KR102374808B1 - Abt를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 제비집을 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 투입하여 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 용매에 비극성 고분자 비드를 투입하여 시알산(sialic acid)을 흡착하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 시알산이 흡착된 비극성 고분자 비드를 분리하고, 탈착제를 투입하여 시알산을 탈착하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 탈착된 시알산을 고형화 하는 단계;를 포함하는 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법은 비극성 고분자 비드를 이용하여 제비집 내의 시알산을 비극성 고분자 비드에 흡착 시키고, 이를 분리 후 탈착제를 투입해 시알산을 비극성 고분자 비드에서 탈착시키는 친화성 비드 기술(Affinity Bead Technique, ABT)을 이용하여 간단한 방법으로 제비집에서 시알산을 분리 정제할 수 있으며, 낮은 에너지를 이용하여 생산성이 높고, 방복적인 생산 공정의 적용이 용이하다는 장점이 있다.

Description

ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법{Purification method of sialic acid in Swallow's nest using ABT}
본 발명은 ABT(Affinity Bead Technique, 친화성 비드기술)를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 분리정제가 어려웠던 시알산을 제비집에서 추출하기 위해 ABT를 이용하여 제비집에 포함된 시알산을 분리정제하는 방법에 관한 것이다.
시알산(sialic acid)은 인지 기능 개선의 효능을 가진 제비집의 성분으로 인지 기능 개선의 메커니즘이 S. Careena et al., “Effect of Edible Bird’s Nest Extract on Lipopolysaccharide-Induced Impairment of Learning and Memory in Wistar Rats,” Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, vol. 2018, pp. 1-7, Aug. 2018.과 D. L. Goh, K. Y. Chua, F. T. Chew et al., “Immunochemical characterization of edible bird’s nest allergens,” Te Journal of Allergy and Clinical Immunology, vol. 107, no. 6, pp. 1082-1088, 2001.과 A. Hidalgo, V. Burgos, H. Viola, J. Medina, and P. Argibay, “Differential expression of glycans in the hippocampus of rats trained on an inhibitory learning paradigm,” Neuropathology, vol. 26, no. 6, pp. 501-507, Dec. 2006. 등의 선행연구에 나타나있다.
인지 기능 개선의 메커니즘은 제비집 추출물 중 시알산이 뇌 신경 시냅스의 적절한 기능에 중요한 화합물인 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc)을 형성하기 위해 공유 결합되어있는 것으로 밝혀졌고, GalNAc는 또한 뇌기능(기억력 및 인지기능)를 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 연구 된 모든 뇌의 해마부 서브필드에서 sWGA 및 GSLⅡ는 음성인 반면에 시알산 물질인 GalNAc, GluNAc는 양성으로 나타나 제비집의 시알산 성분이 뇌기능(기억력 및 인지기능) 향상과 뇌질환(치매 및 알츠하이머 등)에 효과가 있음이 밝혀졌다.
제비집 내부에 시알산이 사람의 2천배, 로얄 제리의 2백배에 가까운 양이 존재하여 시알산을 추출하기 위한 적합한 소재로 널리 알려져 있다.
특히, 시알산을 합성하거나 천연의 시알산을 추출하여 사용하는 것과 비교하여 제비집의 시알산을 분리정제 후 사용하는 것이 경제적이고, 순도가 높으며 제조가 용이한 장점을 가지고 있다.
시알산을 제비집에서 분리 정제하는 방법은 일반적으로 물 추출, 알코올 추출 및 초음파 추출등을 사용하며, 또는, CO2 초임계 유체 추출법, 겔 크로카토그래피, 한외 여과 및 흡착법 등을 사용할 수 있으나, 이물질 제거 등의 분리 정제 과정이 복잡하고, 수율이 낮으며, 다량의 화학 제품을 이용하여 이에 따른 높은 에너지를 사용하는 문제점이 있었다.
따라서, 시알산을 인지 기능 향상을 위한 소재로 활용하기 위해, 저렴한 비용으로 분리정제가 가능하고, 생산성이 높으며, 환경오염을 극소화 할 수 있는 제비집의 시알산 분리 정제 방법에 대한 연구가 시급한 실정이다.
등록특허 제1352282호
본 발명에서는 시알산을 인지 기능 향상을 위한 소재로 활용하기 위해, 저렴한 비용으로 분리정제가 가능하고, 생산성이 높으며, 환경오염을 극소화 할 수 있는 제비집의 시알산 분리 정제 방법을 제공하고자 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은 (a) 제비집을 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 투입하여 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 용매에 비극성 고분자 비드를 투입하여 시알산(sialic acid)을 흡착하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 시알산이 흡착된 비극성 고분자 비드를 분리하고, 탈착제를 투입하여 시알산을 탈착하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 탈착된 시알산을 고형화 하는 단계;를 포함하는 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법을 제공한다.
또한, 상기 단계 (c)의 탈착제는 증류수 단독, 유기 용매 단독, 증류수와 유기 용매 혼합액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 유기 용매는 에탄올(ethanol)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 에탄올의 중량%는 시알산의 탈착 속도에 따른 종속 변수인 것을 특징으로 한다.
아울러, 상기 비극성 고분자 비드는 디비닐 벤젠(Divinylbenzene)과 스티렌(styrene)의 가교 결합으로 형성된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법은 비극성 고분자 비드를 이용하여 제비집 내의 시알산을 비극성 고분자 비드에 흡착 시키고, 이를 분리 후 탈착제를 투입해 시알산을 비극성 고분자 비드에서 탈착시키는 친화성 비드 기술(Affinity Bead Technique, ABT)을 이용하여 간단한 방법으로 제비집에서 시알산을 분리 정제할 수 있으며, 낮은 에너지를 이용하여 생산성이 높고, 방복적인 생산 공정의 적용이 용이하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 시알산 분리 정제 방법은 조작 에너지가 이온성 고분자 비드에 비해 낮은 비극성 고분자 비드를 사용하여 환경오염을 유발하는 유기성 솔벤트의 사용을 최소화할 수 있어 친환경적인 장점이 있다.
또한, 본 발명의 시알산 분리 정제 방법은 g당 수 십만원에서 수 백만원에 달하는 종래의 시알산을 g당 수 천원 단위로 저렴하게 생산이 가능하여 생산 효율성 및 경제성이 높은 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 분리 정제 방법의 공정도.
도 2는 본 발명에 따라 분리 정제되는 시알산 및 시알산의 이성질체 구조식.
도 3은 본 발명에 따라 분리 정제되는 시알산 중 N-acetyl-neuraminic acid(Neu5Ac)와 N-glycolyl-neuraminic acid(Neu5Gc)의 구조식.
도 4는 본 발명에서 사용되는 비극성 고분자 비드의 구조도.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 흡착 단계에 사용되는 흡착 칼럼을 도시한 모식도.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 흡착 단계의 용액 흐름을 나타내는 장치도.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 비극성 고분자 비드에서의 시알산의 등온 곡선도.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 비극성 고분자 비드에서의 2차 곡선도.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 탈착제에 따른 시알산의 탈착 곡선도.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 비극성 고분자 비드에서의 시알산의 흡착 및 탈착 곡선도.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 정제된 시알산의 HLPC 분석도.
본 발명의 실시예에서 제시되는 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있다. 또한, 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이하에서는 본 발명의 시알산 분리 정제 방법에 관하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
도 1은 본 발명에 따른 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법을 순서대로 작성한 공정도로서, 이를 참고하여 설명하면 본 발명은 (a) 제비집을 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 투입하여 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 용매에 비극성 고분자 비드를 투입하여 시알산(sialic acid)을 흡착하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 시알산이 흡착된 비극성 고분자 비드를 분리하고, 탈착제를 투입하여 시알산을 탈착하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 탈착된 시알산을 고형화 하는 단계;를 포함하는 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 단계 (a)는 제비집을 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 투입하여 추출하는 단계(S110)이다.
본 단계는 제비집을 상기한 용매에 투입하여 제비집 내의 성분을 추출하는 단계이다.
본 발명에서 사용되는 제비집은 공지된 다양한 제비집을 사용할 수 있으며, 이러한 제비집이 가지고 있는 시알산(sialic acid)은 사람의 2천배, 로얄 제리의 2백배에 가까운 양을 가지고 있어 저렴하면서도 수급이 용이하고 또한 많은 양을 추출할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
본 발명에서의 용매는 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 투입할 수 있으며, 각각 단독 또는 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매를 혼합하여 용매로 사용할 수 있다.
용매에서 물은 알칼리 이온수로 사용할 수 있으며, 유기 용매는 공지된 다양한 용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올(ethanol)을 사용할 수 있다.
본 발명의 단계 (b)는 단계 (a)에서 추출된 용매에 비극성 고분자 비드를 투입하여 시알산을 흡착하는 단계(S120)이다.
본 단계에서는 단계 (a)에서 추출된 용매 내의 시알산 및 기타 다른 성분의 혼합물에서 시알산 만을 추출하기 위하여 비극성 고분자 비드와 접촉시켜 시알산을 비극성 고분자 비드에 흡착시키는 단계이다.
본 발명에서 추출하고자 하는 시알산은 도 2에 도시한 바와 같으며, 도 2 (b), (c)와 같이 α형과 β형의 두 가지 이성질체를 가지고 있다.
본 발명의 일 실시예에서 분리 정제하고자 하는 시료로는 수용성인 N-acetyl-neuraminic acid(Neu5Ac)와 N-glycolyl-neuraminic acid(Neu5Gc)을 주성분으로 하였으며 그 구조식은 도 3에 도시하였다.
본 단계에서 사용되는 비극성 고분자 비드는 ABT(Affinity Bead Technique, 친화성 비드기술)를 수행하기 위해 사용된다.
ABT는 특정 성분을 추출하기 위한 방법으로, 추출 방법은 특정 성분과 비드를 결합시킨 후 비드를 분리하고, 특정 성분이 비드 결합된 비드에서 특정 성분을 탈착(흡착된 물질이 흡착 계면(界面)으로부터 떨어지는 현상)시킴으로써 특정 성분을 추출할 수 있는 기술을 의미한다.
본 발명에서 비드는 비극성 고분자 비드를 사용하였으며, 비극성 고분자 비드는 도 4에 도시한 바와 같이, 디비닐 벤젠(divinylbenzene)과 스티렌(styrene)의 가교 결합으로 형성된 것을 사용할 수 있다.
본 단계에서 비극성 고분자 비드는 -OH기와 -COOH기를 갖는 시알산을 흡착하며, 이는 후술할 단계에서 분리 후 시알산을 탈착시킴으로써 시알산을 단독으로 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 단계 (c)는 시알산이 흡착된 비극성 고분자 비드를 분리하고, 탈착제를 투입하여 시알산을 탈착하는 단계(S130)이다.
본 단계에서는 단계 (b)에서 시알산이 흡착된 비극성 고분자 비드를 분리하고, 이에 탈착제를 투입하여 비극성 고분자 비드에서 시알산을 분리하게 된다.
본 발명에서 탈착제는 상기 단계 (a)에서 용매로 사용한 물, 알칼리 이온수, 또는 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 사용할 수 있으며, 용매와 마찬가지로 각각을 단독 또는 1종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
단계 (a)와 마찬가지로, 탈착제로 사용 시에 유기 용매는 공지된 다양한 용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.
또한, 본 단계에서 탈착제로 에탄올을 사용할 시에 에탄올의 중량%는 비극성 고분자 비드에서 시알산이 탈착되는 속도에 따른 종속 변수이다.
이는 탈착제로 사용되는 에탄올의 중량%를 높이면 비극성 고분자 비드에서 시알산이 탈착되는 속도가 빨라지며, 중량%를 낮추면 시알산이 탈착되는 속도가 느려짐을 의미한다.
본 발명에서 단계 (d)는 탈착된 시알산을 고형화 하는 단계(S140)이다.
본 단계에서는 단계 (c)에서 탈착되어 분리 정제된 시알산을 고형화하여 다양한 방법으로 활용하도록 하는 단계이다.
상술한 바와 같이 시알산은 인지개선의 효능을 가지고 있어, 식품 또는 약품의 원료로 사용하기 위한 준비를 할 수 있다.
본 발명에서 분리 정제된 시알산은 액상 또는 고상으로 둘 다 사용할 수 있으나, 본 발명의 일 실시예로 고형화할 수 있다.
본 발명에 따른 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법은 비극성 고분자 비드를 이용하여 제비집 내의 시알산을 비극성 고분자 비드에 흡착 시키고, 이를 분리 후 탈착제를 투입해 시알산을 비극성 고분자 비드에서 탈착시키는 친화성 비드 기술(Affinity Bead Technique, ABT)을 이용하여 간단한 방법으로 제비집에서 시알산을 분리 정제할 수 있으며, 낮은 에너지를 이용하여 생산성이 높고, 방복적인 생산 공정의 적용이 용이하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 시알산 분리 정제 방법은 조작 에너지가 이온성 고분자 비드에 비해 낮은 비극성 고분자 비드를 사용하여 환경오염을 유발하는 유기성 솔벤트의 사용을 최소화 하여 친환경적인 장점이 있다.
또한, 본 발명의 시알산 분리 정제 방법은 g당 수 십만원에서 수 백만원에 달하는 종래의 시알산을 g당 수 천원 단위로 저렴하게 생산이 가능하여 생산 효율성 및 경제성이 높은 장점이 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하도록 한다.
제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
<실시예>
(1) 흡착 실험 및 공정
실험용 시료는 제비집 추출물로부터 취득한 시알산(sialic acid)을 공시재료로 하였다. 본 실시예에서 사용한 제비집 추출물은 한양대학교 의과대학, 시알산은 동 대학의 화학과로부터 구입하였다.
흡착 및 탈착제로서 증류수, 아세트니트릴 및 초산을 준비하였고, 다른 모든 시약은 품질이 확보된 시약 등급이었다. 표준 시료와 HPLC용의 증류수, 아세트니트릴, 초산은 미국 Sigma사로부터 구입하였다.
본 발명의 주요한 기술적 내용은 선택적 비드를 사용함으로써 반복적인 실험결과를 최적조건으로 적용할 수 있는 비극성 고분자 비드를 채택하여 사용하였고, 본 발명에서 채택된 비극성 고분자 비드의 바람직한 하나의 예로서는, 디비닐 벤젠과 가교 결합된 소수성의 구형 폴리스틸렌 비드로 비극성 고분자 흡착제인 "KJM-278A-28"을 선택하고 이 "KJM-278A-28"는 한양대학교 화학과로부터 구입하였다.
따라서 본 발명에서는 제비집 추출물로부터 시알산을 분리정제하기 위한 비극성 고분자 비드로서 "KJM-278A-28"을 여러번 반복실험을 거쳐 최적의 비극성 고분자 비드임을 밝히고 이에 의한 분리정제가 바람직한 방법임을 입증하는 원천적 기술내용을 제시하였다.
본 발명의 실시예에서 채택된 비극성 고분자 비드인 "KJM-278A-28"의 공극 망상구조는 도 4에 제시하였다.
"KJM-278A-28"의 물리화학적 특성분석은 표 1과 같다
Absorbent unit KJM-278A-28
Chemical structure - Aromatic Styrenedivinylbenzene
Hydrophobicity - hydrophobic
Particle size ㎛ 400 ~ 700
Particle density m3kg-1 450 ~ 462
Particle porosity - 0.51 ~ 0.72
Moisture holding Capacity % 67 ~ 70
Surface area(BET) m2g-1 705 ~ 900
Average pore diameter Å 70 ~ 87
Average pore volume cm3g-1 1.2 ~ 2.5
Specific gravity - 1.02 ~ 1.06
표 1을 참고하면, "KJM-278A-28"의 입자 크기는 400 ~ 700μm, 평균 공극경은 70 ~ 87Å 평균 공극체적은 1.2 ~ 2.5 cm3g-1, 표면적(BET)은 750 ~ 900m2g-1 이었다.
"KJM-278A-28"는 흡착제로서 사용하기 전에 전처리를 진행해야 하며, 탈이온수로 여러 번 세척하여 무기 불순물을 제거한 후 이소프로필 알코올로 24 시간 동안 세척하여 유기 불순물을 제거한 다음, 진공 상태에서 323K로 2 시간 동안 건조하였다.
또한, 흡착 실험에 사용하기 전에 “KJM-278A-28"를 이소프로필 알코올에 침지시킨 후 이소프로필 알코올을 탈이온수로 완전히 치환하였다. "KJM-278A-28"는 수분 함량을 일정하게 유지하기 위해 탈이온수를 함유하는 데시케이터(desiccators)에서 보관하였다.
(2) 비극성 고분자 비드 "KJM-278A-28"의 측정
1. 입자경의 측정
완전히 팽윤시킨 "KJM-278A-28" 비드 입자의 수분 함량은 383.15K에서 72 시간 동안 진공 오븐에서 건조 시에 발생한 시료의 중량 감소분으로 측정하였다.
산술적인 평균 입자 직경은 침지한 "KJM-278A-28" 비드 입자를 광학 현미경을 이용하여 sorting하여 측정하였고 이때 측정된 입자 크기는 400 ~ 700 mm이었다.
2. 질소 흡탈착 실험/공극
질소 흡착-탈착은 76.8 ~ 80.5 K에서 Adsorbent Mixture 130 흡착 장치(Microtoms사, 미국)를 이용하여 측정하였고, 표면적은 BET 방법을 이용하여 계산하였다. 공극 직경은 BJH 공극 크기 분포 방법을 이용하여 얻었고, "KJM-278A-28" 의 평균 공극 직경은 각각 70 ~ 87Å 이었다.
평형 실험은 일정한 온도(298.35 K)로 유지되는 항온기에서 소정 량의 흡착제를 흡착 용액(약 600 mg/L)와 접촉하면서 수행하였다.
흡착제의 건조 기반 중량은 388.35 K의 진공 오븐에서 48 시간 동안 건조시킨 후에 측정하였다. 평형에 도달한 후, 용액 상태로 유지된 시알산의 농도를, 0.015 ㎛ UF 막 필터를 이용한 여과 후에 432 nm에서 UV 분광광도계(Shimadzu, UV-160A, 일본)를 이용하여 분석하였다.
3. 흡착능력
"KJM-278A-28" 비드의 흡착 능력은 수학식 1에 따라 구하였다:
Figure 112020010703119-pat00001
이 식에서, Co 및 C (mg/L)는 각각 시알산의 초기 및 평형 액상 농도(mgL-) 이며, V는 용액의 체적이고, W은 사용된 흡착제의 질량이다.
4. 농도감쇠곡선
칼베리형(carberry-type) 회분식 흡착조에서 흡착 반응속도 실험을 수행하여 농도 감쇠 곡선을 구하였다. 스테인레스 스크린으로 구성된 4개의 케이지(cage)에 흡착제 입자를 로딩하고 그 케이지를 회전축에 부착하여 용액과의 양호한 접촉이 가능하도록 하였다. 모든 실험은 약 500 rpm에서 수행하였다.
흡착실험을 위한 흡착컬럼은 내경이 0.01m이고 길이가 0.3m인 유리관으로 내경 대 길이를 1 : 10 으로서 하여 구성하였다.
도 5는 흡착 칼럼을 도시한 모식도로, 흡착 칼럼은 비극성 고분자 흡착제(200)를 채우고 유리 비드(100)로 지지하며 그 용액을 칼럼 내로 위쪽으로 주입했다.
채널링(channeling)을 방지하고 칼럼을 통한 그 용액의 분산을 향상시키기 위하여 작은 유리 비드로 이루어진 두 개의 층을 칼럼의 상부 및 하부 영역에 채웠다. 모든 충진(packing) 과정은 칼럼 내에 기포가 발생하는 것을 방지하기 위하여 증류수가 있는 상태에서 수행하였고, 시료를 계획한 시간 간격으로 여러번 채취하였다.
도 6의 구성에서와 같이, 공급용액은 5L 용량의 유리탱크에서 제조하여 항온수조에 고정시키고 흡착컬럼에 연결한 후에 유량은 정량펌프(HS-600DP, Labsup, 한국)를 이용하여 일정한 유량으로 조절하였다.
칼럼의 층(bed)에 물을 채우고 실험의 시작 시에 실험 시스템의 갑작스런 장애를 방지하기 위하여, 실험의 시작 약 2 시간 전에 상기의 수용액과 동일한 유속으로 증류수를 칼럼에 공급하면서 흡착칼럼을 온도 조절기가 구비된 수조를 이용하여 일정 온도로 유지하였다.
탈착 실험을 위한 탈착용매로는 증류수 단독, 에탄올 단독, 증류수와 에탈올의 혼합액을 준비하였다.
(3) 시알산의 순도측정
Shimadzu HPLC(UFLC XR System w/LC-20AD xr, 일본)를 사용하여 시알산의 순도를 측정하였다. 크로마토그래피 분석은 Zorbax XDB-C18 칼럼(4.6 mm x 250 mm, 5 ㎛)을 이용하여 수행하였고 두 개의 이동상은 1% 아세토니트릴-증류수 및 1% 초산-아세토니트릴이고; 유속은 1.0 mL/min, 칼럼 온도는 25℃로 유지하여 분리 정제한 시알산(주입량; 20 ㎕)을 254 nm의 파장에서 측정하였다.
1. 흡착 평형 및 반응속도
일반적으로 합성 고분자 흡착제에의 흡착은 흡착질(adsorbate)과 그 수지 사이의 강제 분산을 통해 이루어지므로 흡착 능력은 흡착제와 흡착질의 특성에 의존하게 되고 흡착 등온선은 흡착계에 대한 가장 기본적이고 유익한 자료로서 알려져 있으며 흡착 과정을 분석 및 디자인하기 위한 모델 예측에 중요한 것이다.
도 7에 298.35 K에서 "KJM-278A-28" 비드 상에서의 시알산의 흡착 등온선을 도시하였다. 그 흡착 유형은 적합하였고, 그 흡착 능력은 400 mg/L 였다.
표면 상에 흡착된 농도와 벌크 상에서의 평형 농도 사이의 상관관계를 설명하기 위하여 다수의 순수 성분 등온선이 제시되었다. 또한, 이들 식들은 흡착제의 흡착 능력 및 흡착 상에서의 흡착 에너지에 대한 정보를 제공하기 위해서도 사용될 수 있다. Langmuir, Freundlich, Sips를 비롯한 잘 알려진 등온선 모델 중에서, "KJM-278A-28" 비드 상에서의 시알산의 흡착 평형 데이터는 하기 수학식 2의 Langmuir 식과 가장 관련이 있는 것으로 확인되었다.
Figure 112020010703119-pat00002
등온선 파라미터들은 변형된 Levenberg-Marquardt 법(IMSL routine DUNSLF)에 기초하여, 실험적 흡착량과 예측 흡착량 사이의 평균 편차(%)를 최소화함으로써 구하였다.
객체 함수(object function)인 E(%)는 하기 수학식 3과 같이 실험적 결과와 예측 결과 사이의 평균 편차(%)를 나타낸다.
Figure 112020010703119-pat00003
상기 수학식 3에서, n은 실험 데이터의 수이고, qexp,k는 실험적 흡착 능력이고, qcal,k 는 계산된 흡착 능력을 표시한다.
도 7의 굵은 선은 Langmuir 등온선 파라미터(qm=625 mg/g, b=5.921X 10-3 L/mg)를 이용하여 예측한 결과이다.
흡착 반응속도 특성은 흡착계에 대한 기본적인 정보로서 시알산의 반응속도 데이터를 하기 수학식 4의 2차 모델(pseudo-second-order model)을 이용하여 분석하였다.
Figure 112020010703119-pat00004
상기 식에서, k2(g/mg/min)는 t/qt 대 t의 선도(plot)를 이용하여 구한 2차 속도 상수이다. "KJM-278A-28"의 선형 선도에 대한 2차 모델의 관계 계수(R2)는 1에 매우 근접하는 것으로서(도 8) 이러한 결과는 흡착 반응 속도가 2차 모델을 통해 성공적으로 설명될 수 있다는 것을 의미한다.
qe 및 k2의 구해진 속도 상수는 각각 81.21 mmol/g 및 0.34 x 10-3 g/mg/min의 범위 내에 있었다.
도 9 및 도 10은 "KJM-278A-28" 칼럼에서 시알산의 실험적인 흡착 및 탈착 곡선을 나타낸 것이다.
비극성 고분자 흡착제인 "KJM-278A-28"에서 시알산의 흡착 특성은 적당하였다.
본 발명의 실시예와 비교하여 시행된 다른 실험 결과로는 활성탄의 경우가 있으며, 활성탄의 탈착 시간은 "KJM-278A-28"의 탈착 시간 보다 빠르며 이러한 결과는 비극성 고분자 비드인 "KJM-278A-28"에서의 시알산의 흡착 능력이 활성탄보다 훨씬 더 높다는 것을 의미한다. 따라서 비극성 고분자 흡착제로써 "KJM-278A-28"이 탁월함을 알 수 있었다.
2. 탈착 연구
일반적으로, 흡착제의 성공 여부는 경제적인 관점에서 흡착제의 재생(탈착) 단계에 의존한다. 흡착제로부터의 흡착질의 재생은 두 개의 알려진 방법들 중 하나를 통해 달성되며 한 가지 방법은 흡착조에서 물리적 조작 조건을 변화시켜서 흡착제와 용질 사이의 평형 상호작용을 저하시키는 것으로서 일반적으로, 로딩된 흡착제의 재생(탈착)은 시간 및 에너지가 소모되는 공정이다.
용매 및 pH 변화와 같은 많은 기술들이 현재까지 널리 사용되어 왔으나, 몇몇의 단점을 가지고 있다.
재생 방법을 선택하는 것은 흡착질 및 흡착제 모두의 물리적 및 화학적 특성에 의존한다.
도 9는 비극성 고분자 흡착제인 "KJM-278A-28" 상에서의 여러 흡착질(증류수 단독, 에탄올 단독, 증류수와 에탄올의 혼합액)에 대한 시알산의 흡착 및 탈착 곡선을 나타낸 것이다.
흡착질은 물리화학적 힘을 통해 흡착제에 결합되므로, 재생 과정에서는 이러한 힘에 반하는 조건이 있어야 하는데, 본 발명의 실시예에서의 비극성 고분자 흡착제인 "KJM-278A-28"의 경우, 시알산을 비드 표면에 결합시키는 물리적인 힘이 강한 특성이 있다.
상기 실험 데이터는 예상한 바와 같이, 시알산이 흡착된 "KJM-278A-28"로부터 에탄올만을 이용한 탈착이 증류수만을 이용한 것보다 더욱 빠르게 일어난다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 비극성 고분자 비드인 "KJM-278A-28"에 대한 에탄올의 친화성이 시알산의 친화력보다 더욱 크다는 것을 의미한다.
이러한 결과로부터 본 발명은 실제 제비집 추출물로부터 기억력 및 인지능력을 향상시키는 시알산을 효율적이고 높은 수율로 보다 친화력이 있는 소재를 분리정제하여 사용이 가능함을 입증한 것이다.
위에서 언급한 과정에 따라 제비집 추출물로부터 미정제 시알산을 분리정제하고, 에탄올-증류수(10 : 90, v/v) 용액의 용출액을 회수하여 회전 증발을 통해 농축하여 용매를 제거한 다음, -80 ℃에서 진공 동결건조기에서 완전히 건조시켜서, 정제된 생성물을 얻을 수 있었다.
분리정제 전 및 후의 시알산 용액의 UV-vis 흡착 스펙트럼은 4개의 명백한 시알산 흡착 피크(Neu5Ac의 경우 218nm, Neu5Ac-의 경우 252 nm, Neu5Gc의 경우 353nm, Neu5Ac-의 경우 448 nm)가 관찰되었다는 것을 도 11에 나타내었다. 또한, 시알산 이외의 다른 이물질들은 흡착 피크가 대부분 사라진 것을 보았을 때, 4가지 시알산의 상대 피크는 친화력이 높은 "KJM-278A-28" 비드를 처리 후에 명백히 증가했다는 것을 알 수 있었다.

Claims (5)

  1. (a) 제비집을 알칼리 이온수 및 유기 용매에 투입하여 추출하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 용매에 비극성 고분자 비드를 투입하여 추출된 용매 내의 시알산 및 기타 다른 성분의 혼합물에서 시알산(sialic acid)만을 흡착하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 시알산이 흡착된 비극성 고분자 비드를 분리하고, 탈착제를 투입하여 시알산을 탈착하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서 탈착된 시알산을 고형화 하는 단계;를 포함하고,
    상기 단계 (b)에서 비극성 고분자 비드를 투입하기 전에, 상기 비극성 고분자 비드를 이소프로필 알코올에 침지시킨 후 이소프로필 알코올을 탈이온수로 완전히 치환하는 단계를 포함하며,
    상기 비극성 고분자 비드의 입자 크기는 400 ~ 700μm, 평균 공극경은 70 ~ 87Å, 평균 공극체적은 1.2 ~ 2.5 cm3g-1, 표면적(BET)은 750 ~ 900m2g-1 인 것이고,
    상기 단계 (c)의 탈착제는 증류수 단독, 유기 용매 단독, 증류수와 유기 용매 혼합액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이며,
    상기 유기 용매는 에탄올(ethanol)인 것인 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 에탄올의 중량%는 시알산의 탈착 속도에 따른 종속 변수인 것을 특징으로 하는 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 비극성 고분자 비드는 디비닐 벤젠(divinylbenzene)과 스티렌(styrene)의 가교 결합으로 형성된 것을 특징으로 하는 ABT를 이용한 제비집의 시알산 분리 정제 방법.
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