JP2003536057A - きわめて大量の試料から分析用試料を調製する濾過手段の使用方法 - Google Patents
きわめて大量の試料から分析用試料を調製する濾過手段の使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、中に複数の中空の繊維（３）が互いに並行に配置されたハウジング（２）を有し、その各多孔質の壁（３ａ）は、開口（４）画定した、濾過手段の使用方法に関するもので、上記手段は、上記繊維と希釈状態で大きさの異なる複数の微生物を含む大量の初期液体試料を処理するためのディスク・セパレータの間で利用可能な容積に対応する外部通路（Ｂ）と、内部通路とを有する。本発明は、少なくとも一つの濃縮工程の間、単一の濾過手段が利用可能とされ、上記繊維の多孔質の壁（３ａ）の原子質量閾値が、初期試料の最小微生物を保持するように定められ、上記手段が、前面モードで不連続に使用され、それによって濃縮液である出力試料液を提供する。
Description
【０００１】
本発明は、希釈状態で大きさの異なる複数の微生物（ウイルス、バクテリア、
寄生虫）および各種有機および無機高分子を含む大量の試料を処理して、濃縮さ
れた状態でとくに汚染物質の同じ相対的混合物を含む少量の液体試料を得るため
必要とするような、液体媒質中に存在する汚染物質の分析の分野に関する。
寄生虫）および各種有機および無機高分子を含む大量の試料を処理して、濃縮さ
れた状態でとくに汚染物質の同じ相対的混合物を含む少量の液体試料を得るため
必要とするような、液体媒質中に存在する汚染物質の分析の分野に関する。
【０００２】
このような汚染物質とくに微生物の集積体および分析用の少量の試料は、微生
物生化学的および生物学的分析方法、とくに例えば多重検出などの免疫検定方法
や分子生物学的手法を用いる場合に、必要となるものである。
物生化学的および生物学的分析方法、とくに例えば多重検出などの免疫検定方法
や分子生物学的手法を用いる場合に、必要となるものである。
【０００３】
例えば吸着法を用いて微生物とくにウイルスを分離濃縮する手段は、公知であ
る。しかし、これらの手段では、それらが微生物の生存能力を保証するものでな
いことに加えて、上に述べたような分析法で使用できる量の試料を得ることがで
きない。
る。しかし、これらの手段では、それらが微生物の生存能力を保証するものでな
いことに加えて、上に述べたような分析法で使用できる量の試料を得ることがで
きない。
【０００４】
液体媒質中の微生物を収集するために用いられる他の手段では、濾過方法およ
び一種類のみの微生物の分析が求められるが、常に定量的な分析結果が得られる
ものではない。
び一種類のみの微生物の分析が求められるが、常に定量的な分析結果が得られる
ものではない。
【０００５】
バクテリアおよび寄生虫の場合には、規格化された方法では、種によって異な
るが、0.2μmから1μmの範囲の大きさの多孔性の平坦な膜を使用することが望ま
しい。
るが、0.2μmから1μmの範囲の大きさの多孔性の平坦な膜を使用することが望ま
しい。
【０００６】
例えば、とくにフランス国特許明細書FR-B-2693474から、公知の方法で一つ以
上の膜を使用してウイルス程度の大きさの微生物を分離できるようにし、同時に
微生物の生存能力を保障する接線限外濾過にもとづく手法も知られている。
上の膜を使用してウイルス程度の大きさの微生物を分離できるようにし、同時に
微生物の生存能力を保障する接線限外濾過にもとづく手法も知られている。
【０００７】
しかし、最終液体試料の量に関する必要性から、この手法を生化学的または生
物学的分析法で分析する試料を作製するために使用することはできない。
物学的分析法で分析する試料を作製するために使用することはできない。
【０００８】
オータキ等（Wat. Sci. Tecch. 37、10,107-116,1998）から、精密濾過膜
の性能を確認するために、中空繊維を用いた限外濾過装置を連続正接モードで使
用し、供給液、濾過液、および濃縮液からそれぞれ試料を回収することによって
周期的に得られる回収物を分析することも知られている。
の性能を確認するために、中空繊維を用いた限外濾過装置を連続正接モードで使
用し、供給液、濾過液、および濃縮液からそれぞれ試料を回収することによって
周期的に得られる回収物を分析することも知られている。
【０００９】
正接モードの濾過および限界濾過手段の使用には、膜での正接速度を維持して
懸濁液内の粒子を濾過するようにし、同時に使用されている膜がすぐに詰まるの
を避けるために濃縮液のすべてまたは一部を再循環させることのできる回路の存
在が必要となる（レオス・Ｊ・ジーマン、アンドリュー・Ｌ・ジドニー、マーセ
ル・デッカー「精密濾過および限外濾過 − 原理および応用」、ニューヨーク
− バーゼル − 香港、1996 “Microfiltration and Ultrafiltration
− Principles and Applications” Leoa J. Zeman, Andrew L. Zydney, Marcel
Dekker, Inc.New York − Basle − Hong Kong 1996）。
懸濁液内の粒子を濾過するようにし、同時に使用されている膜がすぐに詰まるの
を避けるために濃縮液のすべてまたは一部を再循環させることのできる回路の存
在が必要となる（レオス・Ｊ・ジーマン、アンドリュー・Ｌ・ジドニー、マーセ
ル・デッカー「精密濾過および限外濾過 − 原理および応用」、ニューヨーク
− バーゼル − 香港、1996 “Microfiltration and Ultrafiltration
− Principles and Applications” Leoa J. Zeman, Andrew L. Zydney, Marcel
Dekker, Inc.New York − Basle − Hong Kong 1996）。
【００１０】
濾過された流体の再循環は、長い濾過時間が必要となり、とくに、最終的に得
られる量に影響することなく濃縮物および微生物の一部を回収するために余分の
量が必要となる。
られる量に影響することなく濃縮物および微生物の一部を回収するために余分の
量が必要となる。
【００１１】
これらの手法では、配管機構の大きさおよび壁に残存する微生物を抽出するた
めに必要な溶離液の量の大きさ、から大量の濃縮液が用いられ、また、濾過時間
が長くなる。そのため、これらの手法は分析に少量を必要とし、また例えば飲料
水あるいは人が消費する目的の他の流体の汚染に関する疑問に答えるために、迅
速に結果が得られるような分析手段には使用できない。
めに必要な溶離液の量の大きさ、から大量の濃縮液が用いられ、また、濾過時間
が長くなる。そのため、これらの手法は分析に少量を必要とし、また例えば飲料
水あるいは人が消費する目的の他の流体の汚染に関する疑問に答えるために、迅
速に結果が得られるような分析手段には使用できない。
【００１２】
本発明の目的は、濾過手段を使用するにあたって、大量あるいは予め定められ
た量の初期液試料から、微生物の生存能力を保障しながら、同時に、微生物の生
化学的および生物学的分析方法、とくに例えば多重検出などの免疫検定方法や分
子生物学的手法を実施可能な、充分に少量の分析試料を得ることができるように
することである。
た量の初期液試料から、微生物の生存能力を保障しながら、同時に、微生物の生
化学的および生物学的分析方法、とくに例えば多重検出などの免疫検定方法や分
子生物学的手法を実施可能な、充分に少量の分析試料を得ることができるように
することである。
【００１３】
本発明にしたがって使用される濾過手段は、前面モードで中空の繊維を用いる
限外濾過の手法に基づくものである。
限外濾過の手法に基づくものである。
【００１４】
前面モード（frontal mode）とは、正接モード（tangental mode）と異なり、
初期液試料が濾過手段を通過する任意の単流路であって、それは同じ試料の少な
くとも一部が濾過手段の入口に循環して、戻ることのないような単流路を意味す
ると理解すべきものである。
初期液試料が濾過手段を通過する任意の単流路であって、それは同じ試料の少な
くとも一部が濾過手段の入口に循環して、戻ることのないような単流路を意味す
ると理解すべきものである。
【００１５】
この前面モードの限外濾過手段を使用することによって、単流路内で長くとも
一時間程度の時間内に試料を濃縮して少量の濃縮液を得、同時に、微生物の生存
能力、多重収集、および100％に近い収量を保障することができる。
一時間程度の時間内に試料を濃縮して少量の濃縮液を得、同時に、微生物の生存
能力、多重収集、および100％に近い収量を保障することができる。
【００１６】
「多重収集」という表現は、最終試料から、初期試料中に存在するほぼすべて
の異なる種類または種の微生物を収集することが可能であることを意味すると理
解すべきものである。
の異なる種類または種の微生物を収集することが可能であることを意味すると理
解すべきものである。
【００１７】
上に述べたような高い収量が得られるのは、他の装置と異なり、例えば再循環
用配管機構などの補助的配管機構が存在するため、また中空の繊維の全長に沿っ
た多孔部の信頼性のために、無駄となる量がないためである。
用配管機構などの補助的配管機構が存在するため、また中空の繊維の全長に沿っ
た多孔部の信頼性のために、無駄となる量がないためである。
【００１８】
使用される濾過手段の諸特徴は、添付の図面を参照して以下に行う説明から明
らかとなろう。
らかとなろう。
【００１９】
上記濾過手段は、中に複数の中空の繊維（３）が互いに並行に配置されたハウ
ジング（２）を有し、その各多孔質の壁（３ａ）は、開口（４）画定し、したが
って、上記手段は、上記中空の繊維の複数の平行な開口（４）からなる内部通路
（Ａ）および上記繊維と上記ハウジングの間で利用可能な容積に対応する外部通
路（Ｂ）を有する。
ジング（２）を有し、その各多孔質の壁（３ａ）は、開口（４）画定し、したが
って、上記手段は、上記中空の繊維の複数の平行な開口（４）からなる内部通路
（Ａ）および上記繊維と上記ハウジングの間で利用可能な容積に対応する外部通
路（Ｂ）を有する。
【００２０】
本発明によると、この手段は、希釈状態で大きさの異なる複数の微生物を含む
大量の初期液体試料を処理して、濃縮状態で同じ組成の微生物を含む少量の最終
液体試料を得るために用いられる。
大量の初期液体試料を処理して、濃縮状態で同じ組成の微生物を含む少量の最終
液体試料を得るために用いられる。
【００２１】
この手段が用いられるときには、少なくとも一つの濃縮工程が行われ、その中
では、 ａ）単一の濾過手段が使用され、 ｂ）上記濾過手段は、前面モードで使用され、 ｃ）繊維の多孔質の壁（３ａ）の遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生物
を保持するように不連続に決定され、 ｄ）濾過段階では、初期液体試料がすべて上記濾過手段の一方の通路（Ａ，
Ｂ）を介して導入され、濾過液は、上記濾過手段の他方の通路を介して除去され
、濃縮液は、液体試料が導入された通路を介して蓄積され、 ｅ）収集段階では、試料がすべて通過した後、上記一方の通路から上記他方
の通路への上記濾過手段（１）を通る所期液体試料の通過を停止し、濃縮液から
出口液体試料を得る。
では、 ａ）単一の濾過手段が使用され、 ｂ）上記濾過手段は、前面モードで使用され、 ｃ）繊維の多孔質の壁（３ａ）の遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生物
を保持するように不連続に決定され、 ｄ）濾過段階では、初期液体試料がすべて上記濾過手段の一方の通路（Ａ，
Ｂ）を介して導入され、濾過液は、上記濾過手段の他方の通路を介して除去され
、濃縮液は、液体試料が導入された通路を介して蓄積され、 ｅ）収集段階では、試料がすべて通過した後、上記一方の通路から上記他方
の通路への上記濾過手段（１）を通る所期液体試料の通過を停止し、濃縮液から
出口液体試料を得る。
【００２２】
濃縮液によって形成される出口液体試料は、単純に重力を利用する、圧縮気体
を用いる、または上記濾過手段を物理的に攪拌することによって収集できるが、
ＴＷＥＥＮ２０型洗剤および／またはＢＳＡ（牛血清アルブミン）型表面活性剤
を含むＰＢＳ型の食塩溶液（例： NaCl 120ミリモル、KCL 2.7mモル、NaH2PO4
10ミリモル）を用いた微生物の場合には、任意の物質を用いた溶離によっても
収集することも可能である。
を用いる、または上記濾過手段を物理的に攪拌することによって収集できるが、
ＴＷＥＥＮ２０型洗剤および／またはＢＳＡ（牛血清アルブミン）型表面活性剤
を含むＰＢＳ型の食塩溶液（例： NaCl 120ミリモル、KCL 2.7mモル、NaH2PO4
10ミリモル）を用いた微生物の場合には、任意の物質を用いた溶離によっても
収集することも可能である。
【００２３】
本発明の他の一実施例にあっては、濃縮液で形成された出口液体試料は、第
二の濃縮工程を施し、この第二の濃縮工程で得られた試料が初期液体試料として
用いられる。
二の濃縮工程を施し、この第二の濃縮工程で得られた試料が初期液体試料として
用いられる。
【００２４】
中空の繊維（３ａ）の壁は，上に述べたような多孔質の中空の繊維の製造が
可能な任意の材料、例えば酢酸セルロース、エチルセルロース、ポリエーテル・
スルフォン、またはポリアクリロにトリルなどの有機膜あるいはセラミックなど
の無機膜などを用いてつくることができる。
可能な任意の材料、例えば酢酸セルロース、エチルセルロース、ポリエーテル・
スルフォン、またはポリアクリロにトリルなどの有機膜あるいはセラミックなど
の無機膜などを用いてつくることができる。
【００２５】
上記繊維の多孔質の壁（３ａ）に関する遮断閾値は、初期試料の最も小さい微
生物を保持するように決定される。したがって、限外濾過の領域では、10ないし
100nmの孔の多孔質の繊維が用いられ、濃縮液は、ウイルスを含めてウイルスの
大きさ以上のすべての微生物を含むことになるが、とくに検出すべき粒子の大き
さが10nm以下の場合には、ナノメートルの領域用として1ないし10nmの多孔質の
繊維が用いられる。
生物を保持するように決定される。したがって、限外濾過の領域では、10ないし
100nmの孔の多孔質の繊維が用いられ、濃縮液は、ウイルスを含めてウイルスの
大きさ以上のすべての微生物を含むことになるが、とくに検出すべき粒子の大き
さが10nm以下の場合には、ナノメートルの領域用として1ないし10nmの多孔質の
繊維が用いられる。
【００２６】
本発明の一実施例にあっては、初期試料が導入される通路は、内部通路（Ａ）
であり、出口試料が抽出される通路は、外部通路（Ｂ）である。したがって、微
生物は、繊維の内部に蓄積されて濃縮液が形成され、濾過液は、繊維とハウジン
グ（Ｂ）の間で利用可能な容積の中の繊維の外部に沿って通過する。 例えば10ないし100リットルの量の回収された水の試料からなる処理すべき試
料は、弁（Ｃ）を介してモジュールの中空の繊維の中に導入され、蠕動ポンプ、
または弁（Ｄ）および（Ｆ）を閉じたままにして、弁（Ｅ）によって濾過液側で
低圧を生じさせるなど、他の手段を用いて行われる吸引によって搬送される。
であり、出口試料が抽出される通路は、外部通路（Ｂ）である。したがって、微
生物は、繊維の内部に蓄積されて濃縮液が形成され、濾過液は、繊維とハウジン
グ（Ｂ）の間で利用可能な容積の中の繊維の外部に沿って通過する。 例えば10ないし100リットルの量の回収された水の試料からなる処理すべき試
料は、弁（Ｃ）を介してモジュールの中空の繊維の中に導入され、蠕動ポンプ、
または弁（Ｄ）および（Ｆ）を閉じたままにして、弁（Ｅ）によって濾過液側で
低圧を生じさせるなど、他の手段を用いて行われる吸引によって搬送される。
【００２７】
処理されるべき全量がモジュールを通過したとき、ポンプを停止させ、弁（Ｃ
）を閉じて試料源から切断する。
）を閉じて試料源から切断する。
【００２８】
次に、例えば弁（Ｅ）を開いた後例えば圧縮空気で0.5バールに加圧するなど
してモジュールを大気圧下において、例えば弁（Ｆ）を介して濾過液を除去して
ハウジングを空にし、その後に弁（Ｅ）を再び閉じる。
してモジュールを大気圧下において、例えば弁（Ｆ）を介して濾過液を除去して
ハウジングを空にし、その後に弁（Ｅ）を再び閉じる。
【００２９】
濃縮液の収集は、弁（Ｄ）を介して行うが、最初は弁（Ｃ）を開いて重力を利
用し、最後は弁（Ｃ）を閉じて繊維の中に圧縮空気を注入して行う。
用し、最後は弁（Ｃ）を閉じて繊維の中に圧縮空気を注入して行う。
【００３０】
別の一実施例にあっては、初期試料が導入される通路は、外部通路（Ｂ）であ
り、出口試料が抽出される通路は、内部通路（Ａ）である。したがって、微生物
は、繊維とハウジングの間で利用可能な容積内の繊維の外部に蓄積されて濃縮液
を形成し、濾過液は、除去されるべき繊維の内部に沿って通過する。
り、出口試料が抽出される通路は、内部通路（Ａ）である。したがって、微生物
は、繊維とハウジングの間で利用可能な容積内の繊維の外部に蓄積されて濃縮液
を形成し、濾過液は、除去されるべき繊維の内部に沿って通過する。
【００３１】
例えば10ないし100リットルの体積の回収された水の試料からなる処理すべ
き試料は、弁（Ｅ）を介してハウジング内に導入され、蠕動ポンプで行われる吸
引によって低圧を生じさせ、または例えば弁（Ｃ）を閉じたままにして弁（Ｄ）
によって中空の繊維の内部の濾過液側で低圧を生じさせることによって搬送され
る。
き試料は、弁（Ｅ）を介してハウジング内に導入され、蠕動ポンプで行われる吸
引によって低圧を生じさせ、または例えば弁（Ｃ）を閉じたままにして弁（Ｄ）
によって中空の繊維の内部の濾過液側で低圧を生じさせることによって搬送され
る。
【００３２】
処理されるべき全量がモジュールを通過したとき、ポンプを、作動させ続け、
弁（Ｅ）を試料源から遮断し、モジュールのハウジングの中に収容されている濃
縮液の量を減らす。量は、完全に減らしてもあるいは一部を減らしてもよい。
弁（Ｅ）を試料源から遮断し、モジュールのハウジングの中に収容されている濃
縮液の量を減らす。量は、完全に減らしてもあるいは一部を減らしてもよい。
【００３３】
所定の濃縮液の濃度レベルに達したら、ポンプを停止させ、弁（Ｄ）を他のす
べての弁とともに閉じる。
べての弁とともに閉じる。
【００３４】
溶離液をハウジングの中に導入し、次にモジュールを攪拌し、その後に弁（Ｆ
）を介して濃縮液または溶離液を収集し、弁（Ｂ）を介して弁（Ｅ）を介して圧
縮空気を注入して終わることも可能である。
）を介して濃縮液または溶離液を収集し、弁（Ｂ）を介して弁（Ｅ）を介して圧
縮空気を注入して終わることも可能である。
【００３５】
吸着現象を制限するために、繊維を例えばＴＷＥＥＮ２０型洗剤および／また
はＢＳＡ（牛血清アルブミン）型表面活性剤で予め処理しておくこともできる。
はＢＳＡ（牛血清アルブミン）型表面活性剤で予め処理しておくこともできる。
【００３６】
一実施例にあっては、濾過段階（Ｃ）は、分析すべき流体の懸濁物質に応じて
、初期液体試料の事前濾過なしに行うことができる。
、初期液体試料の事前濾過なしに行うことができる。
【００３７】
内部通路（Ａ）を介して導入する方法の場合には、濃縮液の濃度は、濾過手段
の大きさと直接関係する。外部通路（Ｂ）を介して導入する場合には、上記濃縮
液の量は、上記濾過手段の大きさではなく、ハウジングの中に残された量および
／またはハウジングの中に導入された溶離液の量に依存する。
の大きさと直接関係する。外部通路（Ｂ）を介して導入する場合には、上記濃縮
液の量は、上記濾過手段の大きさではなく、ハウジングの中に残された量および
／またはハウジングの中に導入された溶離液の量に依存する。
【００３８】
濾過手段は、濾過時間を二十分と一時間の間として、初期試料の量と得られる
濃縮液の量の比が、少なくとも50に等しく、好ましくは150と500の間になるよう
な大きさとされる。
濃縮液の量の比が、少なくとも50に等しく、好ましくは150と500の間になるよう
な大きさとされる。
【００３９】
用途によって許される場合には、モジュールは、逆流洗浄した後または例えば
酵素の処理に用いられるような50 ppm塩素溶液などの浄化剤で処理した後、再使
用することができる。
酵素の処理に用いられるような50 ppm塩素溶液などの浄化剤で処理した後、再使
用することができる。
【００４０】
逆流洗浄するために使用できる方法は、試料が内部通路（Ａ）または外部通路
（Ｂ）のいずれを介して導入されるかに応じて二つあり、洗浄水は、分析用試料
導入の流れに抗して導入される。
（Ｂ）のいずれを介して導入されるかに応じて二つあり、洗浄水は、分析用試料
導入の流れに抗して導入される。
【００４１】
試料が導入される通路が、弁（Ｃ）を通る内部通路（Ａ）である場合には、逆
流を浴びせることは、水の供給源と弁（Ｆ）の間に配置された蠕動ポンプなどの
給水手段を用い、上記弁を介して本管の水を導入することによって行われる。こ
の場合、弁（Ｄ）は、閉じられ、弁（Ｅ）は、一時的に開いたままにしておく。
流を浴びせることは、水の供給源と弁（Ｆ）の間に配置された蠕動ポンプなどの
給水手段を用い、上記弁を介して本管の水を導入することによって行われる。こ
の場合、弁（Ｄ）は、閉じられ、弁（Ｅ）は、一時的に開いたままにしておく。
【００４２】
ハウジングが一杯になって、弁（Ｅ）を閉じると、水は、強制的に繊維の内部
に沿って流され、弁（Ｃ）または（Ｄ）を通って流れていくことになる。
に沿って流され、弁（Ｃ）または（Ｄ）を通って流れていくことになる。
【００４３】
試料が導入される通路が、外部通路（Ｂ）である場合には、逆流洗浄すること
は、弁（Ｄ）を介して本管の水を導入することによって行われる。この場合、弁
（Ｅ）および（Ｆ）は、閉じられる。
は、弁（Ｄ）を介して本管の水を導入することによって行われる。この場合、弁
（Ｅ）および（Ｆ）は、閉じられる。
【００４４】
繊維が水で一杯になったら、すなわち、弁（Ｃ）から流れる水の中に気泡が見
られないようになったら、この弁を閉じて、水を、強制的にハウジングの中の繊
維の外部をまわって流し、弁（Ｅ）または弁（Ｆ）を通って流れていくことにな
る。
られないようになったら、この弁を閉じて、水を、強制的にハウジングの中の繊
維の外部をまわって流し、弁（Ｅ）または弁（Ｆ）を通って流れていくことにな
る。
【００４５】
モジュールは、一回のみ使用するものと想定されている。さらに、最初に、例
えばガンマ線殺菌処理によってモジュールを消毒することが想定されている。
えばガンマ線殺菌処理によってモジュールを消毒することが想定されている。
【００４６】
他の一実施例にあっては、シールの必要のないモジュールを使用することがで
きる。それによって、外部の汚染（例えば周囲の空気などモジュール外部の流体
による）の危険を避けることができ、また、汚染物質がシールを横切って濃縮液
から濾過液に入り込むのを避けることができる。密閉は、図１に示すように、繊
維の両端をそれぞれ樹脂の中に埋め込み、いかなる汚染物質も漏れ出すのを防ぐ
ようにして行う。シールのあるモジュールでは、このようなことができない。
きる。それによって、外部の汚染（例えば周囲の空気などモジュール外部の流体
による）の危険を避けることができ、また、汚染物質がシールを横切って濃縮液
から濾過液に入り込むのを避けることができる。密閉は、図１に示すように、繊
維の両端をそれぞれ樹脂の中に埋め込み、いかなる汚染物質も漏れ出すのを防ぐ
ようにして行う。シールのあるモジュールでは、このようなことができない。
【００４７】
他の一実施例にあっては、採用する分析方法で使用できる量の濃縮液を得るた
めに、得られた濃縮液に第二の濃縮工程を施す。
めに、得られた濃縮液に第二の濃縮工程を施す。
【００４８】
この第二の濃縮工程では、使用する濾過手段は第一の濃縮工程で使用されるも
のと同じ構成のものでもよいが、濃縮液の初期の量と所定量の間の比にもとづい
て計算されたよりも、少ない量のものとする。
のと同じ構成のものでもよいが、濃縮液の初期の量と所定量の間の比にもとづい
て計算されたよりも、少ない量のものとする。
【００４９】
処理される量が、1 mlの百分の一程度であるので、例えばミリポア社からセン
トリコン−プラス８０の商品名で市販されている装置など遠心分離法を用いた濾
過装置などの公知の手段を使用することができる。
トリコン−プラス８０の商品名で市販されている装置など遠心分離法を用いた濾
過装置などの公知の手段を使用することができる。
【００５０】
これらの濾過手段では、初期試料量と最終試料量の間の比が、少なくとも5000
に等しく、好ましくは15,000から100,000の間となるように、その大きさおよび
処理時間が選ばれる。
に等しく、好ましくは15,000から100,000の間となるように、その大きさおよび
処理時間が選ばれる。
【００５１】
したがって、本発明にもとづく濾過手段を使用すれば、多重収集および多量の
分析用液体中に存在する微生物の100％に近い収量が可能となり、微生物の生存
能力を保障し、長くとも一時間程度の時間でこの多重収集を行うことができ、例
えば連続健康監視のための要件を満たし、とくに免疫検定法や分子生物学的手法
などの生化学的、または生物学的分析方法で使用することが可能な量の分析用濃
縮液を得ることができるなどの効果が得られる。
分析用液体中に存在する微生物の100％に近い収量が可能となり、微生物の生存
能力を保障し、長くとも一時間程度の時間でこの多重収集を行うことができ、例
えば連続健康監視のための要件を満たし、とくに免疫検定法や分子生物学的手法
などの生化学的、または生物学的分析方法で使用することが可能な量の分析用濃
縮液を得ることができるなどの効果が得られる。
【００５２】
以下、例によって本発明にもとづく濾過手段の使用を説明するが、本発明の範
囲が、これらの例によって限定されるものではない。
囲が、これらの例によって限定されるものではない。
【００５３】
例１
器具および方法
中空の酢酸セルロース繊維でつくられた濾過面積1 m2濾過手段を使用する。
【００５４】
ＭＳ２バクテリオファージでドーピングした本管の水50リットルからなる試料
を、内部通路を介して導入する。
を、内部通路を介して導入する。
【００５５】
濃縮液は、重力および圧力を利用して収集する。
【００５６】
濃縮液を、バクテリオファージの生存能力および感染能力の双方を定量的に（
試料の順次10倍希釈の後）または性質的に（ＭＳ２感応性培養バクテリアの感染
による生物学的拡大）も測定するリーシス・プラーク法を用いて分析する。
試料の順次10倍希釈の後）または性質的に（ＭＳ２感応性培養バクテリアの感染
による生物学的拡大）も測定するリーシス・プラーク法を用いて分析する。
【００５７】
順序
水道水の試料のドーピングおよびタンク内への回収に先立って、接種材料を超
音波で処理し、ウイルスの粒子を分解した。
音波で処理し、ウイルスの粒子を分解した。
【００５８】
チオ硫酸ナトリウム20mg/ｌ（ＴＭ（Merck 106516））、すなわち50ｌに1g、
を加えた後、試料をＭＳ２でドーピングした。
を加えた後、試料をＭＳ２でドーピングした。
【００５９】
濾過を一回行い、次にハウジングを空にし、密閉し、空気圧（0.5 b）のもと
に置いた。次に、重力を用いて濃縮液を収集する。次に、圧縮空気（0.5 b）を
繊維の中に注入して繊維の中に残っていた濃縮液の最後の数ミリリットルまで収
集する。
に置いた。次に、重力を用いて濃縮液を収集する。次に、圧縮空気（0.5 b）を
繊維の中に注入して繊維の中に残っていた濃縮液の最後の数ミリリットルまで収
集する。
【００６０】
濃縮液を予め超音波で処理し、大腸菌（E Coli）感応性リーシス・プラーク技
術を用いて計算を行った。
術を用いて計算を行った。
【００６１】
接種材料の調製
ＳＰＷ ＝ 塩ペプトン水
ＰＦＵ ＝ 斑（プラーク）形成単位（感染性ウイルス単位）
Ｉ10x ＝ ｍｌあたり10x のＰＦＵを含む接種材料
【００６２】
濾過
ＳＴＳで中和した水道水50リットルを濾過し、ハウジングを空にした後、一つ
のブランク＝ブランク１（Ｂ１）を構成する濃縮液を収集する。
のブランク＝ブランク１（Ｂ１）を構成する濃縮液を収集する。
【００６３】
膜を逆流洗浄した後、ＳＴＳで中和した水道水50リットルを濾過し、ハウジン
グを空にした後、一つのブランク＝ブランク２（Ｂ２）を構成する濃縮液を収集
した。膜を逆流洗浄した後、水道水50リットルをＳＴＳで中和する。
グを空にした後、一つのブランク＝ブランク２（Ｂ２）を構成する濃縮液を収集
した。膜を逆流洗浄した後、水道水50リットルをＳＴＳで中和する。
【００６４】
15分間待機した後、1リットルを引き出してタンク用の接種材料を希釈する。
【００６５】
1リットルに希釈したＩ10（10ＰＦＵ）1 mｌを用いてドーピングを行う。
【００６６】
一回の濾過の後、濃縮液を収集する（Ｃ10）。
【００６７】
逆流洗浄を行う。
【００６８】
この例では、逆流洗浄は、少なくとも20リットルの水で行う。
【００６９】
上の順序を繰り返し、Ｉ104（104ＰＦＵ）1 mｌでドーピングする。濾過の間
の濾過液の試料の回収によって、試料（Ｆ）が得られた。濾過の終わりに、濃縮
液を収集する（Ｃ104）。
の濾過液の試料の回収によって、試料（Ｆ）が得られた。濾過の終わりに、濃縮
液を収集する（Ｃ104）。
【００７０】
Ｂ１の100mｌをＩ104（104ＰＦＵ）でドーピングすることによって、ドーピン
グしたブランク・コントロール試料（ＢＤ104）を得る。
グしたブランク・コントロール試料（ＢＤ104）を得る。
【００７１】
分析
― Ｉ100、Ｉ10、Ｉ1、Ｃ104、ＢＤ104の定量滴定。
【００７２】
各純粋な試料のアリコート（一部）と接種材料を試験管の中にいれ、希釈を行
う前に超音波で処理する。
う前に超音波で処理する。
【００７３】
リーシス・プラーク技術（lysis plaque technique）を用い、以下の順序で感
染性粒子の数を数える。
染性粒子の数を数える。
【００７４】
融解した（44℃）柔らかいトップ・アガール（寒天）（Top Agar）（0.95％
）2mｌをウイルス懸濁液1mｌおよび指数増殖期の培養物E.coli Hfr 0.3mｌと混
ぜ合わせた。これらの組み合わせは、手早くしかも静かに混ぜ合わせた後、ペト
リ皿の中の栄養素を含む硬い寒天の全表面に上に注ぐ。37℃で培養した後、翌日
にリーシス・プラークを読み取る。
）2mｌをウイルス懸濁液1mｌおよび指数増殖期の培養物E.coli Hfr 0.3mｌと混
ぜ合わせた。これらの組み合わせは、手早くしかも静かに混ぜ合わせた後、ペト
リ皿の中の栄養素を含む硬い寒天の全表面に上に注ぐ。37℃で培養した後、翌日
にリーシス・プラークを読み取る。
【００７５】
得られた結果
【００７６】
例えば、Ｃ104 10-1は、104ＰＦＵでドーピングした試料から得られた濃縮液
の1/10の希釈液を指す。
の1/10の希釈液を指す。
【００７７】
【００７８】定性試験
Ｉ104（正のコントロール＝Ｔ+）、Ｆ（1 50mｌ 試料）、Ｂ２（6×50 mｌ
＋ 全試料を覆うための残量）、 Ｃ10（6×50 mｌ ＋ 全試料を覆うため
の残量）上でのファージの存在または不在の検出。
＋ 全試料を覆うための残量）、 Ｃ10（6×50 mｌ ＋ 全試料を覆うため
の残量）上でのファージの存在または不在の検出。
【００７９】
試料一分量を二倍に濃縮した栄養素の液体培地と混ぜ合わせた。37℃で30分間
培養した後、指数増殖期の培養物E.coli Hfrを接種した。37℃で一晩培養した後
（ウイルス増殖期）、指数培養物E.coli Hfrをすべてペトリ皿の中の栄養素の寒
天の上に塗り付け、乾燥させた。ウイルス拡大液体培地の滴を入れ、37℃で少な
くとも６時間培養する。
培養した後、指数増殖期の培養物E.coli Hfrを接種した。37℃で一晩培養した後
（ウイルス増殖期）、指数培養物E.coli Hfrをすべてペトリ皿の中の栄養素の寒
天の上に塗り付け、乾燥させた。ウイルス拡大液体培地の滴を入れ、37℃で少な
くとも６時間培養する。
【００８０】
滴を入れたポイントでリーシス・プラークの多少の融合が生じることによって
、感染性粒子の存在が明らかとなる。
、感染性粒子の存在が明らかとなる。
【００８１】
感染性粒子が存在しない場合には、E.coli Hfrの成長によって、滴を沈殿した
場所で細胞の厚い層が生成される。
場所で細胞の厚い層が生成される。
【００８２】
Ｎ＝陰性； Ｐ＝陽性； ｎａ＝適用不能
【００８３】
結果の解釈
ブランク（Ｂ２）は、感染性のバクテリオファージを含んでいない。したがっ
て、モジュールは、事前にＭＳ２で汚染されておらず、後で行われた10ＰＦＵの
濃縮は、有効である。
て、モジュールは、事前にＭＳ２で汚染されておらず、後で行われた10ＰＦＵの
濃縮は、有効である。
【００８４】
104ＰＦＵの濃縮中に採取された濾過液の試料（50ml）は、検出可能なＭＳ２
を含んでいない。したがって、膜は、直径25nmのこのウイルスを効果的に保持す
る。
を含んでいない。したがって、膜は、直径25nmのこのウイルスを効果的に保持す
る。
【００８５】
Ｃ10の中で四つの感染性の単位が検出された。したがって、検出閾値は、10Ｐ
ＦＵよりも低い。
ＦＵよりも低い。
【００８６】
実際の収量（すなわち、接種材料の測定タイター：C/Iに関係する）は、特定
の収集方法がない場合（攪拌なし、溶離なし）には104ＰＦＵのドーピングに関
して60％である。これは、測定が、バクテリオファージの感染性に関するもので
あるために、生存能力を考慮したものである。
の収集方法がない場合（攪拌なし、溶離なし）には104ＰＦＵのドーピングに関
して60％である。これは、測定が、バクテリオファージの感染性に関するもので
あるために、生存能力を考慮したものである。
【００８７】
比率Ｃ／ＢＤは、実際の収量にきわめて近い。このことは、濃縮液による干渉
がないことを示している。
がないことを示している。
【００８８】
例２
器具および方法
中空の酢酸セルロース繊維でつくられた濾過面積0.6m2の濾過手段を使用する
。
。
【００８９】
寄生虫クリプトスポリジウム・パルヴムの接合子嚢でドーピングした本管の水
50リットルからなる試料を、外部通路を介して導入する。
50リットルからなる試料を、外部通路を介して導入する。
【００９０】
濃縮液は、重力および圧力を利用した攪拌および収集によって収集する。
ダイナル抗リプトスポリジウム・ダイナビーズ・キット、ref.730.01（接合子
嚢の一体性の尊重）を用いたＩＭＳ−ＩＦＡ：免疫磁気分離 − 免疫蛍光検定法
（米国環境保護庁出版の規格法1622 - EPA-EPA-821-R-99-001参照のこと）を使
用して分析を行う。
嚢の一体性の尊重）を用いたＩＭＳ−ＩＦＡ：免疫磁気分離 − 免疫蛍光検定法
（米国環境保護庁出版の規格法1622 - EPA-EPA-821-R-99-001参照のこと）を使
用して分析を行う。
【００９１】
順序
水道水をタンク内に入れ、チオ硫酸ナトリウム20mg/ｌ（ＳＴＳ（Merck 10651
6））、すなわち50ｌに1g、を加える。
6））、すなわち50ｌに1g、を加える。
【００９２】
試料をC・parvumの接合子嚢でドーピングする。
【００９３】
ハウジングを部分的に空にし、モジュールを攪拌してハウジング内に残された
液体の力で繊維の外表面上のすべての接合子嚢を収集した後、重力を用い、次に
圧縮空気（0.5 b）をハウジングの中に注入して濃縮液を収集する。
液体の力で繊維の外表面上のすべての接合子嚢を収集した後、重力を用い、次に
圧縮空気（0.5 b）をハウジングの中に注入して濃縮液を収集する。
【００９４】
ＩＭＳ−ＩＦＡを用いて接合子嚢のストックおよび濃縮液のストックの計算を
行う。
行う。
【００９５】
濾過
方法
ＳＴＳで中和した水道水50リットルを濾過し、ハウジングを空にした後、一つ
のブランク（Ｂ１）を構成する濃縮液を収集した。この濾過の後に、膜を逆流洗
浄する。
のブランク（Ｂ１）を構成する濃縮液を収集した。この濾過の後に、膜を逆流洗
浄する。
【００９６】
次に、水道水50リットルをＳＴＳで中和し、さらに接合子嚢のストック（すな
わち約10の接合子嚢）のＩ10希釈液でドーピングする。
わち約10の接合子嚢）のＩ10希釈液でドーピングする。
【００９７】
濾過の後、ハウジングを空にし、濃縮液を収集した。（Ｃ10）15分待機した後
、1リットルを引き出してタンク用の接種材料を希釈する。
、1リットルを引き出してタンク用の接種材料を希釈する。
【００９８】
1リットルに希釈したＩ10（10ＰＦＵ）1mｌを用いてドーピングする。
【００９９】
一回の濾過の後、濃縮液を収集する（Ｃ10）。
【０１００】
この濾過の後、少なくとも10リットルの水で逆流洗浄する。
【０１０１】
上の順序を繰り返し、Ｉ100（約100の接合子嚢）でドーピングを行い、濃縮液
Ｃ100を生成し、次にＩ1000（約1000の接合子嚢）でドーピングを行って濃縮液
Ｃ1000を得る。
Ｃ100を生成し、次にＩ1000（約1000の接合子嚢）でドーピングを行って濃縮液
Ｃ1000を得る。
【０１０２】
分析
― ＩＭＳ−ＩＦＡを用いたＩ10、Ｉ100、Ｉ1000、Ｂ，Ｃ10、Ｃ100、Ｃ1000
の計算。
の計算。
【０１０３】
結果
【０１０４】
接種材料に関する測定値よりも高いＣ10およびＣ100に関する結果は、驚くに
はあたらない。顕微鏡での接合子嚢を計算するためのサンプリングは、同一の試
料から得られた計算値を乗算してみるとわかるように、必然的に変動をともなう
ものである。この現象は、接合子嚢が稀な場合により顕著になる。
はあたらない。顕微鏡での接合子嚢を計算するためのサンプリングは、同一の試
料から得られた計算値を乗算してみるとわかるように、必然的に変動をともなう
ものである。この現象は、接合子嚢が稀な場合により顕著になる。
【０１０５】
したがって、Ｃ10およびＣ100に関しては、濾過の後の値の大きさが一定であ
ると考えるべきである。
ると考えるべきである。
【０１０６】
Ｃ1000に関しては、収量を議論することができる。
【０１０７】
結果の解釈
外部通路による濾過法は、接合子嚢100以下の感度を有する。
接合子嚢1000の接種材料では、得られる収量は、最適化なしで70％である。
【０１０８】
例３
用いた順序および方法は、濾過手段を除いて例１で用いたものと同じである。
【０１０９】
中空の酢酸セルロース繊維でつくられた濾過面積0.6m2の濾過手段を使用して
濾過を行う。
濾過を行う。
【０１１０】
試料は、ＭＳ２バクテリオファージでドーピングした本管の水50リットルから
なるものである。上記試料を、内部通路（Ａ）を介して導入する。
なるものである。上記試料を、内部通路（Ａ）を介して導入する。
【０１１１】
濃縮液は、重力および圧力を利用して収集する。
【０１１２】
ブランク（Ｂ１）を一つだけを作製し、1，10、100ＰＦＵで連続してドーピン
グを行う。
グを行う。
【０１１３】
例１の場合と同様に、分析は、リーシス・プラーク技術によって行った。
【０１１４】
上に述べた濾過作業で得られた濃縮液を濾過する第二の工程を以下に述べる順
序で行った。
序で行った。
【０１１５】
ブランク（Ｂ１）濃縮液および各ファージ濃縮液（Ｃ１1、Ｃ１10、Ｃ１100）
、すなわち各約230mｌ、をそれぞれ三つの等しい部分（70-80mｌ）に分け、三つの
市販のセントリコン−プラス80モジュール（ミリポア ref. UFC5LGC08）で第二
回目の濃縮液を行う。
、すなわち各約230mｌ、をそれぞれ三つの等しい部分（70-80mｌ）に分け、三つの
市販のセントリコン−プラス80モジュール（ミリポア ref. UFC5LGC08）で第二
回目の濃縮液を行う。
【０１１６】
このようにして得られた各ドーピング用の三つの濃縮液Ｃ２（＜1mｌ）を混ぜ
合わせ、リーシス・プラークによる定量滴定で分析した。濃縮液Ｂ１から得た三
つのブランク（Ｂ２）に関しても、同じ順序で行った。
合わせ、リーシス・プラークによる定量滴定で分析した。濃縮液Ｂ１から得た三
つのブランク（Ｂ２）に関しても、同じ順序で行った。
【０１１７】
結果
− 接種材料の滴定： Ｉ100 ＝ 144ＰＦＵ（例１と同様に全平均）；
− 第二回目の濾過の後に得られた濃縮液の滴定；
【０１１８】
例えば、Ｃ１1は、1ＰＦＵでドーピングした初期試料を濃縮する第二の工程の
終わりで得られた三つの濃縮液の混合物を指す。
終わりで得られた三つの濃縮液の混合物を指す。
【０１１９】
結果の解釈
まとめて行った二つの濃縮工程によって、50リットルの試料の量が3mｌ以下に
減少した。感応性は、1ＰＦＵに近かった。
減少した。感応性は、1ＰＦＵに近かった。
【０１２０】
もちろん、本発明は、ここで図面および図表を参照して説明する実施例に限定
されるものではなく、添付の特許請求の範囲に入るすべての他の実施例を含むも
のである（とくに、試料を濃縮するために用いられる膜の性質および特徴に関し
て）。
されるものではなく、添付の特許請求の範囲に入るすべての他の実施例を含むも
のである（とくに、試料を濃縮するために用いられる膜の性質および特徴に関し
て）。
【０１２１】
例４
器具および方法
第一の濾過段階のためには中空の酢酸セルロース繊維でつくられた0.12m2の濾
過手段を使用し、第二の濾過段階のためには使い捨てのVivace1170（サートリア
ス・ヴィヴァサイエンシス ref. VS6002）を使用する。
過手段を使用し、第二の濾過段階のためには使い捨てのVivace1170（サートリア
ス・ヴィヴァサイエンシス ref. VS6002）を使用する。
【０１２２】
試料は、寄生虫クリプトスポリジウム・パルヴムの300の接合子嚢および大腸
菌の300のＣＦＵで同時にドーピングした30リットルの本管の水で作製する。
菌の300のＣＦＵで同時にドーピングした30リットルの本管の水で作製する。
【０１２３】
濃縮
水道水をタンク内に入れ、チオ硫酸ナトリウム20mg/ｌ（Merck 106516）、す
なわち30ｌに0.6ｇ、を加える。
なわち30ｌに0.6ｇ、を加える。
【０１２４】
試料をC.parvumE.Coli細胞の接合子嚢でドーピングする。
【０１２５】
段階1： 30リットルから70mｌへ
外路通路を使用して濾過を行った。
【０１２６】
ハウジングを部分的に空にし、モジュールを攪拌した後、圧縮空気（0.5 b
）をハウジングの中に注入して微生物を含む滞留液約35mｌを収集した。
）をハウジングの中に注入して微生物を含む滞留液約35mｌを収集した。
【０１２７】
閉じられた内部コンパートメントの中にドーピングされていない中和された本
管の水を注入によって繊維を通してハウジング内に再導入し（約35mｌ）、前と
同じように攪拌と収集を行う。
管の水を注入によって繊維を通してハウジング内に再導入し（約35mｌ）、前と
同じように攪拌と収集を行う。
【０１２８】
二つの収集された試料の化合物70mｌが、滞留物Ｒ１を構成した。
【０１２９】
段階２： 70mｌから300マイクロリットルへ
使い捨てVivace1170の中で、滞留物Ｒ１に供給業者の指示通りに25℃で1000Ｇ
の遠心力を10分間加えて濃縮を行った。収集効果を改善するため、濾過室内で1m
ｌの濾過液を濃縮液に加え、次に濾過要素を高速で短時間「渦巻かせた」。以前
と同じ条件下でさらに遠心作業を行った結果、最大で300マイクロリットルまで
再濃縮することができた。これによって、最終滞留物Ｒ２が生成された。
の遠心力を10分間加えて濃縮を行った。収集効果を改善するため、濾過室内で1m
ｌの濾過液を濃縮液に加え、次に濾過要素を高速で短時間「渦巻かせた」。以前
と同じ条件下でさらに遠心作業を行った結果、最大で300マイクロリットルまで
再濃縮することができた。これによって、最終滞留物Ｒ２が生成された。
【０１３０】
三回このような結果を得て三つの滞留物Ｒ２を並行的に生成した。
【０１３１】
分析：
Ｃ．ｐａｒｖｕｍの探索
接合子嚢のストックおよび滞留物の一部を、ＩＭＳ（免疫磁気分離 − ダイ
ナル抗リプトスポリジウム・ダイナビーズ・キット、ref.730.01）およびそれに
続くＩＦＡ（免疫蛍光検定）で計算した（方法1622参照）。
ナル抗リプトスポリジウム・ダイナビーズ・キット、ref.730.01）およびそれに
続くＩＦＡ（免疫蛍光検定）で計算した（方法1622参照）。
【０１３２】
滞留物の一部を、下記の順序で、ＩＭＳ（上を参照のこと）およびそれに続く
ＰＣＲで分析した。
ＰＣＲで分析した。
【０１３３】
− ＩＭＳからビーズ／接合子嚢の複合物を10μｌの超純無菌水＋10μｌの水
中50％ Chelex 100の中に取り込んだ。 − 95℃で2分間 ／ −80℃で2分間の熱ショックを5回あたえた。 − 遠心によって濃縮液ペレットにした。 − 増幅ミックス（ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、牛の血清アルブミン：
10pg/μｌ、dNTP：200pモル／μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：50U、プライ
マーＢＢ−３およびＢＢ−４：各1pモル/μｌ、超純水を加えて50μｌとしたもの ）30μｌを加えた。
中50％ Chelex 100の中に取り込んだ。 − 95℃で2分間 ／ −80℃で2分間の熱ショックを5回あたえた。 − 遠心によって濃縮液ペレットにした。 − 増幅ミックス（ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、牛の血清アルブミン：
10pg/μｌ、dNTP：200pモル／μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：50U、プライ
マーＢＢ−３およびＢＢ−４：各1pモル/μｌ、超純水を加えて50μｌとしたもの ）30μｌを加えた。
【０１３４】
プライマーＢＢ−３およびＢＢ−４は、Balatbat A.B.他、J.Clin.Microbiol.
1996,34,1769-1772に記載されている。
1996,34,1769-1772に記載されている。
【０１３５】
− 次のようなＰＣＲプログラムを行う： 94℃で5分間、［94℃で30秒澗、6
0℃で45秒間、72℃で1分間］を40サイクル、次に72℃で5分間。 − 臭化エチジウムの存在下で2％のアガローゼを含む電気泳動ゲル上でＰＣ
Ｒ反応物10μｌを泳動させる。
0℃で45秒間、72℃で1分間］を40サイクル、次に72℃で5分間。 − 臭化エチジウムの存在下で2％のアガローゼを含む電気泳動ゲル上でＰＣ
Ｒ反応物10μｌを泳動させる。
【０１３６】
Ｅ．ｃｏｌｉの探索
培養物E.coliと滞留物の一部を「コリラート１８ｈ」法を用い、ＩＤＥＸＸの
供給業者の勧告にしたがって計算した。この方法は、大腸菌のベータ−グルクロ
ニダーゼの活動の検出をベースにしたものである。
供給業者の勧告にしたがって計算した。この方法は、大腸菌のベータ−グルクロ
ニダーゼの活動の検出をベースにしたものである。
【０１３７】
以下の順序で、ベータ−グルクロニダーゼに関する遺伝情報を指定したｕｉｄ
Ａ遺伝子に対して行った入れ子式ＰＣＲによって滞留物の一部を分析する。
Ａ遺伝子に対して行った入れ子式ＰＣＲによって滞留物の一部を分析する。
【０１３８】
− 濃縮液の一部を膜で濾過する（ミリポア、直径13mm、デュラポアＧＶＷＰ
０１３ ００による孔0.2μm）。 − 上記膜を0.2mｌのＰＣＲ管の中に挿入する。 − 熱ショックによって細胞をライズ（lyze）させる。（85℃ 1分間／氷 1
分間 を6サイクル） − プライマーＵ２７０およびＬ１０５４を用いたリーシス管の中での最初の
増幅。 Ｕ２７０： ５‘−ｇｇＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＴＡ Ｃｇｇ ＣＡＡ Ａ
ｇ−３’ Ｌ１０５４： ５‘−ＴＴＡ ＡＡｇ ＣＣｇ ＡＣＡ ｇＣＡ ｇＣＡ
ｇＴ−３’
０１３ ００による孔0.2μm）。 − 上記膜を0.2mｌのＰＣＲ管の中に挿入する。 − 熱ショックによって細胞をライズ（lyze）させる。（85℃ 1分間／氷 1
分間 を6サイクル） − プライマーＵ２７０およびＬ１０５４を用いたリーシス管の中での最初の
増幅。 Ｕ２７０： ５‘−ｇｇＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＴＡ Ｃｇｇ ＣＡＡ Ａ
ｇ−３’ Ｌ１０５４： ５‘−ＴＴＡ ＡＡｇ ＣＣｇ ＡＣＡ ｇＣＡ ｇＣＡ
ｇＴ−３’
【０１３９】
膜を入れたＰＣＲ管の中に配置された増幅ミックス（Amplification mix）
（150μｌ）： ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、ｄＮＴＰ：200pモル/μｌ、Ｔ ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：1.5Ｕ、プライマー：各1pモル/μｌ、超純水を加えて 150μｌとしたもの。
（150μｌ）： ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、ｄＮＴＰ：200pモル/μｌ、Ｔ ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：1.5Ｕ、プライマー：各1pモル/μｌ、超純水を加えて 150μｌとしたもの。
【０１４０】
ＰＣＲプログラム： 95℃で10分間、［94℃で1分間、60℃で1分間］を30サ
イクル、次に4℃に保持。
イクル、次に4℃に保持。
【０１４１】
− 得られたアンプリコン（amplicons）を超純水で100倍に希釈し、この希釈
液1μｌをプライマーＶａｌ７５４およびＶａｌ９００とともに第二回の増幅用
の基質として使用する（入れ子式ＰＣＲとして公知）。 Ｖａｌ７５４： ５‘−ＡＡＡ ＡＣｇ ｇＣＡ ＡｇＡ ＡＡＡ ＡｇＣ Ａ
ｇ−３ Ｖａｌ９００： ５‘Ａｃｇ ＣｇＴ ｇｇＴ ＴＡＣ ＡｇＴ ＣＣＴ ｇＣ
ｇ−３’
液1μｌをプライマーＶａｌ７５４およびＶａｌ９００とともに第二回の増幅用
の基質として使用する（入れ子式ＰＣＲとして公知）。 Ｖａｌ７５４： ５‘−ＡＡＡ ＡＣｇ ｇＣＡ ＡｇＡ ＡＡＡ ＡｇＣ Ａ
ｇ−３ Ｖａｌ９００： ５‘Ａｃｇ ＣｇＴ ｇｇＴ ＴＡＣ ＡｇＴ ＣＣＴ ｇＣ
ｇ−３’
【０１４２】
新しい管の中に配置された増幅ミックス（50μｌ）： ＰＣＲバッファー、Mg
Cl2：1.5mM、ｄＮＴＰ：200pモル/μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：0.5Ｕ、プ ライマー：各1pモル/μｌ、超純水を加えて50μｌとしたもの。
Cl2：1.5mM、ｄＮＴＰ：200pモル/μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：0.5Ｕ、プ ライマー：各1pモル/μｌ、超純水を加えて50μｌとしたもの。
【０１４３】
ＰＣＲプログラムは、前と同じ。
【０１４４】
− 臭化エチジウムの存在下で2％のアガローゼを含む電気泳動ゲル上でＰＣＲ
反応物10μｌを泳動させる。
反応物10μｌを泳動させる。
【０１４５】
滞留物Ｒ２の処理
滞留物を各100マイクロリットルの三つの部分：Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃに分
割する。
割する。
【０１４６】
部分Ｒ２ａをさらに二つに分割した：その50μｌを、「コリラート１８ｈ」法
（E.coli計算）を用いて処理し、他の50μｌをＩＭＳ−ＩＦＡ（C.parvum計算用
）で処理した。
（E.coli計算）を用いて処理し、他の50μｌをＩＭＳ−ＩＦＡ（C.parvum計算用
）で処理した。
【０１４７】
部分Ｒ２ｂをｕｉｄＡ入れ子式ＰＣＲ（E.coliの分子検出）で分析したが、そ
の前に二つに分割した：その50μｌを、直接分析し、他の50μｌにはE.coli遺伝
子ＤＮＡを添加した（抑制試験）。
の前に二つに分割した：その50μｌを、直接分析し、他の50μｌにはE.coli遺伝
子ＤＮＡを添加した（抑制試験）。
【０１４８】
Ｒ２ｃをＩＭＳ−ＩＦＡ（C.parvumの分子検出）で分析したが、その前に二つ
に分割した：その50μｌを、直接分析し、他の50μｌにはC.parvum遺伝子ＤＮＡ
を添加する（抑制試験）。
に分割した：その50μｌを、直接分析し、他の50μｌにはC.parvum遺伝子ＤＮＡ
を添加する（抑制試験）。
【０１４９】
ＰＣＲは、各々が、陰性のコントロール（標的ＤＮＡなし、滞留物なし）およ
び陽性のコントロール（標的ＤＮＡあり、滞留物なし）を有する。
び陽性のコントロール（標的ＤＮＡあり、滞留物なし）を有する。
【０１５０】
アンプリコン（amplicons）は、すべて、臭化エチジウムの存在下、アガロー
ゼ・ゲルの上で電気泳動によって観察される。
ゼ・ゲルの上で電気泳動によって観察される。
【０１５１】
結果
各地点は、三回再生成された。下の表では、繰り返しで得られた結果は、記号
「／」で分けて示されている。
「／」で分けて示されている。
【０１５２】
【０１５３】
結果の解釈
濃縮液中でコリラートによって検出されたE.coliの細胞の数が少ないのは、こ
の試験が酵素の活動の検出をベースにしたものであるため、濃縮中にバクテリア
が経験したストレスあるいは死亡によるものと説明できる。
の試験が酵素の活動の検出をベースにしたものであるため、濃縮中にバクテリア
が経験したストレスあるいは死亡によるものと説明できる。
【０１５４】
ｕｉｄＡ ＰＣＲは、三回の繰り返しで陽性であった。このことは、5リット
ルの中の50のバクテリア、すなわち1リットルあたり5のバクテリアが、全体とし
てこの方法を繰り返しても感応性を保持していることを示している。
ルの中の50のバクテリア、すなわち1リットルあたり5のバクテリアが、全体とし
てこの方法を繰り返しても感応性を保持していることを示している。
【０１５５】
論理的には、抑制制御のために一部分にバクテリアＤＮＡを付加すると、陽性
の反応が得られる。C.parvumの場合には、個体群法（ＩＭＳ−ＩＦＡ）によって
、理論的予想値より有意に低い計算が得られた。分子生物学にもとづく他の実験
で、10リットル中一つの接合子嚢の収集を繰り返すことができることが示されて
いるので（この特許出願の中には開示されていないデータ）、この場合も、若干
の接合子嚢が、濾過装置の中に保持されずに濃縮中に悪い影響を受けたと考える
ことができる。
の反応が得られる。C.parvumの場合には、個体群法（ＩＭＳ−ＩＦＡ）によって
、理論的予想値より有意に低い計算が得られた。分子生物学にもとづく他の実験
で、10リットル中一つの接合子嚢の収集を繰り返すことができることが示されて
いるので（この特許出願の中には開示されていないデータ）、この場合も、若干
の接合子嚢が、濾過装置の中に保持されずに濃縮中に悪い影響を受けたと考える
ことができる。
【０１５６】
ところで、ＩＭＳ−ＰＣＲは、三回の繰り返しで陽性であった。このことは、
5リットルの中の50のバクテリア、すなわち1リットルあたり5のバクテリアの感
応性がきわめて低いことを示している。
5リットルの中の50のバクテリア、すなわち1リットルあたり5のバクテリアの感
応性がきわめて低いことを示している。
【０１５７】
結論
この例は、二つの工程を一つにまとめた濃縮装置および分子生物学的方法を用
いてバクテリアと寄生虫でドーピングした同じ水の試料を使用することの有効性
を示している。
いてバクテリアと寄生虫でドーピングした同じ水の試料を使用することの有効性
を示している。
２ ハウジング
３ 繊維
３ａ 壁
４ 開口
Ａ 内部通路
Ｂ 外部通路
Ｃ 弁
Ｄ 弁
Ｅ 弁
【図１】
本発明にもとづく濾過手段の縦断面略図である。
【図2】
図１の濾過手段の拡大断面図である。図面中の繊維の大きさは、本発明を理解
しやすくするために、意図的に誇張して拡大されている。
しやすくするために、意図的に誇張して拡大されている。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年４月２日（２００２．４．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｂ０１Ｄ 71/16 Ｂ０１Ｄ 71/16
71/22 71/22
71/42 71/42
Ｃ１２Ｑ 1/24 Ｃ１２Ｑ 1/24
Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｓ
33/48 Ｃ１２Ｍ 3/06
// Ｃ１２Ｍ 3/06 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｊ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ
Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ビユルトー，ステフアンヌ
フランス国 69007 リヨン，リュ サン
ジエロム 22
Ｆターム(参考） 2G045 AA24 BA01 BA13 BB03 BB05
CB25
2G052 AA36 AB16 AD29 AD49 CA03
CA14 CA40 EA02 EA17 ED01
FB00 FC04 FC14 FD01 GA29
JA07
4B063 QA01 QQ05 QS14 QS39
4D006 GA06 HA02 HA04 JA02A
KC03 MA02 MA22 MB05 MC03
MC18 MC19 MC62 PA03 PB24
PC38
Claims (17)
- 【請求項１】 中に複数の中空の繊維（３）が互いに並行に配置され、その各
多孔質の壁（３ａ）は、開口（４）を画定した、ハウジング（２）を有し、上記
中空の繊維の複数の平行な開口（４）からなる内部通路（Ａ）および上記繊維と
上記ハウジングの間で利用可能な容積に対応する外部通路（Ｂ）を有し、希釈状
態で大きさの異なる複数の微生物を含む大量の初期液体試料を処理して、濃縮状
態で同じ組成の微生物を含む少量の最終液体試料を得るために用いられる、濾過
手段の使用において、上記手段が用いられるときには、少なくとも一つの濃縮工
程が行われ、その中では、 （ａ）単一の濾過手段が使用され、 （ｂ）上記濾過手段は、前面モードで使用され、 （ｃ）繊維の多孔質の壁（３ａ）の遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生
物を保持するように不連続に決定され、 （ｄ）濾過段階では、初期液体試料がすべて上記濾過手段の一方の通路（Ａ
，Ｂ）を介して導入され、濾過液は、上記濾過手段の他方の通路を介して除去さ
れ、濃縮液は、液体試料が導入された通路を介して蓄積される、 （ｅ）収集段階では、試料がすべて通過した後、上記一方の通路から上記他
方の通路への上記濾過手段（１）を通る液体試料の通過を停止し、濃縮液から出
口液体試料を得る、 ことを特徴とする濾過手段の使用方法。 - 【請求項２】 上記濾過段階（ｄ）は、初期液体試料の事前濾過なしに行われ
ることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。 - 【請求項３】 上記濾過手段が、超濾過手段であることを特徴とする請求項１
または２に記載の使用方法。 - 【請求項４】 上記濾過手段の繊維は，（例えば酢酸セルロース、エチルセル
ロース、ポリエーテル・スルフォン、またはポリアクリロにトリルなどでつくら
れる）有機膜あるいはセラミックなどの無機膜からなることを特徴とする請求項
１〜３のいずれか一項に記載の使用方法。 - 【請求項５】 上記濾過手段の中空の繊維は、両端がそれぞれ樹脂の中に埋め
込まれ、内部通路（Ａ）と外部通路（Ｂ）との間および、上記濾過手段と外部と
の間を、いかなる汚染物質も通過するのを防ぐことを特徴とする請求項１〜４の
いずれか一項に記載の使用方法。 - 【請求項６】 上記濾過手段の大きさおよび濾過段階の時間は、初期試料の量
と得られる濃縮液の量の比率が、少なくとも50で、好ましくは150と500の間にな
るように定められることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用
方法。 - 【請求項７】 初期試料が導入される通路が、内部通路（Ａ）であり、出口試
料が抽出される通路が、外部通路（Ｂ）であることを特徴とする請求項１〜６の
いずれか一項に記載の使用方法。 - 【請求項８】 初期試料が導入される通路が、外部通路（Ｂ）であり、出口試
料が抽出される通路が、内部通路（Ａ）であることを特徴とする請求項１〜６の
いずれか一項に記載の使用方法。 - 【請求項９】 濾過段階（ｄ）と収集段階（e）の間、外部通路は、空であり
、空気で加圧され得ることを特徴とする請求項７に記載の使用方法。 - 【請求項１０】 上記収集段階（e）は、濃縮液の重力による流れおよび／ま
たは加圧空気の内部通路内への通過によって、行われることを特徴とする請求項
７に記載の使用方法。 - 【請求項１１】 上記濾過段階（d）の間、初期液体試料は、内部通路の入口
への送り出しおよび／または、上記内部通路の出口での吸引によって循環するこ
とを特徴とする請求項７に記載の使用方法。 - 【請求項１２】 上記濾過段階（d）と上記収集段階（e）の間、外部通路は、
部分的または完全に空にされることを特徴とする請求項８に記載の使用方法。 - 【請求項１３】 最終液体試料は、外部通路内での濃縮液溶離によって得られ
ることを特徴とする請求項１２に記載の使用方法。 - 【請求項１４】 逆流洗浄段階の間、微生物のない液体の流れを、上記通路か
ら上記他方の通路へ循環させることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項
に記載の使用方法。 - 【請求項１５】 少なくとも二つの連続する液体試料濃縮工程が行われ、これ
ら二つの工程は、請求項１に記載の濾過手段を使用して行われ、第一の濃縮工程
の終わりに得られた濃縮液が、第二の濃縮工程のための初期液体試料を構成する
ことを特徴とする請求項1〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。 - 【請求項１６】 液体試料に少なくとも二つの連続する処理が行われ、これら
の処理の少なくとも一つは、請求項１に記載の濃縮工程であり、第一の処理の終
わりに得られた濃縮液が、第二の処理のための初期液体試料を構成することを特
徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。 - 【請求項１７】 上記濾過手段の寸法および処理の実施時間は、初期試料の量
と最終試料の量の間の比が、少なくとも5000に等しく、好ましくは15，000から1
00，000の間となるように定められることを特徴とする請求項１５または１６に
記載の使用方法。
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