MXPA06008469A - Sistema diagnostico para llevar a cabo una amplificacion de la secuencia de acidos nucleicos y proceso de la deteccion. - Google Patents
Sistema diagnostico para llevar a cabo una amplificacion de la secuencia de acidos nucleicos y proceso de la deteccion.Info
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Abstract
Se describe un sistema diagnóstico "laboratorio en un chip", integrado para llevar a cabo un proceso de preparación de una muestra en células y/o partículas que contengan una muestra fluida, el sistema consiste en: a) una entrada para una muestra fluida; b) una unidad de lisis para lisar las células y/o partículas contenidas en la muestra fluida; (c) una unidad de extracción de ácidos nucleicos para la extracción de ácidos nucleicos de las células y/o partículas contenidas en la muestra fluida; (d) un reservorio que contiene un fluido para lisis, (e) un reservorio que contiene un eluyente para sacar los ácidos nucleicos recolectados en la unidad de extracción de ácidos nucleicos; en donde la entrada de la muestra está en comunicación hidráulica con la unidad para lisis, estando presente una válvula opcional para regular el paso del fluido entre éstas; en donde la unidad para lisis está en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácidos nucleicos, estando presente una válvula opcional para regular el flujo de fluidos entre éstas; en donde el reservorio que contiene el fluido para la lisis está en comunicación hidráulica con la unidad para la lisis estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre éstos; y en donde el reservorio que contiene el eluyente está en comunicación hidráulica con la unidad para extracción de ácidos nucleicos, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre éstos.
Description
SISTEMA DE DIAGNÓSTICO PARA LLEVAR A CABO UNA AMPLIFICACIÓN DE LA SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y
PROCESO DE DETECCIÓN
La presente invención esta relacionada con la extracción de ácidos nucleicos (AN) , y en particular, con un sistema diagnóstico del tipo laboratorio en un chip, integrado, para llevar a cabo la extracción y concentración de AN combinados. El sistema puede ser utilizado para llevar a cabo una amplificación de las secuencias de AN y el proceso de detección en una muestra fluida que contenga células .
Existe enorme interés en el desarrollo de sistemas de análisis simplificados para la detección de moléculas biológicas que permitan a un usuario no experto 'llevar a cabo procedimientos de análisis complejos sin errores indebidos. Más aún, existe un gran interés en el desarrollo de sistemas de análisis contenidos que requieren mínimo manejo reactivos líquidos y que pueden ser automatizados para permite llevar a cabo el procedimiento de análisis con mínima intervención por parte del usuario, y preferentemente también diminutos para proporcionar un sistema conveniente para el análisis en el lugar de la atención médica. Este hecho es
particularmente importante en el campo de la atención a la salud, especialmente diagnóstico, donde existe una necesidad creciente de sistemas de análisis biológicos que se puedan manejar en una forma eficaz e inocua durante la cirugía de un médico, la clínica, la cirugía veterinaria o incluso en el hogar de los pacientes o en el campo .
Los dispositivos "laboratorio en chip" microfabricados son una opción conveniente para llevar a cabo reacciones biológicas contenidas que requieran mínimo manejo de reactivos por parte del usuario y también permiten el uso de pequeños volúmenes de muestras, una ventaja importante para las reacciones biológicas que requieren reactivos costosos.
Para lograr la purificación y preconcentracion, los químicos analíticos generalmente han recurrido a alguna clase de procedimiento de extracción. Estos métodos consisten en la separación de los analitos que interesan a partir de la matriz de muestras, o de otro modo, separando todas las especies de la matriz de la muestra para dejar atrás los analitos que interesan. Los procesos de extracción pueden involucrar la transferencia de especies de una fase líquida a otra, o la captura de
especies de una fase liquida sobre una superficie sólida. En el primero caso, la concentración previa de una especie generalmente no se logra, a menos que se elimine activamente el disolvente de la fase que contiene esta especie. No obstante, en el último caso, la concentración previa se puede lograr, si: (a) el área de unión disponible es bastante grande para unir más moléculas que estén presentes en la solución en contacto con la superficie en cualquier momento, y (b) las especies pueden ser separadas eficientemente de la fase sólida solo utilizando una cantidad pequeña de eluyente. Puesto que la concentración previa es un aspecto importante del procedimiento de tratamiento previo de la muestra de ácido nucleico, se ha adoptado la extracción "en fase sólida. Un método de extracción de ácidos nucleicos bien establecido involucra la unión del DNA a partículas de sílice en presencia de un agente caotrópico (ver Boom y col., J. Clin. Microbiol. 1990, 28, 945-503). La presente invención consiste en la integración de un método de extracción en fase sólida para DNA en dispositivos para microfluidos .
En la presente invención se puede combinar la extracción de AN y su concentración.
Por el término dispositivo o sistema microfabricado como se utiliza en la presente se entiende cualquier dispositivo fabricado utilizando procesos que normalmente son, pero no exclusivamente, utilizados para la producción en lotes de dispositivos microeletrónicos de semiconductores, y en los últimos años, para la producción de dispositivos micromecánicos semiconductores. Estas técnicas de microfabricación pueden ser, por ejemplo, el crecimiento epitaxial (por ejemplo en fase de vapor, fase liquida, haz molecular, depositación de vapor químico orgánico metálico) , litografía (por ejemplo la fotolitografía, de ases electrónicos, de rayos X, de haz de iones), el grabado (químico, en fase gaseosa, plasma) , electrodepositación, sublimación catódica, impurificación por difusión e implantación iónica. Aunque los materiales no cristalinos como el vidrio se pueden utilizar, los dispositivos microfabricados normalmente se forman sobre sustratos semiconductores cristalinos como silicio o arseniuro de galio, con la ventaja que la circuitería electrónica se puede integrar en el sistema mediante el uso de técnicas de fabricación de circuitos integrados tradicionales. Las combinaciones de un componente microfabricado con uno o más elementos diferentes como la placa de vidrio o un elemento microfabricado complementario frecuentemente se
utilizan y se proponen para entrar dentro del alcance del término microfabricado que se utiliza en la presente. También se propone que entran dentro del alcance del término microfabricados las replicas poliméricas fabricadas de, por ejemplo, sustrato semiconductor cristalino .
La separación y purificación del DNA y/o RNA de células bacterianas y partículas virales es un paso importante en muchas áreas de la técnica como puede ser, por ejemplo, diagnóstico, monitorización ambiental, medicina forense e investigación de la biología molecular .
La microfabricación es un método de construcción atractivo para producir dispositivos para llevar a cabo procesos biológicos para los cuales se desean volúmenes de muestra muy pequeños, como puede ser el análisis y detección de la secuencia de DNA.
ün dispositivo como este, para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida por un paso de detección esta descrito en US 5, 674,742. Las bombas de onda Lamb se utilizan para transportar cebadores de DNA, reactivos polimerasa y reactivos
nucleótidos a partir de tres cámaras de almacenamiento independientes hacia una sola cámara de reacción cuando sea necesario para llevar a cabo un proceso PCR, en el que la temperatura de la cámara de reacción se mantiene en un ciclo según sea necesario.
Otro dispositivo microfabricado, para llevar a cabo un paso de reacción química seguido por un paso de separación por electroforesis , esta descrito en Analytical Chemistry 1994, 66, 4127-4132. Las estructuras grabadas en un sustrato de silicio cubierto por una placa de vidrio proporcionan una cámara de reacción y las conexiones hacia el buffer, el analito, el reactivo y los depósitos de residuos de analitos, así como una columna para electroforesis conectada a un depósito de residuos.
La amplificación basada en la secuencia dé ácidos nucleicos (NASBA) es una técnica que depende del cebador y que se puede utilizar para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una sola mezcla a una temperatura (método isotérmico para la amplificación de ácido nucleico) y fue uno de los primeros métodos para la amplificación del RNA basada en la transcripción que se describió. La NASBA normalmente ofrece una alternativa sencilla y rápida a la PCR para la amplificación de
ácidos nucleicos, y tiene la capacidad de producir una amplificación del RNA de 1000 millones de veces en 90 minutos. Con respecto a otros sistemas de amplificación, como la técnica de la PCR, la capacidad de NASBA para amplificar en forma homogénea e isotérmica analitos de RNA amplia su intervalo de aplicación desde diagnóstico viral hasta la indicación de actividades biológicas como la extracción génica y la viabilidad celular. La técnica NASBA se describe, por ejemplo, en Nature, Volumen 350, páginas 91 y 92. La amplificación de ácido nucleico en NASBA se lleva a cabo por las actividades enzimáticas concertadas de la AMV transcriptasa inversa, RNAsa H y la T7 RNA polimerasa, junto con un par cebador, dando como resultado la acumulación principalmente de RNA monocatenario que se puede utilizar fácilmente para la detección por los métodos de hibridación. La aplicación de un patrón interno de RNA al proceso NASBA da como resultado un método de detección cuantitativo de ácido nucleico con un intervalo dinámico de cuatro logaritmos pero que necesita seis reacciones de amplificación por cuantificación . Este método se mejora drásticamente por la aplicación de múltiples patrones internos de RNA que se puedan distinguir adicionados en diferentes cantidades y mediante la técnica de detección por electro-quimioluminiscencia (SL) . Este proceso NASBA cuantitativo
(A) en un tubo solo necesita un paso del proceso de amplificación para la cuantificación y permite la adición de patrones internos a la muestra clínica en un buffer para lisis antes de la separación real del ácido nucleico. Este enfoque tiene la ventaja de que la eficacia de la separación del ácido nucleico no influye en el resultado de la cuantificación, contrario a los métodos en los que se mezclan patrones internos con el ácido nucleico tipo natural después de su separación de la muestra clínica. El proceso NASBA cuantitativo esta descrito en Nucleic Acid Research (1998) volumen 26, páginas 2150-2155. No obstante, la detección del producto después de NASBA todavía puede ser un procedimiento que requiere mucha mano de obra, normalmente involucra la detección basada en perlas enzimáticas y la detección electroquimioluminiscente (LS) o la espectrofotometría de correlación fluorescente. Sin embargo, en vista de que estos métodos son heterogéneos o requieren algún manejo de la muestra o dispositivos robóticos que en la actualidad no tienen una buena relación del costo y la eficacia, estos se utilizan relativamente poco para aplicaciones de alto rendimiento. ün procedimiento homogéneo en el que la detección del producto es concurrente con la amplificación diana por la generación de una señal específica de la diana facilitaría el
tamizaje a gran escala y la automatización completa. En fechas recientes se ha introducido una técnica de detección de ácido nucleico novedosa basada en sondas (faros moleculares) que fluorescen solo tras la hibridación con su diana.
La hidráulica es la ciencia del flujo de líquidos, por ejemplo, en tubos. Para dispositivos microfabricados, el flujo de un fluido a través de una o más series de cámaras de reacción de tamaño micro o nano normalmente se logra utilizando una bomba, como puede ser una jeringa, bomba rotatoria o vacío precargado o una fuente de presión externa al dispositivo. En otra versión se puede disponer de una microbomba o cámara de vacío, o elementos de bombeo de onda LAMB como parte del propio dispositivo. Otras combinaciones de elementos para regular el flujo incluyen bombas, válvulas y vacío precargado y cámaras de presión que pueden ser utilizadas para regular el flujo de líquidos a través de las cámaras de reacción. Otros mecanismos para transportar fluidos dentro del sistema consisten en el flujo electro osmótico.
La publicación de la solicitud de Patente Internacional WO No. 02/22265 se refiere a un sistema cámara de reacción microfabricado que se puede utilizar
en un método para llevar a cabo NASBA. La solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB 02/005945 se refiere a un sistema de cámaras de reacción microfabricadas y un método para transportar fluidos. El sistema también se puede utilizar en un método para llevar a cabo la NASBA. La solicitud de patente internacional No PCT/GB 03/004768 se refiere a un dispositivo microhidráulico para la fragmentación de ácido nucleico. El dispositivo puede ser utilizado en o junto con un sistema de cámaras de reacción microfabricado para llevar a cabo la NASBA.
La presente invención ofrece un sistema para llevar a cabo un proceso de preparación de la muestra en una muestra fluida que contenga células/o partículas, el sistema consiste en: (a) Una entrada para la muestra fluida. (b) üna unidad de lisis para lisar las células y/o partículas contenidas en la muestra fluida. (c) Una unidad de extracción de ácido nucleico para la extracción de ácidos nucleicos a partir de las células y partículas contenidas en la muestra fluida. (d) Un depósito que contiene líquido para lisis. (e) Un depósito que contiene un eluyente para separar los ácidos nucleicos recolectados en la unidad de extracción de ácidos nucleicos.
En donde la entrada de la muestra está en comunicación hidráulica con la unidad para lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del liquido entre estos.
En donde la unidad para lisis está en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estas.
En donde el depósito que contiene el liquido para lisis esta en comunicación hidráulica con la unidad para lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos; y
en donde el depósito que contiene el eluyente está en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácidos nucleicos, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos.
El sistema puede ser utilizado en volúmenes de muestras de mililitros para diagnósticos regulares. El sistema depende de ciertos reactivos que deben ser previamente cargados.
En la presente invención se puede combinar la extracción y concentración de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, la presente invención propone un sistema de diagnóstico del tipo laboratorio en un chip, integrado, para llevar a cabo un proceso de preparación de una muestra. El sistema puede ser utilizado en o junto con un sistema de cámaras de reacción microfabricadas para llevar a cabo la NASBA.
Por lo menos algunos de los componentes del sistema son preferentemente microfabricados . De preferencia, la unidad para lisis, la unidad de extracción de ácidos nucleicos, el depósito de liquido para lisis y el depósito del eluyente son microfabricados y están integrados, es decir, forman un sustrato común.
El depósito que contiene el liquido para lisis preferentemente esta en comunicación hidráulica con la entrada, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos.
El depósito que contiene el eluyente preferentemente esta en comunicación hidráulica con la entrada, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos.
El sistema de acuerdo con la presente invención normalmente además comprenderá (g) una unidad de reacción de ácidos nucleicos, en donde la unidad de extracción de ácidos nucleicos esta en comunicación hidráulica con la unidad de reacción de ácidos nucleicos, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estas. Preferentemente, la unidad de reacción de ácidos nucleicos es microfabricada y preferentemente esta integrada con los demás componentes. Cualquier reacción normal se puede llevar a cabo en la unidad de reacción. Preferentemente, la reacción permitirá la detección de una secuencia diana especifica y/o un análisis cuantitativo. La unidad de reacción de ácidos nucleicos normalmente contendrá una unidad de amplificación y detección de la secuencia del ácido nucleico que permita la detección de secuencias especificas mediante una reacción de amplificación del ácido nucleico. Los ejemplos pueden ser las técnicas PCR y de amplificación isotérmica como la NASBA. La técnica más preferida es la NASBA en tiempo real que utiliza faros moleculares. Por consiguiente, en un aspecto preferido, la presente invención proporciona un sistema diagnóstico del tipo laboratorio en un chip, integrado, para llevar a cabo la preparación de una muestra, la amplificación de la secuencia de ácido nucleico y el proceso de detección en
una muestra fluida que contenga células y/o partículas, más preferentemente, NASBA en tiempo real. La publicación de la solicitud de Patente Internacional No. WO 02/22265 describe un sistema de cámaras de reacción microfabricadas para llevar a cabo la NASBA.
El sistema de acuerdo con la presente invención preferentemente consiste en la concentración de, por ejemplo, células epiteliales infectadas, la lisis y extracción del mRNA y la amplificación y detección en tiempo real, el sistema puede ser utilizado para el tamizaje de carcinoma cervical, por ejemplo.
El sistema de acuerdo con la presente invención normalmente además comprenderá (h) una unidad de residuos, en donde la unidad de residuos este en comunicación hidráulica con la unidad para lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos. Preferentemente, la unidad de residuos esta microfabricada y preferentemente se integra con los demás componentes.
El sistema normalmente además contiene (i) un depósito que contiene el disolvente de lavado, cuyo depósito en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de
ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo de fluido entre estos. Preferentemente, el depósito que contiene disolvente de lavado se microfabrica y preferentemente se integra con los demás componentes. El disolvente de lavado puede ser elegido de cualquier disolvente conveniente, pero preferentemente es uno que se puede evaporar fácilmente, por ejemplo etanol.
El sistema normalmente además contiene (j) un depósito que contiene un disolvente de lavado, cuyo depósito este en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos. Preferentemente, el depósito que contiene el disolvente de lavado se microfabrica y preferentemente se integra con los demás componentes. El disolvente de lavado puede ser elegido de cualquier disolvente conveniente, pero de preferencia es uno que se puede evaporar fácilmente, por ejemplo isopropanol.
El depósito que contiene el eluyente esta ventajosamente en comunicación hidráulica con el depósito que contiene el primer disolvente de lavado (por ejemplo etanol) y/o el depósito del segundo disolvente de lavado (por ejemplo isopropanol) .
Más convenientemente, el eluyente, el primer disolvente de lavado (etanol) y/o el segundo disolvente de lavado (isopropanol) están contenidos en un depósito común. Esto se puede lograr separando el eluyente, el primer disolvente de lavado y/o el segundo disolvente de lavado entre si en el depósito común mediante el uso de un fluido como puede ser, por ejemplo, aire. Otros fluidos "separadores" (líquidos o gases) pueden utilizarse, sin embargo, siempre que estos sean inmiscibles o por lo menos considerablemente inmiscibles con el eluyente, el primer disolvente de lavado y/o el segundo disolvente de lavado.
En una modalidad preferida, el eluyente, el etanol y/o el isopropanol están contenidos en un conducto o canal que esta en comunicación hidráulica con la entrada y la unidad para lisis. El eluyente, el etanol y/o el isopropanol estando separados por espacios de fluido, como pueden ser los espacios de aire, por ejemplo.
El sistema normalmente además contiene: (k) medios para introducir una muestra fluida y/o aire en la entrada. El medio preferentemente consiste en una bomba o una jeringa. De otro modo, estos medios pueden comprender una o más cámaras de volumen variable en comunicación con
el portal de entrada, en donde si se altera el volumen de las cámaras de volumen variable se afecta y/o restringe el flujo de una muestra fluida hacia adentro y/o hacia afuera de la entrada. La cámara de volumen variable normalmente contiene una membrana flexible súper puesta a un rebajo hueco en el sustrato subyacente. La solicitud de Patente Internacional No PCT/GB 02/005945 describe un sistema de transporte de fluidos preferidos.
El sistema puede ventajosamente ser accionado por un sistema de bombeo individual.
La unidad para la lisis puede tener cualquier forma y configuración adecuada pero por lo regular esta en forma de una cámara o canal. La unidad de lisis preferentemente es para la lisis de células eucarióticas y procarióticas y partículas contenidas en la muestra fluida.
Si se desea, el sistema además comprende una unidad de filtración, cuya unidad este en comunicación hidráulica con la unidad de lisis. La unidad de filtración puede contener, por ejemplo, un filtro de flujo transversal o un filtro hueco. De otro modo, la unidad de lisis además puede tener medios para filtrar la
muestra líquida. El medio puede consistir, por ejemplo, en un filtro de flujo transversal o un filtro hueco, que puede estar integrado con la unidad de lisis.
Si se desea, el sistema además puede contener una unidad de fragmentación, cuya unidad este en comunicación hidráulica con la unidad de lisis. En otra versión, la unidad para lisis puede además tener medios para fragmentar la muestra fluida. La fragmentación aleatoria del DNA o RNA muchas veces es necesaria como un paso de tratamiento previo de la muestra. La fragmentación se puede lograr por medios bioquímicos utilizando enzimas de restricción, o medíante la aplicación de una fuerza física para romper las moléculas (ver por ejemplo P. N. Hengen, Trends, in Biochem. Sci. Vol. 22, pp. 273-274, 1997, y P. F. Davidson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, vol 45, pp. 1560-1568, 1959) . La fragmentación del DNA por cizallamiento por lo regular consiste en hacer pasar la muestra a través de un estrechamiento corto. En una modalidad preferida, el DNA y RNA se rompen por fuerza mecánica cuando se bombean a través de un orificio angosto, debido al rápido estiramiento de la molécula. Un flujo accionado por presión puede conducir a una fuerza de cizallamiento, la cual da origen a la fragmentación de los ácidos nucleicos. La solicitud de Patente
Internacional No. PCT/GB 03/004768 describe un dispositivo microhidráulico para la fragmentación de ácidos nucleicos.
La propia unidad para lisis además puede tener medios para filtrar la muestra fluida y medios para fragmentar la muestra fluida.
El sistema además puede tener medios para calentar el contenido de la unidad de lisis y/o la unidad de extracción de ácidos nucleicos. El medio puede consistir, por ejemplo, en uno o más elementos de Peltier ubicados en o junto a la unidad de lisis y/o la unidad de extracción de ácido nucleico.
La unidad de extracción de ácido nucleico puede tener cualquier forma y configuración convenientes pero normalmente estarán en forma de un canal o cámara. La unidad de extracción de ácido nucleico preferentemente es para la extracción de células eucarióticas y procarióticas y las partículas contenidas en la muestra fluida .
La unidad de extracción de ácido nucleico puede estar por lo menos parcialmente llenada con perlas o partículas
de sílice. Una o más series de electrodos pueden estar provisto junto a las perlas o partículas de sílice para recolectar y/o pre-concentrar los ácidos nucleicos eluidos. La una o más series de electrodos puede comprender electrodos de platino, por ejemplo. Los medios pueden por tanto, estar provistos para aplicar una diferencia de potencial a través de los electrodos. La celda para la extracción preferentemente se forma de o consiste en poli (dimetilsiloxano) (PDMS) . La unidad normalmente contendrá un sustrato y una cubierta subyacente, estando la unidad de extracción definida por un rebajo en una superficie del sustrato y la superficie contigua de la cubierta, el sustrato preferentemente se forma de silicio poli (dimetilsiloxano) (PDMS) . El AN se une' a las superficies de sílice en presencia de agentes caotrópicos.
La integración de los electrodos (por ejemplo los electrodos de platino) puede utilizarse ventajosamente para recolectar en forma reversible y pre-concentrar el AN eluido sobre el chip. Así pues, la presente invención permite lograr la extracción y enriquecimiento de combinados del ácido nucleico.
En una modalidad preferida, la unidad de extracción del ácido nucleico consiste en un canal de
poli (dimetilsiloxano) (PDMS) empacado en perlas de sílice .
El sistema o por lo menos una versión maestra de éste por lo regular se formará de o consistirá en un material semiconductor, aunque también es posible utilizar materiales dieléctricos (por ejemplo vidrio, sílice fusionado, cuarzo, materiales poliméricos y materiales cerámicos) y/o materiales metálicos. Los ejemplos de los materiales semiconductores pueden ser uno o más de los siguientes: elementos del grupo IV (es decir, silicio y germanio) ; compuestos del grupo III-IV (por ejemplo arseniuro de galio, fosfuro de galio, antimoniuro de galio, fosfuro de indio, arseniuro de indio, arseniuro de aluminio y antimoniuro de aluminio) ; compuestos del grupo II-VI (por ejemplo sulfuro de cadmio, seleniuro de cadmio, sulfuro de zinc, seleniuro de zinc) ; y compuestos del grupo IV-VI (por ejemplo sulfuro de plomo, seleniuro de plomo, teluriuro de plomo, teluriuro de estaño) . Los materiales semiconductores preferidos son arseniuro de silicio y de galio. El sistema se puede fabricar utilizando procesos tradicionales asociados con la producción en lotes de dispositivos microelectrónicos semiconductores, y en fechas recientes, la producción de dispositivos
micromecánieos semiconductores. Las técnicas de microfabricación como estas pueden ser, por ejemplo, el crecimiento epitaxial (fase de vapor, fase liquida, haz molecular, depositación de vapor químico orgánico metálico) , litografía (como la foto-, haz electrónico-, rayos X, haz iónico) , grabado (químico, en fase gaseosa, plasma) electrodepositación, sublimación catódica, impurificación por difusión, implantación iónica y micromaquinado . Los materiales no cristalinos como vidrio y materiales poliméricos también se pueden utilizar.
Los ejemplos de los materiales poliméricos pueden ser PMMA (polimetacrilato de metilo) , COC (copolímero de olefinas cíclicas) , polietileno, polipropileno, PL (polilacturo) , PBT (politereftalato de butileno) y PSU (polisulfona) , incluidas las mezclas de dos o más de estos .
El polímero preferido es PDMS o COC.
El dispositivo/sistema normalmente tendrá forma integrada. El dispositivo/sistema puede ser microfabricado en un material sustrato común, por ejemplo un material semiconductor como se describe en la presente, aunque se podría utilizar un material sustrato
dieléctrico como puede ser, por ejemplo, vidrio o un material cerámico. El material sustrato común, sin embargo, preferentemente es un material plástico o polimérico y los ejemplos convenientes se dan en lo anterior. El sistema preferentemente puede formarse por repetición de, por ejemplo, una forma maestra de silicio.
Las ventajas de utilizar plástico en lugar de vidrio de silicio para las estructuras miniaturizadas son muchas, al menos para aplicaciones biológicas. Uno de los beneficios más grandes es la reducción en el costo para la producción masiva utilizando métodos por moldeo por microinyección, estampado en caliente y colado. Un factor de un 100 o más es muy probable para estructuras complejas. La posibilidad de repetir estructuras para moldear inserciones en múltiples capas da una gran flexibilidad y libertad en el diseño. La interconexión entre el mundo micro y macro es en muchos casos más sencilla porque se tiene la opción de combinar las piezas estándar que normalmente se utilizan. Es posible utilizar diversos enfoques para las técnicas de ensamble, como puede ser el sondeo US con soporte de microestructuras, soldeo láser, encolado y laminación. Otras características que son redituables es la modificación superficial. Para estructuras miniaturizadas dirigidas a
análisis biológico, es importante que la superficie sea biocompatible . Mediante el uso del tratamiento con plasma y la polimerización con plasma una flexibilidad y variación de materiales se puede adaptar en el recubrimiento. La resistencia química contra ácidos y bases es mucho mejor que los plásticos que de los sustratos de silicio que quedan grabados fácilmente. Los principales métodos de detección dentro del campo biotecnológico incluye mediciones ópticas. Por tanto, la transparencia de plástico es una principal característica en comparación con el silicio que no es transparente. La técnica microhidráulica de polímeros ahora es un campo establecido pero creciente dentro del mercado de laboratorios en un chip.
El sistema microfabricado como se describe en la presente también esta destinado a comprender dispositivos nanofabricados .
Para una pieza maestra de silicio o semiconductor, es posible definir, por ejemplo, grabado o micromaquinado, una o más de las cámaras de volumen variable, canales microhidráulicos, cámaras de reacción e interconexiones hidráulicas en el sustrato de silicio con dimensiones exactas en escala micro. Una replica de
plástico entonces se puede hacer del maestro de silicio. En esta forma, un sustrato de plástico con una microestructura grabada o maquinada se puede unir por cualquier medio conveniente (por ejemplo utilizando un adhesivo o calentamiento) a una cubierta.
Las válvulas opcionales que se utilizan en el sistema pueden tomar cualquier forma conveniente. Por ejemplo, las válvulas pueden simplemente regular el flujo a lo largo de un conducto o canal que conecte dos unidades. Se puede proporcionar un miembro tipo pistón que se eleve o descienda en un agujero en un conducto o canal mediante la acción de un dispositivo pasador .
El uso del sistema consiste en los siguientes pasos posibles, por ejemplo.
Alternativa 1 (i) Recolección y lisis de la muestra (ii) Extracción del mRNA (procedimiento manual o automático) (iii) Amplificación y detección en tiempo real (preferentemente múltiple)
Alternativa 2 (iv) Una unidad de fragmentación puede incluir la lisis de la muestra y preparación de la muestra (v) Amplificación (NASBA) y detección en tiempo real (preferentemente múltiple)
La presente invención también propone un método para la fabricación de un sistema de diagnóstico del tipo laboratorio en un chip integrado como se describe en la presente, cuyo método consiste en:
A. Disponer de un sustrato que tenga un rebajo de entrada, un rebajo para la unidad de lisis, un rebajo para la unidad de extracción del ácido nucleico, un rebajo para el depósito del liquido para lisis y un rebajo para el depósito del eluyente en una superficie de éste.
B. Disponer de una cubierta; y
C. Unir la cubierta al sustrato para crear la (a) entrada (b) unidad de lisis (c) la unidad de extracción del ácido nucleico, (d) el depósito del liquido para lisis y (e) del depósito del eluyente, cada uno estando definido por el rebajo respectivo en la superficie del sustrato y la superficie contigua de la cubierta.
El término rebajo cuando se utiliza en la presente también esta propuesto para cubrir una variedad de características que pueden ser, por ejemplo, hendiduras, ranuras, agujeros, zanjas y canales, incluidas partes de estos.
El método además comprende el paso de introducir el líquido para lisis en el depósito del líquido para lisis antes o después de unir la cubierta al sustrato.
El método además puede comprender el paso de introducir eluyente en el depósito del eluyente antes o después de unir la cubierta al sustrato.
El método puede consistir en el paso de introducir etanol en el depósito del eluyente antes o después de unir la cubierta al sustrato.
El método además puede consistir en el paso de introducir isopropanol en el depósito del eluyente antes o después de unir la cubierta al sustrato.
El eluyente y/o el etanol y/o el isopropanol preferentemente están separados entre sí por un fluido,
preferentemente aire, aunque es posible utilizar cualquier fluido inmiscible (liquido o gas) .
En una modalidad preferida, el método consiste en:
introducir un eluyente en el depósito del eluyente después de unir la cubierta al sustrato;
introducir un primer volumen de aire en el depósito del eluyente;
introducir etanol en el depósito del eluyente, con lo cual el etanol se separa del eluyente por el primer volumen de aire;
Introducir un segundo volumen de aire en el depósito del eluyente;
introducir isopropanol en el depósito del eluyente, con lo cual el isopropanol se separa del etanol del segundo volumen de aire.
El sustrato se puede formar de silicio, por ejemplo, y la cubierta súper puesta de vidrio, por ejemplo. En este caso, la cubierta de vidrio preferentemente se une
anódicamente al sustrato de silicio, opcionalmente por una capa de óxido de silicio intermedia formada sobre la superficie del sustrato. Los rebajos en el silicio se pueden formar utilizando grabado de iones reactivos otros materiales como materiales poliméricos también se pueden utilizar para el sustrato y/o la cubierta. Materiales como estos se pueden fabricar utilizando, por ejemplo, un molde de silicio, de otro modo, el dispositivo se puede fabricar estructurando inserciones de molde por fresado y maquinado por descarga electrónica (EDM) , seguido por procesamiento mecánico posterior de las partes poliméricas, por ejemplo perforación, fresado, rechazado. Esto puede ser seguido después por la inserción del filtro, disolvente, adhesivo y el montaje de las conexiones hidráulicas.
Los ejemplos de los materiales poliméricos pueden ser PMMA (polimetacrilato de metilo) , COC (copolímero de olefinas cíclicas) , polietileno, polipropileno, PL (polilacturo) , PBT (politereftalato de butileno) y PSÜ (polisulfona) , incluidas las mezclas de dos o más de estos. Se prefiere COC.
Preferentemente, y en particular si se requieren observaciones ópticas del contenido de la celda, se hace
una cubierta súper puesta de una sustancia ópticamente transparente o un material como vidrio, pirex o COC.
Las combinaciones de un componente microfabricado con uno o más de elementos diferentes como placa de vidrio o un elemento microfabricado, complementario, frecuentemente se utilizan y están destinados a entrar dentro del alcance del término microfabricado como se utiliza en la presente.
Parte o toda la base del sustrato puede estar provista con un recubrimiento de espesor normalmente hasta 1 µp?, preferentemente 0.5 µp?. El recubrimiento preferentemente se forma de uno o más del grupo que comprende polietilenglicol (PEG) , albúmina de suero bovino (BSA) , los twen y dextranos. Los dextranos preferidos son aquellos que tienen un peso molecular de 9,000 a 200,0000, especialmente de preferencia que tienen un peso molecular de 20,000 a 100,000 particularmente 25,000 a 75,000, por ejemplo 35,000 a 65,000). Los tween (o polioxietileno sorbitan) pueden ser cualquier forma disponible de Sigma Aldrich Company. Los PEG son preferidos como medio de recubrimiento, en forma individual o en combinación. Por PEG se comprende polietilenglicol puro, es decir, una fórmula
OH- (CH2CH2O) n-H en donde n es un entero por el cual se produce un PEG que tenga un peso molecular normalmente desde 200-10,000, especialmente PEG 1,00 a 5, 000; o PEG con modificación química en donde uno o más olígómeros de etilen glicol se conectan por medios de grupos homobifuncionales como pueden ser, por ejemplo, porciones fosfato y separadores aromáticos. Particularmente preferidos son los polietilenglicoles conocidos como FK108 (una cadena polietilenglicol conectada a otra mediante un fosfato) ; y el PEG comercializado por Sigma Aldrich Company como producto P2263. Los recubiertos anteriores aplicados a las superficies de la celda/cámara, las entradas, salidas y/o canales pueden mejorar el paso del líquido a través del sistema. En particular, se ha encontrado que la muestra se adhiere o pega con menos probabilidad a estas superficies. Se prefieren los recubrimientos de PEG.
En una pieza maestra de silicio o semiconductor, es posible definir, por ejemplo, por grabado o micromaquinado, una o más de las cámaras de volumen variables, los canales microhidráulicos, las cámaras de reacción y las interconexiones hidráulicas en el sustrato de silicio con dimensiones de escala microexactas (el grabado con ión reactivo intenso (DRIE) es una técnica
preferida) . Un molde de plástico entonces se puede fabricar de la pieza maestra de silicio. De este modo, un sustrato de plástico con una micro-estructura grabada o maquinada se puede unir por cualquier medio conveniente (por ejemplo utilizando adhesivo o calentamiento) a una cubierta formando con ello una celda o celdas de fragmentación cerradas, las entradas, salidas y los canales de conexión.
El dispositivo consiste en un sustrato con una micro-estructura deseada formada en su superficie alta. El sustrato puede ser silicio, por ejemplo, o un sustrato plástico formado por la repetición de una pieza maestra de silicio. El sustrato se une en su superficie superior a una cubierta, definiendo con ello una serie de unidades o celdas, entradas, salidas y/o canales. La cubierta puede ser formada de plástico o vidrio, por ejemplo. La cubierta preferentemente es transparente y esto permite la observación del fluido. En general, el dispositivo preferentemente se fabrica por grabado de ión reactivo intenso (DRIE) de silicio para restricciones altas en la relación entre dimensiones, seguido por unión anódica de una cubierta de vidrio. En otra versión, el dispositivo puede ser fabricado estructurando inserciones de molde fresando y maquinado por descarga electrónica (EDM) ,
seguido por moldeo por inyección de las partes del chip, seguido por procesamiento mecánico posterior de las partículas poliméricas, por ejemplo perforación, fresado, rechazado. Esto puede ser seguido posteriormente por la inserción del filtro, unión con disolvente y montaje de las conexiones hidráulicas .
La muestra de ácido nucleico puede ser, u obtenerse de, por ejemplo, un fluido biológico, un producto lácteo, fluidos ambientales y/o agua potable. Los ejemplos pueden ser sangre, suero, saliva, orina, leche, agua potable, agua de mar y agua de estanque. Para muchas muestras biológicas complicadas, como puede ser, sangre y leche, se apreciará que antes de poder separar y purificar el DNA y/o RNA de las células bacterianas y partículas virales en una muestra, primero es necesario separar las partículas virales y las células bacterianas de otras partículas de la muestra. También se observará que puede ser necesario llevar a cabo otros pasos de preparación de la muestra para concentrar las células bacterianas y partículas virales, es decir, para reducir el volumen del material inicial antes de proceder a romper la pared de la célula bacteriana o el recubrimiento de la proteína viral y separar los ácidos nucleicos. Esto es importante cuando el material inicial consiste en un gran volumen,
por ejemplo una solución acuosa que contenga relativamente pocas células bacterianas o partículas variables. Este tipo de material inicial comúnmente se encuentra en aplicaciones de análisis ambiental como pueden ser la monitorización regular de contaminación bacteriana en el agua potable.
Esto es importante cuando el material inicial consiste en un gran volumen, por ejemplo una solución acuosa que contenga relativamente pocas células bacterianas o partículas virales. Este tipo de material inicial es común en aplicaciones de análisis ambiental como la monitorización regular de contaminación bacteriana en agua potable.
El sistema preferentemente esta diseñado para trabajar en una muestra con un volumen de 10-100 mL.
La presente invención también propone un aparato para el análisis de muestras biológicas y/o ambientales, el aparato consiste en un sistema como se describe en la presente. El aparato puede ser un aparato desechable. La presente invención también propone un kit de análisis para el análisis de muestras biológicas y/o ambientales, el kit o equipo comprende un sistema como se describe en
la presente y medios para poner en contacto la muestra con el sistema. El equipo para análisis puede ser un equipo desechable. La presente invención ahora será descrita por medio de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos acompañantes, de los cuales:
La Figura 1 es un esquema de una capa intercalada utilizada para la integración de una membrana plana en un dispositivo de chip polimérico desechable para utilizarlo en la presente invención.
La Figura 2 es un esquema de un diseño de válvula para utilizarlo con el sistema de acuerdo con la invención presente.
Las Figuras 3a-d son esquemas de un diseño de válvula que se utiliza con el sistema de acuerdo con la presente invención.
La Figura 4 es un esquema de una posible distribución de una cámara de perlas de acuerdo con la presente invención.
La Figura 5 es un esquema de un diseño de sistema de acuerdo con la presente invención mostrando el llenado
con el buffer de lisis (Figura 5a) y los fluidos de extracción (Figura 5b) .
La Figura 6 es un esquema de una distribución de chip de acuerdo con la modalidad de la presente invenció .
La Figura 7 es un esquema de un diseño de sistema de acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención.
La Figura 8 se refiere a los ejemplos.
La Figura 9 se refiere a los ejemplos.
Un diseño de chip de plástico de acuerdo con la presente invención preferentemente incorpora canales de suministro, cámaras de reacción y sistemas de activación microhidráulicos y preferentemente se procesa por moldeo por inyección de copolimero de ciclo definas (COC) . La inserción del molde, por ejemplo, para un chip de 12 canales se puede fabricar utilizando fresado de alta presión. El volumen de detección normalmente es alrededor de 80 nL (400 x 2000 x 100 µ??) . El chip de plástico preferentemente primero se activa con plasma de oxigeno
antes de ser recubierto con una solución al 5% de polietilenglicol (PEG) (Sigma Chemical Co . St . Louis, MO) . Después del recubrimiento, el chip puede ser sellado con una membrana de COC de aproximadamente 75 µp? a través de soldeo con disolvente utilizando, por ejemplo, biciclohexilo . Una capa delgada de oro (aproximadamente 25 mm) preferentemente se deposita en la parte posterior del chip para evitar la fluorescencia de fondo del cojincillo térmico sobre la parte superior del elemento de Peltier.
Si es necesario, los elementos de Peltier pueden estar integrados en el portamuestras proporcionando control térmico para los chips de plástico. Bloques de aluminio se pueden poner en la parte superior de los elementos de peltier para asegurar una distribución uniforme del calor en los chips. Pref rentemente se instala un cojincillo térmico sobre los bloques de aluminio para establecer contacto térmico entre los chips y la fuente de calor. Normalmente se colocará un termopar sobre el portamuestras que mide la temperatura del aire y que tiene un circuito de realimentación para los elementos de peltier. El control de la temperatura se puede regular desde afuera con una computadora portátil.
Como se describe en lo anterior, la NASBA es un método de amplificación isotérmico (aproximadamente 41°C) específicamente diseñado para amplificar cualquier secuencia de RNA monocatenario . La reacción NASBA se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones como la detección de la presencia de los RNA virales, específicos, los RNA de otros agentes infecciosos o patógenos o algunos RNA celulares. La actividad simultánea de las tres enzimas, AMV transcriptasa inversa, RNasa H y T7 RNA polimerasa constituye una técnica central en la reacción de amplificación. Dos cebadores oligonucleótidos determinan la especificidad de la reacción y sondas faros moleculares fluorescentes que son específicas para el RNA diana. En aproximadamente 90 minutos la secuencia de ácido nucleico que interesa se puede amplificar a >109 copias. La unidad de detección óptica preferentemente se diseña para excitar los fluorórofos en las cámaras de reacción a aproximadamente 494 nm y para detectar la luz fluorescente emitida a aproximadamente 525 nm. La luz de excitación se puede filtrar utilizando un filtro de banda ancha (465 nm-500 nm) , antes de que la luz sea colimada a través de una lenta. La misma lenta de Fresnel se puede utilizar para enfocar la iluminación y recolección de la luz de fluorescencia. Otra lente puede ser utilizada para
enfocar la luz fluorescente sobre la superficie del detector (por ejemplo un tubo fotomultiplicador) . La recolección de los datos y la preparación de la señal detectada pueden ser procesados en una computadora portátil utilizando el programa MATLA 6.0.088 versión 12 (The Mathworks Inc., Natick, MA) .
El tratamiento previo eficiente de la muestra es un factor importante en el contexto de los sistemas de análisis microtecnológicos . En particular, se necesitan dispositivos para la concentración a fin de permitir la detección de cantidades bajas de partículas específicas, como pueden ser por ejemplo bacterias o virus, presentes en las muestras biológicas. En la técnica se conoce una variedad de métodos de concentración, como pueden" ser las técnicas de filtración como la filtración terminal y la filtración de flujo cruzado utilizando diferentes clases de medios de filtración (canales microestructurados, fibras gruesas porosas o membranas), sedimentadotes por gravedad, centrifugas, filtros de celdas acústicas, trampas ópticas, dioelectroforesis (DEP) , electroforesis, citometria de flujo y métodos basados en la absorción.
Un método de concentración preferido consisté en la filtración terminal. Este es un método relativamente
sencillo y económico que se puede integrar fácilmente en un chip polimérico desechable. Además, el uso de membranas planas garantiza una alta flexibilidad en relación con el campo de aplicación, puesto que se dispone de una variedad de membranas y los tratamientos de superficie se pueden hacer fácilmente, por ejemplo, con PEg o Tween20.
La integración de una membrana plana en un chip desechable de polímero se puede lograr utilizando una preparación sándwich como se muestra en el esquema de la Figura 1. El chip consiste en una membrana cubierta 40, un canal de líquidos 41 y una membrana filtrante 44. La parte superior y la parte inferior del chip se muestran como 42 y 43, respectivamente.
Preferentemente, en el dispositivo se integran una o más válvulas para permitir un control de flujo en el chip. En las Figuras 2 y 3 se muestran los diseños convenientes de las válvulas. Con respecto a la Figura 2, es posible utilizar membranas preformadas o membranas planas. El chip 45 consiste en un canal de líquidos 46 y una membrana preformada 47. La flecha vertical indica la posición abierta.
8·
Con respecto a las Figuras 3a-d, se muestra un chip que tiene un cuerpo, el cual contiene una parte del cuerpo superior 50, una parte del cuerpo principal 52 y una membrana 51 intercalada entre estas. Se dispone de un canal microhidráulico 57 junto a la membrana 51. Se dispone de un pistón 54 y una válvula 55 en los rebajos convenientes de la parte del cuerpo principal 52. El fluido o liquido esta presente en un volumen 53 por encima del pistón 54 (ver Figura 3a) . La válvula 55 se instala con ajuste por interferencia en la posición superior (ver Figura 3a) . En esta posición sella el canal microhidráulico 57 para que no pase fluido. Se puede utilizar un pasador cónico 56b para bajar la válvula 55 a la posición abierta (ver Figuras 3b, 3c y 3d) . En particular, cuando se empuja el pasador 56b hacia arriba este se asegura, con un ajuste por fricción, en un rebajo correspondiente de la válvula 55. Del mismo modo, en relación con el pistón 54, cuando el pasador cónico 56a es empujado hacia arriba este se asegura mediante un ajuste por fricción en un rebajo correspondiente del pistón 54. Para el transporte del liquido desde el volumen 53, los pasador 56a y 56b son empujados hacia los rebajos correspondientes del pistón 54 y la válvula 55, respectivamente, y el liquido es empujado del volumen 53 (ver Figuras 3c y 3d) . Cuando se ha utilizado el chip,
los pasadores cónicos son 56a y 56b están retirados del pistón 54 y la válvula 55, respectivamente.
Los inventores han encontrado que las perlas de sílice son muy adecuadas para la extracción y purificación del RNA. Normalmente para la extracción es posible utilizar 0.3 ó 0.4 mg de perlas con diámetros de 15 µp? a 35 µp?, pero también es posible utilizar perlas de sílice más grandes (hasta alrededor de 200 µp? de diámetro) . En la Figura 4 se muestra una distribución posible de una cámara de perlas. La cámara de perlas 60 se carga antes de la unión chip a chip con perlas de sílice prehumedecidas 61. Después de la adhesión, el paquete de perlas se retiene por los cuellos de botella de 100 µt?. La forma de la cámara de perlas y el ordenamiento de las conexiones hidráulicas 62 (entrada) y 63 (salida) garantiza que el líquido aplicado pase por las perlas de sílices 61, incluso si la cámara de perlas 60 no esta completamente llena. El volumen de la cámara de perlas 60 es de alrededor de 6.5 µL y es adecuado para la extracción de una muestra de normalmente 10 a 50 µL.
Preferentemente se utilizan cuatro líquidos a lo largo del proceso de tratamiento previo: buffer para
lisis (por lo regular aproximadamente 100 µ?,) , isopropanol (normalmente alrededor de 40 µ??) , etanol (normalmente alrededor de 40 µ?,) y buffer de elusión (por lo regular aproximadamente 5-20 µ?_) . Estos tres últimos son necesarios para la extracción. Los inventores han encontrado que es ventajoso almacenar el buffer para lisis en un canal (normalmente un canal de meandros y serpentuoso en la parte superior del chip 70a (ver Figura 5a) y almacenar los líquidos para extracción en dos depósitos en forma de W y uno en forma de U en la parte inferior 70b (ver Figura 5b) .
Todos los depósitos de almacenamientos simplemente pueden estar llenados por medio de canales laterales pequeños (0.5 mm x 0.5 rnm) , indicado en la Figura 5 por las posiciones de la aguja de las jeringas bosquejadas 75a-d. Después del llenado, los canales laterales pueden ser sellados utilizando cualquier medio apropiado, como puede ser con pegamento líquido o cinta.
Ventajosamente, para permitir un sistema de manejo relativamente sencillo, se prefiere utilizar una sola bomba (jeringa) para la activación de todos los líquidos .
En la Figura 6 se muestra una distribución del chip de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención .
Los cuatros depósitos de líquidos (buffer para lisis, isopropanol, etanol y buffer para elusión) se llenan en secuencia utilizando jeringas convencionales (diámetro de aguja 0.4 mm) , y se sellan los canales de llenado .
Primero, se aplica la suspensión de células a la unidad de filtración por medio de una bomba de jeringa. Además de la suspensión de partículas, la jeringa se carga con aproximadamente 200 µ?, a 300 µ?, de aire, el cual se utiliza para la activación de los líquidos en el chip (dependiendo de la aplicación se observará que es posible utilizar otros líquidos inmiscibles) .
Segundo, el aire es bombeado hacia el depósito del buffer para lisis y el buffer desplazado se aplica a las células que se mantienen sobre el filtro. El lisado de células es empujado a través del filtro y se dirige a la cámara de perlas. Debido al paso de filtración adicional se reduce la posibilidad de obstrucción en la cámara de perlas.
Tercero, la bomba de activación (jeringa) se conecta al depósito del liquido para extracción y se cierran las conexiones hacia la cámara del filtro y el depósito del buffer para lisis. Los líquidos de extracción se almacenan en un solo depósito separado por tapones o espacios de aire. Cuando se aplica presión a un lado del depósito, los líquidos se desplazan en paralelo y posteriormente son guiados a través de la cámara de perlas .
El protocolo de operación que incluye las operaciones de la válvula se resume más adelante haciendo referencia también a la Figura 6. Las válvulas no enlistadas están en un estado cerrado, mientras que las válvulas enlistadas están abiertas para la operación correspondiente .
Filtración Válvulas 5, 7: Entra suspensión de células, filtrado —> salida izquierda Lisis Válvulas 2, 3, 7: Entra aire, se desplaza el fluido — salida izquierda Válvulas 2, 3, 6: Entra aire, lisado —> empaque de perlas, salida derecha
Purificación Válvulas 1, 4, 6: Entra aire, isopropanol — paquete de perlas Entra aire, etanol —» paquete de perlas Entra aire, buffer de elusión —> paquete de perlas
Regresando ahora a la Figura 7, la cual muestra otra modalidad preferida de la presente invención, la descripción anterior también aplica a esta modalidad. El sistema uno consiste en una entrada 5 para una muestra fluida, una unidad de lisis/filtración 10, una unidad de extracción de ácido nucleico 15, un canal 20 que contiene fluido para lisis, un canal 25 que contiene eluyente, etanol e isopropanol, una unidad para la amplificación y detección de la secuencia del ácido nucleico 30 y una unidad de residuos 35.
Un canal 11 conecta a la entrada de la muestra 5 a la unidad de lisis/filtración 10. Se dispone de una válvula 12 para regular el flujo de fluidos entre estas.
Un canal 16 conecta la unidad de lisis/filtración 10 a la unidad de extracción de ácido nucleico 15. Se dispone de una válvula 17 para regular el flujo del fluido entre estas.
El canal 20 que contiene el fluido para lisis esta conectado a la unidad de lisis/filtración 10 y la entrada de la muestra 5. Se dispone de las válvulas 22s y 23 para regular el flujo del fluido.
El canal 25 que contiene el eluyente, etanol e isopropanol esta conectado a la unidad de extracción de ácido nucleico 15 y a la entrada de la muestra 5. Se dispone de las válvulas 27 y 28 para regular el flujo del fluido.
Un canal 31 conecta a la unidad de extracción de ácido nucleico 15 con la unidad de amplificación y detección de la secuencia del ácido nucleico 30. Se dispone de una válvula 32 para regular el flujo del fluido entre estas.
Un canal 36 conecta la unidad de lisis/filtración 10 con la unidad de residuos 35. Se dispone de una válvula 37 para regular el flujo del fluido entre estas.
El canal 25 contiene el eluyente y los disolventes de lavado como etanol e isopropanol. El eluyente y los disolventes de lavado se cargan previamente en el canal utilizando un espacio de aire para separar los líquidos entre sí.
Un ejemplo de un líquido buffer para lisis apropiado es Tris/HCl 100 mM, GuSCN 8 M (pH 6.4).
Un ejemplo de una solución para elusión conveniente es Tris/HCl 10 mM, EDTA Na2 1 mM (pH 8) + YOYO-1 1-mM.
La cuantificación del ácido nucleico se puede lograr utilizando un microscopio de florescencia y un programa de análisis para la intensidad de los pixeles (Lispix) .
La unidad de extracción del ácido nucleico contiene perlas de sílice, por ejemplo, 0.3 mg de perlas de sílice de tamaño 15-30 µp?. También se dispone de electrodos de platino (no se muestran) por debajo del lecho empacado para la recolección electrocinética de los" ácidos nucleicos que eluyen, con carga negativa.
El protocolo del funcionamiento se resume a continuación .
Filtración Todas las válvulas están cerradas menos las válvulas 12 y 37. Una jeringa que contiene la muestra fluida (que contiene las células que se van a analizar) se conecta a la entrada de la muestra 5 y se inyecta la muestra a
presión hacia la unidad de filtración/lisis 10. En esta forma se retienen las células en la unidad 10 y la porción restante del fluido pasa entonces a la unidad de residuos 35.
Lisis Todas las válvulas están cerradas menos las válvulas 22, 23, y 37. En un primer paso (optativo), el aire contenido en la jeringa se inyecta a la entrada de la muestra 5. Esto hace que el fluido para lisis contenido en el canal 20 fluya hacia la unidad de filtración/lisis 10. Antes de que el fluido para lisis entre en la unidad de filtración/lisis 10, no obstante, el frente de aire del fluido para lisis, es decir, el aire que se encuentra en la zona del canal 20 entre la válvula 23 y la unidad 10, hace que el resto del liquido de la unidad 10 sea desplazado y fluya a la unidad de residuos 34. Después, en un segundo paso, se cierra la válvula 37 se abre la válvula 17. A medida que el aire contenido en la jeringa se inyecta hacia la entrada de la muestra 5, el fluido para lisis contenido en el canal 20 fluye a presión hacia la unidad para filtración/lisis 10. Como consecuencia, las células contenidas en esta se lisan y el lisado fluye a la unidad de extracción del ácido nucleico 15.
Purificación/extracción Todas las válvulas están cerradas menos las válvulas 27, 28 y 32. En un primer paso, el aire contenido en la jeringa es inyectado a la entrada de la muestra 5. Esto hace que los fluidos (isopropanol, el espacio de aire, etanol, el espacio de aire, el buffer para elusión) contenidos en el canal 25 se muevan como columna de fluido hacia la unidad de extracción de ácido nucleico 15. Este proceso se interrumpe una vez que todos el isopropanol (es decir, la primera parte de la columna del fluido) ha pasado hacia la unidad de extracción de ácido nucleico 15. Después de un tiempo breve (junto con calentamiento opcional del contenido de la unidad 15) , el proceso continua y el espacio de aire entre el isopropanol y el etanol desplaza el isopropanol. El isopropanol se evapora y/o fluye hacia los residuos. Entonces el etanol fluye a presión hacia la unidad de extracción del ácido nucleico 15. El proceso se interrumpe una vez más cuando todo el etanol ha pasado hacia la unidad 15. Después de un tiempo corto (junto con calentamiento opcional del contenido de la unidad 15) , el proceso continua y el espacio de aire entre el etanol y el buffer de elusión desplaza el etanol. El etanol se evapora y/o fluye hacia los residuos. Entonces el buffer de elusión fluye a presión hacia la unidad de extracción
del ácido nucleico 15 y eluye los ácidos nucleicos liberados de la superficie de las perlas de sílice. Los ácidos nucleicos eluidos entonces pasan hacia la unidad de amplificación y detección de la secuencia de ácido nucleico 30.
La presente invención propone un aparato y el método para la extracción y el análisis del ácido nucleico (AN) . La extracción de las muestras biológicas, como pueden ser lisados de células humanas, ha sido satisfactoria, con recolección del AN en los primeros 15 mL del eluido.
La amplificación basada en la secuencias de ácidos nucleicos, en tiempo real (NASBA) ha sido medida en microchips de plástico copolímero de ciclo olefina (COC) con canales de sustrato incorporados y cámaras de reacción paralelas. Se ha hecho la detección satisfactoria de una secuencia de virus de papiloma humano (VPH) 16, artificial, una línea de células SiHa con VPH 16 incorporado y muestras de pacientes que dieron resultados positivos para VPH 16. Los materiales de la muestra aplicados al chip fueron divididos en 11 cámaras de reacción paralelas donde se hizo la detección simultánea en un volumen de detección de 80 nL.
La presente invención ahora será descrita haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Material de la muestra Lineas de células de carcinoma cervical SiHa (carcinoma de células escamosas) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (EUA) . La linea de células SiHa se mantuvo en medio Eagle modificado de Dubelco (DMEM) , suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) , L-glutamina 2 mM y 25 µg/mL de gentamicina. Las células fueron incubadas a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2. A las células se les adicionó tripsina, se contaron en una cámara Burkers y se Usaron en buffer para lisis NASBA (bioMérieux, Holanda, con un contenido de tiosianato de guanidina 5 M) . Se separan los ácidos nucleicos y fueron extraídos utilizando el método de Boom (Boom, R. Sol, J. A., Salimans, M. M. M. , Cansen, C. L., Wertherimvandillen P.M. E., Vandernoordaa, J. J. de Clinical Microbiol., 1990, 28, (3), 495-503.) en un extractor NucliSense. Las células SiHa contienen 1-2 copias de DNA con VPH 16 integrado por célula (Syrjanen, S., Partanen, P., Mantyjarvi, R. , y Syrjanen, K.' J Virol Methods, 1988, 19, 225-238) . Se analizaron diluciones en
series de 10 del extracto de la linea de células SiHa. Además se utilizo como diana secuencias artificiales del tipo VPH 16, del kit HPV Proofer (NorChip AS, Noruega) . Se analizo una serie de diluciones para definir el límite de detección del sistema.
NASBA Los reactivos contenidos en el kit PreTect® HPV-Proofer fueron mezclados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (NorChip AS, Noruega) . Todos los cebadores y sondas estaban disponibles en el kit. Además, se adiciono BSA a la mezcla para una concentración final de 0.05% como un recubrimiento dinámico. La solución de reactivos (25 µ?) del kit y 13 µL del material de la muestra (muestras de líneas de células SiHa y muestras de la secuencia 16 del tipo VPH del kit) fueron mezcladas y calentadas a 65°C durante 2 minutos. Posteriormente se enfrío la mezcla a 41°C durante 2 minutos después de lo cual se adicionaron las enzimas (13 µ?*) . Una cámara de activación sobre cada canal de reacción se abrió por un corte antes de adicionar la mezcla hacia el microchip polimérico. Cada canal de reacción en el chip se lleno con la mezcla por fuerza capilar. La mezcla restante fue extraída hacia la cámara de residuos al final del canal de suministro. Luego se movió el portachip por debajo de
la óptica, donde se midió un canal después de otro. Las mediciones fueron tomadas cada 30 segundos. Solo un área de 2 x 2 mm2 era iluminada por el LED, esta área correspondía a un área de detección de 80 mL. Las diluciones en series de 10 de las secuencias HPV 16 y las lineas de células SiHa también fueron analizadas con el equipo tradicional para hacer la comparación con la detección con el micro chip. Todos los experimentos fueron corridos durante 2.5 horas.
Cálculo Todos los resultados fueron calculados utilizando el analizador PreTect Data Analyzer (PDA) (NorChip AS) . El microchip fue diseñado con 12 cámaras de reacción, pero los dos canales de reacción en cada lado fueron eliminados de los cálculos por error sistemático de las mediciones. Los cálculos fueron basados en algoritmos de regresión polinomial. La relación fue definida como la diferencia en el nivel de fluorescencia al término de la reacción y el nivel de fluorescencia al inicio de la reacción. Todas las muestras con una relación de 1.7 o mayor fueron definidas como positivas. Se definió la relación tiempo positividad o el punto de inicio donde la curva comenzaba a aumentar exponencialmente . Se calculo la pendiente promedio utilizando los valores del 10% de
incremento en el nivel de fluorescencia y el valor del 80% de aumento en el nivel de fluorescencia a partir del punto de inicio. El limite de detección para los microchips poliméricos se estableció en por lo menos la concentración analizada donde todos los 10 canales de reacción fueron positivos.
Resultados La identificación del virus HPV 16 utilizando NASBA en tiempo real se realizo satisfactoriamente en microchips de polímero con un volumen de detección de 80 nL. Las Figuras 8 y 9 muestran el resultado de un experimento realizado en líneas de células SiHa y secuencias oligo HPV 16, respectivamente. Las Figuras muestran gráficas que son claramente positivas y' tienen la misma curvatura que las muestras realizadas utilizando volúmenes regulares de 20 µL y lectores habituales (no se muestran) . La tabla 1 muestra los resultados de una serie de diluciones de las secuencias HPV 16 artificiales y las líneas de células SiHa, obtenidos utilizando los microchips de polímero. Para caracterizar las reacciones de amplificación se evaluaron algunos parámetros diferentes: la relación de la fluorescencia, la relación tiempo a positividad, la pendiente promedio de la parte lineal de la curva, el número de amplificaciones
positivas y el número de microchips de polímero probados. Los valores de la tabla muestran el valor promedio y la desviación estándar de las muestras positivas que fueron analizadas. Para las secuencias HPV 16 y las líneas de células SiHa analizadas en los microchips, la relación fue más o menos constante. En comparación con análisis convencionales (tabla 2) del mismo material muestra, se demostró que la relación era decreciente para concentraciones menores. Los demás parámetros, por otra parte, corresponden muy bien para los microchips y los métodos tradicionales. La relación tiempo a positividad aumento con concentraciones menores. Aunque los valores promedio de la pendiente disminuyeron con las concentraciones menores. Se probaron diluciones en serie de 10 desde 100 aM hasta 100 nM para las secuencias HPV 16 artificiales, mientras que la línea de células SiHa se probó para 0.02
El sistema de detección óptico elaborado sobre especificaciones tuvo un límite de detección de 1 pM y 20 células/µ? para las secuencias artificiales de HPV 16 y el material de la línea de células SiHa, respectivamente. Estos fueron los mismos límites de detección obtenidos para los lectores Biotek tradicionales. Fue posible detectar menores concentraciones en ambos sistemas o, pero los resultados no fueron consistentes. Los
resultados también muestran que cuando la concentración de la muestra de la diana introducida eran decrecientes, aumentaba la desviación estándar. Una comparación de los resultados de la NASBA para las secuencias HPV 16 oligo y las lineas de células de SiHa demostró que todos los parámetros tuvieron la misma tendencia de los microsistemas, asi como para los métodos tradicionales, salvo la relación entre los niveles de fluorescencia al principio y al final de la reacción de amplificación. El ruido de fondo es más peculiar en las cámaras de reacción pequeñas en comparación con los métodos macroscópicos por fluorescencia. Pare de la fluorescencia de fondo se elimino del ensayo aplicando la capa delgada de oro en el lado posterior de los microchips de polímero. El propio COC es autofluorescente dando siempre alguna fluorescencia de fondo. Otra contribución a la detección de ruido es la dispersión de luz debida a las superficies menos perfectas del polímero. La relación tiempo a positividad disminuyo para concentraciones menores como se esperaba porque los sustratos que tardaban más en encontrar e interaccionar con los sustratos [sic] . Para las concentraciones más altas, especialmente para la secuencia artificial HPV 16 en los experimentos aumento la relación tiempo a positividad. Concentraciones de muestra muy altas también pueden inhibir la reacción y
por tanto tardar más que una mezcla de reacción ideal. En la misma forma disminuye la pendiente promedio. Cuando se comienza con cantidades más pequeñas de la diana en la mezcla de reacción, se producirán menos amplicones y la pendiente se hará menor que para concentraciones mayores. El limite de detección de la reacción NASBA depende de la diana que interese, el diseño de los cebadores y sondas. En estos experimentos pudimos detectar concentraciones por debajo de 1 pM y 20 células/^L en ambos sistemas de detección. Por consiguiente, este ejemplo muestra que es posible detectar secuencias artificiales de HPV 16 en concentraciones menores que 1 pM en microchips de polímero utilizando NASBA en tiempo real. Para muestras de lineas de células el limite de detección fue de 20 células/µ??. estos limites de detección son los mismos que los obtenidos en experimentos realizados en el lector Biotek tradicional.
Tabla 1 : NASBA realizado en microchips para detectar series de diluciones de secuencias HPV 16 oligo y linea de células SiHa. Los resultados son el promedio y la desviación estándar de todos los valores obtenidos en los experimentos . Concentración Relación Punto Pendiente Amplif. Número de inicial promedio Posit. / no. chips reacciones probados Secuencia HPV 16 oligo [µ?] 0.1 2. SO + 12.31 ± 45.09 50 / 50 5 0.33 5.36 9. S3 0.01 3.06 14.73 ± 43.43 ± 40 / 40 4 0.37 4.03 9.48 0.001 2.65 ± 9,00 + 45.99 X 30 / 30 3 0.42 2.05 17.65 0.0001 2.75 ± 22.19 + 35.08 ± 30 / 30 3 0.32 4.45 17.94 0.00001 2.56 ± 22.55 ± 29.87 30 / 30 3 0.38 7.36 13,74 0.000001 2.54 ± 25.30 ± 19.62 i 30 / 30 3 0,46 3.60 9.21 0.0000001 2.10 37.09 ± 17.27 + 33 / 70 7 0.32 12.74 11.78 0.00000001 1.85 ± 43.75 ± 9.94 ± 6 / 60 6 0,28 7.13 3.55 0.000000001 2.27 ± 81.00 ± 15.02 + 2 / 20 6 0.86 38.18 6.26 0.OO000O0001 3.93 4.50 21.83 1 / 60 6 Linea células SiHa [células/uL] 2000 2.86 + 16.91 ± 42.57 i 40 / 40 4 0.30 2.67 6.24 200 2.80 ± 18.89 * 40,56 ± 40 / 40 4 0.43 3.39 14.50 20 2.38 30.65 37.49 ÷ 33 / 40 4 0.27 S.28 11. OS 2 2.75 38.02 ± 35.09 ± 60 70 7 ±0.50 26.12 15.47 0.2 2.73 ± 70.13 ± 39.29 4 / 50 5 0.54 39.12 ±1 . S7 0.O2 0 0 0 0 / 30 3
Tabla 2 : Análisis NASBA normal realizado en las secuencias HPV 16 oligo y las lineas de células SiHa. Los resultados son el promedio y la desviación estándar de todos los valores obtenidos en los experimentos Concentración Relación Punto Pendiente Amplif. Número de inicial promedio Posit. / chips no. probados reacciones Secuencia HPV 16 oligo [µ?] 0.1 6.51 ± 14.00 ± 0,77 111.21 6 / 6 0.18 13,29 0.01 6.74 i 13,, 75 ± 1.47 96.26 ± 28.28 6 / 6 0.27 10 0.001 6.47 ± 15.25 ± 1.75 113.05 ± 6 / 6 0,28 33.52 0,0001 5.18 ± 23.83 i 4.55 S4. 2 ± 3S.85 6 / 6 1.07 0.00001 4.80 ± 25.13 ± 3.68 84.10 ± 38.27 12 / 12 1.3.7 15 0.000001 3.S4 ± 26.25 ± 5.52 42.68 ± 11.40 12 / 12 0.81 0.0000001 1.79 ± 33.75 ± 7.42 15.71 1.S3 2 / 12 0.09 0.00000001 0 / 12 0.000000001 0 / 12 20 0.00OO0O0QO1 0 / 12 Linea células SiHa [células/uL] 2000 4.S5 ± 2S.25 ± 1.25 80.09 ± 6.80 6 / 6 0.58 200 3.84 29.25 ± 4.00 52.47 ± 24.82 6 / 6 25 ±1.22 20 3. £6 ± 33.3C ± 7.62 44.04 ± 16.82 5 / 6 1.15 2.96 ± 39.75 i 1.06 27.95 ± 7.15 2 / 6 0,42 0.2 0 / 6 30 0.02 0 / 6
Claims (29)
1. Un sistema de diagnostico del tipo laboratorio en un chip, integrado, para llevar a cabo un proceso de preparación de una muestra fluida que contenga células y/o partículas, el sistema consiste en: (a) una entrada para la muestra fluida. (b) una unidad de lisis para lisar las células y/o partículas contenidas en la muestra fluida. (c) una unidad de extracción de ácido nucleico para la extracción de ácidos nucleicos de las células y partículas contenidas en la muestra fluida. (d) un depósito que contiene fluido para lisis en comunicación hidráulica con la entrada, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos. (e) un depósito que contiene un eluyente para retirar los ácidos nucleicos recolectados en la unidad de extracción de ácido nucleico, el depósito esta en comunicación hidráulica con la entrada, estando 'presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos. en donde la entrada de la muestra esta en comunicación hidráulica con la unidad de lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del liquido entre estas; en donde la unidad para lisis esta en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estas; en donde el depósito que contiene el liquido para lisis esta en comunicación hidráulica con la unidad de lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos; y en donde el depósito que contiene el eluyente esta en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos, y en donde el sistema además contiene una bomba o jeringa para introducir una muestra fluida y/o aire hacia la entrada, con lo cual el sistema es accionado por un solo sistema de bombeo .
2. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, además consiste en (g) una unidad para la reacción del ácido nucleico, preferentemente una unidad de amplificación y detección de la secuencia del ácido nucleico, en donde la unidad de extracción de ácido nucleico esta en comunicación hidráulica con la unidad de reacción del ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo de fluido entre estas.
3. El sistema de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, además comprende: (h) una unidad de residuos, en donde la unidad de residuos esta en comunicación hidráulica con la unidad de lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estas.
4. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, además comprende: (i) un depósito que contiene un disolvente de lavado, preferentemente etanol, cuyo depósito esta en comunicación hidráulica con la unidad de extracción del ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos.
5. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, además comprende: (j) un depósito que contiene otro disolvente de lavado, preferentemente isopropanol, cuyo depósito esta en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos.
6. El sistema de conformidad con la reivindicación 4 ó la reivindicación 5, caracterizado porque el depósito que contiene el eluyente esta en comunicación hidráulica con el depósito que contiene el primer disolvente de lavado y/o el depósito que contiene el segundo disolvente de lavado .
7. El sistema de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el eluyente, el primer disolvente de lavado y/o el segundo disolvente de lavado están contenidos en un depósito común.
8. El sistema de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el eluyente, el primer disolvente de lavado y/o el segundo disolvente de lavado están separados entre si en el depósito común por un fluido, preferentemente aire.
9. El sistema de conformidad con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, caracterizado porque el depósito común contiene un ducto en comunicación hidráulica con la entrada y la unidad de lisis.
10. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, además comprende una unidad de filtración, cuya unidad esta en comunicación hidráulica con la unidad de lisis.
11. El sistema de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la unidad de filtración comprende uno o más de los siguientes: un filtro terminal, un filtro de flujo transversal (por ejemplo canales microestructurados, fibras huecas porosas o membranas) , un sendimentador por gravedad, una centrifuga, un filtro de celdas acústicas, una trampa, dielectroforesis (DEP) , electroforesis, citometria de flujo y métodos basados en adsorción .
12. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la unidad de lisis además tiene medios para filtrar la muestra fluida .
13. El sistema de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el medio consiste en uno o más filtros terminales, un filtro de flujo cruzado (como canales microestructurados, fibras huecas, porosas ó membranas) , un sedimentador por gravedad, una centrifuga, un filtro de celdas acústicas, una trampa óptica, dielectroforesis (DEP) , electroforesis, citometria de flujo y métodos basados en adsorción.
14. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema además contiene medios para calentar el contenido de la unidad de lisis y/o de la unidad de extracción de ácido nucleico.
15. El sistema de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el medio consiste en uno o más elementos de Peltier ubicados en o junto a la unidad de lisis y/o de la unidad de extracción de ácido nucleico.
16. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la unidad de extracción de ácido nucleico está por lo menos parcialmente llena con perlas o partículas de sílice.
17. El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la unidad de extracción de ácido nucleico además comprende una o más series de electrodos junto a las perlas o partículas de sílice para recolectar y/o pre-concentrar los ácidos nucleicos eluidos .
18. El sistema de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque una o más series de electrodos consisten en electrodos de platino.
19. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para extraer los ácidos nucleicos presentes en un fluido biológico, un producto lácteo, un fluido ambiental o agua potable.
20. Un aparato para el análisis de muestras biológicas y/o ambientales, el aparato consiste en un sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
21. Un kit de ensayo para el análisis de muestras biológicas y/o ambientales, el kit consiste en un sistema como se define en una de las reivindicaciones 1 a la 19, y medios para poner en contacto la muestra con el sistema.
22. El aparato de conformidad con la reivindicación 20 o un kit de ensayo como se reclama en la reivindicación 21, el cual es desechable.
23. Un método para la fabricación de un sistema de diagnóstico del tipo laboratorio en un chip, integrado, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, cuyo método consiste en: A. disponer de un sustrato que tenga un rebajo de entrada, un rebajo para la unidad de lisis, un rebajo de la unidad de extracción de ácido nucleico, un rebajo para el depósito del fluido para lisis y un rebajo para el depósito del eluyente, en una superficie de éste; B. disponer de una cubierta; C. unir la cubierta con el sustrato para crear la (a) entrada, (b) la unidad de lisis, (c) la unidad de extracción de ácido nucleico, (d) el depósito del liquido para lisis y (e) del depósito del eluyente, cada uno estando definido por los rebajos respectivos en la superficie del sustrato y la superficie contigua de la cubierta.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23 además comprende el paso de introducir el liquido para lisis en el depósito del liquido para lisis antes o después de unir la cubierta al sustrato.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó la reivindicación 24 además comprende el paso de introducir eluyente en el depósito del eluyente ' antes o después de unir la cubierta al sustrato.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 además comprende el paso de introducir un primer disolvente de lavado, preferentemente etanol, en el depósito del eluyente antes o después de unir la cubierta al sustrato.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 además comprende el paso de introducir un segundo disolvente de lavado, preferentemente isopropanol, en el depósito del eluyente antes o después de unir la cubierta al sustrato.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 en donde el eluyente y/o el primer disolvente de lavado y/o el segundo disolvente de lavado están separados entre si por un fluido, preferentemente aire.
29. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó la reivindicación 24, además comprende: introducir un eluyente en el depósito del eluyente después de unir la cubierta al sustrato; introducir un primer volumen de un fluido inmiscible, preferentemente aire en el depósito del eluyente; introducir un primer disolvente de lavado, preferentemente etanol, en el depósito del eluyente, con lo cual el primer disolvente de lavado se separa del eluyente por el primer volumen del fluido inmiscible; introducir un segundo volumen de fluido inmiscible, preferentemente aire, en el depósito del eluyente; y introducir un segundo disolvente de lavado, preferentemente isopropanol, en el depósito del eluyente, con lo cual el segundo disolvente de lavado se separa del primer disolvente de lavado mediante el segundo volumen del fluido inmiscible. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describe un sistema de diagnostico del tipo laboratorio en un chip, integrado, para llevar a cabo un proceso de preparación de una muestra fluida que contiene células y/o partículas, el sistema consiste en: (a) una entrada para una muestra fluida; (b) una unidad de lisis para lisar las células y/o partículas contenidas en la muestra fluida; (c) una unidad de extracción de ácido nucleico para la extracción de ácidos nucleicos de las células y/o partículas contenidas en la muestra fluida; (d) un depósito que contiene líquido para lisis; (e) un depósito que contiene un eluyente para retirar los ácidos nucleicos recolectados en la unidad de extracción de ácido nucleico, en donde la entrada de la muestra esta en comunicación hidráulica con la unidad de lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del líquido entre éstas; en donde la unidad de lisis esta en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estas; en donde el depósito que contiene el líquido para lisis esta en comunicación hidráulica con la unidad de lisis, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos; y en donde el depósito que contiene el eluyente esta en comunicación hidráulica con la unidad de extracción de ácido nucleico, estando presente una válvula opcional para regular el flujo del fluido entre estos .
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