KR101326438B1 - 분리 매트릭스의 제조 방법 - Google Patents

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안데르스 하그발
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헨릭 이레
안데르스 라르손
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Abstract

본 발명은 다당류 겔의 염-처리 단계 후 다당류 중합체의 가교-결합 단계를 포함하는 불용성 분리 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 겔화가능한 천연 다당류의 수용액을 제공하는 단계; 다당류 용액의 온도를 그의 겔화점 미만의 값으로 낮추는 단계; 생성된 다당류에 1종 이상의 염을 첨가하여 염-처리하는 단계; 및 염-처리된 다당류를 가교-결합시키는 단계를 포함한다. 다당류는 예를 들어 입자, 멤브레인 또는 모노리스로 제조될 수 있다.
분리 매트릭스, 다당류, 겔, 가교-결합

Description

분리 매트릭스의 제조 방법 {METHOD OF PREPARING A SEPARATION MATRIX}
본 발명은 표적 분자, 예컨대 생체분자의 분리 및 정제, 및 보다 구체적으로는 크로마토그래피 매트릭스 및 이의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 액체 크로마토그래피에서 상기 매트릭스의 용도, 및 상기 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼을 포함한다.
생물공학 분야의 최근 진보는 생물학적 및 생화학적 물질, 예컨대 단백질의 회수, 정제 및 분석을 위해 보다 빠르고 보다 정확한 기술을 필요로 하였다. 크로마토그래피가 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 정제 기술이다. 크로마토그래피에서, 2개의 상호 비혼화성 상이 접촉한다. 보다 구체적으로는, 표적 분자가 이동상으로 도입되어 정지상과 접촉한다. 이어서, 표적 분자는 이동상에 의해 시스템을 통해 운반될 때 정지상과 이동상 사이에서 일련의 상호작용을 겪을 것이다. 상호작용은 샘플 중 성분의 물리적 또는 화학적 특성의 차이를 이용한다. 액체 크로마토그래피에서, 임의로 적절한 완충액과 조합된 액체 샘플은 이동상을 구성하고, 이는 분리 매트릭스로서 알려진 고정상과 접촉한다. 통상적으로, 매트릭스는 표적과 상호작용할 수 있는 기인 리간드가 커플링되어 있는 지지체를 포함한다.
분리 매트릭스는 통상적으로 무기 재료, 예컨대 실리카, 또는 유기 재료, 예 컨대 합성 또는 천연 중합체로 제조된 지지체를 기재로 한다. 합성 중합체, 예컨대 스티렌 및 디비닐벤젠의 중합체가 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 역상 크로마토그래피 (RPC)와 같이 일부 소수성을 나타내는 지지체에 종종 사용된다. 또한, 합성 중합체는 종종 천연 중합체보다 바람직한데, 이는 이들이 보다 강성이고 압력 내성으로 용이하게 제조되어 보다 유리한 유동 특성을 제공하는 지지체를 생성하기 때문이다.
통상적으로 아가로스와 같은 다당류인 천연 중합체가 수십년간 분리 매트릭스의 지지체로서 이용되었다. 히드록실기의 존재로 인해 천연 중합체의 표면은 통상적으로 친수성이어서, 본질적으로 단백질과 비특이적 상호작용을 제공하지 않는다. 인간 생체내 용도를 위한 약물 또는 진단 분자의 정제에 특히 중요한 천연 중합체의 또다른 이점은 그들의 비독성 특성이다. 아가로스는 상승된 온도에서 물에 용해될 수 있으며, 이어서 특정 온도 (겔화점)로 냉각시 다공성 겔을 형성할 것이다. 가열시, 겔은 통상적으로 겔화점보다 상당히 높은 온도 (용융점)에서 다시 용융할 것이다. 겔화는 다당류 중합체의 나선-나선 응집이 관여하므로, 종종 물리적 가교결합으로서 언급된다.
상기한 바와 같이, 천연 중합체는 합성 중합체보다 덜 강성이고 덜 압력 내성이어서, 결과적으로 이의 개선 방법이 추구되었다. 예를 들어, 다당류의 농도를 변화시킴으로써, 지지체의 다공성을 증가시켜 표적 물질 수송을 개선시키고 크로마토그래피 동안 표적이 상호작용하는 면적을 증가시킬 수 있다. 고려할 또다른 필수 파라미터는 예를 들어 미립자 분리 매트릭스의 팩킹된 베드에서 지지체의 유동 특성이다. 이동상이 베드를 통과할 경우, 역압은 주로 입자간 틈새 채널에 의해 조절될 것이다. 느린 유속에서, 입자는 비압축성으로 간주될 수 있으며, 이때 역압은 입자 크기에 따른 기울기로 유속에 따라 선형으로 증가한다. 유속이 증가함에 따라, 입자는 유체정압 하에 변형을 시작하여, 틈새 채널의 직경을 감소시키고 역압을 빠르게 증가시킬 수 있다. 특정 유속에서, 매트릭스의 강성도에 따라, 베드는 붕괴될 것이고 역압은 무한대에 접근한다.
강성도 및 그에 따른 아가로스의 유동 특성을 개선시키는 가장 통상적인 방법은 그의 화학적 가교-결합이다. 상기 가교-결합은 이용가능한 히드록실기 사이에서 일어나며, 예를 들어 에피클로로히드린을 사용하여 통상적으로 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다.
US 4,973,683호 (Lindgren)는 다공성 다당류 겔의 가교-결합, 및 보다 구체적으로는 다공성 다당류 겔의 비특이적 상호작용을 최소화하면서 강성도를 개선시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 아가로스 겔, 및 예컨대 할로겐기 또는 에폭시드기와 같은 반응성 기 및 이중 결합을 포함하는 "일관능성"으로 지칭되는 시약을 제공하는 것을 포함한다. 상기 시약은 그의 반응성 기를 통해 겔에 결합되며, 이어서 이중 결합이 에폭시드 또는 할로히드린으로 활성화되어, 최종적으로 아가로스 상의 히드록실기와 반응하여 가교-결합을 제공한다.
US 5,135,650호 (Hjerten et al)는 용질 불침투성인 정도로 비다공성이며 HPLC용으로 충분히 강성인, 고도의 압축성 크로마토그래피 정지상 입자, 예컨대 아가로스 비드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 비드는 다공성 아가로스 비드 로부터 출발하여 유기 용매와 접촉하여 다공성이 붕괴된 후, 붕괴된 세공 내부의 비드 표면이 붕괴된 상태로 세공을 고정하도록 가교-결합되어 제조된다. 별법으로, 비드는 세공 표면에 그라프팅되는 중합성 물질로 세공을 충전하고 그라프트 중합을 수행함으로써 제조된다. 개시된 발명의 하나의 이점은, 단일 정지상이 높은 압력에서 효과적이지만 낮은 압력에서도 사용될 수 있다는 것이다. 그러나, 용매, 특히 이 특허에서 사용된 용매의 사용은 일반적으로 건강 및 안전의 이유로 회피된다.
US 6,602,990호 (Berg)는 다공성 가교-결합 다당류 겔의 제조 방법에 관한 것이며, 여기서 이관능성 가교제는 다당류의 용액에 첨가되고 그 활성부위를 통해 다당류의 히드록실기에 결합된다. 이어서, 다당류 겔이 용액으로부터 형성된 후, 가교제의 비활성 부위가 활성화되어 겔의 가교-결합을 수행한다. 따라서, 가교제는 다당류 겔에 첨가되는 상기 논의된 방법과 대조적으로 다당류 용액에 도입된다. 이관능성 가교제는 하나의 활성 부위, 즉 다당류의 히드록실기와 반응할 수 있는 부위, 예컨대 할라이드 및 에폭시드, 및 하나의 비활성 부위, 즉 활성 부위가 반응하는 조건 하에서 반응하지 않는 기, 예컨대 알릴기를 포함한다. 따라서, 이 경우의 이관능성 가교제는 상기 논의된 US 4,973,683호 (Lindgren)에 따라 사용된 "일관능성 시약"에 상응한다. 생성된 겔로 구성된 입자는 높은 유속 및 역압을 견딜 수 있는 개선된 능력을 제공하는 것으로 나타났다. US 6,602,990호 방법의 단점은 가교제의 활성화에 브롬이 필요하다는 것이다.
US 5,998,606호 (Grandics)는 매트릭스의 가교-결합 및 관능화가 동시에 일 어나는, 크로마토그래피 매트릭스의 합성 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 중합체 탄수화물 매트릭스의 표면에 제공된 이중 결합은 금속성 촉매의 존재 하에 활성화되어 매트릭스를 가교-결합시키고 할로히드린, 카르복실 또는 술포네이트기로 관능화시킨다. 이중 결합은 할로겐 원자 또는 에폭시드 및 이중 결합을 함유하는 활성화 시약과 접촉함으로써 매트릭스 표면에 제공된다. 따라서, US 5,998,606호 활성화 시약은 US 4,973,683호 일관능성 시약 및 US 6,602,990호 이관능성 가교제에 상응한다.
문헌 [Journal of Functional Polymers, Vol. 13, March 2000: "Preparation of Two Types of Immobilized Metal-Chelated Complex Affinity Membrane Chromatography Media"] (Qi et al)에는 매트릭스로서 셀룰로스 여과지를 사용하고, 알칼리 처리, 에폭시드화 활성화를 거치고, 이미노디아세트산이나트륨과 커플링하고, Cu2 +를 고정하여 거대다공성 셀룰로스 친화성 멤브레인을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 아가로스는 활성화 후의 멤브레인 상에 공유 가교-결합되어 샌드위치-유사 구조를 갖는 멤브레인을 생성한다.
US 2005/0220982호 (Moya et al)는 다당류, 1종 이상의 겔-억제제(들) 및 물과 같은 용매로 구성된 실온 겔-억제된 용액를 형성하고, 성분이 용해될 때까지 혼합물을 가열하고, 용액으로서 혼합물을 약 실온으로 냉각시키고, 용액으로 3차원 구조체를 형성하고, 구조체를 겔화제에 첨가하여 다당류 겔을 형성함으로써, 다당류 구조체, 예컨대 비드, 겔 필름 및 다공성 기판 상의 다공성 코팅을 형성하는 방 법에 관한 것이다. 겔-억제제는 예를 들어 아연, 리튬 또는 나트륨 염을 기재로 한다. 다당류의 코팅은 확산성 유동이 다당류층 자체내에서 일어나도록 하기에 충분한 두께이다. 기재된 방법의 이점은 실온에서 구조체가 형성되고 통상적으로 실온 초과의 온도에서 잘 겔화되는 다당류 중합체에 의해 중합체의 제어된 겔화가 이루어진다는 것이다. 또한, 실질적으로 세공을 다당류로 차단하지 않으면서 표면 코팅이 달성된다는 것이다. 그러나, 상기 실온에서의 조작은 아가로스 용액의 주의깊은 제어를 필요로 하며, 이는 전 공정을 비교적 시간 소모적으로 만든다.
따라서, 기술이 가교-결합된 다당류 분리 매트릭스의 제조에 이용가능하더라도, 상이한 향후 응용은 매트릭스에 대한 상이한 요건을 부과하므로, 대안적인 방법이 여전히 요구된다.
<발명의 간략한 설명>
본 발명의 한 양태는 대규모 처리에 적절한 유동 특성을 제공하는 다당류 분리 매트릭스의 제조 방법을 제공하는 것이다. 이는 첨부된 특허청구범위에서 정의된 바와 같은 분리 매트릭스를 제조함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 특정 양태는 응집 위험을 감소시키면서 가교-결합을 허용하는 미립자 다당류 분리 매트릭스의 제조 방법을 제공하는 것이다. 이는 통상적으로 사용되는 온도보다 높은 온도에서 가교-결합될 수 있는, 첨부된 특허청구범위에서 정의된 바와 같이 제조된 분리 매트릭스에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 특정 양태는 세공 구조의 붕괴 없이 개선된 강성도의 다공성 분리 매트릭스의 제조를 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다. 이는 표적 분자가 세 공에 들어가도록 허용하는 세공 크기의 분리 매트릭스를 제조하는, 첨부된 특허청구범위에 정의된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 이 양태는 증가된 유속으로 비교적 작은 표적 분자, 예컨대 단백질을 정제 및/또는 단리시키는데 유리하다.
본 발명의 다른 양태 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명에 나타날 것이다.
정의
용어 "미립자" 분리 매트릭스는 본원에서 입자, 예컨대 본질적으로 구형인 입자 또는 덜 규칙적인 형태의 입자로 구성된 분리 매트릭스를 의미한다.
본원에서 종종 "겔화 온도"라고 지칭되는 "겔화점"은 용액의 중합체가 물리적으로 상호작용하여 고체 겔을 형성하는 온도를 의미한다.
용어 "겔화가능한"은 본원에서 물리적 겔을 형성할 수 있음을 의미한다.
용어 "천연" 다당류는 비개질 상태의 다당류, 즉 치환되거나 유도체화되지 않은 다당류를 지칭한다.
용어 분리 "매트릭스"는 본원에서 리간드가 부착되는 다공성 또는 비다공성 고체 지지체로 구성된 물질을 의미한다. 크로마토그래피 분야에서, 분리 매트릭스는 종종 수지 또는 매질을 지칭한다.
용어 "리간드"는 본원에서 그의 통상적인 의미, 즉 표적 분자와 상호작용할 수 있는 화학적 대상, 예컨대 이온 교환 공정에서 반대 전하를 띤 표적 분자와 상호작용할 수 있는 전하를 띤 기로 사용된다.
Kav는 (Ve-V0)/(Vt-V0)로 정의되는 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피) 파라 미터이며, 여기서 Ve는 시험 분자 피크의 용출 부피이고, V0은 컬럼의 공극 부피이고, Vt는 전체 베드 부피이다. Kav는 특정 시험 분자에 접근가능한 정지상 부피의 분획의 척도이다.
Kav DX는 덱스트란 분자에 대한 KAV이다. 실시예에서, 각각 분자량 110 kD, 500 kD 및 1000 kD의 덱스트란이 사용되었다.
본 발명은 다당류 겔을 염-처리한 후 다당류 중합체를 가교-결합시켜 불용성 분리 매트릭스, 예컨대 입자, 모노리스(monolith) 또는 멤브레인을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 온도를 낮추어 다당류 겔을 그의 용액으로부터 제공하는 선행 단계를 포함할 수 있다. 겔은 멤브레인 캐리어의 코팅, 다당류 입자, 또는 상이한 재료로 제조된 입자 상의 코팅으로서 제공될 수 있다. 겔은 유리하게는 다공성이다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은
(a) 겔화된 천연 다당류로 구성된 입자의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
(b) 1종 이상의 염을 첨가하여 현탁된 입자를 염-처리하는 단계; 및
(c) 염-처리된 입자를 가교-결합시키는 단계
를 포함하는, 분리 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다.
다당류는 바람직하게는 온도 변화에 의해 겔을 형성할 수 있는 임의의 다당류일 수 있으며, 아가로스, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 키토산, 코냑, 커드란, 카라기난, 펙틴, 겔란 및 알기네이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자가 이해하듯이, 상기 겔화된 다당류 입자는 유리하게는 1종의 다당류로 구성되지만, 본 발명은 또한 2종 이상의 다당류의 혼합물로 구성된 입자를 사용하는 것을 포함한다. 본 방법의 유리한 실시양태에서, 다당류는 아가로스이다. 특정 방법에서, 입자 코어 또는 캐리어는 상기한 바와 같은 다당류로 코팅된다. 캐리어는 하기 멤브레인 캐리어의 문맥에서 논의된 것과 같을 수 있다.
상기에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 단계 (a)에서 제공된 다당류 입자는 천연 다당류, 즉 중합체를 유도체화 또는 가교-결합과 같은 임의의 개질 또는 치환처리하지 않은 다당류로 구성된다. 따라서, 본 발명은 비-개질된 다당류에 염을 첨가한다.
유리한 실시양태에서, 다당류 입자는 본질적으로 구형 입자 (비드)이다. 크로마토그래피 분야에서, 입자 크기는 통상적으로 누적 부피 분포의 중간 입자 크기로서 제공된다. 본 방법에서, 비드의 평균 크기는 직경이 10 내지 300 μm, 바람직하게는 30 내지 200 μm, 보다 바람직하게는 45 내지 165 μm, 예컨대 약 45 μm일 수 있다.
상기 다당류 비드는 표준 방법, 예컨대 역 현탁 겔화에 따라 당업자에 의해 용이하게 제조된다 (문헌 [S Hjerten: Biochim Bio-phys Acta 79(2), 393-398 (1964)] 참조). 예를 들어, 아가로스를 제조할 경우, 아가로스를 그의 융점 초과 온도에서 수성 용매, 예컨대 물 또는 통상적으로 사용되는 임의의 다른 용매에 용해 또는 분산시켜 아가로스 액적을 수득한다. 이어서, 용해된 아가로스를 교반하면서 통상적으로 사용되는 유기 용매, 예컨대 톨루엔 또는 헵탄에 유화시킨 후, 온도를 아가로스 겔화점 미만, 편리하게는 실온으로 감소시킨다. 본 방법에서, 제조된 비드를 유리하게는 예를 들어 에탄올 또는 물로 세척하여 임의의 용매 흔적을 제거하고, 물 또는 적절한 수용액에 현탁시킨다. 따라서, 유리한 실시양태에서, 입자는 가교-결합 단계 전에 세척된다.
당업자가 이해하듯이, 에멀젼이 아니라 다당류 입자의 수성 현탁액을 제조하는 다른 방법이 존재한다. 따라서, 다른 실시양태에서, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 US 6,248,268호 (FMC Corporation)에 개시된 바와 같이, 수성 매질 중 열적으로 겔화가능한 다당류로 구성된 조성물을 주변 공기에 분무하고, 분무된 조성물을 공기 중에서 겔화시켜, 다당류 입자를 수득한다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 간단히 거대 다당류 단편을 제조하고 이를 적절한 평균 입자 크기로 분쇄하여 수득할 수 있는 것과 같은 다당류 입자는 불규칙적 형태이다. 또다른 실시양태에서, 다당류 입자는 타원 또는 섬유-유사 입자와 같이 신장된다.
본 방법의 단계 (b)에서 첨가된 염은 선택된 온도 및 염 농도에서 목적하는 강성도를 제공할 수 있는 임의의 염일 수 있지만, 바람직하게는 모두 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈의 보다 높은 말단부에서 평가되는 2개의 이온으로 구성된다.
한 실시양태에서, 단계 (b)에서 첨가된 염의 음이온은 술페이트 또는 포스페이트, 바람직하게는 술페이트이다. 다른 실시양태에서, 염의 양이온은 Mg, Li, Na, K 및 NH4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유리한 실시양태에서, 염의 양이온은 Mg 및 Na로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 단계 (b)에서 첨가된 염은 MgSO4 또는 Na2SO4일 수 있다. 유리한 실시양태에서, 염은 MgSO4이다.
단계 (b)에서 첨가된 염(들)은 수용액 또는 고체 형태로 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 단계 (b)에서 첨가된 염(들)의 양은 0.5 내지 1.3 M의 현탁액 중 최종 농도를 제공하기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 현탁액 중 염 농도는 1.0 M 미만, 예컨대 0.5 내지 1.0 M, 바람직하게는 0.5 내지 0.8 M 또는 0.8 내지 1.0 M이다. 다른 실시양태에서, 현탁액 중 염 농도는 1.0 M 초과, 예컨대 1.0 내지 1.3 M, 바람직하게는 1.0 내지 1.2 M, 예를 들어 약 1.1 M 또는 1.2 내지 1.3 M이다.
염이 첨가된 현탁액은 바람직하게는 교반되면서, 다당류의 특성을 본 발명자에 의해 관찰된 개선된 유동 특성 및 개선된 강성도로 변화시키기에 충분한 시간 동안 상승된 온도에서 유지된다. 염-처리의 기간은 당업자에 의해 용이하게 결정되며, 예를 들어 1시간 이하, 예컨대 20 내지 40분, 유리하게는 약 30분 동안 지속될 수 있다. 따라서, 염-처리 동안의 온도는 94 내지 98℃의 범위 중 임의의 온도로 유지될 수 있으며, 매트릭스의 목적하는 특성에 따라 적용된다. 한 실시양태에서, 온도는 94 내지 96℃, 예컨대 94 내지 95℃ 또는 95 내지 96℃, 예컨대 약 94℃, 약 95℃ 또는 약 96℃이다. 또다른 실시양태에서, 온도는 96 내지 98℃, 예컨대 96 내지 97℃ 또는 97 내지 98℃, 예컨대 약 97℃ 또는 약 98℃이다.
유리한 실시양태에서, 본 방법은 바람직하게는 약 96℃의 온도에서 Na2SO4 또는 MgSO4와 같은 술페이트를 첨가하는 염-처리를 포함한다. 보다 유리한 실시양태에서, 상기 방법은 약 96 내지 97℃의 온도에서 1.0 M 초과의 현탁액 중 염 농도로 Na2SO4 또는 MgSO4를 첨가하는 염-처리를 포함한다.
상기에 나타난 바와 같이, 다당류 입자는 염 첨가의 후속 단계에서 가교-결합된다. 유리한 실시양태에서, 단계 (c)의 가교-결합 단계는 가교제의 첨가를 포함한다. 가교제는 임의의 적절한 단량체 또는 다당류를 중합시키는 것으로 알려진 이관능성 시약, 예컨대 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 디에폭시드, 디이소시아네이트 등일 수 있다. 다당류의 가교-결합은 당업계에 널리 알려져 있다 (예를 들어 상기 논의된 US 4,973,683호 및 US 6,602,990호 참조). 본 방법의 한 이점은 통상적으로 사용되는 기술보다 높은 온도에서 가교-결합시켜 매우 강성인 다당류 입자의 제조를 허용하고, 이어서 응집체 형성을 감소 또는 심지어 제거한다는 것이다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 상기 특징이 가교-결합 전 염 첨가에 관련됨을 추정할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 가교-결합된 다당류 매트릭스의 히드록실기에 크로마토그래피 리간드를 부착시키는 후속 단계를 포함한다. 관능화 또는 종종 유도체화라고도 알려진, 불용성 매트릭스에의 크로마토그래피 리간드 부착은 이온-교환 매트릭스를 제조하기 위해 전하를 띈 또는 전하를 띌 수 있는 기를 부착시키거나; 친화성 매트릭스를 제조하기 위해 생물학적 친화성을 나타내는 기를 부착시키거나; 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 매트릭스를 제조하기 위해 킬레이팅기를 부착시키거나; 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매트릭스를 제조하기 위해 소수성기를 부착시킴으로써 제공될 수 있다. 별법으로, 멀티모달로 알려진 기, 즉 하나의 기 이외에 하나 이상을 함유하는 기, 예컨대 소수성기 이외에 이온-교환기가 본 발명에 따라 제조된 매트릭스에 부착된다. 특정 실시양태에서, 관능기는 4급 암모늄 (Q), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 디에틸아미노프로필, 술포프로필 (SP) 및 카르복시메틸 (CM) 기로 이루어진 군으로부터 선택된 이온-교환 리간드이다. 분리 매트릭스와 같은 불용성 지지체에 관능기를 부착시키는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 치환기의 알릴화 및 표준 시약과 조건의 사용의 선행 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992] 참조). 특정 실시양태에서, 가교-결합된 분리 매트릭스는 관능화 전에 가요성 암(arm), 텐태클(tentacle) 또는 플러프(fluff)라고도 알려진 연장제가 제공된다. 널리 알려진 연장제는 덱스트란이다 (예를 들어 다당류 매트릭스에의 연장제 첨가가 보다 상세히 기재된 US 6,537,793호 참조).
본 발명은 또한 본 발명에 따라 처리된 가교-결합 분리 매트릭스의 멸균을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 용기에 분리 매트릭스를 팩킹 또는 단순히 제공하고, 후속으로 그 내용물을 갖는 용기를 멸균하는 것에 관한 것이다. 따라서, 상기 방법의 특정 실시양태는 멸균 전 크로마토그래피 컬럼에 가교-결합된 분리 매트릭스를 제공하는 단계를 포함한다. 멸균은 열 및/또는 스팀 처리, 예컨대 오토클레이브처리, 조사, 마이크로파, 고압, 화학 시약 또는 널리 알려진 임의의 다른 멸균 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기한 바와 같이 제조된 가교-결합 분리 매트릭스이다. 유리한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다당류 분리 매트릭스는 본질적으로 구형 다공성 입자로 구성된다. 한 실시양태에서, 입자는 110 kDa 덱스트란에 대한 Kav 값이 약 0.4 이상, 바람직하게는 0.5 초과이다. 유리한 실시양태에서, 입자에 크로마토그래피 리간드가 제공된다. 이 실시양태에서, 세공은 표적 분자의 유입을 분리시키기에 충분한 크기이며, 따라서 입자의 결합력을 개선시킨다. 또한, 상기 제조 방법은 대규모 처리를 위해 충분히 강성인 매트릭스를 제공한다. 이 실시양태는 하기 용도 양태의 문맥에서 예시된 표적 분자 중 임의의 하나에 유용하지만, 특히 단백질과 같은 비교적 작은 표적 분자에 유리하다.
입자 형태의 분리 매트릭스가 상기에 논의되었지만, 당업자가 이해하듯이, 본 방법은 다른 형태의 분리 매트릭스의 제조에 동일하게 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 분리 매트릭스는 통상적으로 사용되는 임의의 다른 형태, 예컨대 모노리스, 필터 또는 멤브레인, 칩, 표면, 모세관, 섬유 등으로 제조될 수 있다.
유리한 실시양태에서, 분리 매트릭스를 제조하는 본 방법은
(i) 겔화가능한 천연 다당류의 수용액을 제공하는 단계;
(ii) 다당류 용액의 온도를 그의 겔화점 미만의 값으로 낮추는 단계;
(iii) (ii) 단계로부터 생성된 다당류에 1종 이상의 염을 첨가하는 염-처리 단계; 및
(iv) 염-처리된 다당류를 가교-결합시키는 단계
를 포함한다.
한 실시양태에서, 다당류는 천연 다당류, 즉 중합체를 유도체화 또는 가교-결합과 같은 임의의 개질 또는 치환처리하지 않은 다당류이다. 유리한 실시양태에서, 염(들)은 용액 중 0.5 내지 1.3 M의 농도로 첨가된다.
상기 제1 양태의 문맥에서 상세설명한 것 중 임의의 하나, 예컨대 다당류, 염의 성질, 온도 및 염 농도 등은 다른 형태의 분리 매트릭스의 제조를 위해 상기 방법에 적용될 수 있다.
상기에 나타난 바와 같이, 다당류는 입자로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 매트릭스는 멤브레인 또는 필터이다. 본 발명의 강성 매트릭스를 생성시키는 상기 상세설명과 달리, 멤브레인의 제조는 널리 알려져 있으며, 당업자에 의해 용이하게 수행된다.
다른 실시양태에서, 분리 매트릭스는 모노리스이다. 이 실시양태에서, 모노리스 생성물의 목적하는 다공성을 보장하기 위해 유리하게는 포로젠(porogen)이 첨가된다. 적절한 포로젠은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 모노리스 제조에 관한 다른 상세설명이 당업계에 널리 알려져 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기한 바와 같은 분리 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼이다. 컬럼은 임의의 통상적인 재료, 예컨대 생체적합성 플라스틱, 예를 들어 폴리프로필렌, 유리 또는 스테인레스강으로 제조될 수 있다. 컬럼은 실험실 규모 또는 대규모 정제에 적절한 크기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 컬럼에 루어 어댑터(luer adaptor), 튜빙 커넥터(tubing connector) 및 돔형 너트(domed nut)가 제공된다.
유리한 실시양태에서, 상기 단계 (i)은 또한 다공성 멤브레인 캐리어를 제공하고, 상기 캐리어를 다당류 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 예를 들어 다당류의 고온 용액 중에 멤브레인 캐리어를 함침시키는 것일 수 있으며, 이 경우 다당류-침지된 멤브레인은 바람직하게는 단계 (ii)의 냉각 전에 용액으로부터 제거된다. 멤브레인 캐리어는 다당류 용액과 상용성이고, 따라서 유리하게는 본질적으로 친수성인 임의의 재료로 제조될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 멤브레인 캐리어는 친수성 중합체, 예컨대 아가로스, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 키토산, 코냑, 커드란, 카라기난, 펙틴, 겔란, 알기네이트 및 둘 이상의 상기 중합체의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체로 제조된다. 본 방법의 유리한 실시양태에서, 멤브레인 캐리어는 셀룰로스로 제조된다. 가장 유리한 실시양태에서, 셀룰로스 멤브레인 캐리어는 아가로스 용액과 접촉하여 혼성 셀룰로스-아가로스 멤브레인을 제공한다. 다른 실시양태에서, 멤브레인 캐리어는 합성 중합체 또는 세라믹 재료로 제조되며, 예컨대 표면의 화학 개질에 의해 실질적으로 친수성 표면을 나타내도록 처리된다. 따라서, 한 실시양태에서, 멤브레인 캐리어는 친수성 표면을 나타낸다.
본 방법에 사용된 멤브레인 캐리어는 시판용 멤브레인일 수 있다. 별법으로, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조된다. 멤브레인 캐리어의 평균 세공 크기는 그의 의도된 용도에 좌우될 것이며, 0.1 내지 10 μm, 예컨대 0.2 내지 5 μm의 범위 중 임의의 크기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 멤브레인은 카트리지로서 제공된다. 다른 실시양태에서, 멤브레인은 적층된 멤브레인이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 다른 멤브레인은 롤 상에 제공된다. 당업자가 이해하듯이, 멤브레인 캐리어의 크기 및 구조는 또한 용도에 좌우될 것이다.
단계 (iii)의 염-처리는 유리하게는 멤브레인 캐리어를 따뜻한 염 수용액에 최종 생성물의 목적하는 유동 특성을 얻기에 적절한 시간 동안 침지시켜 수행된다. 한 실시양태에서, 염-처리의 기간은 0.5 내지 4시간, 예컨대 1 내지 3시간, 예를 들어 1 또는 2시간이다. 당업자는 간단한 시험을 사용하여 소정의 멤브레인 캐리어-다당류 조합에 가장 적절한 시간을 찾아낼 수 있다. 하기 실험부에 나타난 바와 같이, 본 발명자는 뜻밖에 다당류 코팅된 멤브레인 캐리어를 본 발명에 따른 염으로 처리함으로써 코팅 단계 후 실질적으로 감소된 멤브레인 캐리어의 다공성이 소생될 수 있다는 것을 나타내었다.
이어서, 염-처리된 멤브레인의 다당류 코팅은 당업계에 널리 알려진 임의의 방법에 따라 가교-결합된다. 한 실시양태에서, 멤브레인의 제조 방법은 다당류 코팅의 히드록실기에 크로마토그래피 리간드를 부착시키는 후속 단계를 포함한다. 리간드를 부착시키는 이러한 관능화는 상기한 바와 같이 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 가교-결합 및 관능화는 실질적으로 동시에 일어난다.
다른 양태에서, 본 발명은 다공성 멤브레인 캐리어를 제공하고 상기 캐리어를 겔화가능한 다당류의 수용액과 접촉시켜 제조된 멤브레인에 관한 것이며, 여기서 개선된 유동 특성을 제공하는 다당류 코팅은 US 6,602,990호 (Berg) 또는 SE 0402322-2호 (Berg et al.)에 기재된 방법으로 수득된다. 상기 방법 둘 다는 겔화 전 다당류 중합체의 알릴화 또는 다른 유도체화와 같은 다당류의 개질을 포함하며, 이는 가교-결합 후 수득된 코팅의 강성도를 증가시킬 것이다. 멤브레인 캐리어는 예를 들어 셀룰로스 또는 임의의 다른 친수성 재료일 수 있으며, 코팅 다당류는 유리하게는 아가로스이다.
유리한 실시양태에서, 본 방법은 수득된 가교-결합 분리 매트릭스의 멸균 단계를 포함한다. 멸균은 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 멤브레인은 일회용 제품으로서도 알려져 있는 단일 사용용으로 제조된다. 단일 사용은 예를 들어 멤브레인이 오염물질, 예컨대 안전 또는 건강상의 이유로 제한적으로 처리되는 오염물질을 흡착하는데 사용되는 경우에 유리하다. 단일 사용은 또한 순도가 가장 중요한 경우, 예컨대 제약 산업에서 유리하다. 단일 사용 제품의 추가 이점은 세척 검증에 대한 필요성이 제거된다는 것이다.
다른 실시양태에서, 분리 매트릭스는 모노리스이다. 이 실시양태에서, 제품의 목적하는 다공성을 보장하기 위해 유리하게는 포로젠이 첨가된다. 적절한 포로젠이 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 모노리스 제조에 관한 다른 상세설명이 당업계에 널리 알려져 있다.
마지막으로, 본 발명은 사실상 임의의 종류의 표적 분자에 대한, 상기한 바와 같이 제조된 분리 매트릭스의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 용도의 한 실시양태에서, 생체분자 또는 유기분자는 액체로부터 단리, 정제 및/또는 제거된다. 따라서, 이 양태는 상기한 바와 같은 액체 크로마토그래피 방법이며, 매트릭스에 표적 분자를 흡착시키는 단계 및 임의로는 표적의 선택적 탈착 (통상적으로는 구배 용출로 알려짐)의 후속 단계를 포함한다. 필요한 경우, 하나 이상의 세척 단계가 흡착과 용출 사이에 제공된다. 별법으로, 본 용도는 표적 분자의 지체를 위한 것이며, 이 경우 표적은 다른 성분과 비교하여 컬럼 상에 선택적으로 지체된다. 이 경우, 용출 단계가 필요 없다.
한 실시양태에서, 본 컬럼은 본질적으로 구형 다공성 입자를 포함한다. 크로마토그래피 컬럼은 HPLC에서 사용하기 위해 본 발명에 따른 분리 매트릭스로 팩킹될 수 있다. 별법으로, 본 발명에 따른 분리 매트릭스는 단순히 컬럼에 충전되어, 확장된 베드 흡착 (EBA)으로도 알려져 있는 유동화 베드 방식으로 사용되도록 한다. 또다른 별법에서, 본 발명에 따른 분리는 컬럼에서 중합되는 모노리스이다. 본 발명의 유리한 실시양태에서, 본 발명에 따른 분리 매트릭스를 포함하는 컬럼은 멸균되어 단일 사용을 허용한다. 이러한 단일 사용 또는 일회용 컬럼은 멸균이 쟁점인 경우, 특히 제약 산업 및 종종 진단 분야에서도 유리하다.
본 발명은 또한 별개 구획에 상기한 바와 같은 분리 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼, 1종 이상의 완충액, 및 표적 분자의 정제와 관련된 설명서를 포함하는 키트를 포함한다.
마지막으로, 본 발명은 임의의 종류의 표적 분자에 대한, 상기한 바와 같이 제조된 분리 매트릭스의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 용도의 한 실시양태에서, 생체분자 또는 유기분자는 액체로부터 단리, 정제 및/또는 제거된다. 따라서, 이 양태는 상기한 바와 같은 액체 크로마토그래피 방법이며, 매트릭스에 표적 분자를 흡착시키는 단계 및 임의로는 표적의 선택적 탈착 (통상적으로는 구배 용출로 알려짐)의 후속 단계를 포함한다. 필요한 경우, 하나 이상의 세척 단계가 흡착과 용출 사이에 제공된다. 별법으로, 본 용도는 표적 분자의 지체를 위한 것이며, 이 경우 표적은 다른 성분과 비교하여 컬럼 상에 선택적으로 지체된다. 이 경우, 용출 단계가 필요 없다.
본 용도의 한 실시양태에서, 약 300 cm/h 이상, 예컨대 400 cm/h 이상, 바람직하게는 500 cm/h 이상, 보다 바람직하게는 700 cm/h 이상의 액체 유동을, 분자량 110 kD의 덱스트란에 대해 약 0.4 이상의 Kav를 나타내는 본질적으로 구형인 입자로 구성된 매트릭스에 적용한다.
상기에 나타난 바와 같이, 표적 분자는 임의의 생체분자, 예컨대 펩티드, 단백질, 예컨대 수용체 및 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 핵산, 예컨대 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 및 원핵 또는 진핵 세포; 또는 유기 분자, 예컨대 약물 후보 등일 수 있다. 한 실시양태에서, 약물 후보는 개인화된 투약에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 분리 매트릭스는 또한 식품 및 음료 산업에 유용한 표적 분자의 분리, 예컨대 표적 분자의 오염으로부터 기능성 식품 원료의 정제 및/또는 음료의 정제에 유용하다. 식품 산업에서 널리 알려진 표적 분자는 유장 제품, 예컨대 각종 유단백질이다.
본 발명의 마지막 양태는 배양 중 접착 세포의 성장을 위한 캐리어로서의, 본 발명에 따라 제조된 분리 매트릭스의 용도이다. 이러한 세포는 예를 들어 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포일 수 있다. 매트릭스의 추가 용도는 생체촉매를 생성하기 위한 효소의 고정이다.
실험부
본 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 제공되며, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기 및 본 명세서 여러곳에 제공된 모든 참고 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
재료 및 방법
입자 특성
원형의 Kd 평가를 위한 덱스트란
원료 덱스트란 5 mg/ml
M=196300 10 mg/ml
M=123600 10 mg/ml
M=66700 10 mg/ml
M=43500 10 mg/ml
M=4440 10 mg/ml
M=1080 10 mg/ml
모든 덱스트란은 0.25 M NaCl 중에 희석된 원료 덱스트란을 제외하고는 0.2 M NaCl 용액으로 희석된다.
유효성 시험
아카타(AKTA)TM 익스플로러 (ID 494) (지이 헬스케어(GE Healthcare), 스웨덴 업살라 소재)를 사용하여 1％ 아세톤 용액을 주입함으로써 유효성 시험을 수행하였다. 이 시험은 컬럼 팩킹의 성질에 대한 값을 제공하였다. 인가된 비대칭은 0.75 내지 1.25의 범위이며 플레이트 수는 1000 Nm 초과이었다.
선택성
A-900 오토샘플러가 장착된 아카타TM 익스플로러 (ID 494)를 사용하여 Kd 평가를 수행하였다. 덱스트란 샘플의 검출을 위해 시마주(Shimadzu) RI-검출기 (RID-10A)를 아카타TM 시스템에 연결하였다. 하기 조건을 사용하였다:
유속: 0.2 ml/분
이동상: 0.2 M NaCl
주입 루프: 100 μl
평가
당업계에 널리 알려진 방법에 따라 덱스트란 피크를 평가하였다. 이어서, Kd 값을 하기와 같이 이용가능한 세공 표면의 척도로서 계산하였다:
Kd = (Ve-V0)/(Vc-V0-겔 매트릭스) = (Ve-V0)/(Vt-V0)
Ve = 보유 부피 (용출된 덱스트란) (ml)
V0 = 공극 부피 (보유 원료 덱스트란) (ml)
Vc = 계산된 컬럼 부피 (베드 높이 (cm) × 컬럼 표면적 (cm2)) (ml)
Vt = 총 액체 부피 (NaCl 보유 부피) (ml)
실시예 1: 다당류 입자의 일반 합성
염 처리: 대략 1.5 g의 비-가교결합 세파로스(Sepharose)™ HP (아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 스웨덴 업살라 소재)를 탈이온수 10 베드 부피로 세척하여 겔 입자 75％의 수성 현탁액을 얻었다. 이어서, 각각의 원형에 대해 하기에 설명된 염을 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 30분 동안 각각의 원형에 대해 하기에 설명된 온도로 가열한 후 빙조를 이용하여 30℃ 미만으로 냉각시켰다. 이어서, 소결 유리 깔대기 상에서 물 10 베드 부피로 겔을 세척하여 현탁액 중 염을 제거하였다.
가교-결합: 가교제로서 에피클로로히드린을 이용하고, 포라쓰(Porath) (분리용 겔 생성물, 1982, EP 81850244호)에 따라 상기 에피클로로히드린 및 NaOH를 4회 이용하여, 가교-결합을 수행하였다.
관능화: 음이온 교환체를 얻기 위해, 4급 암모늄기 (Q기)를 널리 알려진 방법에 따라 가교-결합된 입자에 부착시켰다. 부착 후 0.1 M AgNO3으로 Cl-의 적정을 수행하여 관능성 Q기의 양을 측정하였다.
컬럼 - 팩킹: 팩킹 액체로서 탈이온수를 이용하여 HR 5/20 컬럼 (지이 헬스케어, 스웨덴 업살라 소재)에서 상기한 바와 같이 제조된 입자를 팩킹하였다. 컬럼을 먼저 306 cm/h의 유속에서 대략 15분 동안 팩킹한 다음, 764 cm/h의 유속에서 대략 15분 동안 팩킹하였다. 76 cm/h의 유속에서 0.4％ 아세톤 25 μl를 주입한 후 피크 비대칭을 측정하여 컬럼 팩킹을 시험하였다. 0.8 내지 1.8의 피크 비대칭을 갖는 컬럼을 본 연구에서 허용가능한 것으로 간주하였다.
실시예 2 내지 4: 입자 원형
시판용 세파로스 매트릭스로부터 출발하여, 염, 처리 시간 및 기간을 변화시키면서 상기한 바와 같이 원형을 제조하였다. 결과를 하기 표에 기록하였다.
실시예 5 내지 6: 비교 입자 실시예
상기 실시예 2 내지 4에서 출발 물질로서 사용된 2개의 세파로스™ 매트릭스를 시험하되 염 처리 단계를 생략하면서, 두 비교예를 수행하였다.
결과
유속
원형 기재 매트릭스 염 처리
M ( mol /l 입자 현탁액) 		최대 온도
(℃) 		입자 직경
( 몰번
( Malvern ),
d50 v ) (μm) 		유속
(최대)
( ml /분)
실시예 2
U1262069		 세파로스TM
4B		 0.35 M MgSO4 +
0.5 M Na2SO4 		96.8 58 34.5
실시예 3
U1262073		 세파로스TM
6B		 1.3 M Na2SO4 96.7 76 32.5
실시예 4
U1262074		 세파로스TM
6B		 0.5 M MgSO4 +
0.5 M Na2SO4 		96.9 55 85
비교예 5
U1262066		 세파로스TM
4B		 - - 83 6
비교예 6
U1262067		 세파로스 TM
6B		 - - 89 10
유효성 시험
원형 비대칭 플레이트 수
( Nm )
실시예 2
U1262069		 1.00 1609
실시예 3
U1262073		 0.77 2520
실시예 4
U1262074		 1.26 1489
비교예 5
U1262066		 0.75 2281
비교예 6
U1262067		 0.49* 886**
* 본 목적을 위해 허용가능한 비대칭
** 이 팩킹을 4회 반복한 후에도, 본 시험에서 설정된 기준을 여전히 충족하지 않음.
이용가능한 세공 표면
원형 기재 매트릭스 유속
(최대)
( ml /분) 		입자 직경
( 몰번 , d50 v ,
110000)
실시예 2
U1262069		 세파로스TM
4B		 34.5 0.67
실시예 3
U1262073		 세파로스TM
6B		 32.5 0.59
실시예 4
U1262074		 세파로스TM
6B		 85 0.10
비교예 5
U1262066		 세파로스TM
4B		 6 0.65
비교예 6
U1262067		 세파로스TM
6B		 10 0.46
실시예 7 내지 10: 멤브레인의 염 처리
실시예 7: 아가로스 용액 중 멤브레인의 함침 - 멤브레인 A
아가로스 0.3 g을 95℃에서 3시간 동안 물 30 mL 중에 용해시켜 1％ 아가로스 용액을 제조하였다. 이어서, 재생된 셀룰로스 멤브레인 (사르토리우스(Sartorius), 0.45 μm, 제품 번호 3S18406-047N)을 95℃에서 1시간 동안 아가로스 용액 중에 함침시켰다. 이어서, 멤브레인을 아가로스 용액으로부터 제거하고, 실온으로 냉각시켜, 아가로스가 멤브레인 구조 내에서 겔화될 수 있도록 하였다.
실시예 8: 염 용액에서의 멤브레인 처리 - 멤브레인 B
실시예 7에 기재된 바와 같이 제조된 혼성 멤브레인 A를 96℃에서 1시간 동안 황산암모늄 ((NH4)2SO4) (1 M 용액) (50 mL) 중에 함침시킨 다음, 용액으로부터 제거하고, 냉각시켰다. 멤브레인을 물로 잘 세척하였다.
실시예 9: 멤브레인 유동성 측정
상기한 바와 같이 제조 및 처리된 멤브레인 조각을 15 mm 직경 필터 깔때기에 넣고, 진공 0.7 bar를 적용하였다. 물 50 mL를 깔때기에 붓고, 스톱워치를 작동시켰다. 모든 물이 멤브레인을 통과할 때까지의 시간을 기록하였다. 삼중 분석을 수행하였다.
유속을 cm2 및 분 당 ml로 계산하였다.
실시예 10: 멤브레인 유동성에 대한 결과
멤브레인 아가로스 용액 (％) 염 처리 유속 (ml/분/cm2)
기준 - - 21.8
멤브레인 A 1 안함 2.1
멤브레인 B 1 함 18.7

Claims (31)

  1. 삭제
  2. (a) 겔화된 천연 다당류로 구성된 입자의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
    (b) 1종 이상의 염을 첨가하여 현탁된 입자를 염-처리하는 단계; 및
    (c) 염-처리된 입자를 가교-결합시키는 단계
    를 포함하고,
    염(들)이 0.5 내지 1.3 M의 현탁액 중 염 농도로 첨가되고, 염 처리 동안의 온도가 94 내지 98℃인, 분리 매트릭스의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 다당류가 아가로스인 방법.
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서, 단계 (b)에서 첨가된 염의 음이온이 술페이트인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 염의 양이온이 Mg, Na, K, Li 및 Cu로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 염의 양이온이 Mg 및 Na로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 염이 MgSO4인 방법.
  9. 삭제
  10. 제2항에 있어서, 염 처리 동안의 온도가 96℃인 방법.
  11. 제2항에 있어서, 단계 (a)의 다당류 입자가 유기 용매 중에서 유화되어 제조되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 입자가 유화 후 세척되는 방법.
  13. 제2항에 있어서, 단계 (c)의 가교-결합 단계가 가교제 첨가를 포함하는 것인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 겔화된 다당류의 히드록실기에 크로마토그래피 리간드를 부착시키는 후속 단계를 포함하는 방법.
  15. 제2항에 정의된 바와 같이 제조된, 가교-결합된 다당류 분리 매트릭스.
  16. 제15항에 있어서, 이용가능한 세공 부피가 110 kD의 덱스트란에 대한 Kav 값 0.5 이상에 상응하는 매트릭스.
  17. 제15항에 정의된 바와 같은 분리 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼.
  18. (i) 겔화가능한 천연 다당류의 수용액을 제공하는 단계;
    (ii) 다당류 용액의 온도를 그의 겔화점 미만의 값으로 낮추는 단계;
    (iii) (ii) 단계로부터 생성된 다당류에 1종 이상의 염을 첨가하는 염-처리 단계; 및
    (iv) 염-처리된 다당류를 가교-결합시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 염(들)이 0.5 내지 1.3 M의 현탁액 중 염 농도로 첨가되고, 염 처리 동안의 온도가 94 내지 98℃인, 분리 매트릭스의 제조 방법.
  19. 삭제
  20. 제18항에 정의된 바와 같이 제조된, 가교-결합된 다당류 분리 매트릭스.
  21. 제20항에 있어서, 멤브레인 또는 모노리스(monolith)인 매트릭스.
  22. (i) 다공성 멤브레인 캐리어를 제공하고, 상기 캐리어를 겔화가능한 다당류 수용액에 접촉시키는 단계;
    (ii) 다당류 용액의 온도를 그의 겔화점 미만의 값으로 낮추는 단계;
    (iii) 1종 이상의 염을 첨가하여 염-처리하는 단계; 및
    (iv) 염-처리된 다당류를 가교-결합시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 염(들)이 0.5 내지 1.3 M의 현탁액 중 염 농도로 첨가되고, 염 처리 동안의 온도가 94 내지 98℃인, 분리 매트릭스의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 멤브레인 캐리어가 친수성 표면을 나타내는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 멤브레인 캐리어가 셀룰로스로 제조된 것인 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 다당류가 천연 다당류인 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제22항 또는 제23항에 있어서, 겔화된 다당류 코팅의 히드록실기에 크로마토그래피 리간드를 부착시키는 후속 단계를 포함하는 방법.
  29. 제22항 또는 제23항에 있어서, 수득된 가교-결합 분리 매트릭스의 멸균 단계를 포함하는 방법.
  30. 액체로부터 생체분자 또는 유기분자를 정제, 단리 또는 제거하기 위해 제15항에 따르는 분리 매트릭스를 사용하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 분리 매트릭스에 적용된 이동상의 유속이 300 cm/h 이상인 방법.
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