lett. 221(1)、167−171,1987)を組み込んだpUC19により形質転換を行ったJM109を、100μg/mlのアンピシリンを添加したLB培地により37℃で一晩培養した。該培養液を、波長600nmにおける吸光度が0.5となるようにPBSで希釈し、試料とした。
2.により調整した試料1mlを2ml容量のエッペンドルフチューブ(エッペンドルフ社製)に入れ、これに1.により調整した無定形ジルコニア粉末(φ32μm以下)あるいは無定形ジルコニア粉末(φ32μm以上φ75μm以下)、あるいは無定形ジルコニア粉末(φ75μm以上)を3.0g添加した。該試料と無定形ジルコニア粉末を含んだチューブを室温で2分間激しく攪拌した。その後、遠心分離により上清を回収した。一方、2ml容量のエッペンドルフチューブに入れた該試料1mlに上記無定形ジルコニア粉末と同容積の球形ジルコニア(φ30μm)あるいはアルミナ粉末(比重3.5、φ50μm以下)を添加し、上記操作と同様に試料を攪拌し、上清を回収した。
3.で調整した上清を滅菌水で2倍希釈し、そのうち2μlを用いて、プライマー(MecP4:5’−TGCTATCCACCCTCAAACAGG−3’(配列番号1)とプライマー(MecP2:5’−AACGTTGTAACCACCCCAAGA−3’(配列番号2)を用いたライトサイクラー(ロッシュ・ダイアグノスティックス社製)による定量PCRを行うことにより上清中のmecA遺伝子を定量した。PCR反応は、94℃で20秒、43℃で30秒、72℃で2分を1サイクルとして40サイクル行った。対照として、2.により調整した該試料1mlを13000回転で10分間遠心した沈殿からQIA prep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)によりプラスミドを抽出し、定量PCRを行なった。
(i)は長径が32μm以下の無定形ジルコニア粉末により、大腸菌を破砕し核酸を回収した場合、(ii)は長径が32μm以上75μm以下の無定形ジルコニア粉末により、大腸菌を破砕し核酸を回収した場合、(iii)は長径が75μm以上の無定形ジルコニア粉末により、大腸菌を破砕し核酸を回収した場合、(iv)は粒子径が30μm以下の球形ジルコニアにより、大腸菌を破砕し核酸を回収した場合、(v)は長径が50μm以下の無定形アルミナ粉末により、大腸菌を破砕し核酸を回収した場合を示す。
Claims (2)
- 粉末状固形物を、微生物を含む試料に添加し、該試料を攪拌することにより試料中の微生物を破砕する方法において、該粉末状固形物が無定形ジルコニアであり、該ジルコニアの長径が32μm以下であり、該ジルコニアの比重が3.5以上であり、該ジルコニアの硬度(Hv10)が600以上である、微生物の破砕方法。
- 請求項1の方法により微生物を破砕することで該微生物から核酸を抽出することを特徴とする、核酸の抽出方法。
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