JP2021006065A - 核酸を含有する検体から核酸を分離する方法及びそのための装置 - Google Patents
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Abstract
Description
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、
を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置
を用い、
前記核酸採取部材の収容空間に検体を収容する工程1と、
工程1の後に、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続して、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通させる工程2と
工程2において形成された、前記処理試薬収容容器の容器内空間と前記核酸採取部材の収容空間とが一体となった混合用空間内で、前記検体と前記処理試薬とを混合して前記混合物を形成し、前記混合物内で前記検体中の核酸を遊離させる工程3と、
工程3において遊離された核酸を含む前記混合物を、前記処理試薬収容容器の容器内空間の体積を減少させることにより圧送し、前記核酸採取部材の混合物排出口から前記担体を介して排出する工程4と、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置を提供する。
前記処理試薬収容容器が、前記放出口の周縁を囲う放出口周縁部を備え、
前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部であり、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とは、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とが当接した状態で接続することができるように構成されており、
前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている。
前記核酸採取部材が、周壁部の外周面から外方向に張り出した張出部と、張出部の周縁から、前記周壁部の、前記処理試薬供給口が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部とを更に備え、
前記放出口周縁部の外周面と、前記混合物漏出防止壁部の内周面とのうち一方又は両方には、全周を囲うように周方向に延び、径方向に向け突出した、圧縮変形可能なリング状突起が少なくとも1つ形成されており、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面とが対向し、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間で挟まれた前記リング状突起が圧縮変形して、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間の前記混合物の通過、及び/又は、前記処理試薬供給口周縁部の外周面と前記放出口周縁部の内周面との間の前記混合物の通過が阻止されるように、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とが形成されている。
有機溶媒、アルデヒド系消毒剤、ヨウ素剤、塩素剤、過酢酸、オゾン、過酸化水素、メルブロミン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、界面活性剤、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも1種の、微生物の感染性を低減する成分と、
アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも1種の、核酸を遊離させる成分と
を含む、検体中の核酸を遊離させるための検体処理試薬を提供する。
検体中の核酸を遊離する方法であって、
検体と前記検体処理試薬とを混合して混合物を形成し、該混合物中で、前記検体に含まれ得る微生物の感染性を低減するとともに、前記検体中の核酸を遊離させる工程1を含む方法、を提供する。
検体から核酸を分離する方法であって、
前記工程1と、
前記工程1で形成された混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させる工程2と
を含む方法、を提供する。
核酸を含有し、S−S結合により架橋した成分を含む検体から核酸を分離する方法であって、
チオール系還元剤を含む前記検体処理試薬と前記検体との混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させること
を含む方法を提供する。
本発明は、処理試薬収容容器と核酸採取部材とを用いて、核酸含有検体から核酸を分離する方法に関する。処理試薬収容容器の具体例としては、図1に示す処理試薬収容容器100を挙げることができ、核酸採取部材の具体例としては、図2に示す核酸採取部材200を挙げることができる。以下、本発明に用いる各器具及びそれを用いた方法について図面に記載の実施形態を参照して説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
<核酸を分離するための装置>
本発明はまた核酸を含有する検体から核酸を分離する装置を提供する。
<処理試薬>
検体中の核酸を遊離させる処理試薬は、核酸を遊離させる成分を含み、好ましくは更に、微生物の感染性を低減する成分、及び、核酸の担体への吸着を促進する成分から選択される1種以上を含む。処理試薬は、前記成分として、或いは前記成分以外の成分として水や、有機溶媒等の液体媒体を含むことができる。
<核酸>
本発明における核酸とは、DNAやRNAといったデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドの重合体が例示される。核酸の起源は特に限定されず、真核生物、細菌、アーキア、ウイルス、ウイロイド、人工合成物などに由来する核酸であってよい。
<核酸を含有する検体>
本発明に用いることができる検体は核酸を含有する検体(核酸を含有している可能性のある検体も包含する)であれば特に限定されない。核酸を含有する検体としては例えば生体試料、飲食物、河川水、海水等が挙げられる。生体試料はヒト等の動物に由来するものであってもよいし、植物に由来するものであってもよいし、微生物に由来するものであってもよい。生体試料としては血液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻汁、拭い液等が挙げられる。
<感染性微生物>
本発明における感染性微生物とは、他の生物に感染して宿主に感染症を起こす性質や能力を有する微生物のことを指し、例えば、梅毒トリポネーマやボレリアなどのスピロヘータ、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、抗酸菌(結核菌等)、破傷風菌、大腸菌などの病原性細菌や、病原性真菌などが挙げられる。感染性微生物としては更に、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、HIVウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオウイルスなどのウイルスも例示できる。すなわち、本明細書において「微生物」という用語の範囲にはウイルスも含まれる。
<核酸を吸着する担体>
本発明における核酸を吸着する担体(以下「核酸吸着性担体」という場合がある)とは、処理試薬と検体との混合物の存在下において、遊離した核酸を吸着することが可能な核酸吸着性担体を指す。
<洗浄液>
本発明に用いる洗浄液は、核酸が吸着した核酸吸着性担体に残存する可溶化試薬や試料由来の夾雑物を洗浄できるものであれば良く、核酸が溶解しない有機溶媒や水溶性高分子溶液、糖水溶液が例示されるがこれに限定されない。
<溶離液>
本発明に用いる溶離液は、核酸吸着性担体に吸着された核酸を溶離させることが可能な液体であれば特に限定されない。溶離液としては水、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液等が挙げられる。溶離液には溶離液としての機能を阻害しない限り、またPCR反応を阻害しない限り、pH緩衝性成分、塩等の成分が含まれていてもよい。
<本発明の装置の各要素を構成する材料>
本発明の装置の各要素を構成する材料は、一般的に液体を保存する容器に使用することができる材料を用いればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフラート、ポリ塩化ビニル、テフロン(登録商標)、アクリロニトリルブタジエンスチレン、アクリルなどの合成樹脂が挙げられる。また、ガラスや金属といった一般的に液体を保存する容器に使用されている材料であってもよい。これらの中から複数を組み合わせて使用することも可能である。経済性の観点から好ましくは合成樹脂である。
<本発明の処理試薬の好ましい実施形態>
喀痰等の、S−S結合により架橋した成分を含む検体中の核酸を遊離させるための処理試薬の好適な実施形態は、微生物の感染性を低減する前記成分と、核酸を遊離させる前記成分に加えて、更にチオール系還元剤を含む処理試薬である。本実施形態の処理試薬は、喀痰等の、S−S結合により架橋した成分を含む検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるために特に好適に用いることができる。チオール系還元剤としてはN−アセチル−L−システインが好ましい。本実施形態の処理試薬におけるチオール系還元剤の濃度は上記の通りである。処理試薬は、好ましくは、微生物の感染性を低減する前記成分と、核酸を遊離させる前記成分と、チオール系還元剤とが水中に溶解した水溶液である。微生物の感染性を低減する前記成分及び核酸を遊離させる前記成分として、微生物の感染性を低減し且つ核酸を遊離させる成分を用いてもよい。処理試薬はより好ましくは、処理試薬全量に対して、0.5重量%以上のチオール系還元剤を含む水溶液であり、該濃度の更に好ましい範囲は上記の通りである。本実施形態の処理試薬は、上記の他の成分を更に含んでもよい。他の成分としてはカオトロピック剤が好ましく、カオトロピック剤の量は検体と混合した時の終濃度が上記の範囲となる量であることが好ましい。
<本発明の核酸の分離方法の好ましい実施形態>
本発明の他の実施形態は、
核酸を含有し、S−S結合により架橋した成分を含む検体から核酸を分離する方法であって、
微生物の感染性を低減する前記成分、核酸を遊離させる前記成分、及び、チオール系還元剤を含む処理試薬と前記検体との混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させること
を含む方法に関する。
「核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する装置であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置」又はその好ましい実施形態を指す。
[実施例1]
図示するような処理試薬収容容器100と、核酸採取部材200と、排出物収容容器400と、洗浄液収容容器440と、連結部材450と、溶離液収容容器460と、核酸回収容器470とを用いて以下の操作を行った。核酸採取部材200は、図2に示すように検体受容部材240と担体保持部材250とを組み合わせたものである。担体保持部材250は、担体205として、円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体(膜厚1.5mm、口径4mm、スルーポア径30〜40μm(測定法:走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値))を備える。ただし溶離液収容容器460としては、図4−5に示す形態とは異なり、圧送部461が、押し潰すことにより、圧送部内部空間111及び容器内空間110の体積が減少するように変形可能な袋体からなるものを用いた。
(核酸の抽出)
図4−1に示すように核酸採取部材200を排出物収容容器400に接続し、抗酸菌の一種であるMycobacterium smegmatis(M.smegmatis)の培養液(1.0×106CFU/mL)を検体Sとして、検体3mLを核酸採取部材200の収容空間203に入れた。次いで図4−2に示すように、5重量%の水酸化ナトリウムと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが処理試薬101として封入された処理試薬収容容器100を核酸採取部材200に接続した。次いで、検体Sと処理試薬101との混合物421を混合用空間420内で、装置の全体を10回上下に振り混ぜることにより混合した後、室温条件で5分間静置した。
[実施例2]
検体SとしてM.smegmatisの培養液(1.0×104CFU/mL)を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例3]
検体SとしてM.smegmatisの培養液(1.0×102CFU/mL)を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例4]
洗浄液443として60重量%エタノール水溶液15mLが封入された洗浄液収容容器440を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例5]
洗浄液443として20重量%エタノール水溶液15mLが封入された洗浄液収容容器440を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例6]
処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと60重量%のエタノールを含む水溶液3mLが封入された処理試薬収容容器100を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例7]
処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと60重量%のエタノールを含む水溶液15mLが封入された処理試薬収容容器100を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例8]
処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウム、30重量%のヨウ化ナトリウム(検体と混合したときの終濃度がおおよそ1.3M)、及び60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容容器100を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例9]
処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウム、20重量%のヨウ化ナトリウム(検体と混合したときの終濃度がおおよそ0.8M)、及び60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容容器100を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例10]
処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウム、20重量%の尿素(検体と混合したときの終濃度がおおよそ2.1M)、及び60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容容器100を用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例11]
円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体として、膜厚1.0mm、口径4mm、スルーポア径30〜40μm(測定法:走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値)のものを用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例12]
円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体として、膜厚1.5mm、口径10mm、スルーポア径30〜40μm(測定法:走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値)のものを用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例13]
円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体として、膜厚1.0mm、口径4mm、スルーポア径5〜10μm(測定法:走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値)のものを用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.smegmatisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例14]
図示するような処理試薬収容容器100と、核酸採取部材200と、排出物収容容器400と、洗浄液収容容器440と、連結部材450と、溶離液収容容器460と、核酸回収容器470とを用いて以下の操作を行った。核酸採取部材200は、図2に示すように検体受容部材240と担体保持部材250とを組み合わせたものである。担体保持部材250は、担体205として、円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体(膜厚1.5mm、口径4mm、スルーポア径30〜40μm(測定法:走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値)を備える。ただし溶離液収容容器460としては、図4−5に示す形態とは異なり、圧送部461が、押し潰すことにより、圧送部内部空間111及び容器内空間110の体積が減少するように変形可能な袋体からなるものを用いた。
[実施例15]
検体SとしてM.bovis(BCG株)の培養液(1.0×102CFU/mL)を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例16]
検体SとしてM.bovis(BCG株)の培養液(5.0×101CFU/mL)を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例17]
検体SとしてM.bovis(BCG株)の培養液(2.5×101CFU/mL)を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例18]
検体SとしてM.bovis(BCG株)の培養液(5.0×101CFU/mL)に、豚由来ムチンを20重量%となるように加えた粘稠な溶液を用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容容器100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例19]
検体Sとしてグラム陰性細菌であるEscherichia coliの培養液(1.0×102CFU/mL)を用いた以外は、実施例14と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、E.Coliの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例20]
検体Sとしてグラム陽性細菌であるStreptococcus thermophilusの培養液(1.0×102CFU/mL)を用いた以外は、実施例14と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、S.thermophilusの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例21]
(殺菌効力の試験)
本実施例では、核酸分離装置に用いる処理試薬のM.smegmatisおよびM.bovis BCG(BCG)に対する殺菌効力を評価した。
<菌液の調製>
M.smegmatisは、抗酸菌増菌用液体培地(極東製薬工業社製)を用いて37℃で二週間培養した。培養した菌液をポアサイズが5μmのAcrodisk filter(Pall Corporation製)でろ過し不要な菌塊を除いた。本ろ過液を吸光度530nmにて測定し、ろ過液のO.D.が0.1になっているのを確認した。本ろ過液を、1ml中に10の7乗個相当の菌が含まれている菌液として後述する殺菌効力評価に用いた。
<処理試薬の調製>
本評価に用いる処理試薬として、エタノール(EtOH)、水酸化ナトリウム(NaOH)の二成分を混ぜた組成、これら二成分にN−アセチル−L−システイン(NALC)の三成分を混ぜた組成、これら三成分にグルタールアルデヒドを混ぜた組成を調製した。またポジティブコントロール(PC)としてフェノール溶液を、ネガティブコントロール(NC)として生理食塩水を設定した。本評価に用いた処理試薬の組成を表1に示す。表1中、各組成物は水溶液であり、各組成物中の各成分の割合を重量%で示す。
上述したM.smegmatis菌液、BCG菌液、M.smegmatis含有擬似喀痰、BCG含有擬似喀痰の四種類を用いて、各処理試薬の殺菌効力の評価を行った。
殺菌率(%)
=[(NCの生菌数)−(処理試薬使用時の生菌数)]/(NCの生菌数)×100
M.smegmatis擬似喀痰、BCG擬似喀痰に対する殺菌効力評価も、上述した菌液に対する評価と同様の手法で行い、殺菌率を算出した。
[実施例22]
検体Sとしてマウスの血液3mLにM.bovisの培養液(1.0×107CFU/mL)を3μL添加して十分に混合したものを用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例23]
検体Sとしてマウスの筋肉組織3ccをすりつぶしたものにM.bovisの培養液(1.0×107CFU/mL)を3μL添加して十分に混合したものを用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例24]
検体SとしてE.coliの培養液(1.0×107CFU/mL)3mLにM.bovisの培養液(0.5×105CFU/mL)を3μL添加して十分に混合したものを用いた以外は実施例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例25]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:2+、培養検査:陽性)を用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例26]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:1+、培養検査:陽性)を用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例27]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:±、培養検査:陽性)を用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例28]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例29]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を10倍に希釈したものを用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例30]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を100倍に希釈したものを用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[実施例31]
検体Sとして喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を1000倍に希釈したものを用い、処理試薬101として5重量%の水酸化ナトリウムと5重量%のN−アセチル−L−システインと60重量%のエタノールを含む水溶液5mLが封入された処理試薬収容溶液100を用いた以外は実施例14と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約7分であった。
[比較例1]
結核菌の一種であるM.Bovis(BCG株)の培養液(1.0×104CFU/mL)を検体として、栄研化学(株)より販売されているLoopamp(登録商標) PURE DNA抽出キットを用い、キットの取扱説明書に準じて核酸の抽出を行った。培養液60μLを検体処理チューブに添加して90℃で5分間加熱し、2分間室温で放置した。吸着剤チューブに検体処理チューブを接続して、上下左右に振盪して混合させた。滴下注入キャップを接続して、吸着剤チューブを絞り、核酸抽出液を採取した。採取した核酸抽出液10μLを採取し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.Bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約9分であった。
[比較例2]
検体としてM.Bovis(BCG株)の培養液(1.0×102CFU/mL)を用いた以外は比較例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約9分であった。
[比較例3]
検体としてM.bovis(BCG株)の培養液(5.0×101CFU/mL)を用いた以外は比較例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出し、M.bovisの核酸抽出を確認した。PCRに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約9分であった。
[比較例4]
検体としてM.bovis(BCG株)の培養液(2.5×101CFU/mL)を用いた以外は比較例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出したところ、リアルタイムPCRでは核酸の増幅は検出されなかった。
[比較例5]
検体としてM.bovis(BCG株)の培養液(1.0×103CFU/mL)に、豚由来ムチンを20重量%となるように加えた粘稠な溶液を用いた以外は比較例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出したところ、リアルタイムPCRでは核酸の増幅は検出されなかった。
[比較例6]
検体としてM.bovis(BCG株)の培養液(1.0×102CFU/mL)に、豚由来ムチンを20重量%となるように加えた粘稠な溶液を用いた以外は比較例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出したところ、リアルタイムPCRでは核酸の増幅は検出されなかった。
[比較例7]
検体として実施例28と同一の喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を用い、結核検査指針2007(発行:財団法人結核予防会)に記載のNALC−NaOH法を用いて喀痰の消化・汚染除去を行い、続いてアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添付文書に記載の手順に従って核酸抽出した。得られた核酸抽出物をリアルタイムPCRで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。
[比較例8]
検体として実施例30と同一の喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を100倍希釈したものを用い、結核検査指針2007(発行:財団法人結核予防会)に記載のNALC−NaOH法を用いて喀痰の消化・汚染除去を行い、続いてアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添付文書に記載の手順に従って核酸抽出した。得られた核酸抽出物をリアルタイムPCRに供したところ、核酸の増幅は検出されなかった。
[比較例9]
検体として実施例31と同一の喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を1000倍希釈したものを用い、結核検査指針2007(発行:財団法人結核予防会)に記載のNALC−NaOH法を用いて喀痰の消化・汚染除去を行い、続いてアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添付文書に記載の手順に従って核酸抽出した。得られた核酸抽出物をリアルタイムPCRに供したところ、核酸の増幅は検出されなかった。
[比較例10]
検体として実施例28と同一の喀痰(塗抹検査:−、培養検査:陽性)を用いた以外は比較例1と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムPCRで増幅、検出したところ、リアルタイムPCRでは核酸の増幅は検出されなかった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (21)
- 核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する方法であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、
を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置
を用い、
前記核酸採取部材の収容空間に検体を収容する工程1と、
工程1の後に、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続して、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通させる工程2と
工程2において形成された、前記処理試薬収容容器の容器内空間と前記核酸採取部材の収容空間とが一体となった混合用空間内で、前記検体と前記処理試薬とを混合して前記混合物を形成し、前記混合物内で前記検体中の核酸を遊離させる工程3と、
工程3において遊離された核酸を含む前記混合物を、前記処理試薬収容容器の容器内空間の体積を減少させることにより圧送し、前記核酸採取部材の混合物排出口から前記担体を介して排出する工程4と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記処理試薬収容容器が、前記放出口の周縁を囲う放出口周縁部を備え、
前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部であり、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とは、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とが当接した状態で接続することができるように構成されており、
前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている、
請求項1に記載の方法。 - 前記核酸採取部材が、周壁部の外周面から外方向に張り出した張出部と、張出部の周縁から、前記周壁部の、前記処理試薬供給口が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部とを更に備え、
前記放出口周縁部の外周面と、前記混合物漏出防止壁部の内周面とのうち一方又は両方には、全周を囲うように周方向に延び、径方向に向け突出した、圧縮変形可能なリング状突起が少なくとも1つ形成されており、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面とが対向し、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間で挟まれた前記リング状突起が圧縮変形して、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間の前記混合物の通過、及び/又は、前記処理試薬供給口周縁部の外周面と前記放出口周縁部の内周面との間の前記混合物の通過が阻止されるように、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とが形成されている、
請求項2に記載の方法。 - 工程4の後に、洗浄液を用いて担体を洗浄し、担体から核酸以外の不要成分を除去する工程5を更に含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程5の後に、核酸を溶離させる溶離液を担体と接触させ、担体から核酸を溶離させる工程6を更に含む、請求項4に記載の方法。
- 前記処理試薬が、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する装置であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置。 - 前記処理試薬収容容器が、前記放出口の周縁を囲う放出口周縁部を備え、
前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部であり、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とは、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とが当接した状態で接続することができるように構成されており、
前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている、
請求項7に記載の装置。 - 前記核酸採取部材が、周壁部の外周面から外方向に張り出した張出部と、張出部の周縁から、前記周壁部の、前記処理試薬供給口が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部とを更に備え、
前記放出口周縁部の外周面と、前記混合物漏出防止壁部の内周面とのうち一方又は両方には、全周を囲うように周方向に延び、径方向に向け突出した、圧縮変形可能なリング状突起が少なくとも1つ形成されており、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面とが対向し、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間で挟まれた前記リング状突起が圧縮変形して、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間の前記混合物の通過、及び/又は、前記処理試薬供給口周縁部の外周面と前記放出口周縁部の内周面との間の前記混合物の通過が阻止されるように、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とが形成されている、
請求項8に記載の装置。 - 前記担体から核酸以外の不要成分を除去するための洗浄液を収容する洗浄液収容容器を更に備える、請求項7〜9のいずれか1項に記載の装置。
- 前記担体から核酸を溶離させる溶離液を収容する溶離液収容容器を更に備える、請求項7〜10のいずれか1項に記載の装置。
- 前記処理試薬が、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む、請求項7〜11のいずれか1項に記載の装置。
- 有機溶媒、アルデヒド系消毒剤、ヨウ素剤、塩素剤、過酢酸、オゾン、過酸化水素、メルブロミン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、界面活性剤、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも1種の、微生物の感染性を低減する成分と、
アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも1種の、核酸を遊離させる成分と
を含む、検体中の核酸を遊離させるための検体処理試薬。 - カオトロピック剤及び有機溶媒からなる群から選択される少なくとも1種の、核酸の担体への吸着を促進する成分を更に含有する、請求項13に記載の検体処理試薬。
- チオール系還元剤を更に含有する、請求項13又は14に記載の検体処理試薬。
- 微生物の感染性を低減する前記成分としてアルコールを含み、
核酸を遊離させる前記成分としてアルカリ物質を含む、
請求項15に記載の検体処理試薬。 - 微生物の感染性を低減する前記成分及び核酸を遊離させる前記成分としてアルカリ物質を含む、請求項15に記載の検体処理試薬。
- 微生物の感染性を低減する前記成分としてアルコールを更に含む、請求項17に記載の検体処理試薬。
- 前記検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるための、請求項15〜18のいずれか1項に記載の検体処理試薬。
- 核酸を含有し、S−S結合により架橋した成分を含む検体から核酸を分離する方法であって、
請求項15〜18のいずれか1項に記載の検体処理試薬と前記検体との混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させること
を含む方法。 - 前記担体が、シリカを含む担体である、請求項20に記載の方法。
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