ES2876239T3 - Procedimiento para detectar un microorganismo en una muestra - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para detectar un microorganismo en una muestra, comprendiendo el procedimiento: a) filtrar una muestra a través de un filtro para atrapar cualquier microorganismo presente en la muestra; b) tratar el filtro para liberar ADN o material genómico a partir de los microorganismos atrapados; c) amplificar el ADN o material genómico liberado a partir de los microorganismos atrapados; y d) identificar regiones específicas del ADN o material genómico para determinar la presencia, identificar la especie o cuantificar el número aproximado de cualquier microorganismo atrapado, en el que la etapa c) comprende amplificación por desplazamiento múltiple sobre el filtro.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para detectar un microorganismo en una muestra
Sector de la invención
PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR UN MICROORGANISMO EN UNA MUESTRA
Estado de la técnica anterior
Dentro de la industria farmacéutica, todos los productos se deben someter a prueba para determinar su esterilidad para garantizar la seguridad del paciente. Las pautas de la MHRA (Medicines and Healthcare products Regulatory Agency, Agencia Reguladora de Medicamentos y Productos Sanitarios) establecen que las simulaciones de crecimiento basadas en caldo se utilizan para lograr esto para la esterilidad, pruebas de simulación y pruebas de validación. Antes de la distribución de un producto en el mercado, se utilizan caldos enriquecidos con nutrientes, tales como caldo de soja y triptona (TSB), para determinar la esterilidad del producto. Tales caldos, cuando se incuban a una temperatura apropiada, proporcionan condiciones adecuadas para el crecimiento de muchos microorganismos. Por tanto, el crecimiento de los microorganismos en el caldo actúa como un indicador de un producto contaminado, y se evalúa mediante una determinación visual de la turbidez o, en algunos casos, un cambio de color, del caldo después de 14 días. A los 14 días del muestreo, el producto ya puede estar en el mercado y, a veces, incluso administrarse a un paciente. Cuando se identifica la turbidez del caldo, se realiza una investigación extensiva de su posible fuente y, con frecuencia, esto conduce a la retirada y destrucción del producto que se está sometiendo a prueba.
La utilización de tales pruebas basadas en caldo no se limita a la industria farmacéutica, y se pueden encontrar aplicaciones, pero sin constituir limitación, en las industrias de alimentos, agua y diagnóstico.
Aunque la premisa detrás de la utilización de caldo con nutrientes es lógica, los inventores de la presente invención han reconocido las siguientes limitaciones para su aplicación, siendo estas: 1) la prueba puede durar hasta 14 días, ya que algunos microorganismos crecen lentamente; 2) la identificación de turbidez tiene cierto grado de subjetividad, ya que se basa en la experiencia, la habilidad y el conocimiento del “lector” del caldo para reconocer turbidez dentro de una solución; 3) debido al tiempo de incubación requerido para la prueba, se pueden haber administrado productos contaminados al paciente antes de detectar la contaminación, lo que conduce posiblemente a infección y muerte; y 4) no todos los microorganismos pueden crecer en los caldos recomendados, lo que da como resultado resultados negativos posiblemente falsos. La Patente EP1593747 A1 da a conocer un procedimiento para detectar, enumerar e identificar microorganismos, que comprende: (a) filtrar una muestra líquida a través de una membrana adecuada para la retención de microorganismos, (b) someter la membrana a una etapa de amplificación, en el que la etapa de amplificación contiene uno o varios agentes de detección, y (c) detectar la presencia/ausencia de uno o varios microorganismos, el número detectado y el tipo. Sin embargo, este procedimiento no incluye ninguna etapa de lisis para liberar el ADN.
Tras un incidente reciente en el que las limitaciones descritas anteriormente contribuyeron a la muerte de tres bebés en el Reino Unido, los inventores de la presente invención han desarrollado una prueba alternativa que supera las limitaciones del estándar regulador actual al proporcionar una determinación en el mismo día de la contaminación del producto.
Características de la invención
Según un primer aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para detectar un microorganismo en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a) filtrar una muestra a través de un filtro para atrapar cualquier microorganismo presente en la muestra; b) tratar el filtro para liberar ADN o material genómico a partir de los microorganismos atrapados;
c) amplificar el ADN o material genómico liberado a partir de los microorganismos atrapados; y
d) identificar regiones específicas del ADN o material genómico para determinar la presencia, identificar la especie o cuantificar el número aproximado de cualquier microorganismo atrapado,
en el que la etapa c) comprende amplificación por desplazamiento múltiple sobre el filtro.
Por consiguiente, la presente invención da a conocer una tecnología de amplificación de ADN que permite identificar la presencia de microorganismos individuales (tales como células bacterianas o fúngicas individuales) en cuestión de horas. El procedimiento de la presente invención significa que no se requiere ninguna etapa de cultivo. La rápida naturaleza de la amplificación de ADN permite a los usuarios obtener un resultado antes de que el producto se lance al mercado, proporcionando una mayor garantía, en el momento de su lanzamiento, de que los productos lanzados cumplen los rigurosos requisitos de carga biológica de los organismos reguladores.
La utilización de amplificación de ADN también reduce en gran medida la subjetividad en la lectura de un resultado. La presencia o ausencia de ADN se puede detectar de diferentes maneras, muchas de las cuales requieren una mínima interpretación por parte del usuario. Por ejemplo, la utilización de qPCR para analizar la presencia de secuencias de ADN específicas proporciona una lectura de fluorescencia distinguible fácilmente y legible con una máquina en caso de que la secuencia esté presente. En particular, las técnicas de análisis de ADN dan el mismo tipo de lectura, independientemente de los microorganismos de origen. Por tanto, un usuario solo tiene que estar capacitado para un tipo de lectura. Esto es en contraposición con la utilización de caldos de crecimiento, en los que pueden crecer diferentes cultivos de microorganismos en diferentes grados y pueden tener aspectos muy diferentes. En algunos casos, puede ser muy difícil interpretar lo que está ocurriendo en el caldo.
La técnica de la presente invención no se limita a detectar únicamente los microorganismos que pueden crecer en cualquier caldo dado. La amplificación de ADN se puede llevar a cabo utilizando procedimientos robustos y reproducibles que funcionan en cualquier ADN o material genómico, independientemente del microorganismo del que proceda el ADN o material genómico. Esto resulta particularmente ventajoso para detectar microorganismos que se multiplican únicamente en condiciones muy específicas, por ejemplo, partículas de virus que requieren que esté presente una célula huésped adecuada para la replicación de las partículas.
Al hacer pasar muestras a través de un filtro, se atrapa cualquier microorganismo presente en la muestra sobre o en el filtro. Normalmente, se utilizan filtros adecuados para la esterilización de la muestra que pasa a través del filtro y, a continuación, normalmente, se desechan los filtros. En cambio, los inventores de la presente invención se han dado cuenta de que el filtro puede constituir una etapa clave en el procedimiento de detección de cualquier microorganismo en la muestra.
Los inventores de la presente invención se aprovechan en primer lugar del hecho de que se atrapa cualquier microorganismo por el volumen pequeño y fácil de manejar del filtro. Además, los inventores de la presente invención han determinado que es posible aplicar de manera reproducible las técnicas de biología molecular de liberación y amplificación de ADN o material genómico a cualquier microorganismo in situ, es decir, sobre o en el filtro. Esto evita la necesidad de cualquier etapa de resuspensión antes de la posterior manipulación de los microorganismos. Esto minimiza el número de etapas llevadas a cabo antes de amplificar el ADN o material genómico, minimizando el riesgo de perder el microorganismo, o perder el ADN o material genómico no amplificado, y generar un falso negativo. Esto es particularmente importante ya que la identificación exitosa debe ser posible con bajos números de microorganismos, e incluso con un único microorganismo.
Por tanto, el procedimiento de la presente invención puede permitir a un usuario capturar un único microorganismo a partir de una amplia gama de medios de muestra gaseosa o líquida, liberar y mantener el ADN o material genómico del microorganismo en o sobre el volumen fácilmente controlable y dimensionado de manera adecuada de un filtro y aprovechar ese control para someter el ADN o material genómico a condiciones de amplificación de una manera robusta y reproducible para proporcionar una señal detectable en un periodo de tiempo corto. Por tanto, el procedimiento puede detectar niveles de contaminación tan bajos como 1 unidad formadora de colonias
(UFC) por 100 ml de muestra. En otras palabras, el procedimiento puede detectar niveles de contaminación tan bajos como una célula viable en cualquier volumen de muestra.
Además, en caso de que haya más de un tipo de microorganismo, el ADN o material genómico de los diferentes microorganismos se debe amplificar a velocidades similares. Esto es en contraposición al procedimiento de la técnica anterior, en el que los microorganismos de replicación más rápida podrían dejar fuera de competición a los organismos de replicación más lenta. Por tanto, el procedimiento de la presente invención permite la detección rápida y precisa de múltiples contaminantes, es decir, indica la presencia de múltiples tipos de microorganismo. Esto supera una posible limitación del procedimiento basado en caldo de la técnica anterior, en el que un microorganismo de replicación rápida, pero más benigno, podría enmascarar posiblemente la presencia de un patógeno peligroso en una planta de producción.
El microorganismo para la detección puede ser uno o varios de una bacteria, un hongo, una arquea, un protozoo, una alga, un microanimal o un virus. En particular, el microorganismo se puede seleccionar entre uno o varios de bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, una levadura, un moho, una alga unicelular o diatomea o un virus de ADN o ARN. Dado que el procedimiento de la presente invención libera y amplifica material genómico y/o ADN, el procedimiento se puede aplicar con una capacidad similar en una amplia variedad de microorganismos. Esto supera una limitación significativa de la técnica anterior, en la que es poco probable que haya un único medio de crecimiento adecuado para todos los microorganismos que, idealmente, un usuario desearía someter a prueba.
El procedimiento se puede aplicar a una muestra gaseosa o líquida de, como mínimo, aproximadamente, 0,01 pl. Por ejemplo, una muestra líquida puede tener un volumen de, como mínimo, aproximadamente, 500 pl, o una muestra gaseosa puede tener un volumen de, como mínimo, aproximadamente, 0,5 l. Esto permite aplicar el procedimiento a una amplia gama de tipos de muestra, desde muestras pequeñas, tales como gotas de orina, hasta muestras grandes, tales como unos pocos litros de solución salina de una línea de producción de solución salina.
La muestra se puede filtrar a través de un filtro que tiene un tamaño de poro de, aproximadamente, 0,01 pm a, aproximadamente, 5 pm. Normalmente, el filtro puede tener un tamaño de poro de, aproximadamente, 0,2 pm. Tamaños de poro tales como estos deben atrapar todos los tipos de células procariotas y eucariotas, así como la mayoría de las partículas de virus.
El ADN o material genómico se puede liberar a partir de los microorganismos atrapados poniendo en contacto el filtro con energía sónica, energía física o lisis biológica/química, tal como una solución de enzimas y/o un tampón de lisis. De este modo, es posible liberar el ADN o material genómico a partir de una amplia variedad de microorganismos.
El procedimiento de liberación de ADN o material genómico puede emplear etapas secuenciales de descomponer las paredes celulares de los microorganismos y lisar los microorganismos para liberar su ADN o material genómico. Esto permite la liberación de ADN o material genómico a partir de microorganismos que tienen estructuras más complejas que encapsulan el ADN o material genómico. Esto incluye, por ejemplo, bacterias Gram-negativas con múltiples membranas celulares o eucariotas con membranas celulares y nucleares.
El ADN o material genómico descrito en el presente documento puede consistir en todo el material genético contenido en el microorganismo contaminante. Normalmente, el ADN o material genómico incluye ADN y/o ARN codificante y/o no codificante. En el caso de que el microorganismo contaminante sea un virus, el ADN o material genómico puede ser simplemente ARN.
La amplificación del ADN o material genómico se puede realizar utilizando un procedimiento de amplificación basado en reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como amplificación por desplazamiento múltiple (MDA, multiple displacement amplification). No es necesario que la amplificación produzca hebras de ADN genómico de longitud completa. Es suficiente que se produzcan hebras o fragmentos más cortos, siempre que la suma de esas hebras o esos fragmentos sea representativa del genoma completo. La MDA presenta beneficios, que incluyen una frecuencia de error más baja que la PCR convencional y se puede realizar en o sobre el filtro sin necesidad de ciclos de temperatura. Una ventaja adicional surge del hecho de que el ADN o material genómico está representado por un gran número de hebras o fragmentos cortos. Las hebras o los fragmentos cortos de ADN se pueden extraer o separar a partir del filtro de manera más fácil y fiable.
Después de la amplificación del ADN o material genómico, el ADN o material genómico amplificado se puede extraer o separar del filtro. Esto permite llevar a cabo la etapa de identificar regiones específicas del a Dn o material genómico en un entorno independiente del filtro, por ejemplo, en un dispositivo de pCr , tal como un dispositivo de qPCR. Después de la amplificación del ADN o material genómico, normalmente hay suficiente ADN o material genómico presente para que ya no sea necesario el control proporcionado por tener el ADN sobre el filtro.
Los procedimientos para extraer o separar ADN o material genómico amplificado del filtro incluyen utilizar fuerza positiva, negativa o centrífuga.
La identificación de regiones específicas del ADN o material genómico se puede realizar utilizando análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, se puede utilizar PCR cuantitativa (qPCR). El análisis mediante PCR es rápido y fiable. La identificación se puede llevar a cabo sobre el filtro o lejos del filtro después de extraer o separar el ADN o material genómico amplificado del filtro.
La muestra puede ser un purgado de conducto, una muestra de fluido corporal (tal como una muestra de sangre u orina), una muestra de frotis, una muestra de tos o aire, una sustancia alimenticia, una solución para nutrición parenteral, una bebida, una composición farmacéutica o agua.
Según un segundo aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o identificar un contaminante, comprendiendo el procedimiento someter a prueba una muestra obtenida de un paciente, animal o procedimiento de fabricación utilizando el procedimiento del primer aspecto de la presente invención.
Descripción breve de los dibujos
La figura 1 proporciona un diagrama de flujo esquemático que describe un procedimiento de la presente invención. En la etapa 1, se filtra una muestra para atrapar cualquier microorganismo potencialmente contaminante, tal como una bacteria o un hongo. En la etapa 2, las paredes celulares de los microorganismos atrapados se digieren con enzimas en tampón 1; a continuación, en la etapa 3, los microorganismos se lisan utilizando tampón 2 para liberar su ADN o material genómico. En la etapa 4, el ADN o material genómico se amplifica en secciones cortas de ADN utilizando tampón 3 y tampón 4. A continuación, estas secciones amplificadas se separan del filtro en la etapa 5. Finalmente, en la etapa 6, las regiones específicas de ADN se amplifican adicionalmente en tampón 5 mediante qPCR para identificar la presencia de microorganismos diana.
Descripción
El procedimiento de la presente invención da a conocer un procedimiento para detectar un microorganismo en una muestra, teniendo el procedimiento múltiples etapas.
En la etapa a), se filtra una muestra a través de un filtro para atrapar cualquier microorganismo presente en la muestra. Los filtros adecuados están disponibles fácilmente en el mercado. Por ejemplo, con frecuencia se utilizan “unidades de filtro estéril” para esterilizar líquidos y gases. Para esterilizar un fluido de este tipo, se hace pasar a través del filtro estéril a un recipiente estéril. El filtro estéril tiene un tamaño de poro que impide el paso de microorganismos, haciendo de ese modo que el fluido que pasa a su través sea estéril. A continuación, en general, se desechan los filtros estériles.
Los microorganismos quedan atrapados en el filtro. Mediante esto se pretende decir que, durante el flujo del fluido a través del filtro, los microorganismos quedan atrapados en el filtro de tal manera que los microorganismos no acaban en el filtrado. El mecanismo preciso mediante el cual los microorganismos quedan atrapados dependerá del tipo de filtro empleado. Una opción es que los microorganismos queden atrapados dentro de una matriz de material de filtro, por ejemplo, dentro de un poro. Otra opción es que los microorganismos se adhieran a la superficie del filtro o que, simplemente, queden retenidos físicamente sobre la superficie del filtro por el flujo de fluido. Normalmente, el filtro solo capturará a los microorganismos en forma de células completas. Cualquier ADN de flotación libre que pueda estar presente en la muestra pasará a través del filtro, es decir, no quedará atrapado. Esto reduce el riesgo de falsos positivos que pueden ser el resultado de ADN preexistente que aún no se ha degradado dentro de la muestra inicial.
La etapa de filtración permite el atrapamiento de uno o varios microorganismos a partir de una amplia gama de volúmenes de fluido. Los volúmenes adecuados para muestras líquidas incluyen, como mínimo, aproximadamente, 0,01 pl, o, como mínimo, aproximadamente, 500 pl. Incluso cuando está presente un único microorganismo en un volumen muy grande de fluido, al hacer pasar todo el volumen a través del filtro, el único microorganismo queda atrapado en el filtro. De este modo, el procedimiento de la presente invención se puede aplicar a cualquier volumen grande, tal como, como mínimo, aproximadamente, 10 ml, preferentemente, como mínimo, aproximadamente, 25 ml, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente, 50 ml. En realizaciones de la presente invención, una muestra líquida puede tener un volumen de, como mínimo, aproximadamente, 100 ml.
Los volúmenes adecuados para muestras gaseosas incluyen, como mínimo, aproximadamente, 0,01 pl o, como mínimo, aproximadamente, 0,5 l. De nuevo, el procedimiento es particularmente útil para identificar microorganismos en cualquier volumen grande de gas, tal como, como mínimo, aproximadamente, 10 l, preferentemente, como mínimo, aproximadamente, 50 l, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente, 100 l.
La etapa de filtración permite el atrapamiento de microorganismos a partir de una gama amplia de fluidos. Las muestras para la filtración pueden ser líquidos o gases. Algunos fluidos adecuados incluyen: fluidos corporales, tales como orina, saliva, sangre, esputo o gases de exhalación de los pulmones; muestras de productos fluidos tomadas de procedimientos de fabricación; purgados de conducto; corrientes de desecho; o lavados líquidos de productos para su distribución.
En realizaciones de la presente invención, en las que la muestra es un gas de exhalación, el volumen de la muestra puede ser de, como mínimo, aproximadamente, 0,5 l o estar en el intervalo de, aproximadamente, 0,5 l a, aproximadamente, 10 l.
Los tamaños de poro de filtro típicos para atrapar microorganismos oscilan entre, aproximadamente, 0,01 pm y, aproximadamente, 5 pm. Preferentemente, el filtro tiene un tamaño de poro de, aproximadamente, 0,2 pm. Los filtros con tales tamaños de poro están disponibles fácilmente en el mercado, en particular, con tamaños de poro de 0,2 pm y 0,45 pm.
En la etapa b), se trata el filtro para liberar ADN o material genómico a partir de los microorganismos atrapados. El procedimiento de tratamiento no está limitado particularmente, salvo por el hecho de que el ADN o material genómico se debe liberar de tal manera que se pueda someter posteriormente a amplificación. En la técnica se conocen bien procedimientos para liberar ADN genómico a partir de diversos tipos de organismos.
Los procedimientos adecuados para liberar ADN o material genómico a partir de los microorganismos incluyen poner en contacto el filtro con energía sónica, energía física o lisis biológica/química, tal como una solución de enzimas y/o un tampón de lisis. Un ejemplo de energía sónica implica someter los microorganismos a ultrasonicación. Esta es una técnica de alteración celular utilizada habitualmente que libera el contenido de una célula. Las técnicas de energía física para alterar microorganismos se conocen bien, e incluyen agitación con perlas o criopulverización, lo que puede ser particularmente aplicable a células sobre la superficie de un filtro. Las técnicas de energía física que son particularmente compatibles con microorganismos atrapados dentro de un poro del filtro incluyen ciclos de presión o descompresión de nitrógeno. Los enfoques de lisis biológica/química para liberar ADN o material genómico a partir de un microorganismo, tales como soluciones de enzima y tampones de lisis adecuados, se conocen bien y están disponibles en el mercado. Por ejemplo, enzimas, tales como la lisozima, son particularmente eficaces para degradar las paredes celulares de los microorganismos. Los tampones de lisis que comprenden determinados detergentes (tales como dodecilsulfato de sodio) pueden ser particularmente eficaces para disolver las paredes celulares de los microorganismos.
El procedimiento para liberar ADN o material genómico puede comprender etapas secuenciales de descomponer las paredes celulares de los microorganismos y lisar los microorganismos para liberar su ADN o material genómico. Determinados microorganismos tienen múltiples capas protectoras alrededor de su ADN o material genómico. Por ejemplo, las bacterias Gram-negativas tienen múltiples capas de pared celular, y las células eucariotas protegen adicionalmente su ADN genómico dentro del núcleo de una célula. Las etapas secuenciales de descomponer las paredes celulares y membranas adicionales se pueden emplear para garantizar que se libera el ADN o material genómico.
En la etapa c), se amplifica el ADN o material genómico. Mediante esto se pretende decir que se puede amplificar el genoma completo, o que se pueden amplificar regiones específicas de interés del a Dn o material genómico. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han descubierto que esta etapa de amplificación se puede llevar a cabo sobre el filtro. En consecuencia, el ADN o material genómico liberado no se tiene que separar del filtro antes de amplificarse, evitando de ese modo el riesgo de perder el ADN durante el procedimiento de separación y mejorando tanto la precisión como la sensibilidad del procedimiento de la presente invención.
La amplificación del ADN o material genómico se puede realizar mediante amplificación por desplazamiento múltiple (MDA). La MDA es particularmente adecuada, ya que es menos propensa a error, tiene un sesgo de amplificación reducido y, normalmente, proporciona una cobertura completa del genoma.
Las enzimas de amplificación se pueden desnaturalizar después de haberse logrado una amplificación suficiente. En la etapa d), se identifican las regiones específicas del ADN o material genómico con el fin de determinar la presencia, identificar la especie o cuantificar el número aproximado de microorganismos presentes en la muestra. Se conocen procedimientos para identificar secuencias específicas de ADN. Por ejemplo, se pueden utilizar secuenciación génica o procedimientos basados en PCR, tales como qPCR.
Esencialmente, la etapa de identificación simplemente tiene que confirmar la presencia o ausencia de ADN o material genómico. Si hay presente ADN o material genómico, ha habido contaminación.
Por tanto, por “regiones específicas” se pretende decir cualquier región específica que se puede utilizar para identificar genéricamente la presencia de ADN o material genómico. En la identificación de la presencia de a Dn o material genómico, se pueden elegir regiones específicas que son comunes entre microorganismos. Por ejemplo, hay regiones ribosómicas 16S y 18S adecuadas que se conservan a través de células bacterianas y fúngicas. Además, se pueden elegir regiones específicas que son específicas para determinados microorganismos. Esto permite la capacidad adicional para identificar específicamente determinados microorganismos. Una ventaja es que, junto con la detección genérica de la presencia de microorganismos, se puede examinar una lista de microorganismos de especial preocupación con la misma rapidez. Por ejemplo, la identificación de determinadas bacterias resistentes a múltiples fármacos, tales como SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina), puede indicar una necesidad urgente de ir más allá de simplemente retener la liberación de lotes e iniciar una descontaminación más amplia de la planta de producción.
Si se requiere, se pueden amplificar adicionalmente regiones específicas del ADN o material genómico. Esto se puede realizar, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores dirigidos únicamente a esas regiones específicas de ADN o material genómico. Cuando se utilizan etapas de amplificación adicionales, puede ser beneficioso desnaturalizar cualquier enzima de la primera etapa de amplificación antes de la etapa de amplificación adicional. Esto garantiza que las enzimas de la primera etapa de amplificación no interfieran con la etapa de amplificación adicional.
Con determinadas técnicas, sería posible identificar las regiones específicas de ADN o material genómico mientras aún se encuentren sobre el filtro. Por ejemplo, se podrían aplicar al filtro colorantes indicadores de ADN, tales como colorantes intercaladores. Si hay presente ADN, el colorante se intercala y se activa, confirmando la presencia de ADN.
En realizaciones de la presente invención, puede haber una etapa ci) adicional entre la etapa c) (amplificación) y la etapa d) (identificación), en la que la etapa ci) comprende extraer o separar el ADN o material genómico amplificado del filtro. Esto permite detectar las regiones específicas de ADN o material genómico en un entorno lejano del filtro. Debido al hecho de que el ADN o material genómico ya se ha amplificado en la etapa c), podría haber suficiente ADN o material genómico presente para que la pérdida de cierto ADN o material genómico en la transferencia ya no represente un riesgo significativo de un falso negativo.
El ADN o material genómico amplificado se puede extraer o separar del filtro utilizando fuerza positiva, negativa o centrífuga. Mediante lo anterior se pretende decir que el ADN o material genómico amplificado se puede extraer o separar del filtro en la misma dirección que la filtración original o en la dirección inversa a la filtración original. Esto se puede realizar impulsando el ADN amplificado a través del filtro (fuerza positiva) o retirando el ADN amplificado a través del filtro (fuerza negativa), o utilizando centrifugación para forzar al ADN amplificado a través del filtro.
Si el ADN o material genómico amplificado se extrae o separa del filtro antes de la identificación, se pueden utilizar técnicas basadas en PCR, tales como qPCR, para la identificación de regiones específicas del ADN o material genómico. Por ejemplo, se puede utilizar qPCR para proporcionar información más específica que simplemente la presencia o ausencia de ADN. Por ejemplo, se puede utilizar qPCR para calcular cuánto contaminante había presente originalmente. Además, con la utilización de diferentes colorantes indicadores, la qPCR se podría configurar para identificar diferentes tipos o especies de microorganismo.
El procedimiento de la presente invención se desarrolló inicialmente para sustituir a la simulación de caldo y la prueba de esterilidad dentro del sector farmacéutico. Sin embargo, también tiene utilidad en las industrias de alimentos y agua, así como en entornos de diagnóstico de enfermedades infecciosas clínicas y veterinarias.
El procedimiento de la presente invención se puede utilizar para someter a prueba cualquier microorganismo que pueda haber liberado ADN o material genómico en o sobre el filtro. Tal como se mencionó, están disponibles una amplia variedad de técnicas para liberar ADN o material genómico a partir de prácticamente todos los microorganismos. En teoría, por tanto, el procedimiento de la presente invención es compatible con prácticamente todos los microorganismos. Tales microorganismos incluyen una bacteria, un hongo, una arquea, un protozoo, una alga o un microanimal. También se pretende que el término “microorganismo” cubra partículas de virus. De este modo, el procedimiento de la presente invención también se puede utilizar para someter a prueba una partícula de virus. El procedimiento de la presente invención también se podría utilizar para someter a prueba células vegetales. Más específicamente, el procedimiento de la presente invención se puede utilizar para someter a prueba bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, una levadura, un moho, una alga unicelular o diatomea.
El procedimiento de la presente invención se puede aplicar a muestras de una amplia variedad de fuentes. La muestra puede ser un purgado de conducto. Mediante esto se quiere hacer referencia a una planta de fabricación que transfiere productos fluidos a lo largo de conductos. Después de que se haya transferido el producto, se purgan los conductos. El fluido de purgado se puede utilizar para determinar si un fluido contaminado había dejado cualquier microorganismo en los conductos. Por ejemplo, en un entorno farmacéutico, el procedimiento de la técnica anterior consiste en hacer pasar 100 ml de caldo a través de las tuberías y a lo largo del aparato utilizado para preparar el producto farmacéutico. En el procedimiento de la presente invención, se pueden hacer pasar, en su lugar, 100 ml de una solución de lavado a través de las tuberías y a lo largo del aparato y, a continuación, utilizarse como la muestra de la presente invención.
La muestra puede ser un fluido corporal, tal como una muestra de sangre u orina. La orina sana no contiene células que contienen ADN y se puede analizar fácilmente mediante el procedimiento de la presente invención. La sangre sana tiene células que contienen ADN y sería necesario someterla a una versión modificada del procedimiento de la presente invención para lisar las células sanguíneas antes de la filtración.
La muestra puede ser una muestra de frotis. Mediante esto se pretende decir que el frotis se lava utilizando un fluido vehículo, y el fluido vehículo es la muestra que se hace pasar a través del filtro. El frotis se puede recoger a partir de cualquiera de una variedad de fuentes, tales como la superficie de un producto para su liberación, a partir de los equipos de fabricación o incluso a partir de un cuerpo humano o animal.
La muestra puede ser una muestra de aire. Esta puede ser el aire dentro de una planta controlada, tal como una planta para la producción y expansión de productos biofarmacéuticos. Se puede hacer pasar el aire, y otros gases, directamente a través del filtro sin la necesidad de un líquido para capturar cualquier microorganismo del gas. Esta minimización del número de etapas requeridas antes de que el ADN amplificado esté presente de nuevo minimiza la posibilidad de un falso negativo.
El procedimiento de la presente invención se puede aplicar a la monitorización ambiental, tal como en el entorno microbiológico o farmacéutico. De manera convencional, la monitorización ambiental se lleva a cabo exponiendo placas de agar al entorno, dejando la placa de agar abierta al entorno durante un periodo de cuatro horas (muestreo pasivo de aire) o extrayendo aire a través de la superficie de la placa (muestreo activo de aire), o simplemente poniendo en contacto la placa de agar con la superficie que se va a investigar (una placa de contacto). Una vez que se han expuesto las placas de agar al entorno, requieren incubación durante, como mínimo, tres días. Sin embargo, pueden ser necesarios periodos de incubación de hasta siete días. El procedimiento de presente invención se podría utilizar para sustituir estos medios tradicionales de monitorización ambiental. En este contexto, el procedimiento de la presente invención se puede utilizar con muestreo activo de aire para impulsar aire a través de un filtro, después de lo cual se pueden llevar a cabo las etapas de tratamiento, amplificación e identificación. Alternativamente, se puede utilizar un frotis para monitorizar una superficie de interés, transfiriéndose el frotis resultante a una solución que, a continuación, se puede hacer pasar a través de un filtro, después de lo cual se pueden llevar a cabo las etapas de tratamiento, amplificación e identificación. Esta aplicación del procedimiento de la presente invención permitiría que los resultados de monitorización ambiental estén disponibles antes de que los lotes de un producto abandonen una planta, proporcionando de ese modo una mayor garantía de calidad al procedimiento de fabricación.
La muestra puede ser una sustancia alimenticia, una bebida o una composición farmacéutica. Estas sustancias se pueden almacenar durante periodos de tiempo prolongados y pueden contener nutrientes adecuados para el crecimiento de microorganismos. Dado que las sustancias están destinadas para el consumo humano o animal, es particularmente importante garantizar la esterilidad de las sustancias que abandonan la planta de producción. Esto es particularmente importante para sustancias que se administran por vía intravenosa, tales como determinadas composiciones farmacéuticas y con la nutrición parenteral, ya que estas evitan muchos de los mecanismos de defensa del cuerpo humano o animal para los microorganismos invasores.
La muestra puede ser agua. Esta puede ser agua potable, agua destinada a la formulación de diversos alimentos, bebidas o composiciones farmacéuticas para su consumo, agua destinada a cualquier composición para su almacenamiento a largo plazo o agua industrial. Esta también puede ser agua utilizada para lavar conductos, otros equipos de fabricación o productos para su liberación.
Tal como se mencionó anteriormente, el procedimiento de la presente invención se puede utilizar en muestras del cuerpo humano o animal. En particular, la utilización de cebadores específicos para diferentes tipos de microorganismos invasores permite el diagnóstico rápido del microorganismo invasor.
Por ejemplo, el procedimiento se puede utilizar para detectar rápidamente la presencia de microorganismos invasores en sangre y, por tanto, proporciona una alerta temprana de septicemia. Esto sería particularmente útil para pacientes inmunodeprimidos en los que la medicación rápida es crítica. El procedimiento de la presente invención puede proporcionar una identificación rápida del microorganismo específico, lo que permite la administración de un tratamiento antimicrobiano eficaz en lugar de simplemente administrar antibióticos de amplio espectro. Además, la utilización de cebadores específicos de Mycobacterium tuberculosis podría proporcionar una prueba conveniente rápida para detectar tuberculosis (TB) en humanos y ganado bovino. En la actualidad, las pruebas para detectar TB requieren grandes piezas de equipos que requieren camiones para su transporte a las granjas. El procedimiento de la presente invención requiere equipos mínimos y es compatible con un dispositivo de mano que puede funcionar con una batería. Esto permite dispositivos de prueba para detectar TB de bajo coste y convenientes.
Ejemplos
Materiales y procedimiento
Lo siguiente se describe con referencia a la figura 1. Para someter a prueba la presencia de microorganismos contaminantes en un volumen de líquido de, aproximadamente, 100 ml, en primer lugar, se hace pasar a través de un filtro de 0,2 pm que, mediante exclusión molecular, atrapa físicamente cualquier célula bacteriana o fúngica (etapa 1). Las paredes celulares de cualquier microorganismo se digieren mediante la adición de 1 pl de tampón 1 (una solución de enzimas que consiste en lisostafina 1 mg/ml, lisozima 5 mg/ml y glucanasa 2,5 mg/ml) a la superficie del filtro e incubación del filtro a 37 °C durante 30 minutos (etapa 2). El genoma de los microorganismos se libera lisando su membrana celular, lo cual se logra mediante la adición de 1 pl de tampón 2 (KOH 200 mM, DTT 50 mM) a la superficie del filtro e incubación a 65 °C durante 10 minutos (etapa 3), seguido por la adición de 1 pl de tampón 3 (Tris HCl 900 mM, KCI 300 mM, HCl 200 mM) a la superficie del filtro. El genoma liberado se amplifica (replica/copia) en secciones al azar utilizando un procedimiento de amplificación por desplazamiento múltiple (MdA), tal como el descrito a continuación: añadir 9 pl de tampón 4 (0,45 pl de enzima Phi29, 0,09 pl de BSA, 0,9 pl de tampón Phi29, 0,45 pl de hexámeros al azar (20 pM), 0,45 pl de dNTP (40 pM), 6,5 ul de agua) a la superficie del filtro e incubar el filtro a 30 °C durante 3 horas. Las enzimas se desnaturalizan para evitar que interfieran con la siguiente etapa de amplificación mediante incubación a 65 °C durante 10 minutos (etapa 4). Las secciones de ADN amplificadas se extraen a través del filtro (mediante fuerza positiva, negativa o centrífuga) (etapa 5). Se añaden alícuotas de 2 pl del ADN amplificado al tampón 5 (10 pl de sonda Taqman, 4 pl de cebadores mixtos (10 uM), 0,05 pl de sonda FAM TAMRA) que contiene cebadores y sondas fluorescentes específicos de la región conservada en el regiones ribosómicas 16S y 18S presentes en las células bacterianas y fúngicas enumeradas en la tabla 1 (etapa 6). La reacción tiene lugar en una máquina para qPCR StepOne Plus, con el siguiente programa:
95 °C, 10 min
95 °C, 15 s 40 ciclos
60 °C, 1 min
Figure imgf000008_0001
Control positivo. Para garantizar que la sección de qPCR de la prueba es funcional y no produce resultados falsos negativos, se ha desarrollado un control positivo para la prueba. Se incorpora una hebra de 100 pb de ADN sintetizado, cuya secuencia se generó al azar y se sometió a prueba mediante una búsqueda en BLAST del NCBI para garantizar que no se encuentra en ninguna especie bacteriana ni fúngica. Los cebadores se diseñaron para esta secuencia y se utilizó una sonda con la etiqueta fluorescente JOE para distinguir de la sonda fluorescente FAM para las cepas bacterianas y fúngicas (tabla 1).
Secuencia de ADN del control positivo:
GATCGCTCAGTCGCTTTTCGTACTGCGCGAAAGTTCGCACCGCTCATACACTTGGTTCCG
AAGCCT GT CCT GAT ATAT GAAT CCAAACT AG AGCGGGGCT
Control negativo. Se utiliza agua estéril ultrapura para representar un “no molde” o control negativo para todos los experimentos. El valor de CT (cycle threshold, umbral de ciclo) que proporciona esto en la reacción de qPCR también se utiliza como referencia para determinar una reacción positiva en las muestras, es decir, para que una muestra se considere positiva, necesita tener un valor de CT inferior a los valores de CT para este control en, como mínimo, una unidad.
Tabla 1
Figure imgf000009_0001
Resultados
Para garantizar que la prueba funcione para todos los microorganismos de la farmacopea, incluyendo Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Microccocus luteus, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis, se añadieron soluciones de prueba de agua con entre 1 y 100 unidades formadoras de colonias (UFC) de cada organismo. Se hizo crecer cada uno en caldo de soja y triptona (TSB) durante la noche (a 37 °C para S. aureus, B. subtilis y P. aeruginosa y a 30 °C para M. luteus, A. brasiliensis y C. albicans). Al día siguiente los cultivos se diluyeron hasta un volumen apropiado y se sembró en placa una alícuota para determinar con precisión la densidad celular o se sometió a la prueba. Los resultados de la tabla 2 muestran que la prueba fue eficaz para detectar estos organismos.
Tabla 2
Figure imgf000009_0002
Tras el desarrollo de la prueba en los seis microorganismos de la farmacopea, se realizó en cuatro especies bacterianas adicionales para determinar su amplia aplicabilidad. Se añadió agua con de 1 a 100 unidades formadoras de colonias de Staphylococcus epidermidis, Salmonella dublin, Escherichia coli o Lactobacillus lactis y se realizó la prueba tal como se describió anteriormente. Los resultados de la tabla 3 muestran que la prueba es eficaz para detectar estas especies.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para detectar un microorganismo en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a) filtrar una muestra a través de un filtro para atrapar cualquier microorganismo presente en la muestra; b) tratar el filtro para liberar ADN o material genómico a partir de los microorganismos atrapados;
c) amplificar el ADN o material genómico liberado a partir de los microorganismos atrapados; y
d) identificar regiones específicas del ADN o material genómico para determinar la presencia, identificar la especie o cuantificar el número aproximado de cualquier microorganismo atrapado,
en el que la etapa c) comprende amplificación por desplazamiento múltiple sobre el filtro.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es una bacteria, un hongo, una arquea, un protozoo, una alga, un microanimal o un virus.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el microorganismo se selecciona entre uno o varios de bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, una levadura, un moho, una alga unicelular o diatomea o un virus de ADN o a Rn .
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa a) comprende filtrar la muestra a través de un filtro que tiene un tamaño de poro de, aproximadamente, 0,01 pm a, aproximadamente, 5 pm.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que el filtro tiene un tamaño de poro de, aproximadamente, 0,2 pm.
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa b) comprende poner en contacto el filtro con energía sónica, energía física o lisis química, tal como una solución de enzimas y/o un tampón de lisis.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa b) comprende etapas secuenciales de descomponer las paredes celulares del uno o varios microorganismos y lisar los microorganismos atrapados para liberar su ADN o material genómico sobre o en el filtro.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende, además, la etapa ci) entre la etapa c) y la etapa d), comprendiendo la etapa ci) extraer ADN o material genómico del filtro.
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que la etapa ci) comprende extraer ADN o material genómico del filtro utilizando fuerza positiva, negativa o centrífuga.
10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa d) comprende identificar regiones específicas del ADN o material genómico utilizando reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
11. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que la etapa d) comprende reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).
12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la muestra es un purgado de conducto, una muestra de fluido corporal (tal como una muestra de sangre u orina), una muestra de frotis, una muestra de tos o aire, una sustancia alimenticia, una solución para nutrición parenteral, una bebida, una composición farmacéutica o agua.
13. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad o identificar un contaminante, comprendiendo el procedimiento someter a prueba una muestra obtenida de un paciente, animal o procedimiento de fabricación, según el procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
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