KR101626846B1

KR101626846B1 - 핵산 분리 방법 및 장치

Info

Publication number: KR101626846B1
Application number: KR1020090129134A
Authority: KR
Inventors: 황규연; 김준호; 남궁각
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2016-06-02
Also published as: KR20110072276A

Abstract

핵산을 효율적으로 분리하는 방법 및 핵산 분리 장치를 제공한다.

핵산 분리 장치, 핵산 분리 방법

Description

핵산 분리 방법 및 장치{Method and apparatus for isolating nucleic acids}

핵산을 효율적으로 분리하는 방법 및 핵산 분리 장치에 관한 것이다.

현재 시장에 출시되어 있는 핵산 분리 장치는 자성체 비드를 사용하는 방식과 필터 칼럼을 사용하는 방식으로 나눌 수 있다. 상기 장치들은 수 내지 수십 ㎍의 양으로 핵산을 분리할 수 있으며, 추출되는 핵산의 농도는 수 내지 수십 ng/㎕ 정도이다. 핵산이 사용되는 분자 진단의 과정 중에는 수백 ng/㎕ 이상의 고농도의 핵산을 요구하는 경우가 있으나, 상기 장치로는 고농도의 핵산 용출액을 수득하는데 한계가 있다.

고농도의 핵산을 수득하기 위해서는 용출액의 부피가 수 내지 수십 ㎕ 정도가 되어야 한다. 그러나, 자성체 비드를 사용하는 핵산 분리 장치의 경우, 핵산 분리 과정 중 자기장을 이용한 자성체 비드를 수집할 때, 비드가 분산된 용출액과 함께 움직이게 된다. 따라서, 용출액을 회수하기가 어려워 용출의 효율이 저하된다. 또한, 필터 칼럼을 사용하는 핵산 분리 장치의 경우, 용출 과정에서 핵산이 칼럼 내 필터의 표면적 전체에 결합된다. 그러므로, 소량의 용출액만으로 결합된 핵산 전체를 용출시키지 못하게 되어, 고농도의 핵산을 용출하기 어렵다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, 핵산을 보다 효율적으로 분리하는 방법 및 이와 관련된 장치가 여전히 요구되고 있다.

가스의 압력 조절 또는 초음파의 강도 조절에 의해 고체 지지체를 상기 용출액에 분산시키는 단계를 포함하는 핵산을 분리하는 방법 및 이를 이용한 핵산 분리 장치를 제공한다.

일 양상은 핵산을 포함하는 시료를 상기 핵산의 양에 대한 결합 효율이 70% 이상이 되도록 하는, 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와 접촉시켜 상기 핵산을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계; 상기 고체 지지체를 용출액과 접촉시키고, 일정한 시간 동안 가스의 압력 조절 또는 초음파의 강도 조절에 의해 상기 고체 지지체를 상기 용출액에 분산시키는 단계; 및 상기 고체 지지체로부터 용출액을 분리하는 단계를 포함하는 핵산 분리 방법을 제공한다.

상기 방법은, 핵산을 포함하는 시료를 상기 핵산의 양에 대한 결합 효율이 70% 이상이 되도록 하는, 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와 접촉시켜 상기 핵산을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.

용어, "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 상기 핵산은 DNA (gDNA 및 cDNA) 및/또는 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 분자의 기본 구성 단위로서, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하며, 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다.

상기 단계에 있어서, 핵산을 포함하는 시료를 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와의 접촉은 예를 들어, 상기 고체 지지체에 상기 핵산을 포함하는 시료를 첨가하여 직접 혼합하는 방법으로 실시될 수 있다.

상기 접촉 단계에 사용되는 상기 시료는 핵산을 포함하는 시료이면 어떠한 것이라도 가능하다. 핵산을 포함하는 시료는 생물학적 시료 또는 비생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 예를 들어, 바이러스, 세균, 조직 또는 세포 등을 포함한다. 상기 비생물학적 시료는 예를 들어, 합성된 핵산 산물 또는 PCR에 의한 증폭 산물 등을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 생물학적 시료는 시료 중에 포함된 핵산이 상기 고체 지지체와 결합을 용이하게 할 수 있도록 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라, 생물학적 시료의 추출물(extract)을 추출하여 상기 방법에 적용할 수 있다.

또한, 상기 단계에서, 상기 핵산의 양에 결합 효율이 70% 이상, 또는 90% 이상이 되도록 하는, 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체가 사용될 수 있다. 상기 결합 효율(binding efficiency)은 상기 고체 지지체에 상기 핵산이 결합할 수 있는 정도를 나타내며, 결합 친화도(binding affinity) 또는 결합량일 수 있다. 예를 들어, 결합 효율이 70%가 되도록 하는 것은 시료로 사용되는 핵산의 양에 대하여 70%의 중량비에 해당하는 고체 지지체를 사용하는 것일 수 있다.

상기 시료가 비생물학적 시료인 경우라면, 상기 핵산이 포함된 시료로부터, 상기 시료가 생물학적 시료인 경우라면, 상기 생물학적 시료의 추출물로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 핵산의 양을 측정하여, 상기 고체 지지체의 사용량을 결 정할 수 있다. 상기 고체 지지체를 상기 시료 내에 포함된 핵산보다 과량을 사용함으로써, 충분한 양의 고체 지지체에 핵산이 모두 결합할 수 있게 되어 핵산 용출의 효율을 증가시킬 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 핵산이 결합된 고체 지지체는 하기 기재될 핵산 분리 장치의 필터 칼럼 내의 필터 위에 패킹(packing)될 수 있다. 상기 필터의 포어 크기는 상기 고체 지지체가 패킹될 수 있도록 상기 고체 지지체의 크기보다 작아야 한다. 예를 들어, 상기 고체 지지체의 직경은 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛ 일 수 있다.

상기 접촉 단계에서 사용될 수 있는 상기 고체 지지체는 슬라이드, 웨이퍼, 비드, 막 및 판으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들면, 비드를 사용할 수 있다. 상기 비드는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 고체 지지체는 핵산에 결합하는 특성을 가질 수 있다. 즉, 상기 고체 지지체는 핵산과 이온 결합, 흡착 등의 비공유 결합을 통해 핵산에 결합하는 특성을 갖는 것이다. 예를 들어, 상기 고체 지지체는 그 자체 또는 상기 고체 지지체의 표면에 핵산이 결합할 수 있는 관능기가 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체에 코팅될 수 있는 관능기는 예를 들면, 아민계 혹은 카르복실계의 관능기일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 방법은 상기 접촉 단계 후에 결합되지 않은 시료를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척은 당업계에 널리 알려진 세척액을 사용하여 이루 어질 수 있다. 상기 세척액은 상기 고체 지지체에 결합된 핵산은 이탈시키지 않으면서, 상기 고체 지지체에 부착되지 않는 핵산 등의 물질을 제거할 수 있는 특성을 갖는 것이면 어떠한 물질이라도 가능하다. 예를 들면, 상기 세척액은 상기 특성을 가지면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물을 제거할 수 있는 용액이다. 예를 들면, 상기 접촉 단계 후에, 70%의 에탄올을 필터상에 패킹된 고체 지지체에 통과시켜 상기 고체 지지체에 결합되지 않은 시료를 세척할 수 있다. 상기 세척 단계를 통해, 핵산을 포함하는 시료 중에 포함된 불순물을 제거할 수 있다. 따라서, 상기 핵산 및 고체 지지체 복합체에 존재할 수 있는 불순물을 제거함으로써, 이후 단계에서 핵산의 용출이 더욱 효율적으로 이루어질 수 있게 할 수 있고, 핵산의 순도를 증가시키도록 하여, 후속 단계를 원활하게 진행할 수 있도록 도움을 줄 수 있다.

상기 방법은 또한, 상기 고체 지지체를 용출액과 접촉시키고, 일정한 시간 동안 가스의 가스의 압력 조절 또는 초음파의 강도 조절에 의해 상기 고체 지지체를 상기 용출액에 분산시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계에 있어서, 상기 용출액과의 접촉은 상기 접촉 단계에서 형성된 핵산-고체 지지체 복합체에 결합되어 있는 핵산을 상기 고체 지지체로부터 분리하기 위해 실시한다. 용어 "핵산-고체 지지체 복합체(nucleic acid-solid support complex)"는 상기 접촉 단계에서 상기 핵산과 상기 고체 지지체가 수소 결합, 반데르발스 힘, 이온 결합 또는 소수성 상호작용 등의 비공유 결합을 통해 형성된 복합체를 의미한다.

상기 용출액은 예를 들어, pH가 5 내지 12인 것일 수 있으며, 상기 pH 범위 내의 당업계에 공지된 용출액, 예를 들어, 물 또는 Tris-HCl 등을 사용하여 상기 핵산-고체 지지체 복합체를 분산시킬 수 있다. 또한, 고농도로 핵산을 분리하기 위해, 상기 용출액의 양은 5 ㎕ 내지 1000 ㎕, 5 ㎕ 내지 500 ㎕ 또는 5 ㎕ 내지 100 ㎕가 되도록 사용될 수 있다.

상기 단계는 일정한 시간 동안 가스의 압력 조절(즉, 가압 및 감압) 또는 초음파의 강도 조절(즉, 인가 및 비인가)를 반복함으로써 이루어질 수 있다. 가스의 가압 및 감압 또는 초음파의 인가 및 비인가에 의하여 상기 핵산-고체 지지체 복합체는 용출액 중에 분산될 수 있다. 구체적으로, 상기 가스 또는 초음파는 일정한 시간 동안, 예를 들어, 1 내지 10초의 펄스 및 1 내지 20초의 휴지기를 반복하여 가압 및 감압 또는 인가 및 비인가될 수 있다. 상기 반복은 예를 들어. 1 내지 200회, 5 내지 100회 또는 10 내지 50회 동안 이루어질 수 있다. 상기 가압 및 감압 또는 인가 및 비인가는 프로그램 하에 자동으로 이루어질 수 있다. 상기 단계에서 가압된 가스(pressurized gas)를 사용하는 경우, 상기 가압된 가스는 대기압에 비해 0.01 Pa 내지 200 kPa, 0.1 Pa 내지 100 kPa 또는 1 Pa 내지 100 kPa의 압력이 되도록 가압될 수 있다. 또한, 초음파를 사용하는 경우, 상기 초음파는 15 내지 400 kHz, 30 내지 200 KHz 또는 50 내지 100 KHz의 주파수로 인가될 수 있다.

상기 방법은 또한, 상기 고체 지지체로부터 용출액을 분리하는 단계를 포함한다.

상기 단계에서, 용출액의 분리는 상기 분산 과정을 통해 핵산-고체 지지체 복합체로부터 핵산이 용출된 용출액을 상기 고체 지지체로부터 분리하여 핵산이 용출된 용출액만을 얻는 것을 의미한다. 상기와 같이, 가압된 가스의 가압 및 감압 또는 초음파의 인가 및 비인가로부터 발생하는 외부의 물리적인 힘을 이용함으로써, 상기 고체 지지체에 결합되어 있던 핵산은, 상기 용출액에 의한 화학적인 분리와 더불어, 더욱 효율적으로 분리될 수 있다. 상기 분리된 핵산이 포함된 용출액은 당업계에 널리 알려진 분리 방법, 예를 들어, 원심 분리, 가압된 가스, 진공 등을 통해 상기 고체 지지체로부터 분리될 수 있다.

다른 양상은 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체가 충진될 수 있는, 상단 개구부, 하부 개구부 및 내부에 필터가 배치된 필터 칼럼; 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체를 액체 중에 분산시키기 위한 상기 필터 칼럼에 배치된 분산 유니트; 및 상기 분산 유니트의 작동을 조절하기 위한 분산 조절부를 포함하는 핵산 분리 장치를 제공한다.

상기 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체에 대한 설명은 상기한 바와 같다. 상기 고체 지지체가 충진될 수 있는 필터 칼럼은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라, 상업적으로 이용가능한 빈 필터 칼럼에 상기 고체 지지체를 직접 충진하거나, 고체 지지체가 충진된 필터 칼럼을 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 필터 컬럼에 충진될 수 있는 고체 지지체는 핵산과 이미 결합되어 있는 것일 수 있다. 즉, 상기 핵산-고체 지지체 복합체의 형태로 필터 칼럼에 충진될 수 있다.

상기 필터 칼럼은 예를 들어, Qiagen 사의 스핀 칼럼 등일 수 있다. 또한, 상기 필터 칼럼의 재질은 초음파 투과성 재질일 수 있으며, 예를 들어, 금속, 세라믹, 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 필터 칼럼의 형상은 예를 들어, 몸체는 원통형이고, 하부는 개방되어 있는 콘(con) 형상으로 되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체는 상기 필터 칼럼의 하단에 충진되어 있을 수 있다. 상기 필터 칼럼의 하단 개구부에는 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체가 유출되지 않도록 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체의 크기보다 작은 크기의 포어를 포함하는 필터를 포함할 수 있다.

상기 분산 유니트는 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체를 액체 중에 분산시킬 수 있는 유니트일 수 있다. 상기 분산 유니트는 예를 들면, 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체에 가압된 가스를 가하는 가압 장치 또는 초음파를 인가하는 초음파 발생 장치(sonicator)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 가압 장치 또는 초음파 발생 장치는 상기 필터 칼럼에 상단 또는 하단 개구부에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 가압 장치가 연결되는 경우, 상기 필터 칼럼에서 핵산 용출액의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 유체 소통가능하게 연결될 수 있다. 또한, 상기 가압 장치 또는 초음파 발생 장치는 착탈 가능하도록 장착될 수 있다. 예를 들어, 상기 가압 장치는 상기 필터 칼럼의 하단 개구부에 고무 재질의 관을 통해 연결되어 작동시킬 수 있다.

한편, 상기 필터 칼럼 내의 물질이 외부로 유출되는 것을 방지하기 위해 상 기 가압 장치 또는 초음파 발생 장치가 연결된 반대편 말단에 상기 필터 칼럼의 개구부를 개폐할 수 있는 커버를 더 포함할 수 있다. 따라서, 핵산을 포함하는 시료, 핵산-고체 지지체 복합체, 세척액 또는 용출액 등을 상기 커버가 개방된 상태에서 필터 컬럼에 수동으로 주입할 수 있다. 또한, 상기 커버는 공기가 순환할 수 있는 공기 순환구(vent hole)를 더 포함할 수 있다.

상기 장치에서 분산 유니트로써, 가압 장치가 장착되어 있는 경우, 상기 가압 장치는 상기 필터 칼럼에서 핵산 용출액의 용출 방향의 개구부 말단에 연결될 수 있으며, 예를 들어, 유체 소통가능하게 연결될 수 있다. 상기 가압 장치는 분산 조절부를 통해 압력의 조절이 가능한 장치일 수 있다. 상기 압력의 조절은 프로그램 하에 자동으로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 가압 장치를 조절함으로써, 예를 들어, 가압된 질소 기체를 상기 필터 칼럼 상에 존재하는 핵산-고체 지지체 복합체를 포함하고 있는 용출액에 주입하여, 상기한 압력 및 시간의 범위로 가압된 가스를 가압 및 감압 또는 초음파를 인가 및 비인가함으로써 상기 핵산-고체 지지체 복합체를 용출액에 분산시킬 수 있다.

상기 장치에서 분산 유니트로써, 초음파 발생 장치가 장착되어 있는 경우, 상기 초음파 발생 장치의 진동자는 상기 필터 칼럼 내부에 장착되어 있을 수 있다. 상기 초음파 발생 장치는 분산 조절부를 통해 초음파 인가 및 비인가의 조절이 가능한 장치일 수 있다. 상기 초음파 인가 및 비인가의 조절은 프로그램 하에 자동으로 이루어지는 것일 수 있다. 초음파의 인가 및 비인가에 의해, 진동자는 핵산-고체 지지체 복합체를 포함하고 있는 용출액을 진동시켜, 상기 용출액 내에서 핵산- 고체 지지체 복합체를 분산시킬 수 있다.

상기 핵산 분리 장치는 상기 필터 칼럼에 세척액을 공급하는 착탈 가능한 세척액 저장부를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 필터 칼럼에 용출액을 공급하는 착탈 가능한 용출액 저장부를 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 분리 장치는 상기 필터 칼럼에 시료를 공급하는 착탈 가능한 시료 저장부를 더 포함할 수 있다.

상기 세척액 저장부, 용출액 저장부 또는 시료 저장부는 각각 상기 필터 칼럼에서 핵산의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 연결될 수 있다. 상기 세척액 저장부, 용출액 저장부 또는 시료 저장부는 상기 필터 칼럼의 핵산의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 상기 세척액 저장부, 용출액 저장부 또는 시료 저장부와 연결될 수 있는 통로를 형성시킴으로써 장착시킬 수 있다. 이때, 상기 세척액 저장부, 용출액 저장부 또는 시료 저장부는 상기 필터 칼럼과 유체 소통가능하도록 관을 통해 연결될 수 있다. 한편, 상기 세척액 저장부, 용출액 저장부 또는 시료 저장부로부터 상기 필터 칼럼으로 공급되는 세척액, 용출액 또는 시료는 상기 세척액 저장부, 용출액 저장부 또는 시료 저장부와 연결된 제1 조절부, 제2 조절부 또는 제3 조절부에 의해 수동 또는 자동으로 조절될 수 있다. 또한, 상기 필터 칼럼으로부터 발생하는 폐액을 저장할 수 있는 폐액 저장부를 상기 필터 칼럼의 핵산의 용출 방향의 개구부 말단에 유체 소통가능하게 포함할 수 있다.

핵산을 고농도로 분리하는 방법 및 핵산 분리 장치에 의하면, 핵산을 포함하 는 시료로부터 소량의 용출액에 고농도의 핵산을 효율적으로 용출하여 분리할 수 있다.

이하 하나 이상의 실시예를 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 핵산 분리 장치

도 1 내지 도 3은 일 실시예에 따른 핵산 분리 장치에 관한 모식도이다.

이하, 도 1 내지 도 3을 참조하여 핵산 분리 장치 및 그를 이용한 핵산 분리 방법의 일 구체예를 설명하도록 한다.

일 구체예에 따른 핵산을 분리하기 위한 장치는 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체(120) 또는 핵산-고체 지지체 복합체(130)가 충진될 수 있는 필터 칼럼(100); 및 상기 고체 지지체(120) 또는 핵산-고체 지지체 복합체(130)를 액체 중에 분산시키기 위해 상기 필터 칼럼(100)의 내부 또는 외부에 배치된 분산 유니트(150)를 포함한다. 또한, 상기 핵산 분리 장치는 분산 과정 중에 필터 칼럼(100) 내부의 물질이 외부로 유출되는 것을 방지하기 위해 상기 필터 칼럼의 개구부를 개폐할 수 있는 커버(140)를 더 포함할 수 있다. 상기 장치는 세척액 저장부(160), 용출액 저장부(170) 또는 시료 저장부(180)를 유체 소통가능하게 더 포함할 수 있으며, 이들을 적절히 조합하여 포함시킬 수 있다. 또한, 상기 장치는 분산 유니트(150)를 조절하는 분산 조절부(220)를 더 포함할 수 있고, 상기 각각의 저장 부(160, 170, 180)는 그에 저장된 액체의 양을 조절하는 제1 조절부(190), 제2 조절부(200) 또는 제3 조절부(210)를 더 포함할 수 있다.

도 1 및 도 3을 참조하여 핵산 분리 과정을 설명하도록 한다. 핵산을 포함하는 시료를 상기 고체 지지체(120)가 충진된 필터 칼럼(100)에 제공하여, 상기 고체 지지체(120)와 접촉시키면, 핵산과 상기 고체 지지체(120)가 결합된 핵산-고체 지지체 결합체가 형성된다. 이후, 핵산에 포함된 불순물을 제거하기 위해 세척액을 이용하여 상기 핵산-고체 지지체 결합체를 세척한다. 이때, 세척액은 실험자가 필터 칼럼(100)에 직접 주입하거나, 필터 칼럼(100)에서 핵산의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 연결될 수 있는 착탈 가능한 세척액 저장부(160)로부터 공급될 수 있다. 또한, 상기 세척액 저장부(160)로부터 상기 필터 칼럼으로 공급되는 세척액은 상기 세척액 저장부(160)와 연결된 제1 조절부(190)에 의해 조절될 수 있다.

이후, 상기 필터 칼럼(100)에 용출액을 첨가하여, 상기 핵산-고체 지지체 결합체를 분산시킨다. 상기 용출액은 실험자가 필터 칼럼(100)에 직접 주입하거나, 필터 칼럼(100)의 핵산 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 연결될 수 있는 착탈 가능한 용출액 저장부(170)로부터 공급될 수 있다. 상기 용출액 저장부(170)로부터 상기 필터 칼럼으로 공급되는 용출액은 상기 용출액 저장부(170)와 연결된 제2 조절부(200)에 의해 조절될 수 있다. 또한, 상기 용출액 및 핵산-고체 지지체 결합체의 분산은 상기 분산 유니트(150)에 의해 이루어지며, 이때, 상기 분산 유니트(150)는 상기 필터 칼럼(100)에서 핵산의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 유체 소통가능하게 연결될 수 있는 착탈 가능한 가압 장치 또는 초음파 발생 장치(sonicator)일 수 있다. 상기 가압 장치로부터 발생하는 가압된 가스 또는 초음파 발생 장치로부터 발생하는 초음파에 의해 상기 용출액 및 핵산-고체 지지체 결합체는 필터 칼럼(100) 내에서 충분히 분산되며, 이 과정 중에 상기 핵산-고체 지지체 결합체로부터 핵산이 용출액 중에 용출된다. 분산 유니트(150)로 가압 장치 또는 초음파 발생 장치를 사용하는 경우, 압력 또는 초음파는 분산 조절부(220)를 통해 조절할 수 있다. 상기 분산 조절부(220)로부터 조절되는 압력 또는 초음파는 펄스(pulse) 및 휴지기(rest)를 반복하는 형태일 수 있으며, 이러한 조절은 상기 분산 조절부(220)로부터 프로그램 하에 자동으로 이루어질 수 있다. 한편, 고체 지지체로부터 용출액의 분리는 당업계에 공지된 방법에 따라 이루어질 수 있다.

또한, 도 2와 같이 상기 핵산 분리 장치에서 시료 제공부를 사용하는 경우, 상기 핵산-고체 지지체 복합체(130)의 형성은 핵산을 포함하는 시료를 상기 시료 제공부(180)에서 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 핵산-고체 지지체 복합체(130)는 상기 필터 칼럼(100)에서 핵산의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 연결될 수 있는 착탈 가능한 시료 저장부(180)로부터 상기 필터 칼럼(100)으로 공급되어 상기 필터 칼럼(100)에 충진될 수 있다. 또한, 상기 시료 저장부(180)로부터 상기 필터 칼럼으로 공급되는 시료는 상기 시료 저장부(180)와 연결된 제3 조절부(210)에 의해 조절될 수 있다. 필터 칼럼에 충진된 상기 핵산-고체 지지체 복합체는 상기와 동일한 방법으로 세척 및 용출 과정을 거치게 되고, 그 결과 핵산은 용출액으로 용출될 수 있다.

하기 실시예는, 상기 하나 이상의 구체예에 따른 핵산 분리 장치를 이용하여 핵산을 분리하고, 상기 장치의 효율을 확인한 결과이다.

실시예 2: 고체 지지체의 양 및 압력의 조절에 따른 폴리뉴클레오티드 용출의 효율성 평가

자체 제작한 칼럼에 포어 크기 3 ㎛ 를 갖는 필터(cellulose acetate, Advantec)를 칼럼 내부의 하단 개구부에 장착하여 필터 칼럼으로 사용하였다. 마이크로 튜브에 PEG(20% 폴리에틸렌, 2.5M NaCl)용액 존재 하에서 비드(직경 4 ㎛의 카르복실-코팅된 폴리스티렌 비드 30 ㎕(Bangs Lab))와 임의의 폴리뉴클레오티드 단편(약 1000 내지 2000 bp, 102.6 ng/㎕)을 10분 동안 결합시키고, 상기의 비드-핵산 복합체를 상기 필터 칼럼에 가압하여(150 kPa) 8분 동안 충진시켰다. 이때, 폴리뉴클레오티드의 단편의 부피를 증가시켜가며, 정제 및 농축 효과를 동시에 평가하였다. 이후, 가압 상태로 상기 필터 칼럼에 75 %의 에탄올을 1 ㎖ 첨가하여, 결합되지 않은 폴리뉴클레오티드 및 불순물을 제거하였다. 상기 필터 칼럼을 2분 동안 75 kPa, 1분 동안 112.5 kPa로 가압한 다음, 30초 동안 최초 가압 상태(150 kPa)에서 상기 비드를 건조시키고, 모든 시료에 대하여 핵산 용출액(dH₂O) 50 ㎕를 첨가하였다. 이후, 상기 필터 칼럼의 하단에 고무관으로 연결된 가압 장치로부터 질소 기체를 발생시켜, 70 kPa, 60 kPa, 및 50 kPa 의 압력으로 각각 5분 동안 상기 비드를 가압하였다. 상기 가압은 각각 2초 동안 펄스(pulse)를, 8초 동안 휴지 기(rest)를 두는 조건으로 하였다. 이후, 150 kPa의 압력으로 5 분 동안 가압하여 폴리뉴클레오티드 용출액을 수득하였다.

상기 수득한 폴리뉴클레오티드 용출액 중의 폴리뉴클레오티드의 농도, 폴리뉴클레오티드의 총량 및 수율을 자외선과 피코그린 다이(picogreen dye)로 정량하여 표 1에 나타내었다.

시료	투입 핵산 농도(ng/㎕)	투입 핵산 용액 부피 (㎕)	획득 핵산 농도 (ng/㎕)	획득 핵산 총량(㎍)	수율(%)	핵산 농축률 (배)	260/280
투입 핵산	102.6						1.62
1	102.6	100	157.1	7.85	82	1.53	1.89
2	102.6	500	902	45.1	88	8.79	1.85
3	102.6	1000	1730	86.5	84	16.9	1.90
4	102.6	2000	3795	189.8	92	37.0	1.88

표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실험에서 50 ㎕의 용출액을 이용하여 효과적으로 핵산을 정제할 수 있었다. 또한, 저농도의 샘플을 고농도로 농축이 가능함을 확인할 수 있었으며, 수율은 80% 이상이었다. 또한, 표 1에서 흡광도 비 260 nm/280 nm (DNA/protein)가 1.8 이상으로 증가된 것으로 보아, 분리된 폴리뉴클레오티드는 순도가 높음을 확인할 수 있었다. 한편, 상기 실시예와 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 펄스와 휴지기 없이 50 kPa의 압력으로 20분 동안 일정하게 가압한 결과, 상기 필터 칼럼에서 용출액의 넘침(overflow) 현상이 간헐적으로 발생하여 원하는 폴리뉴클레오티드 용출액을 수득할 수 없었다.

도 1은 일 구체예에 따른 핵산 분리 장치에 관한 것으로서, 분산 유니트로 가압장치가 장착된 것인 핵산 분리 장치의 모식도이다.

도 2는 일 구체예에 따른 핵산 분리 장치에 관한 것으로서, 분산 유니트로 가압장치가 장착되고, 시료 저장부가 추가된 것인 핵산 분리 장치의 모식도이다.

도 3은 일 구체예에 따른 핵산 분리 장치에 관한 것으로서, 분산 유니트로 초음파 발생 장치가 장착된 것인 핵산 분리 장치의 모식도이다.

<도면에 사용된 주요 부호에 대한 설명>

100: 필터 칼럼

110: 필터

120: 고체 지지체

130: 핵산-고체 지지체 복합체

140: 커버

150: 분산 유니트

160: 세척액 저장부

170: 용출액 저장부

180: 시료 저장부

190: 제1 조절부

200: 제2 조절부

210: 제3 조절부

220: 분산 조절부

Claims

핵산을 포함하는 시료를 핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와 접촉시켜 상기 핵산을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계;

상기 핵산이 결합된 고체 지지체를 용출액과 접촉시키고, 상기 용출액에 가압된 가스를 주입하거나 초음파를 인가하여 상기 핵산이 결합된 고체 지지체를 상기 용출액에 분산시키는 단계로서, 상기 가스의 주입에 의한 압력의 부가 또는 초음파의 인가가 펄스 및 휴지기의 반복에 의해 이루어지는 것인 단계; 및

상기 고체 지지체로부터 용출액을 분리하는 단계를 포함하는 핵산 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 결합시키는 단계 후에 결합되지 않은 시료를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 직경이 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 펄스 및 휴지기의 반복은 1 내지 10초의 펄스 및 1 내지 30초의 휴지기의 반복인 것인 방법.
핵산에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체가 충진될 수 있는, 상단 개구부, 하부 개구부 및 내부에 필터가 배치된 필터 칼럼;

상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체를 액체 중에 분산시키기 위해 상기 필터 칼럼에 배치되고, 가압된 가스를 주입하여 압력을 가하는 가압 장치 또는 초음파를 제공하는 초음파 발생 장치(sonicator)인 분산 유니트; 및

상기 분산 유니트로부터 제공되는 압력의 부가 또는 초음파의 인가를 펄스 및 휴지기를 반복하는 형태로 조절하기 위한 분산 조절부를 포함하는 핵산 분리 장치.
삭제
제6항에 있어서, 상기 가압 장치 또는 초음파 발생 장치는 상기 필터 칼럼에 상단 또는 하단 개구부에 연결된 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 가압 장치 또는 초음파 발생 장치는 상기 필터 칼럼에서 핵산 용출액의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 연결된 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 장치는 상기 가압 장치 또는 초음파 발생 장치가 연결된 반대편 말단에 상기 필터 칼럼의 개구부를 개폐할 수 있는 커버를 더 포함하는 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 초음파 발생 장치의 진동자는 상기 고체 지지체 또는 핵산-고체 지지체 복합체 집단의 내부에 포함되어 있는 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 필터 칼럼에서 핵산 용출액의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 유체 소통가능하게 연결되며, 상기 필터 칼럼에 세척액을 공급하는 착탈 가능한 세척액 저장부를 더 포함하는 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 필터 칼럼에서 핵산 용출액의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 유체 소통가능하게 연결되며, 상기 필터 칼럼에 용출액을 공급하는 착탈 가능한 용출액 저장부를 더 포함하는 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 필터 칼럼에서 핵산 용출액의 용출 방향 또는 그 반대 방향의 개구부 말단에 유체 소통가능하게 연결되며, 상기 필터 칼럼에 핵산을 포함하는 시료를 공급하는 착탈 가능한 시료 저장부를 더 포함하는 것인 장치.
제6항에 있어서, 상기 필터 칼럼의 재질은 초음파 투과성 재질인 것인 장치.