JP6075519B1 - 抽出方法、分析方法、抽出装置および分析装置 - Google Patents

抽出方法、分析方法、抽出装置および分析装置 Download PDF

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Abstract

本発明は、流体中に存在する核酸と前記核酸を包含する被覆構造体とを含む生物学的試料を金属メッシュにより捕集する第１工程と、前記生物学的試料が捕集された前記金属メッシュを核酸抽出液に浸漬する第２工程と、前記核酸抽出液を回収する第３工程と、をこの順で備え、前記核酸抽出液は、前記核酸を溶解可能であり、前記被覆構造体を溶解しない、前記核酸の抽出方法である。

Description

本発明は、抽出方法、分析方法、抽出装置および分析装置に関する。より詳しくは、気体や液体中物質から核酸を抽出するための抽出方法、それを用いた分析方法、抽出装置、および、それを用いた分析装置に関する。
近年、環境改善等の目的で、環境中に存在する微生物等に由来するＤＮＡを直接解析する手法が注目されている。特に、土壌に含まれる微生物由来のＤＮＡを解析する手法について種々の研究が進められている（例えば、星野ら，「土壌からのＤＮＡ抽出方法」，環境バイオテクノロジー学会誌，2005年，Vol.5，No.1，p.43-53（非特許文献１）参照）。
しかし、このような土壌に含まれる微生物からＤＮＡを抽出するためには、遠心分離等の煩雑な操作が必要である。
一方、院内感染予防、パンデミック対策、途上国における衛生環境改善等を目的として、空気中や液体中の細菌、ウィルス等の核酸を含有する生物学的試料を捕集し、捕集された生物学的試料中の核酸を遺伝子解析等の生物学的手法で分析する（核酸の同定、定量などを行う）ことにより、細菌、ウィルス等の存在を確認する方法が検討されている。ただし、大気中の核酸を含有する生物学的試料を捕集し、核酸を分析するための具体的な方法は、現状では確立されていない。
星野ら，「土壌からのＤＮＡ抽出方法」，環境バイオテクノロジー学会誌，2005年，Vol.5，No.1，p.43-53
特に大気中の微量な生物学的試料は、土壌中のそれとは異なり、遠心分離等によって十分な量を回収することが困難である。したがって、フィルタを用いてある程度多量の大気を濾過し、捕集された生物学的試料がフィルタ上で濃縮されるようにする必要があると考えられる。
しかしながら、フィルタとして、例えば従来から一般的に用いられているメンブレンフィルタやゼラチンフィルタを用いた場合、以下のような問題がある。メンブレンフィルタを用いた場合は、メンブレンフィルタの複雑な細孔の内部に入り込んだ生物学的試料は回収が難しいという問題があった。
また、ゼラチンフィルタを用いた場合は、ゼラチンが大気中の水分と接触することにより変質してしまうという問題があった。
また、液体中の極微量な生物学的試料を回収する際も、遠心分離などの煩雑な作業が必要であるという問題があった。
本発明は上記の事情に鑑み、気体中や液体中の生物学的試料を濾過により捕集し、捕集された生物学的試料から核酸のみを効率的に抽出することのできる抽出方法および抽出装置を提供することを目的とする。
本発明は、流体中に存在する核酸と核酸を包含する被覆構造体とを含む生物学的試料を金属メッシュにより捕集する第１工程と、
生物学的試料が捕集された金属メッシュを核酸抽出液に浸漬する第２工程と、
核酸抽出液を回収する第３工程と、をこの順で備え、
核酸抽出液は、核酸を溶解可能であり、被覆構造体を溶解しない、核酸の抽出方法である。
金属メッシュの孔径は、生物学的試料より小さく、核酸より大きいことが好ましい。また、金属メッシュは核酸抽出液によって溶解されないことが好ましい。
核酸抽出液はフェノールを含有することが好ましい。
第１工程において、金属メッシュに生物学的試料を捕集する前に、流体中に含まれる生物学的試料以外の夾雑物をプレフィルタにより除去することが好ましい。
流体は、異なる粒径を有する複数種の生物学的試料を含有し、
第１工程において、複数種の生物学的試料の各々を孔径の異なる複数の金属メッシュの各々で捕集し、
第２工程において、複数種の生物学的試料の各々が捕集された複数の金属メッシュの各々を複数の核酸抽出液の各々に浸漬することが好ましい。
また、本発明は、上記の抽出方法によって抽出された核酸を分析する第４工程を備える、生物学的試料の分析方法にも関する。
また、本発明は、流体を流すための流路を有する捕集部材と、
捕集部材の流路内に設けられた、流体中に存在する核酸と核酸を包含する被覆構造体とを含む生物学的試料を捕集するための金属メッシュと、
生物学的試料が捕集された金属メッシュを浸漬するための核酸抽出液を収容する容器と、を備え、
核酸抽出液は、核酸を溶解可能であり、被覆構造体を溶解しない、核酸の抽出装置にも関する。
金属メッシュの孔径は、生物学的試料より小さく、核酸より大きいことが好ましい。また、金属メッシュは核酸抽出液によって溶解されないことが好ましい。
核酸抽出液はフェノールを含有することが好ましい。
捕集部材の流路内の金属メッシュより上流側に設けられた、流体中に含まれる生物学的試料以外の夾雑物を除去するためのプレフィルタをさらに備えることが好ましい。
流体は、異なる粒径を有する複数種の生物学的試料を含有し、
捕集部材の流路内に設けられた、複数種の生物学的試料の各々を捕集するための孔径の異なる複数の金属メッシュと、
複数種の生物学的試料の各々が捕集された複数の金属メッシュの各々を浸漬するための複数の核酸抽出液の各々を収容する複数の容器と、を備えることが好ましい。
あるいは、本発明は上記生物学的試料が非生物学的物質に付着した形態であることを特徴とする場合にも関する。
捕集部材はシリンジバレルであり、
シリンジバレル内で液密状態で摺動可能なガスケットと、ガスケットに装着されたプランジャーと、をさらに備えることが好ましい。
また、本発明は、上記の抽出装置を備え、
抽出装置によって抽出された核酸を分析するための分析機器をさらに備える、生物学的試料の分析装置にも関する。
本発明によれば、流体中の生物学的試料を濾過により捕集し、捕集された生物学的試料から核酸のみを効率的に抽出することのできる抽出方法および抽出装置を提供することができる。
実施形態１の抽出方法および抽出装置を説明するための断面模式図である。 実施形態１の抽出方法および抽出装置を説明するための別の断面模式図である。 実施形態１の変形例を示す断面模式図である。 本発明の実施形態に用いられる金属メッシュの一例の構成を説明するための概略図である。（ａ）は斜視図であり、（ｂ）は平面図である。 実施例１で用いた抽出装置の構成を示す図である。（ａ）は斜視図、（ｂ）は分解斜視図、（ｃ）は断面模式図、（ｄ）は（ｃ）の部分拡大図である。 実施例１におけるアガロースゲル電気泳動の分析結果を示す電気泳動写真である。 実施例２におけるアガロースゲル電気泳動の分析結果を示す電気泳動写真である。 実施例３における同定細菌の属分布を示すグラフである。
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、図面において、同一の参照符号は、同一部分または相当部分を表す。なお、各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもない。
［実施形態１］
（第１工程）
本工程では、流体中に存在する「生物学的試料」（例えば、気体、液体などの流体中に分散粒子として含まれる生物学的試料）を金属メッシュにより捕集する。
生物学的試料は、核酸を包含する被覆構造体」とを含んでいる。生物学的試料としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を含有するものであれば特に限定されないが、微生物、核酸を含有する構造体、細胞などが挙げられる。微生物としては、細菌、菌類（真菌）などが挙げられる。核酸を含有する構造体としては、ウィルスなどが挙げられる。なお、生物学的試料が微生物または細胞である場合、「核酸を包含する被覆構造体」には、細胞膜、核膜などが含まれる。また、生物学的試料がウィルスである場合、「核酸を包含する被覆構造体」には、カプシド、エンベロープなどが含まれる。
また、生物学的試料は、上記の微生物、核酸を含有する構造体、細胞などと他の無機物、有機物等との複合物であってもよい。このような複合物としては、例えば、呼気中水蒸気を含む水蒸気や無機物からなる粉塵に付着したウィルスが挙げられる。粉塵としては、例えば、大気中のＰＭ２．５、ＳＰＭ、ＰＭ１０、砂粒、石、などが挙げられる。このように、本発明は、生物学的試料が非生物学的物質に付着した形態である場合にも適用可能である。
図１を参照して、本実施形態で用いられる抽出装置は、気体（大気、エアロゾル等）を流すための流路を有するシリンジバレル（捕集部材）１２と、シリンジバレル１２の流路内に設けられた、大気中の生物学的試料３１を捕集するための金属メッシュ１０とを備えている。吸引装置（図示せず）などにより、大気をシリンジバレル１２の流路内に図中の矢印の方向に流すことで、金属メッシュ１０で大気中の生物学的試料３１を捕集することができる。
金属メッシュ１０の孔径は、生物学的試料より小さいことが好ましい。この場合、金属メッシュ１０によって、より確実に生物学的試料を捕集することができる。また、金属メッシュ１０の孔径は、核酸より大きいことが好ましい。この場合、金属メッシュ１０に捕集された生物学的試料から核酸を抽出する際に、核酸が金属メッシュにトラップされてしまうことを防止できる。
また、金属メッシュは核酸抽出液によって溶解されないことが好ましい。この場合、核酸抽出液が汚染されて、後段の分析時に分析精度が低下することを防止できる。なお、金属メッシュ１０の構成の詳細については、後述する。
また、本実施形態においては、シリンジバレル（捕集部材）１２の流路内の金属メッシュ１０より上流側であるシリンジバレル１２の流入口に、プレフィルタ２０が固定部材２１によって固定されている。これにより、生物学的試料３１以外の（生物学的試料より粒径が大きい）夾雑物３２を除去することができる。プレフィルタ２０の孔径は、夾雑物３２が通過できない大きさであり、生物学的試料３１が通過できる大きさである。
このように、第１工程においては、金属メッシュに、上述の複合物を含む生物学的試料を捕集する前に、気体（エアロゾル）中に含まれる生物学的試料以外の夾雑物をプレフィルタにより除去することが好ましい。この場合、金属メッシュに生物学的試料以外の夾雑物が捕集されることを抑制でき、生物学的試料の分析精度を向上させることができる。
例えば、細菌のサイズは１μｍ程度、ウィルスのサイズは０．１μｍ程度であるが、大気中では、それらが単独で存在するよりも気体中の他の分散粒子（粒径０．１μｍ以上１００μｍ以下程度）に付着している場合が多いと言われている。これらを考慮すると、プレフィルタ２０の孔径をＤ１とし、金属メッシュ１０の孔径をＤ２とすると、例えば、Ｄ１およびＤ２は、共に５０ｎｍ以上５００μｍ以下であり、Ｄ１＞Ｄ２の関係となっている。例えば、形状が概球形であり、大きさが約１００ｎｍのロタウィルスが付着した大きさ約５０μｍの砂粒を捕集する場合、該砂粒を捕集するために、該砂粒よりも大きな粒子を排除する目的で、Ｄ１を５００μｍとし、Ｄ２を４０μｍとする。Ｄ２を４０μｍとすることで、該砂粒よりも小さな異物が金属メッシュ１０に捕集されないようにすることができる。
（第２工程）
本工程では、生物学的試料３１が捕集された金属メッシュ１０を核酸抽出液に浸漬する。
具体的には、図２を参照して、（ａ）に示すように、ガスケット４１に装着されたプランジャー４２を押し込むことで、ガスケット４１をシリンジバレル１２内に挿入する。
次に、図２の（ｂ）に示されるように、容器５に収容されたＤＮＡ抽出液（核酸抽出液）６にシリンジバレル１２の先端部を浸け、プランジャー４２を引き上げることで、ガスケット４１をシリンジバレル１２内で液密状態で摺動させ、ＤＮＡ抽出液６をシリンジバレル１２内に吸引する。これにより、生物学的試料３１が捕集された金属メッシュ１０をＤＮＡ抽出液６に浸漬することができる。必要に応じて、そのままの状態で加熱等のＤＮＡ抽出作業を行う。これにより、ＤＮＡ（核酸）が生物学的試料３１からＤＮＡ抽出液６へ抽出される。なお、具体的な抽出方法としては、種々公知の手法を適用可能である。また、核酸抽出液としては、核酸の種類に応じて種々の抽出液が知られており、市販のキット等として入手することが可能である。
核酸抽出液は、生物学的試料中の核酸を溶解可能であり、被覆構造体を溶解しない。これにより、核酸抽出液を用いて、生物学的試料中から核酸を選択的に抽出することができる。
核酸抽出液は、有機溶媒（フェノール、クロロホルムなど）を含有することが好ましい。この場合、従来のメンブレンフィルタ、ゼラチンフィルタ等は、核酸抽出液の成分である有機溶媒によって溶解されてしまうが、本実施形態の金属メッシュは、有機溶媒によって溶解されないという利点を有している。
核酸抽出液は、ＤＮＡを効率的に抽出できる点で、フェノールを含有することが特に好ましい。なお、ＲＮＡを抽出する際にもフェノールによって共存するＤＮＡを除去できるため、ＲＮＡ抽出液もフェノールを含有することが好ましい。なお、「核酸抽出液がフェノールを含有する」とは、生物学的試料が捕集された金属メッシュが浸漬される液中にフェノールが含まれていればよく、抽出液のキットなどにおいて全ての液にフェノールが含まれている必要はない。
核酸抽出液は、さらにクロロホルムを含むことが好ましい。フェノールはＤＮＡを効率的に抽出できるが、液液分離の際に水層と完全に分離せず、一部が水層に溶解するため、その分回収効率が下がってしまう。そこで、水層との分離性の高いクロロホルムを添加することで、フェノールを有機層側へ移行させ、ＤＮＡ等の核酸の回収率を上げることができる。
（第３工程）
本工程では、核酸抽出液（少なくとも一部）を回収することにより、核酸を抽出する。
具体的には、図２の（ｃ）に示されるように、ＤＮＡ（核酸）が生物学的試料３１からＤＮＡ抽出液６へ抽出された後、プランジャー４２を押し下げて、ガスケット４１をシリンジバレル１２内で液密状態で摺動させ、ＤＮＡを含有するＤＮＡ抽出液を容器内に吐出する。なお、生物学的試料３１は、金属メッシュ１０上に捕集されるため、ＤＮＡと分離される。
次に、図２の（ｄ）に示されるように、シリンジバレル１２等を金属メッシュ１０と共に取り除き、ＤＮＡ抽出済みのＤＮＡ抽出溶液を得る。このようにして、気体中の生物学的試料から核酸を抽出することができる。
なお、上記の抽出方法によって抽出されたＤＮＡ（核酸）は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された後に、遺伝子解析等の種々公知の生物学的手法を用いた分析（第４工程）に供される。
なお、生物学的試料が細菌等の微生物である場合は、核酸を抽出する前に捕集された微生物を培養して増殖させ、抽出される核酸の量を増やす処理を行ってもよい。
この場合、本実施形態では、金属メッシュ上に微生物が捕集されているため、例えば、微生物が捕集された金属メッシュの表面を寒天培地等に押し付けて、微生物を培地に転写することで、微生物を容易に培地上に植菌するができる。なお、従来のメンブレンフィルタで微生物を捕集した場合、同様の方法では、フィルタの細孔内に入り込んで捕集された微生物を培地に転写することは難しく、十分な量の微生物を培地に植菌することは困難である。
次に、本実施形態の変形例について説明する。図３を参照して、気体が、異なる粒径を有する複数種の生物学的試料３１ａ，３１ｂを含有している場合、第１工程において、複数種の生物学的試料３１ａ，３１ｂの各々を孔径の異なる複数の金属メッシュ１０１，１０２の各々で捕集することが好ましい。また、第２工程において、複数種の生物学的試料３１ａ，３１ｂの各々が捕集された複数の金属メッシュ１０１，１０２の各々を複数の核酸抽出液の各々に浸漬することが好ましい。これにより、異なる種類の生物学的試料を分級し、各々の生物学的試料から核酸を別々に抽出することができ、異なる種類の生物学的試料の各々の分析精度を向上させることができる。
次に、図４を参照して、本発明の実施形態に用いられる金属メッシュ１０の一例の構成を説明する。本実施形態の金属メッシュ１０は、気体や液体中の生物学的試料を濾過するために用いられる膜状の金属メッシュであって、生物学的試料が通過できない大きさの複数の貫通孔１１を有している。
金属メッシュは、金属または半導体で構成されている。金属としては、特に限定されないが、ニッケル、金、銀、銅、鉄、クロム、ステンレス鋼、白金、チタンなどが挙げられる。好ましくはニッケル、金、銀、銅、白金、チタンおよびクロムであり、さらに好ましくはニッケル、金、白金、およびチタンである。
金属メッシュ１０は、第１主面１０ａと、第１主面１０ａと対向する第２主面１０ｂとを有している。貫通孔１１は第１主面１０ａから第２主面１０ｂに向かって貫通している。すなわち、貫通孔は、金属メッシュの厚み方向に貫通している。
本実施形態の金属メッシュにおいては、例えば、複数の貫通孔１１が、金属メッシュの主面上の少なくとも一方向に周期的に配置されている。これにより、濾過特性が安定した金属メッシュを得ることができる。
例えば、貫通孔１１は、図４に示すようなマトリックス状（格子状）に一定の間隔で配置されていることが好ましい。具体的には、図４（ｂ）に示されるように、第１主面１０ａ側からみて正方形の貫通孔１１が、該正方形の各辺と平行な２つの配列方向（図中の縦方向と横方向）に等しい間隔で設けられていることが好ましい。
ただし、貫通孔１１は、濾過特性が不安定にならない範囲で、一部の貫通孔が周期的に配置され、他の貫通孔１１が非周期的に配置されていてもよい。
なお、金属メッシュは、貫通孔１１の周囲に外周部（図示せず）を有していてもよい。なお、外周部は、例えば、濾過の際に金属メッシュを固定するために固定部材によって挟持される部分となる。
金属メッシュの孔径（貫通孔１１の孔径）は、生物学的試料を捕集できる大きさであれば特に限定されないが、例えば、物理的に生物学的試料が通過できないか、または通過し難い大きさであることが好ましい。具体的には、金属メッシュの孔径は、生物学的試料より小さいことが好ましい。
ここで、貫通孔１１の孔径（金属メッシュの孔径）とは、例えば、貫通孔１１に内接する円の直径である。例えば、貫通孔１１の形状が図４（ｂ）に示されるような正方形である場合、貫通孔１１に内接する円の直径は、図４（ｂ）にＤで示される貫通孔１１の配列方向の長さであり、これが貫通孔１１の孔径（金属メッシュの粒径）である。
なお、「金属メッシュの孔径が生物学的試料より小さい」とは、例えば、上記金属メッシュの孔径が、生物学的試料の数平均粒子径よりも小さいことを意味する。ただし、数平均分子量に限らず、生物学的試料の大きさの他の指標（体積平均分子量など）と比較して、金属メッシュの孔径が小さい場合も本発明の範疇に含まれる。生物学的試料の大きさの指標は、生物学的試料を金属メッシュで捕集できるかどうかを基準として、最適なものを選択すればよい。
また、金属メッシュの孔径は、核酸より大きいことが好ましい。ここで、「金属メッシュの孔径が核酸より大きい」とは、例えば、上記金属メッシュの孔径が、核酸の数平均粒子径よりも大きいことを意味する。ただし、数平均分子量に限らず、核酸の大きさの他の指標（体積平均分子量など）と比較して、金属メッシュの孔径が大きい場合も本発明の範疇に含まれる。核酸の大きさの指標は、核酸を金属メッシュを通過できるかどうか（核酸が金属メッシュにトラップされるかどうか）を基準として、最適なものを選択すればよい。なお、金属メッシュの孔径は、当然、流体（気体、液体など）の媒質が通過できる大きさである。
例えば、金属メッシュが、貫通孔１１が図４に示すように縦横に規則的に配置された金属メッシュである場合において、貫通孔１１の孔サイズ（図４（ｂ）に示されるＤ）は、例えば、生物学的試料の表面上の２点間を結ぶ直線のうち最長のものの長さ以下であることが好ましい。
また、金属メッシュ１０の桟部の幅Ａ（図４（ｂ）参照）は、例えば、０．５μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
なお、貫通孔１１を含む金属メッシュの主面の面積に対する貫通孔の開口面積の比率（以後、開口率と表記することがある）は、金属メッシュを通過する流体（気体）の流速を高める観点から３％以上であることが好ましく、１０％以上であることがより好ましい。また、金属メッシュの強度保証の観点から、９０％以下であることが好ましく、８０％以下であることがより好ましい。なお、開口率は、例えば、図４（ｂ）にＤで示される貫通孔（主に貫通孔１１）の孔サイズとＰで示される貫通孔の格子間隔（ピッチ）を制御することによって調整することができる。
金属メッシュの厚みは、必要な機械的強度を維持できる範囲で、薄い方が好ましい。金属メッシュの厚みが厚くなると、一般に流体を通過させた際の圧力損失が大きくなる。金属メッシュの圧力損失が大きくなると、流速が遅くなったり、流体を流すことが困難になったりするため、処理効率が低下するといった問題があるからである。
具体的に、金属メッシュの平均厚みは、好ましくは０．２μｍ以上４０μｍ以下であり、より好ましくは０．５μｍ以上５μｍ以下である。
なお、従来のメンブレンフィルタやゼラチンフィルタは比較的軟質であるため、高精度でろ過のための孔を形成することが困難である。また、仮に高精度な孔を形成することができたとしても、保存期間や使用中において孔の精度を維持することが困難である。さらに、開口率が低いため、処理に長い時間を要した。このため、従来は、所望の生物学的試料を選択的に精度良く短時間に捕集することができず、核酸を効率的に抽出することが難しかった。
これに対して、金属メッシュは、上述のような所望の孔を高精度で高開口率で形成することが可能であり、保存期間や使用中において孔の精度を維持することができる。したがって、本実施形態においては、金属メッシュを用いることで、所望の生物学的試料を選択的に精度良く捕集することができ、核酸を効率的に抽出することが可能である。
［実施形態２］
本実施形態は、実施形態１と同様であるが、流体に液体を用いている点で、実施形態１と異なっている。
液体中に含まれる生物学的試料として、大腸菌がある。大腸菌には様々な形状のものがあるが、最も短い軸方向で０．４μｍ程度である。例えば、水道水や工業用水などにおける水中の大腸菌を捕集する目的において、Ｄ２＝２００ｎｍとすることで、高い効率で大腸菌を捕集することができる。
［実施形態３］
本実施形態は、第２工程および第３工程が実施形態１と異なり、第１工程は実施形態１と同様である。
本実施形態における第２工程および第３工程は、主に（Ａ）サンプル回収、細胞破砕、（Ｂ）除蛋白、（Ｃ）ＤＮＡ沈殿、および（Ｄ）ＤＮＡ精製の手順で実施される。
本実施形態においては、生物学的試料を金属メッシュ上に捕集するため、従来のメンブレンフィルタを使用した場合と比べて、第２工程および第３工程に用いる核酸抽出のための方法の選択肢を増やすことができる。生物学的試料（細菌、ウイルスなど）に対して、核酸以外のタンパク質（疎水性高分子）等を破砕し（変性させ）、核酸を抽出するための種々の生物学的試料の処理方法について、金属メッシュとメンブレンフィルタとの適性（耐性）を対比して表１に示す。
表１に示されるように、金属メッシュを用いた実施形態においては、メンブレンフィルタを用いる比較形態よりも、幅広い処理条件を選択することができる。このため、処理効率（抽出速度）を向上させたり、また、抽出できる細胞のバリエーションを増やしたりすることができる。
例えば、フェノールおよびクロロホルムに対して耐性のないメンブレンフィルタを用いる場合、フェノールおよびクロロホルムを用いた核酸抽出をメンブレンフィルタに捕集された生物学的試料に対して直接行うことはできない。このため、核酸抽出の前に、生物学的試料をメンブレンフィルタと分離する処理が必要になる。あるいは、フィルターが溶解してしまうと、後工程で核酸に関する情報を読み取る上で、感度低下を招いてしまう。これに対して、金属メッシュを用いる場合、フェノールおよびクロロホルムを用いた核酸抽出を、生物学的試料が金属メッシュに捕集された状態のままで行うことができるため、事前に生物学的試料をメンブレンフィルタと分離する処理を省略することができ、処理効率を向上させることができる。
以下、本実施形態における第２工程および第３工程の具体例について、メンブレンフィルタを用いる比較形態と対比して説明する。
（１）微生物からのＤＮＡ抽出の場合
生物学的試料が微生物を含有する分散粒子であり、核酸がＤＮＡである場合について、第２工程および第３工程の概要を表２に示す。なお、表２および後述の表３における各処理は、上から下へ順に実施される。
なお、比較形態で用いるメンブレンフィルタとしては、例えば、ポリエーテルスルホン製メンブレンフィルタが挙げられる。該メンブレンフィルタは、例えば、「Ｓｔｅｒｉｖｅｘ」（商品名：メルクミリポア社製、ポアサイズ０．２２μｍ）として市販されているものである。
表２に示されるように、本実施形態は比較形態に対して、上記のＳＤＳ／アルカリ処理を用いることができる点で有利である。これに対して、比較形態では、メンブレンフィルタがアルカリに対して耐性が低いため、アルカリを用いないＳＤＳ（緩衝液）処理を行っている。
ＳＤＳ／アルカリ処理は、界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）とアルカリを含む水溶液に、生物学的試料が捕集された金属メッシュを浸漬する処理であり、フェノール等を用いたＤＮＡ抽出処理の前に、微生物を構成するタンパク質を変性させて破壊するための処理である。比較形態のＳＤＳ溶液（緩衝液）による処理も同様の処理であるが、ＳＤＳ／アルカリ処理の方が、アルカリによってタンパク質を迅速に変性させることができる。
したがって、本実施形態では、比較形態に対して、全体の処理工程に要する時間を短縮することができ、処理効率を向上させることができる。
なお、上記のフェノール：クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出において、フェノールまたはクロロホルムを、金属メッシュを含む水溶液中に添加する工程が、本実施形態の第２工程に相当する。また、フェノール：クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出において、ＤＮＡが溶解した有機層を回収する工程が、本実施形態の第３工程に相当する。
（２）ウィルスからのＲＮＡ抽出の場合
生物学的試料がウィルスを含有する分散粒子であり、核酸がＤＮＡである場合について、第２工程および第３工程の概要を表３に示す。
表３に示されるように、メンブレンフィルタを用いる比較形態では、メンブレンフィルタがフェノールとチオシアン酸グアニジンに対して耐性がないため、まず、界面活性剤であるＳＤＳの緩衝液に、生物学的試料が捕集されたメンブレンフィルタを浸漬するＳＤＳ（緩衝液）処理により、生物学的試料をメンブレンフィルタから液中に抽出した後に、フェノールとチオシアン酸グアニジンの溶液による処理を行い、生物学的試料から核酸を抽出する必要がある。なお、比較形態において、ＳＤＳ（緩衝液）処理を行わずに、フェノールとチオシアン酸グアニジンの溶液による処理を直接行った場合、核酸が抽出される前に、メンブレンフィルタの細孔の閉塞等が生じて、生物学的試料からの核酸の抽出が困難になってしまうと考えられる。
これに対して、金属メッシュを用いる本実施形態では、生物学的試料が捕集された金属メッシュに、直接、フェノールとチオシアン酸グアニジンによる処理を施すことによって、金属メッシュから生物学的試料を分離すると共に、生物学的試料から核酸を分離することができる。
したがって、本実施形態では、比較形態よりも処理工程を減らすことができるため、比較形態に対して、全体の処理工程に要する時間を短縮することができ、処理効率を向上させることができる。
なお、上記のフェノールとチオシアン酸グアニジンの溶液による処理、および、クロロホルム添加の工程が、本実施形態の第２工程に相当する。また、クロロホルム添加後に水層を回収する工程が、本実施形態の第３工程に相当する。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
本実施例では、空気中の塵埃を３層の金属メッシュを備える抽出装置を用いて捕集し、捕集された塵埃に含まれるロタウィルスの抽出および検出を行った。
（第１工程：ロタウィルスの捕集）
図５は、実施例１で用いた抽出装置の構成を示す図である。（ａ）は斜視図、（ｂ）は分解斜視図、（ｃ）は断面模式図、（ｄ）は（ｃ）の部分拡大図である。
主に図５（ｃ）、（ｂ）を参照して、抽出装置２（金属メッシュを用いた塵埃の捕集装置）では、第２積層部２ｃ（上段）の金属メッシュ１０１（開口サイズ：４．０μｍ）、第１積層部２ｂ（中段）の金属メッシュ１０２（開口サイズ：１．８μｍ）、および、本体２ｄ（下段）の金属メッシュ１０３（開口サイズ：１．１μｍ）の３種類の金属メッシュが、直列に積み重ねて設置されている。
なお、カバー部２ｄは、第１積層部２ｂおよび第２積層部２ｃを収容可能な下方に開口した空間を有しており、本体２ａに第１積層部２ｂ、第２積層部２ｃおよびカバー部２ｄを積み重ねることで、吸気口２２から排気口２３に通じる流路が形成され、図５（ａ）、（ｃ）に示されるような抽出装置２が構成される。
図５（ｃ）、（ｄ）を参照して、吸引スイッチ２４を操作し、本体２ａに内蔵されたポンプを作動させることで、空気を吸気口２２から吸引し、排気口２３から排出することができる。本実施例では、この吸気口２２と排気口２３の間に、２時間で５５Ｌの空気を通過させ、空気中の塵埃を金属メッシュに捕集した。
（第２工程および第３工程：核酸抽出液の回収）
次に、捕集された塵埃から核酸（ＲＮＡ）抽出液を回収した。
まず、金属メッシュ１０２または金属メッシュ１０３を試験管に入れ、フェノールとチオシアン酸グアニジンを含むＲＮＡ抽出用試薬（「ISOGEN-LS」、Code No. 311-02621、(株)ニッポンジーン)を０．７５ｍＬ加えた。５分間室温で静置した後、試験管にさらにクロロホルムを０．２ｍＬ加え、１５秒間攪拌した後、３分間室温で静置した。その後、金属メッシュを試験管内から取り除いた。
高速遠心分離機により１２０００ｇ（「g」は重力加速度である）、１５分間の遠心分離を行い、試験管内で水と有機溶媒を２液相に分離させた。試験管から取り出した水相に、０．５ｍＬのイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを沈殿させた。液体を取り除いたのち、７０％エタノールで同様に処理して、沈殿物を洗浄した。この沈殿物（塵埃にＲＮＡが含まれていれば、ＲＮＡを含む）を５０μＬの水に溶解し、腐食酸（フミン酸）などのＰＣＲ阻害物質を除去するために、核酸精製キット（One Step PCR Inhibitor Removal Kit：ザイモ・リサーチ社）で精製し、最終的に５０μＬの水に溶出して、「ＲＮＡ抽出液」を回収した。
（第４工程：核酸の分析）
さらに、以下の方法によって、「ＲＮＡ抽出液」中に含まれるＲＮＡ（ウィルス由来のＲＮＡ）を逆転写酵素処理によりＤＮＡへ変換した。
具体的には、逆転写反応キット（「ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Kit」、Code No. FSQ-101、東洋紡(株))を用いて逆転写酵素反応を実施し、ＲＮＡ（ロタウイルスのＶＰ４遺伝子など）からｃＤＮＡを調製した。なお、以下に記載される試薬の多くは、上記キットに含まれる試薬である。
まず、９μＬのRNAaseフリー水（「RNase-free Water」、タカラバイオ(株)）、３μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、１μＬのプライマー（ロタウィルスのＶＰ４遺伝子を増幅させる５’−ＴＧＧＣＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡ−３’および５’−ＣＴＡＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡ−３’の配列を有する合成オリゴヌクレオチド）、および、２μＬの上記「ＲＮＡ試料液」を混合した。得られた混合液を、９７℃で２分間加熱した後、２分間氷上に静置して冷却した。
上記混合液１５μＬを、７．５μＬの「RNase-free Water」、６μＬの「5x RT Buffer」（反応バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓなどを含む５倍濃度の逆転写反応バッファー。東洋紡(株)）、および、１．５μＬの「Enzyme Mix」（「ReverTra Ace」（登録商標）と「RNase inhibitor」を混合した酵素液、東洋紡(株)）と混合した。得られた混合液を、４２℃下に３０分間、９７℃下に５分間、および、４℃下に５分間の順に、加熱および冷却して、逆転写反応を進行させた。
次に、ＰＣＲ用酵素液（「KOD-Plus-Ver.2」、Code No. KOD-211、東洋紡(株))を使用して、ＰＣＲによるロタウィルス遺伝子の検出を行った。
まず、１４μＬの「RNase-free Water」、２．５μＬの「10x Buffer for KOD -Plus- Ver.2」（Code No: KOD-3B、東洋紡(株)）、２．５μＬのｄＮＴＰｓ水溶液（２ｍＭ）を、１．５μＬのＭｇＳＯ４水溶液（２５ｍＭ）、１μＬのＤＭＳＯ、０．５μＬの「KOD-plus-Ver.2」、および、１μＬのプライマー（ロタウィルスのＶＰ４遺伝子を増幅させる５’−ＴＧＧＣＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡ−３’および５’−ＣＴＡＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡ−３’の配列を有する合成オリゴヌクレオチド）を混合した。
得られた混合液に対して、最初に９５℃下で２分加熱した後、９４℃下で３０秒、４８℃下で３０秒、および、７２℃下で１分を１サイクルとするＰＣＲを３５サイクル実施した。最後に、７２℃下で７分、および、４℃下で１０分の加熱および冷却を行い、ＤＮＡ試料液を得た。得られたＤＮＡ試料液をアガロースゲル電気泳動で分析した結果（電気泳動写真）を図６に示す。
図６において、レーン１には分子量マーカー（100bp DNA Ladder H3 RTU、GeneDireX社）を流した。レーン３および４と、レーン５および６と、レーン７および８と、レーン９および１０とには、それぞれ相異なる場所で捕集した空気中の塵埃から得たＤＮＡ試料液を流した。なお、これらの奇数レーン（レーン３、５、７および９）には、金属メッシュ１０２（開口サイズ：１．８μｍ）から得たＤＮＡ試料液を流し、偶数レーン（レーン４、６、８および１０）には、金属メッシュ１０３（開口サイズ：１．１μｍ）から得たＤＮＡ試料液を流した。なお、レーン２には、ポジティブコントロールとして、培養したロタウイルスから得た上記と同様のＤＮＡ試料液を流した。
図６のレーン６〜８において、ロタウイルスから得たＤＮＡ（レーン２）と同様の位置にバンドが認められた。この結果から、レーン６〜８に流されたＤＮＡ試料液中に、ロタウィルス由来のＤＮＡが含まれていたことが分かる。したがって、レーン６〜８のサンプルに対応する場所の空気中にロタウィルスが含まれていたと考えられる。
（実施例２）
実施例１と同様の方法を用いて、空気中から塵埃を捕集した。
次に、金属メッシュ１０１を入れた試験管、金属メッシュ１０２を入れた試験管、および金属メッシュ１０３を入れた試験管を準備し、核酸抽出キット（「NucleoSpin（登録商標） Soil」、Code No. U0780A（代理店：タカラバイオ（株））、マッハライ・ナーゲル社)に上記キットに添付のＳＬ１バッファー（ＳＤＳ溶解液）を７００μＬ加え、さらにキットに添付の「Enhancer SX」溶液を１５０μＬ加え、混合液を室温で５分間激しく攪拌した。
次に、１１０００ｇで２分間の遠心分離を行った後、１５０μＬのＳＬ３バッファー（「Lysis Buffer SL3」、タカラバイオ(株)）を加えて攪拌し、その後、４℃で５分間静置した。１１０００ｇで１分間遠心した後、上清液（サンプル）を採取した。上清液にＳＢバッファー（「Binding Buffer SB」、タカラバイオ(株)）を加えて、平衡化したミニスピンカラム（「NucleoSpin Inhibitor Removal Column」、タカラバイオ(株)）に通過させ、該サンプル中の抽出ＤＮＡを吸着させた。
次に、上記カラムに、５００μＬのＳＢバッファー、５５０μＬのＳＷ１バッファー（「Wash Buffer SW1」、タカラバイオ(株)）、および、７００μＬのＳＷ２バッファー（「Wash Buffer SW2」、タカラバイオ(株)）をこの順に流して、カラムを洗浄した後、３０μＬのＳＥバッファー（「Elution Buffer SE」、タカラバイオ(株)）を流して、ＤＮＡをカラムから溶出させて、ＤＮＡ抽出液を得た。
次に、「Bacterial 16S rDNA Clone Library Construction Kit」（タカラバイオ(株)）を用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を増幅した。
まず、５μＬの上記ＤＮＡ抽出液、２５μＬの「2×Gflex PCR buffer」（タカラバイオ(株)）、１μＬのプライマー混合液〔「16S-FA PCR primer」（5’-TTTTAAAGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’）と「16S-R3 PCR primer」（5’-TTAATACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’）の混合液〕、１μＬの「Tks Gflex DNA polymerase」（タカラバイオ(株)）、および、１８μＬの「DNA free water」（タカラバイオ(株)）を混合した。
得られた混合液に対して、最初に９４℃下で１分加熱した後、９８℃下で１０秒、５５℃下で１５秒、および、６８℃下で４５秒を１サイクルとするＰＣＲを３５サイクル実施した。最後に、４℃下で１０分の冷却を行い、ＤＮＡ試料液（ＰＣＲ増幅物含有液）を得た。得られたＤＮＡ試料液をアガロースゲル（１．２％）電気泳動で分析した結果（電気泳動写真）を図７に示す。
図７において、レーンＭには、２μＬの分子量マーカー（「1kb DNA ladder」、タカラバイオ(株)）を流した。レーン１には、金属メッシュ１０１（開口サイズ：４．０μｍ）から得たＤＮＡ試料液を１０μＬ流した。レーン２には、金属メッシュ１０２（開口サイズ：１．８μｍ）から得たＤＮＡ試料液を１０μＬ流した。レーン３には、金属メッシュ１０３（開口サイズ：１．１μｍ）から得たＤＮＡ試料液を１０μＬ流した。レーン４には、ネガティブコントロールを１０μＬ流した。
図７のレーン１〜３において、１．５ｋｂ程度の分子量を有するＤＮＡのバンドが認められた。この結果から、本実施例で得られたＤＮＡ試料液中に、1６Ｓ ｒＤＮＡに由来する１．５ｋｂ程度の分子量を有するＰＣＲ増幅物が含まれていたことが確認された。したがって、塵埃に含まれる微生物から、その後の解析に足る量の遺伝子を抽出できたことがわかった。
（実施例３）
本実施例では、実施例２でレーンＭおよびレーン１〜４の各々に流したＤＮＡ試料液（ＰＣＲ産物）について、環境中の細菌の群集構造解析用ライブラリー作製用のキット（「Bacterial 16S rDNA Clone Library Construction Kit」（タカラバイオ(株)）を用いた分析を実施した。すなわち、ＤＮＡ試料液中に含まれるＤＮＡをプラスミドベクターに挿入し、大腸菌のプラスミドクローンを分離した。得られた１００クローンの挿入部のＤＮＡ配列を解析した。以下に詳細を説明する。
まず、１μＬのＤＮＡ試料液（１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ産物）と、上記キットに添付された１μＬのプラスミドベクター含有液「pBackZero-alpha linear vector」（５０ｎｇ／μＬ）、５μＬの「DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞」、および、５μＬの「DNA free water」と、を混合した。その後、１６℃下で３０分間反応を進行させて、ＤＮＡをプラスミドベクターに挿入した。得られたプラスミドベクターを大腸菌（「E.coli HST08 Premium Competent Cell」、タカラバイオ(株)）に導入した。
大腸菌を単クローン化して培養した後、「PureYield Plasmid Miniprep System」（プロメガ社）を使用して、大腸菌からプラスミドを抽出精製した。このプラスミドを「ABI PRISM(R) 3100 ジェネティックアナライザー」により定法に従って配列解析した。解析配列のＢＬＡＳＴサーチにより同定された微生物（細菌）を下表に示す。
図８は、本実施例において同定された上記細菌の属分布を示すグラフである。なお、図８では、菌種はすべて「属」レベルでまとめている。なお、図８において、表４の「uncultured bacterium」と記したクローンは、最も配列の相同性の高い(相同性：９５％以上）属に含めている。また、「not identified bacteria」は、相同性の高い既知の属が見当たらないことを示す。また、「other」は、「門」までの情報しかなく、「属」の情報がないことを示す。
表４〜表６および図８に示される結果から、空気中の塵埃に含まれる微生物のおおよその組成がわかる。すなわち、検出微生物のコロニー数（重複数）から相対的な存在量がわかる。検出された微生物について、病原菌（Serratia属、Nocardia属など）、食品劣化に関わる菌（Enterobacter科など）、水質の劣化に関わる菌（Methylobacteriumなど）などが同定できた。したがって、この方法を利用することで、病院や食品工場など微生物の管理が必要な場所で環境のモニタリングができる。また、本発明の抽出方法（抽出装置）を用いた分析方法によって、流体（空気）中の微生物を検出可能であることが分かる。
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
本発明は、医療分野や環境衛生分野において利用することができる。例えば、空気中に存在する細菌、ウィルス等の分析（同定、定量など）を行うことにより、その分析結果を基に、細菌やウィルスによって生じる健康被害の予防に役立てることができる。
１０，１０１，１０２，１０３ 金属メッシュ、１２ シリンジバレル、２ 抽出装置、２ａ 本体、２ｂ 第１積層部、２ｃ 第２積層部、２ｄ カバー部、２０ プレフィルタ、２１ 保持部材、２２ 吸気口、２３ 排気口、２４ 吸引スイッチ、３１ 生物学的試料、３２ 夾雑物、４１ ガスケット、４２ プランジャー、５ 容器、６ ＤＮＡ抽出液。

Claims (14)

  1. 流体中に存在する核酸と前記核酸を包含する被覆構造体とを含む生物学的試料を金属メッシュにより捕集する第１工程と、
    前記生物学的試料が捕集された前記金属メッシュを核酸抽出液に浸漬する第２工程と、
    前記核酸抽出液を回収する第３工程と、をこの順で備え、
    前記金属メッシュの孔径は、前記生物学的試料より小さく、前記核酸より大きく、
    前記核酸抽出液は、前記核酸を溶解可能であり、前記被覆構造体を溶解しない、前記核酸の抽出方法。
  2. 前記金属メッシュは、主面上の少なくとも一方向に周期的に配置された複数の貫通孔を有する、請求項１に記載の抽出方法。
  3. 前記金属メッシュは前記核酸抽出液によって溶解されない、請求項１または２に記載の抽出方法。
  4. 前記核酸抽出液はフェノールを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抽出方法。
  5. 前記第１工程において、前記金属メッシュに前記生物学的試料を捕集する前に、前記流体中に含まれる前記生物学的試料以外の夾雑物をプレフィルタにより除去する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抽出方法。
  6. 前記流体は、異なる粒径を有する複数種の生物学的試料を含有し、
    前記第１工程において、前記複数種の生物学的試料の各々を孔径の異なる複数の金属メッシュの各々で捕集し、
    前記第２工程において、前記複数種の生物学的試料の各々が捕集された前記複数の金属メッシュの各々を複数の核酸抽出液の各々に浸漬する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抽出方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の抽出方法によって抽出された前記核酸を分析する第４工程を備える、前記生物学的試料の分析方法。
  8. 流体を流すための流路を有する捕集部材と、
    前記捕集部材の前記流路内に設けられた、前記流体中に存在する核酸と前記核酸を包含する被覆構造体とを含む生物学的試料を捕集するための金属メッシュと、
    前記生物学的試料が捕集された前記金属メッシュを浸漬するための核酸抽出液を収容する容器と、を備え、
    前記金属メッシュの孔径は、前記生物学的試料より小さく、前記核酸より大きく、
    前記核酸抽出液は、前記核酸を溶解可能であり、前記被覆構造体を溶解しない、前記核酸の抽出装置。
  9. 前記金属メッシュは前記核酸抽出液によって溶解されない、請求項８に記載の抽出装置。
  10. 前記核酸抽出液はフェノールを含有する、請求項８または９に記載の抽出装置。
  11. 前記捕集部材の前記流路内の前記金属メッシュより上流側に設けられた、前記流体中に含まれる前記生物学的試料以外の夾雑物を除去するためのプレフィルタをさらに備える、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抽出装置。
  12. 前記流体は、異なる粒径を有する複数種の生物学的試料を含有し、
    前記捕集部材の前記流路内に設けられた、前記複数種の生物学的試料の各々を捕集するための孔径の異なる複数の金属メッシュと、
    前記複数種の生物学的試料の各々が捕集された前記複数の金属メッシュの各々を浸漬するための複数の核酸抽出液の各々を収容する複数の容器と、を備える、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の抽出装置。
  13. 前記捕集部材はシリンジバレルであり、
    前記シリンジバレル内で液密状態で摺動可能なガスケットと、前記ガスケットに装着されたプランジャーと、をさらに備える、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抽出装置。
  14. 請求項８〜１３のいずれか１項に記載の抽出装置を備え、
    前記抽出装置によって抽出された前記核酸を分析するための分析機器をさらに備える、前記生物学的試料の分析装置。
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