JP5887665B2 - 膨張床カラムおよび使い捨て可能なクロマトグラフィー - Google Patents
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Description
精製すべき混合物および移動性相の、静止相への導入は、流動床の安定な形成を可能にするが、従来技術において向けられていた課題である。その混合物および/または移動性相の導入による静止相でのチャンネル形成は、床の膨張の安定性を低下させ(たとえば逆混合および望ましくない乱流による)、そして分離効率を低下させることが知られている。この課題は、使用されるカラムの直径とともに増大し、したがって特に商業的規模の精製を意図されたカラムで激しい。WO99/65586およびWO01/85329は、混合物および/または移動性相がカラムに導入される分配器(distributor)を設けることにより、この課題を解決しようとする。WO01/85329において、その分配器は多数の出口を含み、それを通って液体はカラムに達するように進む。上昇流カラムの場合に、分配器はカラムの基部に設けられ、出口は、カラムに入る液体流から生じる静止相での乱流を最小とするために、カラムの底部方向に向けられるのが好ましい(すなわち、移動性相の移動方向に反対の方向)。分配器は、カラムの底部を越えて液体の分配を確実にするために十分速く回転され、しかし静止相で形成される「撹拌帯域」を最小にするために十分にゆっくりと撹拌され、そこでは安定な膨張が達成され得ない。非回転分配器の使用は、静止相にチャンネル形成、したがって比較的安定でない膨張を導く、ことは例に示される。WO99/65586において、流体の分配は、カラムの底部で静止相の磁気撹拌を用いて達成される。さらに、撹拌帯域の高さを最小にするのが好適である。
第2の態様において、本発明は、第1の態様に関連して用いられる装置を提供する。
第3の態様において、本発明は、第1の態様の方法および/または第2の態様の装置に関連して用いられるカラムを提供する。この態様によるカラムは:カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分;液体のための出口を含む上方部分;ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、さらにカラムの上方部分はカラムの内部と外部の間に流体の接続を与えるベントを含む。
第4の態様において、本発明は、膨張床クロマトグラフィーで用いられるカラムを提供し:カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分;液体のための出口を含む上方部分;ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、その入口は静止相媒体の動かされる撹拌には適合されない、を含む。
第5の態様において、本発明は、膨張床クロマトグラフィーを実施するための装置を提供し、本発明の第4の態様のカラムを含む。好ましくは、その装置は少なくともカラム入口上流の第1ポンプおよびカラム出口下流の第2ポンプをさらに含む。
第6の態様において、本発明は、分離すべき少なくとも1つの成分を含む液体の膨張床クロマトグラフィーを実施する方法を提供し:カラムに含まれる静止相媒体に、入口上流の第1ポンプにより入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること;静止相媒体により流体から少なくとも1つの成分を吸着させること;ならびに出口下流の第2ポンプにより出口を通ってカラムから液体を回収すること、からなる。好適には、その方法は、本発明の第4の態様によるカラムを用いて実施される。
適切には、ベントは保護フィルター、適切にはマイクロフィルター、を含み得、そしてフィルターは汚染物がカラムに入るのを防止し、および/または微生物がカラムを出、または入るのを防止する。
好適には、ベントはカラムにおける単純な開口である。あるいは、ベントは圧力開放バルブであってもよい。あるいは、ベントはカラムの外側圧力より低いヘッドスペースにおける圧力を保持するための手段を含み得る。
出口は管の形態であってもよい。管は移動可能であるので、管の上流端はカラム内の選定された位置に設けられ得る。たとえば、管の上流端はカラム内の移動性相の液面より下方であるか、静止相の高さより上方に位置される。適切には、このような位置取りは、管の上流端近くの、浮力のあるサポートの使用により達成され得、このサポートは移動性相の表面に浮き、移動性相の表面で、またはその下方で、管の上流端の位置を維持する。あるいは、このような位置は電気もしくは空気アクチュエーターのような機械的手段により達成され得る。好ましくは、電気もしくは空気リニアアクチュエーターは、カラム頂部の位置に環状シールされた開口により、上下に出口管を動かすためにカラムの外側に設けられる。好ましくは、1つの統合ユニットとして出口管を備える。あるいは、カラムは2つの部分、シールされたカラムおよび出口管、を備え、それらはカラム頂部のシールされた開口を通して管の挿入により使用される前に組み立てられる。いずれの場合も、出口管は、ついでポンプ管に接続され、カラムの最終的な使用に続き、カラムと出口管はカラムスタンド、アクチュエーターおよびポンプ(これらは生成物との接触はない)から分離され、そして処分される。
懸濁相は、凝集防止物質の2つ以上の組み合わせを含み得る。適切には、懸濁相における物質の濃度は、低分子量に対して、少なくとも1%、好ましくは5%、好ましくは少なくとも10%、たとえば少なくとも30%、または50%;ポリマーに対して、少なくとも0.1%、たとえば少なくとも0.5%、1%、2%、5%または10%;そして洗浄剤に対して、少なくとも0.01%、たとえば少なくとも0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、または5%である。
され得、ここでHOは充填床モードにおける床高さであり、Hは膨張モードにおける床高さである。
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口を含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること;ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口、出口およびベントからシールを除去すること。
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口およびシールされたベントを含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること;ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口および出口からシールを除去すること。
このことは、カラムがベンダーから予備充填されて供給されることを可能にし、静止相媒体のみならず、上述のように懸濁相、たとえば凝集阻害剤を含む、も含むであろう。
静止相媒体が少なくとも1成分を溶出させること;そして吸着および溶出段階の少なくとも1つの反復の後に、カラムを処分すること、好ましくはカラムは、カラムが最初に使用されたのと同一の静止相媒体をなお含む。
膨張床吸着カラムが図13に示すように(しかし図9による入口(コーン高さは15cm)を有する)、組み立てられ、2つのぜん動ポンプ(Watson Marlow)に接続された。それは沈殿床高さ25cmに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径(体積)(d(0.5))149μmで密度3.1g/mLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために25%グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは30床容量の脱イオン水で洗浄された。
例2 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが例1のように(しかし図8による入口(コーン高さは15cm)を有する)、組み立てられた。それは沈殿床高さ25cmに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径(体積)(d(0.5))130μmで密度2.8g/mLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために25%グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは30床容量の脱イオン水で洗浄された。
例3 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが例1のように(しかし図3(コーンなし)による入口を取り付けられた。それは沈殿床高さ25cmに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径(体積)(d(0.5))149μmで密度3.1g/mLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために25%グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは30床容量の脱イオン水で洗浄された。
例4 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラム(10cm径)が例3のように組み立てられた。それは沈殿床高さ25cmに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径(体積)(d(0.5))130μmで密度2.8g/mLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために25%グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは30床容量の脱イオン水で洗浄された。
例5 ヒト血漿からヒトIgGの吸着
膨張床吸着カラム(10cm径)が例2のように組み立てられ、沈殿床高さ50cmに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤は、リガンドとして4−アミノ−安息香酸と結合された、アガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径(体積)(d(0.5))95μmで密度2.9g/mLであった(UpFront Chromatography A/S, コペンハーゲン、デンマーク、製品No.CS118,バッチ45818 WV)。吸着剤はク
25%グリセロール溶液(リン酸カリウム緩衝液、pH7.2)に懸濁された。使用直前に、カラムは30床容量の脱イオン水で洗浄された。
Claims (10)
- 分離されるべき少なくとも1つの成分を含む液体の上方流膨張床吸着クロマトグラフィーを実施する装置であり、
カラムに含まれる静止相媒体に、入口を通って前記液体を供給し、前記液体が前記入口から前記カラムの底部に進むように前記入口が構成されており、乱流の低下と変動し得る量のヘッドスペースの下の前記静止相媒体の膨張を生じさせ、
前記静止相媒体により前記液体から少なくとも1つの成分を吸着させ、
出口を通って前記カラムから前記液体を回収し、
少なくとも前記入口を通る前記液体の流速の調節により前記静止相媒体の膨張を調節し、
前記カラムの外側の圧力に関して前記ヘッドスペースにおける過剰圧力を、外側圧力+10kPa以下に制限し、
(A)前記静止相媒体が、(i)少なくとも2.5g/mLの密度を有するとともに(ii)20〜200μmの間の平均粒径を有する粒子を備え、
(B)第1ポンプが、少なくとも3cm/分の流速で前記液体を前記カラムに送り、
(C)前記入口が回転入口ではなく、
(D)前記入口が、磁気駆動および機械的駆動の撹拌に適用されず、
(E)前記入口が、少なくとも0.1mmの最小大きさおよび2mmの最大大きさを有するとともに水平もしくは下方を向いた少なくとも一つの開口を備える少なくとも一つの管を備える、装置。 - 前記出口の下流の第2ポンプをさらに含む請求項1に記載の装置。
- 前記第1ポンプおよび前記第2ポンプがぜん動ポンプである請求項2に記載の装置。
- 前記出口が、上流端が前記カラム内の選定された位置に移動され得るように適合された管を含み、前記装置は、前記管の上流端の位置を調節するためのコントローラーをさらに含む請求項1〜3のいずれかに記載の装置。
- 前記コントローラーがリニアアクチュエーターである請求項4に記載の装置。
- 前記リニアアクチュエーターが気力アクチュエーターである請求項5に記載の装置。
- 前記リニアアクチュエーターがエレクトリックアクチュエーターである請求項5に記載の装置。
- 前記カラムにおける液体および/または静止相媒体レベルのモニターをさらに含む請求項1〜7のいずれかに記載の装置。
- 前記モニターが超音波モニターである請求項8に記載の装置。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の装置であり、
発酵液源、
消費された発酵液のための容器、
溶出物源、および、
前記発酵液の少なくとも1成分のさらなる精製のための手段
のうちの少なくとも1つをさらに含む装置。
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