KR101355276B1 - 크로마토그래피 매트릭스의 제조 - Google Patents

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지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비
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Abstract

본 발명은 이용가능한 하이드록실 기를 포함하는 다당류 담체를 제공하는 단계; 및 상기 하이드록실 기를 비닐 술포네이트와 반응시킴으로써 술포네이트-관능화 (S-관능화) 양이온 교환체를 제공하는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다. 담체의 하이드록실 기는 아가로스 중합체의 하이드록실일 수 있으며, 또는 다르게는 이들은 폴리하이드록시관능성 중합체와 같은 연장체 상에 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 담체는 개선된 유동 압력 특성을 가지는 아가로스로 제조될 수 있다.
크로마토그래피, 매트릭스, 다당류, 하이드록실, 비닐 술포네이트, 연장체

Description

크로마토그래피 매트릭스의 제조 {MANUFACTURE OF CHROMATOGRAPHY MATRICES}
본 발명은 크로마토그래피 매트릭스의 제조, 더 구체적으로는 양이온 교환체의 유리한 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 컬럼, 및 정제 공정에서의 그의 용도를 포괄한다.
액체로부터 또는 다른 고체 물질로부터 오염물질 또는 원하는 분자와 같은 하나의 화합물을 분리할 필요가 있는 경우가 많이 존재한다. 하전되거나 또는 하전가능한 화합물을 포획하여 분리하기 위한 수많은 분야에서 전하-전하 기반의 상호작용이 이용된다.
세제 업계에는, 직물 천으로부터 오염물이나 먼지와 같은 물질을 분리하기 위한 방법 및 세제가 있다. 흔히 접하는 예는 세탁물 세척 업계로서, 여기에서는 세척되는 재료로부터 오염물을 분리하기 위하여 세척용 분말에 하전된 컨디셔너 및 세제가 통상적으로 도입된다. 가효제(benefit agent)라고도 알려진 이와 같은 하전된 컨디셔너는, 오염물과 컨디셔너 사이의 인력을 이용하여; 직물 섬유로부터 직접 오염물을 방출시키기 위하여; 또는 섬유를 변형시켜 세척 공정을 촉진하기 위하여 사용된다. 그 효과를 향상시키기 위하여, 제거되어야 할 물질에 대한 친화성을 증가시키는 다른 화학적 성분 상에 그들이 치환되는 형태로 컨디셔너를 제공하는 것이 제안된 바 있다.
WO 03/040279호는 세탁 분야용 중합체에 관한 것으로서, 더 구체적으로는 직물 천의 세탁시 오염물 방출을 촉진하기 위한 치환 다당류 구조의 이용에 관한 것이다. 적합한 다당류에는 40 초과, 바람직하게는 50-100,000 범위의 중합도를 가지는 다당류가 포함된다. 개시된 다당류 구조는 에스테르 또는 에테르 연결을 통하여 다당류에 결합된, 하이드록시알킬, 카르복시알킬 또는 술포알킬 또는 그의 염과 같은 알킬 기로 치환된 것이었다. 평균 치환도, 즉 반복 당 단위체 상에의 관능기의 평균 치환도는 바람직하게는 0.1-3, 더 바람직하게는 0.1-1이다. WO 03/040279호에 따르면, α- 또는 β- 결합된 주사슬, 바람직하게는 β-1,4-결합된 주사슬을 가지는 다당류가 사용될 수 있다. 셀룰로오스-계 물질이 면 섬유에 부착하는 것으로 업계에서는 인식되어 왔으므로, 바람직한 다당류는 셀룰로오스이다.
화학 및 생물공학 분야에서, 약물 또는 약물 후보물과 같은 표적 화합물은 항상 제조 공정에서 유래하는 오염성 물질로부터 분리될 필요가 있다. 예를 들어, 재조합 숙주 세포의 발현에 의해 제조된 단백질 약물 또는 약물 후보물은 예컨대 숙주 세포 및 경우에 따라 세포 잔재물, 다른 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 및 염과 같은 발효액 잔류물로부터 분리될 필요가 있을 것이다. 그 범용성 및 표적 화합물에 대한 민감성으로 인하여, 크로마토그래피는 현재 사용되는 많은 생물공학 정제 체계에서 적어도 하나의 단계로서 이용된다. 크로마토그래피라는 용어는 모두 2종의 상호 혼화불가능한 상을 접촉시키는 원리에 기반하는, 밀접하게 연관된 분리 방법의 집합을 포괄한다. 더 구체적으로, 표적 화합물은 이동 상 내로 도입 되며, 이 이동 상이 고정 상과 접촉한다. 다음에, 표적 화합물은 이동 상에 의해 시스템을 통하여 운반되면서 고정 상과 이동 상 사이의 일련의 상호작용을 받게 된다. 상호작용은 샘플 성분들의 물리적 또는 화학적 특성의 차이를 활용한다.
크로마토그래피의 고정 상은 표적 화합물과 상호작용을 할 수 있는 관능기인 리간드가 결합되어 있는 고체 담체로 구성된다. 따라서, 리간드는 원하는 분자의 분리, 동정, 및/또는 정제를 수행하는 능력을 담체에 부여하게 된다. 액체 크로마토그래피법은 통상적으로 화합물을 분리하기 위하여 사용되는 상호작용 원리를 따라 명명된다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피는 전하-전하 상호작용에 기반하며; 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수성 상호작용을 이용하고; 친화성 크로마토그래피는 특이적인 생물학적 친화성에 기반한다.
잘 알려진 바와 같이, 이온 교환은 하전된 표적 화합물과 반대로 하전된 크로마토그래피 매트릭스 사이의 가역적인 상호작용에 기반한다. 용리는 대부분 통상적으로 염 농도를 증가시키는 것에 의해 수행되나, pH를 변화시키는 것도 동일하게 가능하다. 이온-교환체는 양으로 하전된 표적 화합물을 흡착하기 위하여 음으로 하전된 크로마토그래피 매트릭스가 사용되는 양이온-교환체; 및 음으로 하전된 표적 화합물을 흡착하기 위하여 양으로 하전된 크로마토그래피 매트릭스가 사용되는 음이온-교환체로 구분된다. 넓은 pH 구간에 걸쳐 하전되는 이온-교환체에 대하여 "강" 이온 교환체라는 용어가 사용되며, 반면, "약" 이온-교환체는 소정 pH 값에서 하전가능하다. 한가지 통상적으로 사용되는 강 양이온-교환체는 S 기로 알려진 술포네이트 리간드를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 양이온 교환체는 관능 기에 의해 형성되는 기 및 그의 담체에의 링커(linker)에 의해 명명되는데; 예를 들어, SP 양이온 교환체에서는 S 기가 프로필에 의해 담체에 결합된다.
리간드가 결합되어 있는 담체의 특성 역시 크로마토그래피 매트릭스의 분리 특성에 영향을 주게 된다. 원하는 크로마토그래피 양식에 따라, 실질적으로 친수성이거나 또는 소수성인 담체가 바람직할 수 있다. 담체에 대한 추가적인 고려사항은 관능화의 용이성이다. 리간드의 결합에 사용되는 화학작용에 따라, 담체는 좀 더 반응성인 형태로 활성화, 즉 전환될 수 있다. 이러한 활성화 방법은 덱스트란 또는 아가로스와 같은 친수성 담체 하이드록실 기의 알릴화와 같이, 이 분야에 잘 알려져 있다. 공유 리간드 결합은 통상적으로 고체 지지 매트릭스 상에 하이드록실, 카르복실, 티올, 아미노 기 등과 같은 반응성 관능기를 사용함으로써 달성된다. 매트릭스의 결합 용량을 향상시키기 위하여, 종종 리간드와 담체 사이에 간단하게 링커로 알려진 연결 암(linking arm)이 제공된다. 이와 같은 링커는 리간드를 담체로부터 물리적으로 멀어지도록 하게 되며, 이에 따라 매트릭스에 의한 방해를 최소화하면서 표적 화합물이 리간드와 상호작용할 수 있게 된다. 그러나, 크로마토그래피 매트릭스 합성에서의 링커의 사용은, 매트릭스 표면 상의 관능기와 반응하여 그와 공유 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 관능기; 및 리간드 상의 관능기와 반응하여 그와 공유 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 관능기를 가지는 관능성 반응물의 사용을 필요로 한다.
미국 특허 5,789,578호 (마쎄이(Massey) 대학)는, 표적 화합물과 결합할 수 있으며, 술파이드, 술폭사이드, 또는 술폰 관능기를 포함하는 연결 기를 통하여 매 트릭스에 공유적으로 결합되는 리간드를 가지는 지지 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다. 비술파이트가 S 기를 제공하는 반응물로서 사용된다. 더 구체적으로, 미국 특허 5,789,578호는 알릴 글리시딜 에테르, 알릴 할라이드 또는 프로파르길 할라이드를 사용하고, 염기의 존재 하에 통상적인 방법을 사용하여 펜던트(pendent) 에틸렌형 불포화 성분을 가지는 담체를 제공한다. 구체적으로, 할라이드 또는 글리시딜 기는 알칼리성 pH에서 매트릭스의 하이드록실 기와 반응한다. 이러한 조건 하에서는, 알릴 기가 매트릭스 또는 반응 용액에 사용된 물과 제한된 반응성을 가질 것으로 기대된다. 다음에, 에틸렌형으로 불포화된 기는 유리 라디칼 조건 하에서 티올-함유 리간드와 반응하여 그의 공유 결합을 제공한다.
그러나, 상기-논의된 미국 특허 5,789,578호에서 개시된 바와 같은 알릴기의 도입 및 이어지는 S 기의 결합은 담체 상에 반응하지 않은 일부 알릴 기를 남기는 동시에 다른 일부는 인접 술포네이트-술피네이트 기를 도입하게 된다. 또한, 활성화된 반응물은 원치 않는 가교-결합 반응의 위험도 수반하게 된다. 명백히, 예컨대 약물 제조 공정에 추가된 어떠한 단계도 공정을 더 고비용으로 할 것이며, 따라서, 화학적 공정에서 모든 공정을 가능한 한 간단하게 만드는 것은 일반적인 목표이다.
따라서, 이 분야에는, 바랍직하게는 상기-논의된 단점들 중 하나 이상을 피하면서 더 빠르고 더 강력한 방식으로 다당류 담체의 관능화를 가능케 하는 개선된 방법의 분명한 필요성이 있다.
<발명의 개요>
일 양태에서, 본 발명은 양이온-교환 기를 포함하는 크로마토그래피 매트릭스의 신규한 제조 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다당류 담체에 결합된 S 기를 포함하는 크로마토그래피 매트릭스의 제조 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 유리하게도 선행 기술의 방법보다 더 균질한 양이온 교환체로 귀결된다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 선행 기술의 매트릭스에 비해 증가된 용량으로 1종 이상의 면역글로뷸린을 결합시킬 수 있는 크로마토그래피 매트릭스에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 세부사항 및 장점은 하기하는 상세한 설명 및 청구항에서 분명해질 것이다.
<정의>
여기에서 "표적 화합물"이라는 용어는 누군가 수용액으로부터 분리하고자 하는 모든 화합물, 분자 또는 다른 물질을 의미한다. 표적 화합물은 원하는 생성물이거나, 또는 액체 생성물의 원치 않는 오염물질일 수 있다.
여기에서 사용되는 "다당류"라는 용어는 천연 다당류, 합성 다당류, 다당류 유도체, 변형 다당류, 및 이들의 모든 혼합물을 포함한다.
여기에서 "리간드"라는 용어는 표적 화합물과 상호작용할 수 있는 관능기를 포함하는 물질을 말하는, 크로마토그래피에서 통상적인 의미로 사용된다. 리간드 기의 예는 양으로 하전되거나 또는 하전가능한 기 (음이온 교환 리간드); 음으로 하전되거나 또는 하전가능한 기 (양이온 교환 리간드); 소수성 기; 항체에 대한 항원의 친화성과 같이 표적 화합물에 대하여 특이적인 생물학적 친화성을 가지는 기 (친화성 리간드) 등이다.
여기에서 "연장체(extender)"라는 용어는 담체의 표면에 결속되어 있음으로써 리간드와 담체 사이의 거리를 연장시키는 기능을 하는 중합체를 의미한다. 이와 같은 "연장체"의 한 가지 주요 기능은 이용가능한 표면적을 증가시킴으로써; 그리고 빠른 표면 확산 및 이와 유사한 과정을 위하여 유연성 중합체 사슬을 제공함으로써, 표적 분자의 결합 용량 및 질량 수송을 증가시키는 것이다. 연장체는 예컨대 "유연성 암", "촉수" 및 때때로 "보풀"로도 알려져 있다. 숙련자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 논의되었던 링커 역시 소정 정도의 연장을 제공하게 되나, 통상적으로 링커는 더 긴 중합체 연장체에 비해 더 작은 수의 원자로 구성된다.
따라서, 본 발명은 술포네이트-관능화된 담체의 제조를 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 제1 양태로써, 본 발명은 이용가능한 하이드록실 기 (OH 기)를 포함하는 다당류 담체를 제공하는 단계; 및 상기 하이드록실 기를 비닐 술포네이트와 반응시켜 술포네이트-관능화된 (S-관능화된) 양이온 교환체를 제공하는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다. 본 문맥에서, "이용가능한"이라는 용어는 반응에 이용가능하다는 것을 의미함을 알 수 있다. 일 구현예에서, 반응에 사용되는 하이드록실 기는 원래 다당류에 존재하는 하이드록실 기이다.
따라서, 유리하게도 본 발명은 다당류를 알릴화하는 예비-활성화 단계의 필요성을 피하게 된다. 따라서, 더 빠르며 그에 따라 비용이 덜 드는 방법이 본 발명에 의해 제공되며, 이 방법에서는 상기 논의된 바와 같은 부반응의 위험이 실질적으로 감소한다. 따라서, 본 발명 방법은 실질적으로 균질인 생성물로 귀결된다.
본 문맥에서, 여기에서 사용되는 "비닐 술포네이트"라는 용어는 하기 화학식 (I)로 정의되는 비치환 비닐 술포네이트와,
CH2=CH-SO3
화학식 (II)로 정의되는 치환 비닐 술포네이트 모두를 포괄하는 것으로 이해되어야 하며,
CHR1=CR2-SO3
여기서, R1 및 R2 중 하나 이상은 크로마토그래피 매트릭스에 어떠한 원치 않는 상호작용도 부여하지 않는 소정의 적합한 치환체일 수 있다.
따라서, 본 발명 방법의 일 구현예에서, 하이드록실 기는 상기 화학식 (I)로 정의된 바와 같은 비치환 비닐 술포네이트와 반응한다. 다른 구현예에서, 하이드록실 기는 상기 화학식 (II)로 정의된 바와 같은 α-치환 또는 β-치환 비닐 술포네이트와 반응한다.
적합한 비닐 술포네이트는 클라리안트(Clariant) GmbH 사와 같은 시중의 출 처로부터 입수가능하다. 이 분야의 숙련자라면 알 수 있는 바와 같이, 반응은 친핵성 하이드록실 기가 비닐 술포네이트의 β-탄소를 공격하게 되는 마이클 첨가반응(Michael addition)일 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명 방법에 의해 수득되는 S-관능화 양이온 교환체는 도식적으로 담체-링커-O-CH2-CH2-S로써 기재될 수 있다.
잘 알려진 바와 같이, 마이클 첨가반응에서, 하이드록사이드 또는 알콕사이드 이온은 통상적으로 촉매로서 사용된다. 반응 기간은 10시간 이하, 예컨대 4-6시간의 범위일 수 있으며, 온도는 20-80 ℃의 범위 중 어느 것일 수 있다. 본 발명의 방법에서, 반응은 유리하게도 물과 같은 수성 용매 중에서 수행된다. 따라서, 일 구현예에서, 선행 기술의 방법과 비교할 때 본 발명 방법의 추가적인 장점은 그것이 휘발성 및 독성 화학물질을 사용할 필요가 없다는 것이다.
유리한 일 구현예에서, 담체는 가교-결합된 다당류를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 다당류 담체는 그의 강성 및 그에 따른 그의 유동-압력 특성을 개선하는 방법에 의해 제조되는데, 이러한 강성의 다당류는 때때로 고유동 아가로스와 같은 "고유동(high flow)" 다당류로 표시된다. 따라서, 본 발명의 제1 양태는, 그 강성을 개선하는 방법에 의해 제조되는 소정의 겔화가능 다당류로부터 담체가 제조되는, 상기한 바와 같은 술포알킬-관능화 크로마토그래피 매트릭스를 제공하는 방법도 포괄하며, 상기 방법은 하기에 더 상세하게 논의될 것이다.
따라서, 본 발명의 방법에서, 가교-결합된 담체는 하기에 의해 제공될 수 있 다:
(a) 수성 다당류 용액을 제공하고, 상기 다당류의 하이드록실 기 중 일부를 치환하는 단계;
(b) 다당류 용액을 겔화하여 담체를 제공하는 단계; 및
(c) 다당류의 하이드록실 기를 반응시킴으로써 (b)로부터 수득된 다당류 겔을 가교-결합시키는 단계.
제1 구현예에서, 다당류 강성의 개선은 "비-반응성 기"로도 알려진, 친핵성 공격에 민감하지 않은 소정의 적합한 기를 사용한 치환에 의해 달성된다. 비-반응성 기를 사용한 치환에 의해, 다당류의 안정성이 개선될 것이며, 이어지는 가교-결합 단계의 제어가 더 용이하게 된다. 일 구현예에서, 비-반응성 기는 에테르, 에스테르, 아미드 및 크산테이트로 구성되는 군에서 선택된다.
다른 구현예에서, 다당류 강성의 개선은, 모두 하이드록실 기와 쉽게 반응하는 예컨대 알릴 기, 에폭사이드, 할로하이드린, α,β-불포화 카르보닐과 같은, 친전자성 기 또는 쉽게 친전자성 기로 전환되는 기와 같이, 본 발명 맥락에서 "반응성"인 기를 사용한 치환에 의해 달성된다.
따라서, 다른 구현예에서, 치환은 하나의 활성 부위 및 하나의 불활성 부위를 가지는 이중관능성 가교-결합제를 다당류 용액에 첨가하여 다당류의 하이드록실 기가 가교-결합제의 활성 부위와 반응하도록 하는 단계; 단계 (b)의 겔화 후에 가교-결합제의 불활성 부위를 활성화하는 단계; 다음에, 상기 활성화된 부위를 다당류 겔의 하이드록실 기와 반응시켜 겔을 가교-결합시키는 단계에 의해 제공될 수 있다.
결론적으로, 본 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스의 제조 방법은 하기를 포함한다:
a) 하나의 활성 부위 및 하나의 불활성 부위를 가지는 이중관능성 가교-결합제를 다당류 용액에 첨가하여 다당류의 하이드록실 기가 가교-결합제의 활성 부위와 반응하도록 하고;
b) 냉각과 같은 것에 의해 다당류 용액을 겔화함으로써 담체를 제공하고;
c) 가교-결합제의 불활성 부위를 활성화하고;
d) 이렇게 수득된 활성화된 부위를 다당류 겔의 하이드록실 기와 반응시켜 겔을 가교-결합시키고;
e) 나머지 하이드록실 기를 비닐 술포네이트와 반응시켜 술포네이트-관능화된 (S-관능화된) 양이온 교환체를 제공한다.
본 발명 방법에 사용되는 이중관능성 가교-결합제는 하나의 활성 부위 및 하나의 불활성 부위를 포함할 것이다. 본 문맥에서, "활성 부위"라는 용어는 다당류의 하이드록실 기와 반응할 수 있는 모든 기를 의미한다. 이러한 기의 예는 할라이드, 에폭사이드, 메틸올 기이다. "불활성 부위"라는 용어는 반응성 부위와 동일한 반응 조건 하에서는 반응성이 아니나, 나중에 다당류의 하이드록실 기와 반응하도록 활성화될 수 있는 기를 말한다. 따라서, 적합한 가교-결합제는 알릴브로마이드; N-메틸올 아크릴아미드; 비닐 벤질클로라이드; 및 신나모일 클로라이드와 같은 알릴글리시딜 에테르 및 알릴할라이드로 구성되는 군에서 선택된다. 일 구현예에 서, 이중관능성 가교-결합제는 알릴글리시딜 에테르, 알릴브로마이드 및 에피클로로하이드린을 포함하는 군에서 선택된다. 이렇게 가교-결합된 겔은 업계 관련계층에 알려진 바와 같은 통상적인 방법에 의해 추가적으로 가교-결합될 수 있다. 상기 방법 중 단계 (a)-(d)와 관련한 추가적인 세부사항은 여기에 참조로써 개재되는 미국 특허 6,602,990호 (베르그(Berg))에 제공된 것과 같은 것일 수 있다.
크로마토그래피에서 가능한 한 높은 결합 용량을 얻기 위하여, 본 발명 방법에 사용되는 담체는 표적 화합물에 결합하는 이용가능 표면적을 가능한 한 크게 제공해야 한다. 따라서, 일 구현예에서, 담체는 다공성이다. 본 문맥에서, 반응에 이용가능한 기는 통상적으로 담체의 외부 표면 상 및 충분한 크기를 나타내는 기공의 표면 상 모두에 존재한다는 것이 이해되어야 한다.
크로마토그래피 담체의 표면적을 증가시키는 또 다른 또는 추가적인 방법은 담체와 리간드 사이에 하나 이상의 연장체를 제공하는 것이다. 친수성 연장체는 하이드록시, 카르복시, 아미노, 반복성 에틸렌 옥사이드 (-CH2CH2O-), 및 아미도로 구성되는 군에서 선택되는 관능기를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 연장체는 다당류와 같은 친수성 중합체를 포함한다. 예시적인 다당류 연장체는 전분; 셀룰로오스 에테르와 같은 셀룰로오스, 예컨대 하이드록시에틸 셀룰로오스; 메센테로이드(Mesenteroid) B-512와 같은 덱스트란; 및 아가로스이다.
다당류와 같은 폴리하이드록시관능성 중합체는 그 친수성, 및 리간드의 결속 및 부착 모두를 위한 반응성 하이드록실 기의 충분한 공급량으로 인하여 바람직한 연장체이다. 일 구현예에서, 연장체는 셀룰로오스 에테르; 덱스트란; 전분 및 전분 유도체; 헤미셀룰로오스; 펙틴; 식물 종자 고무 (예, 로커스트 빈 검 또는 구아 고무); 식물 삼출물 고무 (예, 아라비아 고무); 풀룰란(pullulan); 경화글루칸(scleroglucan); 및 크산탄으로 구성되는 군에서 선택되는 다당류이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명 방법에 사용되는 담체는 덱스트란으로 그라프트되어 연장체를 제공하는데, 이 경우 반응에 이용가능한 하이드록실은 적어도 부분적으로 덱스트란으로부터 유래하게 된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 비닐 술포네이트와의 반응 전에 다당류 겔에 연장체를 제공하는 단계를 포함한다. 덱스트란은 예컨대 GE 헬스케어(Healthcare) (스웨덴 웁살라) 사로부터 시중 제품으로서 쉽게 구입가능하며, 잘 알려진 방법에 따라 다당류 담체에 결합될 수 있다. 덱스트란의 가장 적합한 분자량은 담체의 기공 크기와 같은 다른 조건에 달려 있을 것이며, 20-70 kD과 같이 10-500 킬로달톤 (kDa)의 범위일 수 있다. 유리한 일 구현예에서, 덱스트란은 류코노스톡(Leuconostoc) 메센테로이드로부터 유도되며, 분자량 약 40 kD의 것이다. 일 구현예에서, 덱스트란은 약 5 ％의 글루코스 잔기가 분지점인 것을 의미하는 중간급 분지형이다.
다른 구현예에서, 연장체는 합성 중합체를 포함한다. 이러한 합성 중합체는 폴리비닐 알콜; 폴리아크릴- 및 폴리메타크릴아미드; 피콜(Ficoll)TM (슈크로스-에피클로로하이드린 분자); 하이드록시관능성 폴리비닐에테르와 같은 폴리비닐 에테르; 폴리글리세롤; 하이드록시관능성 폴리아크릴아미드; 하이드록시관능성 폴리메 타크릴레이트; 폴리글리시돌; 및 에톡실화 폴리올을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
숙련자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 최적의 연장체의 길이 (크기)는 담체에의 결합점의 수, 연장체의 성질, 리간드의 구조 및 크기는 물론 연장체 분자 당 리간드의 수와 같은 몇 가지 인자에 달려있을 것이다. 본 발명 연장체의 분자량은 500 D 초과, 바람직하게는 1000 D 초과, 가장 바람직하게는 5-500 kD 범위일 것이다.
일 구현예에서, 연장체는 잘 알려진 방법에 따라 리간드가 결합될 수 있는 반응성 기를 포함하는 중합체이다. 다른 구현예에서, 리간드는 담체 표면으로 결속되기 전에 연장체에 결합되며, 이것 역시 이 분야 숙련자에 의해 용이하게 달성된다. 담체에의 연장체의 결합은 이 분야 숙련자에 의해 용이하게 수행되는데, 예컨대 여기에 참조로써 포함되는 미국 특허 6,428,707호 (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) AB 사)를 참고하라.
상기 언급한 바와 같이, 다당류 담체는 화학 반응에 이용가능한 하이드록실 기를 포함한다. 따라서, 담체를 제공함에 있어, 다당류는 아가로스, 아가, 셀룰로오스, 덱스트란, 전분, 펙틴, 키토산, 곤약(konjac), 카라기난, 젤란, 알기네이트 등과 같이 겔을 형성할 수 있는 모든 다당류일 수 있다. 일 구현예에서, 다당류 담체는 덱스트란 및 아가로스로 구성되는 군에서 선택된다. 유리한 일 구현예에서, 다당류 담체는 아가로스이다. 구체적인 구현예에서, 담체는 덱스트란 연장체가 결합된 아가로스 겔로 구성된다. 다른 구체적인 구현예에서, 담체는 덱스트란 연장체가 결합된 덱스트란 겔로 구성된다.
크로마토그래피 분야에서는, 아가로스가 그 다공성으로 인하여 리간드 결합에 이용가능한 표면을 증가시키는 담체를 구성한다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 크로마토그래피 담체의 선택은, 하전된 기의 "담체"로서 작용하는 화학적 성분이 직물 재료에 대한 전체적 인력을 증가시키도록 선택되었던, 세제 업계에서 사용되는 상기-논의의 생성물에 적용되던 그것과, 다른 척도에 기반하게 된다.
다당류 담체는 이 분야에 잘 알려져 있는 임의 통상적인 방법에 의해서 제조될 수 있다. 비-관능화 크로마토그래피 담체는 세파로스(Sepharose)TM (스웨덴 웁살라의 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) 사)와 같이, 시중에서 구입가능하다. 다당류 담체는 입자, 바람직하게는 본질적으로 구형인 입자, 모노리스(monolith), 막, 필터, 칩, 모세관 또는 소정의 다른 형태와 같은, 모든 적합한 형상의 것일 수 있다.
본 발명 방법의 일 구현예에서, 담체는 본질적으로 구형인 입자와 같은 겔 입자로 구성된다. 따라서, 상기한 방법에서, (b)는 입자를 제조하는 것을 포함하며, 이것은 예컨대 유기 상 중 아가로스 용액의 현탁 겔화에 의해 숙련자에 의해 용이하게 달성된다. 이러한 입자는 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 이 분야 숙련자에 의해 용이하게 제조되는데, 예컨대 문헌 [S Hjerten: Biochim Bio-phys Acta 79(2), 393-398 (1964)]를 참조하라. 구체적인 구현예에서, 입자의 평균 직경은 약 200 ㎛ 미만과 같이 약 400 ㎛ 미만이다. 따라서, 입자 직경의 예시적 범 위는 10-100 ㎛, 예컨대 20-80 ㎛, 30-50 ㎛ 또는 50-70 ㎛이다.
다른 구현예에서, 다공성 담체는 막을 포함한다. 다당류 막은 이 분야 숙련자에 의해 용이하게 제조되는데, 예컨대 문헌 [S. T. Johnston, W.M. Deen: J. Membr. Sci. 153 (1999) 271-179]를 참조하라.
제2 양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 제조되는 크로마토그래피 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명자들에 의해 이러한 매트릭스는 결합 용량 부분에서 예상치 못했던 특성을 제공하는 것으로 나타났다.
제4 양태에서, 본 발명은 비닐 술포네이트를 다당류의 하이드록실 기와 반응시킴으로써 제조되는 술포네이트-관능화된 (S-관능화된) 다당류 담체를 포함하는, 액체 크로마토그래피 컬럼에 관한 것이다. 일 구현예에서, 컬럼은 상기한 바와 같이 제조된 술포네이트-관능화 (S-관능화) 양이온 교환체를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명 컬럼은 상기한 바와 같이 제조된 크로마토그래피 매트릭스를 포함한다. 컬럼은 생체적합 플라스틱 예컨대 폴리프로필렌, 스테인레스 스틸과 같은 강철, 또는 유리와 같은, 어떠한 통상적인 물질로부터도 제조될 수 있다. 컬럼은 실험실 규모 또는 대규모 정제에 적합한 크기의 것일 수 있다. 구체적인 일 구현예에서, 본 발명에 따른 컬럼에는 루어 어댑터(luer adaptor), 배관 커넥터, 및 반구형 너트가 제공된다. 크로마토그래피 매트릭스는 컬럼 내에 충전되거나, 또는 유동층으로서 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 크로마토그래피 컬럼은 "제한-사용" 크로마토그래피 컬럼으로 알려진 종류의 것으로서, 본 문맥에서 이것은 1-10 회와 같이 제한된 수의 사용에 가장 적합한 충전 크로마토그래피 컬럼을 의미한다. 이러한 제한-사용 제품은 시중에서 "일회용 제품"으로 알려져 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 비닐 술포네이트를 아가로스의 하이드록실 기와 반응시킴으로써 제조한 다공성 술포네이트-관능화 (S-관능화) 아가로스 크로마토그래피 매트릭스를 통하여 표적 화합물(들)을 포함하는 액체를 통과시켜 표적 화합물(들)을 흡착하는 단계; 및 크로마토그래피 매트릭스를 용리액과 접촉시킴으로써 상기 표적 화합물(들)을 회수하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 표적 화합물을 분리하는 공정에 관한 것이다. 따라서, 본 발명 공정은 양이온 교환 크로마토그래피의 방법이다. 가장 바람직한 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 상기한 바와 같다.
양이온 교환 크로마토그래피의 원리는 이 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 크로마토그래피 매트릭스는 흡착과 용리 사이에 세척될 것이다. 이 분야 숙련자라면 인식할 수 있는 바와 같이, 이러한 공정에서는 통상적인 버퍼와 조건이 유용할 것이다. 크로마토그래피 방법의 재고를 위해서는, 예컨대 문헌 [Protein Purification - Principles, High Resolution Methods and Applications (J.-C. Janson and L. Ryden, 1989 VCH Publishers, Inc.)]를 참조하라.
상기 공정은 단백질 예컨대 단일클론 또는 다클론 항체, 디펩티드 또는 올리고펩티드와 같은 펩티드, 펩티드 핵산, 바이러스, 세균 세포와 같은 세포, 프리온 등과 같은 생체분자와 같은 표적 화합물의 분리 또는 정제와 같은 분리에 사용될 수 있다. 유리한 일 구현예에서, 표적 화합물은 단백질이며, 본 방법은 실질적으로 순수한 단백질을 제공한다. 가장 유리한 구현예에서, 표적 화합물은 IgG와 같은 이뮤노글로뷸린이다.
다르게는, 본 공정은 약물 후보물과 같은 양이온성 유기 분자를 분리하기 위하여 사용된다. 다른 구현예에서, 본 공정은 예컨대 진단 목적으로 상기 논의된 표적 화합물들 중 어느 것을 동정하기 위하여 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 공정은 유청으로부터 유래하는 다양한 단백질, 당 및 감미료 용액, 아미노산 함유 용액과 같은, 식품 및 음료 업계의 생성물을 정제하기 위하여 사용된다. 따라서, 본 발명 공정의 생성물은 항체-기반의 약물 또는 진단약; 유전자 치료에 사용하기 위한 플라스미드 또는 바이러스와 같이, 치료에 사용하기 위한 벡터; 기능성화된 식품과 같은 식품 보조물; 진단 시약 등과 같은 약물 또는 약물 표적물일 수 있다. 본 발명에 따라 정제된 분자의 구체적인 적용분야는 개인형 의약을 위한 약물로서의 것이다.
본 실시예들은 단순히 예시적인 목적을 위하여 제공되는 것으로서, 첨부된 청구항에 의해 규정되는 바와 같은 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 개선된 유동/압력 특성을 가지는 아가로스에 대한 S 기의 결합
실시예 1a: 본 발명에 따른 비닐 술포네이트 결합
본 실시예에서, 개시 물질은 미국 특허 6,602,990호 (베르그(Berg))에서 개시된 바와 같이 제조된 아가로스 겔 입자, 즉, 개선된 유동/압력 특성을 가지는 아 가로스였다.
비닐 술포네이트를 사용한 결합 과정: 7 mL의 배수된 겔을 유리 필터 상에 위치시키고, 15 mL의 수 중 30 ％ 비닐 술폰산 (VSA) (플루카(Fluka) 사)로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 겔을 반응 용기로 이동시키고, VSA 용액을 첨가하여 총 부피를 9 mL로 하였다. 이후, 7 mL의 50 ％ (18 M) 수산화 나트륨 모액을 첨가하였다. 반응 슬러리를 휘젓고, 6시간 동안 50 ℃로 가열한 다음, 반응 용액으로부터 겔을 여과함으로써 반응을 중지하고, 여러번 나누어 물로 겔을 세척하였다.
실시예 1b ( 비교예 ): 통상적인 나트륨 비술파이트 결합
개시 물질은 상기 실시예 1a에서 정의된 바와 같은 아가로스 겔 입자였다.
알릴화 : 100 ml의 아가로스 입자를 12 mL의 50 ％ NaOH 수용액 및 0.5 g의 NaBH4와 혼합하였다. 혼합물을 50 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 알릴글리시딜 에테르 (60 ml)를 첨가하고, 현탁액을 50 ℃에서 강하게 교반하면서 추가적인 18시간 동안 방치하였다. 5 M AcOH의 계속적인 첨가에 의해 pH 7에 도달할 때까지 중화한 후, 혼합물을 여과하고, 겔을 0.5 L의 에탄올, 1 L의 증류수, 200 ml의 0.2 M 아세트산 및 500 ml의 증류수로 순차적으로 세척하였다. 알릴 함량은 0.14 밀리몰/mL 이었다.
나트륨 비술파이트를 사용한 SP 결합: 상기 알릴화 아가로스 입자의 수 중 교반 슬러리 (총 부피 130 mL)에 28 g의 나트륨 비술파이트를 첨가하고, NaOH로 pH를 조정하였다. 슬러리 내부로 공기를 연속적으로 폭기시킴으로써, 반응 혼합물을 실온 에서 18시간 동안 교반하고, 증류수로 세척하였다. 이온 용량은 0.11 밀리몰/mL 이었다.
결과
실시예 1의 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 2: 개선된 유동/압력 특성을 가지는 아가로스에 대한 연장체를 통한 S 기의 결합
실시예 2a: 본 발명에 따른 비닐 술포네이트 결합
개시 물질은 상기 실시예 1a에서 정의된 바와 같은 아가로스 겔 입자였다.
에폭시-활성화 과정: 55 g의 아가로스 겔을 배수하고, 온도-조절 반응 용기에서 15 mL의 증류수와 함께 교반하였다. 8.5 mL의 50 ％ NaOH 및 20 mg의 NaBH4를 첨가하고, 5분 간의 교반 후, 14 mL의 에피클로로하이드린을 첨가하였다. 반응 슬러리를 30 ℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 유리 필터 깔대기에서 증류수로 다중 세척하였다.
덱스트란 -결합 과정: 21 g의 덱스트란(Dextran) T40 (스웨덴 웁살라의 아머샴 바이오사이언시스 사)을 25 mL의 증류수에 용해시켰다. 실시예 1a에서 개시된 바와 같이 제조되었으며 상기한 바와 같이 에폭시-활성화된 50 g의 배수 아가로스 겔 입자를 첨가하고, 30 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 2.5 mL의 50 ％ NaOH를 첨가하고, 슬러리를 30 ℃에서 18시간 동안 교반한 후, 이어서 유리 필터 깔대기에서 증류수로 다중 세척하였다.
비닐 술포네이트를 사용한 결합 과정:
실시예 1a에서 상기한 바와 같이 비닐 술포네이트를 사용하여, 본 발명에 따라 고도로 가교-결합된 아가로스의 연장체에 S 기를 결합하였다.
실시예 2b ( 비교예 ): 통상적인 나트륨 비술파이트 결합
본 실시예에서는, 상기 실시예 1a에서 정의된 아가로스 겔 입자를 에폭시-활성화하고, 실시예 2a에서 상기된 바와 같은 덱스트란 연장체를 제공하였다.
나트륨 비술파이트를 사용한 SP -결합: 상기 실시예 1b에서 개시된 바와 같이 반응을 수행하였다.
결과
실시예 2의 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 3: 덱스트란 연장체의 효과
실시예 3a: 연장체를 통한 아가로스에의 S 기의 결합
시중에서 구입가능한 가교-결합 아가로스 입자 (세파로스TM)를 스웨덴 웁살라의 아머샴 바이오사이언시스 사로부터 입수하였다.
실시예 2a에서 상기한 바와 같이 에폭시-활성화, 덱스트란 연장체의 결합 및 비닐 술포네이트를 사용한 S 기의 결합을 수행하였다.
실시예 3b: 연장체를 사용하지 않은 아가로스에의 S 기의 결합
개시 물질은 실시예 3a에서 상기한 바와 같은 시중에서 구입가능한 아가로스였다.
실시예 1a에서 상기한 바와 같이 비닐 술포네이트를 사용한 S 기의 결합을 수행하였다.
결과
실시예 3의 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
실시예 4: 이온 용량 및 단백질 결합
상기 실시예 1-3으로부터 수득된 생성물을 하기한 바와 같이 시험하였다. 결과는 표 1 (실시예 1 및 2) 및 표 2 (실시예 3)에 제시하였다.
덱스트란 함량 측정
덱스트란 함량과 관련하여 하기와 같이 실시예 2a, 2b 및 3a의 생성물을 시험하였다. 1.0 mL의 덱스트란-변형된 겔을 취하여 가열 장치가 장착된 분석용 저울 상에서 120 ℃로 건조하였다. 상응하는 에폭시-활성화 겔을 대조로써 사용하였으며, 덱스트란 변형 겔과 동일한 방식으로 분석하였다. 대조 겔과 덱스트란-결합 겔 사이의 중량 차이를 결합된 덱스트란의 양인 것으로 간주하고 mg/mL겔 로 나타내었다.
이온 용량 측정
적정에 의해 클로라이드 이온 교환 용량을 측정하였다. 겔 슬러리를 0.5 M HCl로 3분 동안 처리한 다음, 1 mM HCl로 철저하게 세척하였다. 1.0 ml의 겔 샘플을 취하였다. 샘플을 적정 용기로 이동시키고, 5 mL의 물을 첨가하였다. 다음에, 0.1 M NaOH로 pH 7.0까지 샘플을 적정하였다.
단백질 용량 측정
AKTATM (스웨덴 웁살라의 아머샴 바이오사이언시스 사) 10/100에 탑재된 HR5/5 컬럼에서, 50 mM 아세테이트 pH 4.75 중 라이소자임에 대하여 1 mL/분 및 다클론 이뮤노글로뷸린 (IgG)에 대하여 0.5 mL/분의 유속으로, 파과 용량(breakthrough capacity)을 측정하였다. 파과 용량에 대한 단백질 용액의 농도는 대략 4.0 mg/ml이었다. 파과 곡선으로서 동적 단백질 결합 용량을 측정하였으며, 용량은 최대 UV280 흡광도의 10 ％에서 해독하였다.
파과 용량법은 하기와 같이 수행되었다:
크로마토그래피 시스템의 우회 체제(bypass position)를 통하여 안정한 바탕선에 도달할 때까지 흡착 버퍼를 펌핑하였다. 자동 영점(auto zero)을 수행하고, 시스템을 통하여 ca:10 ml의 단백질 용액 (슈퍼 루프(super loop)를 통하여 적용)을 펌핑하여 안정한 100 ％ 신호를 얻었다. 이 단계의 유속은 분석시의 것과 동일한 것으로서, 다시 말하면 300 cm/시간 (1 ml/분)이었다. 100 ％ 신호의 20 ％에서 기록된 흡광도가 파과 용량법에 설정되었다. 흡착 버퍼를 사용한 안정한 바탕선에 도달한 후, 다시 우회 체제에서, 정면 분석(frontal analysis)을 시작하였다. 방법은 시스템에 탑재된 컬럼을 통하여 10 ml의 흡착 버퍼 (대략 5 컬럼 부피)를 사용한 컬럼 평형으로 시작되었다. 이후, 자동 영점을 수행하고, 20 ％ 파과가 달성될 때까지 단백질 용액이 컬럼에 적용되었다.
결과
크로마토그래피
매트릭스		 덱스트란 양
(mg/mL)		 이온 용량
(마이크로몰/mL)		 IgG에 대한 용량
(mg/mL)		 라이소자임에 대한
용량 (mg/mL)
실시예 1a
실시예 1b
실시예 2a
실시예 2b		 0
0
16
16		 107
121
120
109		 23
13
97
18		 54
71
147
71
크로마토그래피
매트릭스		 덱스트란 양
(mg/mL)		 이온 용량
(마이크로몰/mL)		 IgG에 대한 용량
(mg/mL)		 라이소자임에 대한
용량 (mg/mL)
실시예 3a
실시예 3b		 16
0		 113
97		 143
68		 131
103

Claims (21)

  1. 이용가능한 하이드록실 기를 포함하는 1종 이상의 다당류 담체를 제공하는 단계; 및
    상기 하이드록실 기를 비닐 술포네이트와 반응시켜 술포네이트-관능화된 (S-관능화된) 양이온 교환체를 제공하는 단계
    를 포함하며,
    하이드록실 기가 비닐 술포네이트와 반응하여 S-관능화된 양이온 교환체를 제공하도록 연장체를 통하여 담체 표면에 결합된, 크로마토그래피 매트릭스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다당류가 가교-결합된 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 담체가
    (a) 수성 다당류 용액을 제공하고, 상기 다당류의 하이드록실 기 중 일부를 치환하는 단계;
    (b) 다당류 용액을 겔화하여 담체를 제공하는 단계; 및
    (c) 다당류의 하이드록실 기를 반응시킴으로써 (b)로부터 수득된 다당류 겔을 가교-결합시키는 단계
    에 의해 제공되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, (a)에서 정의된 상기 하이드록실 기의 치환이, 하나의 활성 부위 및 하나의 불활성 부위를 가지는 1종 이상의 이중관능성 가교-결합제를 다당 류 용액에 첨가하여 상기 활성 부위를 다당류의 하이드록실 기 중 일부와 반응시키는 것에 의해 제공되며; 여기서, (b)에서 정의된 겔화 후에 상기 첨가된 가교-결합제의 불활성 부위를 활성화하고; 이렇게 활성화된 부위를 다당류 겔의 하이드록실 기와 반응시켜 (c)에서 정의된 가교-결합을 제공하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류가 아가로스 및 덱스트란으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 다당류가 아가로스인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 연장체가 1종 이상의 폴리하이드록시관능성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 연장체가 덱스트란을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 다공성인 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 구형인 겔 입자로 구성되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 막인 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 의해 제조된 술포네이트-관능화 (S-관능화) 아가로스 입자로 구성되는 크로마토그래피 매트릭스.
  13. 비닐 술포네이트를 아가로스에 결합된 연장체 상에 제공된 하이드록실 기와 반응시킴으로써 제조된 다공성 술포네이트-관능화 (S-관능화) 아가로스 입자를 포함하는 매트릭스를 포함하는 액체 크로마토그래피 컬럼.
  14. 제13항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 제조된 술포네이트-관능화 (S-관능화) 양이온 교환체를 포함하는 컬럼.
  15. 비닐 술포네이트를 아가로스에 결합된 연장체 상에 제공된 하이드록실 기와 반응시킴으로써 제조된 다공성 술포네이트-관능화 (S-관능화) 아가로스 크로마토그래피 매트릭스를 통하여 표적 화합물(들)을 포함하는 액체를 통과시켜 표적 화합물(들)을 흡착하는 단계; 및
    크로마토그래피 매트릭스를 용리액과 접촉시킴으로써 상기 표적 화합물(들)을 회수하는 단계
    를 포함하는, 1종 이상 표적 화합물의 분리 방법.
  16. 제15항에 있어서, 크로마토그래피 매트릭스가 구형인 겔 입자로 구성되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 1종 이상의 표적 화합물이 단백질인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 1종 이상의 표적 화합물이 이뮤노글로뷸린인 방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 제조된 크로마토그래피 매트릭스를 사용하는 액체 크로마토그래피.
  20. 삭제
  21. 삭제
KR1020087004901A 2005-08-31 2006-08-30 크로마토그래피 매트릭스의 제조 KR101355276B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

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