CN101252986A - 色谱基体的制造 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制造色谱基体的方法,包括提供包含有效羟基的多糖载体;和使所述羟基与磺酸乙烯基酯反应以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)阳离子交换剂。载体的羟基可以是琼脂糖聚合物的羟基;或者它们也可以由增充剂,如多羟基官能聚合物提供。在一个实施方案中,载体由具有改善的流量-压力性能的琼脂糖制成。
Description
技术领域
本发明涉及色谱基体的制造,更具体地,涉及制造阳离子交换剂的优良方法。本发明还包括包含所述基体的色谱柱及其在纯化工艺中的应用。
背景
需要从液体或从其它固体物质中分离出一种化合物,如污染物或所期望的分子的例子很多。在很多领域内都利用基于电荷-电荷的相互作用来俘获并因此而分离带电或可带电的化合物。
在清洁剂工业中,已存在从纺织物分离出化合物,如泥土和污垢的方法和清洁剂。常见的实例是洗衣工业,在这里,一般把带电调节剂和清洁剂掺进洗衣粉,以从被洗涤材料分离出污垢。这种带电调节剂,也称为增效剂(benefit agent),用来直接从纺纤中剥离污垢;或者改性纤维以促进清洁过程;利用的是污垢与调节剂之间的吸引力。为提高它们的效率,已提出以如下形式提供调节剂:在其中,它们被取代到另一种化学部分上,以提高它们对拟除去化合物的亲合力。
WO 03/040279涉及洗衣应用的聚合物,更具体地,涉及在纺织物洗涤期间用取代多糖结构来促进污垢剥离。适用的多糖包括聚合度大于40,优选50~100 000的多糖。已公开的多糖结构已被通过酯或醚键偶联到多糖上的烷基,如羟烷基、羧烷基或磺烷基或其盐所取代。平均取代度,即重复糖单元上官能团的平均取代数,优选为0.1~3,更优选0.1~1。按照WO 03/040279,可以用具有α-或β-连接骨架,优选β-1,4-连接骨架的多糖。由于本领域已认识到纤维素基材料能粘结到棉纤维上,所以优选的多糖是纤维素。
在化学和生物技术领域内,常需要把目标化合物,如药品或侯选药品与源自制造过程的污染物分离开来。例如,由重组宿主细胞的表达所产生的蛋白质药品或侯选药品将需要与,例如,宿主细胞和可能的细胞碎片、其它宿主细胞蛋白质、DNA、RNA和来自发酵肉汤的残渣如盐类分离开来。由于其多样性和其对目标化合物的敏感性,在目前所用的很多生物技术纯化程序中包含至少一步色谱技术。术语色谱技术包括一类密切相关的分离法,它们全都基于使2个彼此不混溶的相接触的原理。更具体地,是把目标化合物引进流动相,而使流动相与固定相接触。然后目标化合物将随着被流动相携带通过该体系而经历一系列固定相与流动相之间的相互作用。这些相互作用利用样品各组分在物理或化学性质方面的差别。
色谱分析中的固定相由其上已偶联了配体的固体载体组成,所述配体是能与目标化合物发生相互作用的官能团。因此,配体将使载体具有实现分离、鉴定和/或纯化所感兴趣的分子的能力。液相色谱法一般按分离化合物所利用的相互作用原理命名。例如,离子交换色谱技术基于电荷-电荷相互作用;疏水相互作用色谱技术(HIC)利用疏水相互作用;以及亲合色谱技术基于特定的生物亲合性。
如众所周知,离子交换基于带电荷目标化合物与带相反电荷的色谱基体之间的可逆相互作用。洗脱最常用的方法是增加盐浓度,但改变pH值也同样可能。离子交换剂可分成用带负电荷的色谱基体来吸附带正电荷的目标化合物的阳离子交换剂和用带正电荷的色谱基体来吸附带负电荷的目标化合物的阴离子交换剂。术语“强”离子交换剂用来指在宽阔pH范围内荷电的离子交换剂,而“弱”离子交换剂是在一定pH值下可荷电的。常用的强阳离子交换剂包含称为S基的磺酸酯配体。在有些情况下,这类阳离子交换剂是根据官能团及其与载体的连接物所形成的基团命名;如SP阳离子交换剂,在其中S基通过丙基连接在载体上。
已偶联了配体的载体的性能也会影响色谱基体的分离性能。取决于拟用的色谱技术方式,可优选基本亲水或疏水的载体。对载体的进一步考虑是其官能化的容易程度。取决于适用于偶联配体的化学,载体可以被活化,即转变为反应性更高的形式。这类活化法是本领域周知的,如烯丙基化诸如葡聚糖或琼脂糖之类的亲水载体的羟基。共价配体连接一般利用固态支持基体上的反应性官能团,如羟基、羧基、硫醇、氨基等来实现。为了提高基体的结合能力,常在配体与载体之间提供简称为连接物的连接臂。这类连接物将使配体与载体之间物理地隔开,从而允许目标化合物与配体相互作用受基体的干扰最小。但是,在色谱基体合成中用连接物要求使用下述的功能试剂:其含至少一个能与基体表面官能团反应而形成共价键的的官能团;和至少一个能与配体上的官能团反应而形成共价键的官能团。
US 5,789,578(Massey University)涉及制备包含具有能结合其上已通过包括硫化物、亚砜或砜官能团的连接基团共价连接的目标化合物的配体的支撑基体的色谱基体的方法。用亚硫酸氢盐作为提供S基的试剂。更具体地,US 5,789,578用烯丙基缩水甘油醚、烯丙基卤或炔丙基卤和传统方法,在有碱存在下生成其上悬挂有烯类不饱和实体的载体。具体地,卤化物或缩水甘油基与基体羟基在碱性pH下反应。在这些条件下,估计烯丙基团与基体或反应溶液中所用的水只有有限的反应性。然后在自由基条件下烯类不饱和基与含硫醇配体反应,以使它们共价连接。
但是,如上述US 5,789,578中所公开,引进烯丙基和S基的随后偶联将在载体上留下一部分烯丙基未反应,而另一部分将引进连位磺酸酯-亚磺酸酯基团。此外,活化试剂也将不可避免地产生不希望发生的交联反应的危险。显然工艺中,如药品制造工艺中,加进的任何步骤,都将使该工艺成本更高,因此在化学加工中的一般目标是要使任何工艺尽可能简便。
因此,在该领域内目前显然需要以更快和更稳键的途径使多糖载体官能化的改进方法,优选避免一个或多个上述缺点。
发明概述
在一个发明点中,本发明提供一种制造包含阳离子交换基团的色谱基体的新方法。
在另一个发明点中,本发明涉及一种制造包含与多糖载体偶联的S基团的色谱基体的方法,该方法有利于生成比先有技术方法更均匀的阳离子交换剂。
在再一个发明点中,本发明涉及一种能以比先有技术基体更强的能力结合一种或多种免疫球蛋白的色谱基体。
从随后的详述及权利要求书,本发明的其它细节和优点将变得显而易见。
定义
术语“目标化合物”,在本文中是指希望从水溶液中分离出来的任何化合物、分子或其它实体。目标化合物可以是所期望的产物或液态产物中不希望存在的污染物。
术语“多糖”,如本文所用,包括天然多糖、合成多糖、多糖衍生物、改性多糖以及它们的任何混合物。
术语“配体”,在本文中,按其在色谱技术中的传统意义用来指包含能与目标化合物发生相互作用的官能团的实体。配体基团的实例是带正电荷或可带正电荷的基团(阴离子交换配体);带负电荷或可带负电荷的基团(阳离子交换配体);疏水基团;对目标化合物具有特定生物亲合性,如抗原对抗体的亲合性,的基团(亲合配体)等。
术语“增充剂”,在本文中,是指已被束缚在载体表面且因此而起扩展配体与载体之间距离的作用的聚合物。这种增充剂的一个主要作用是通过下列机理提高目标分子的结合能力和质量输运:增加有效表面积;提供柔性聚合物链以加快表面扩散和类似过程。增充剂也叫做,例如,“柔性臂”、“触手”和有时称作“绒毛”。正如技术人员将理解,前述连接物也提供一定程度的扩展,但连接物包含的原子数一般少于较长的聚合物增充剂。
发明详述
因此,本发明涉及一种制造磺酸酯-官能化载体的改进方法。更具体地,在第一个发明点中,本发明涉及一种制造色谱基体的方法,包括:提供包含有效羟基(OH基)的多糖载体;和使所述羟基与磺酸乙烯基酯反应,以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)阳离子交换剂。在本文内容中,应理解,术语“有效”是指对反应有效。在一个实施方案中,反应中所用的羟基是原来存在于多糖中的羟基。
因此本发明有利地避免了对烯丙基化多糖预活化步骤的需要。因此,本发明提供了更快和从而成本更低的方法,在其中发生上述副反应的危险被大大减小了。因此,本方法导致相当均匀的产物。
应理解,在本文内容中,术语“磺酸乙烯基酯”,如本文所用,包括如通式(I)所定义的未取代磺酸乙烯基酯
CH2=CH-SO3 (I)
和以下通式(II)所定义的磺酸取代乙烯基酯
CHR1=CR2-SO3 (II)
其中,R1和R2中至少之一可以是不会与色谱基体发生任何不希望相互作用的任何合适取代基。
因此,在本方法的一个实施方案中,羟基与以上通式(I)所定义的未取代磺酸乙烯基酯反应。在另一个实施方案中,羟基与以上通式(II)所定义的磺酸α-取代或β-取代乙烯基酯反应。
适用的磺酸乙烯基酯可购自商品,如Clariant GmbH。如本领域技术人员所理解,反应将是迈克尔加成,在其中,亲核羟基将进攻磺酸乙烯基酯中的β碳原子。因此,在一个实施方案中,由本方法所获得的S-官能化阳离子交换剂可以示意地描述为
载体-连接物-O-CH2-CH2-S
如众所周知,在迈克尔加成中,常用氢氧离子或烷氧化物离子作为催化剂。反应时间最长可达10h,例如4~6h,以及温度可以是20~80℃之间的任何温度。在本方法中,反应优选在含水溶剂,如水,中进行。因此,在一个实施方案中,本发明超过先有技术方法的另一项优点是,它避免了需要使用挥发性和毒性化学物品。
在一个有利实施方案中,载体包含交联多糖。在特定实施方案中,多糖载体已用提高其刚性和因此改善其流量-压力性能的方法制成,刚性多糖有时也叫做“高流量”多糖,例如,高流量琼脂糖。因此,本发明的第一个发明点也包括一种提供如上所述的磺基烷基官能化色谱基体的方法,在其中,载体从由提高其刚度的方法制备的任何可凝胶化的多糖制成,该方法将在下面更详细地讨论。
因此,在本方法中,交联载体可通过如下方法提供:
(a)提供多糖水溶液并取代所述多糖的部分羟基;
(b)凝胶化多糖溶液,以生成载体;和
(c)通过使多糖的羟基反应而交联获自(b)的多糖凝胶。
在第一个实施方案中,多糖刚性的提高是通过用不易受亲核进攻的任何合适基团,也称为“非-反应性基团”,进行取代而实现的。通过用非反应性基团取代,多糖的稳定性将得到提高,而且更易控制随后的交联步骤。在一个实施方案中,非-反应性基团选自醚、酯、酰胺和黄原酸酯。
在另一个实施方案中,多糖刚性的提高是通过用在本文内容中属“反应性”的基团,如亲电基或容易转化为亲电性的基团,如都很易与羟基反应的烯丙基、环氧化物、卤代醇、α,β-不饱和羰基取代而实现的。
因此,在另一个实施方案中,取代可进行如下:在多糖溶液中加入含一个活性部位和一个非活性部位的双官能交联剂并使多糖的羟基与交联剂的活性部位反应;在步骤(b)的凝胶化后,活化交联剂的非活性部位;然后使活化部位与多糖凝胶的羟基反应以交联该凝胶。
因此,在该实施方案中,制造色谱基体的方法包括:
a)在多糖溶液中加入含一个活性部位和一个非活性部位的双官能交联剂并允许多糖的羟基与交联剂上的活性部位反应;
b)通过使多糖溶液凝胶化,例如通过冷却,形成载体;
c)活化交联剂上的非活性部位;
d)使由此获得的活化部位与多糖凝胶上的羟基反应,以交联该凝胶;
e)使剩下的羟基与磺酸乙烯基酯反应,以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)阳离子交换剂。
在本方法中所用的双官能交联剂将包含一个活性部位和一个非活性部位。在本文内容中,术语“活性部位”是指能与多糖上的羟基反应的所有基团。这类基团的实例是卤化物、环氧化物和羟甲基。术语“非活性部位”是指在与反应性部位相同的反应条件下不是反应性的但随后能被活化到与多糖的羟基反应的基团。因此,适用的交联剂选自烯丙基缩水甘油基醚和烯丙基卤,如烯丙基溴;N-羟甲基丙烯酰胺;乙烯基苄基氯;和肉桂酰氯。在一个实施方案中,双官能交联剂选自烯丙基缩水甘油基醚、烯丙基溴和表氯醇。由此交联的凝胶还可以用目前技术状况所已知的传统方法进一步交联。关于上述方法中步骤(a)~(d)的更详细的内容,可以如US 6,602,990(Berg)所提供,该文献引于此供参考。
为了在色谱技术中获得尽可能高的结合能力,本方法中所用载体应具有尽可能大的与目标化合物结合的有效面积。因此,在一个实施方案中,载体是多孔的。在本文中,应理解,对反应有效的基团常存在于载体的外表面和具有足够尺寸的孔的表面上。
提高色谱载体表面积的另一条或又一条途径是在载体与配体之间提供一种或多种增充剂。亲水增充剂可包含选自下列的官能团:羟基、羧基、氨基、重复的氧化乙烯(-CH2-CH2-O-)和酰胺基。在一个实施方案中,增充剂包含亲水聚合物,如多糖。多糖增充剂的典型实例是淀粉;纤维素,如纤维素醚,例如,羟乙基纤维素;葡聚糖,如MesenteroidB-512;和琼脂糖。
多羟基官能聚合物,如多糖,因其亲水性和供束缚和连接配体的丰富反应性羟基而成为优选增充剂。在一个实施方案中,增充剂是选自下列的多糖:纤维素醚、葡聚糖;淀粉和淀粉衍生物;半纤维素;果胶;植物种籽胶(例如,剌槐豆胶或瓜胶);植物渗出胶(如阿拉伯树胶);短醒霉多糖;硬葡聚糖;和黄原胶。
因此,在一个实施方案中,本方法中所用的载体已接枝了葡聚糖以形成增充剂,在这种情况下,对反应有效的羟基将至少部分源自葡聚糖。因此,在一个实施方案中,本方法包括在与磺酸乙烯基酯反应之前提供含增充剂的多糖凝胶这一步。葡聚糖作为商品很易得到,例如,获自GE Healthcare(Uppsala,Sweden),而且可按熟知方法偶联到多糖载体上。葡聚糖最适用的分子量将取决于其它条件,如载体的孔尺寸,且可以在10~500kDalton(kDa),如20~70kD范围内。在一个有利实施方案中,葡聚糖已衍生自肠系膜样明串株菌,且分子量为约40kD。在一个实施方案中,葡聚糖是中等支化的,意味着约5%葡萄糖残基是支化点。
在另一个实施方案中,增充剂包含合成聚合物。这类合成聚合物可选自聚乙烯醇;聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺;FicollTM(蔗糖-表氯醇分子);聚乙烯基醚,如羟基官能聚乙烯基醚;聚合甘油;羟基官能聚丙烯酰胺;羟基官能聚甲基丙烯酸酯;聚缩水甘油;和乙氧基化多元醇。
如技术人员所理解,优化增充剂的长度(尺寸)将取决于数个因素,如与载体的连接点数目、增充剂的性质、配体的结构和尺寸及其在每个增充剂分子上的数目。本增充剂的分子量可以在500D以上,优选1000D以上,最优选在5~500kD范围内。
在一个实施方案中,增充剂是包含配体能按熟知方法连接的反应性基团的聚合物。在另一个实施方案中,配体在被束缚到载体表面之前连接在增充剂上,本领域的技术人员很容易实现这一点。本领域的技术人员很容易把增充剂连接到载体上,见,例如,US 6,428,707(AmershamPharmacia Biotech AB),该文献引于此供参考。
如上所述,多糖载体包含对化学反应有效的羟基。因此,在提供载体时,多糖可以是能形成凝胶的任何多糖,如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、果胶、脱乙酰壳多糖、魔芋、角叉莱胶、胞外多糖、藻酸盐等。在一个实施方案中,多糖载体选自葡聚糖和琼脂糖。在一个有利实施方案中,多糖载体是琼脂糖。在特定实施方案中,载体由其上已偶联了葡聚糖增充剂的琼脂糖凝胶组成。在另一个特定实施方案中,载体由其上已偶联了葡聚糖增充剂的葡聚糖凝胶组成。
琼脂糖构成载体,载体的孔隙率将增加可用于配体偶联的表面积,这是色谱技术领域内周知的。因此选择色谱载体所基于的判据将与适用于清洁剂工业中所用的上述产物的那些不同,在清洁剂工业中,选择起荷电基团的载体作用的化学部分是为了增加对纺织材料的总吸引力。
多糖载体已能用本领域内熟知的任何传统方法制成。非官能化色谱载体有商品可购,如SepharoseTM(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)。多糖载体可以呈任何合适的形状,如颗粒,优选基本球状颗粒、整块、膜、过滤用多孔物质、碎片、毛细管或任何其它形式。
在本方法的一个实施方案中,载体由凝胶颗粒,如基本球状颗粒,组成。因此,在以上方法中,(b)包括制备颗粒,本领域的技术人员很容易用琼脂糖溶液在有机相中的悬浮凝胶化作用实现这一点。本领域的技术人员很容易用习用方法制备这类颗粒,见,例如,S Hjertén:BiochimBiophys Acta 79(2),393~398(1964)。在一个特定实施方案中,颗粒的平均直径小于约400μm,如小于约200μm。因此,颗粒直径的典型范围为10~100μm,如20~80μm,例如,30~50μm或50~70μm。
在另一个实施方案中,多孔载体包含膜。本领域的技术人员很容易制造多糖膜,见,例如,S.T.Johnston,W.M.Deen:J.Membr.Sci.153(1999)271~179。
在第二个发明点中,本发明涉及如上所述制成的色谱基体。本发明者已给出这样的基体以示在结合能力方面的意外性能。
在第四个发明点中,本发明涉及液相色谱柱,它包含由磺酸乙烯基酯与多糖的羟基反应而制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)多糖载体。在一个实施方案中,该柱包含如上所述制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)阳离子交换剂。
在一个特定实施方案中,本色谱柱包含如上所述制成的色谱基体。该柱可以由任何传统材料制造,如生物相容的塑料,例如,聚丙烯;钢,如不锈钢;或玻璃。色谱柱可具有适用于实验室规模或大规模纯化的尺寸。在一个特定实施方案中,按照本发明的色谱柱配有luer适配器、管接头和圆盖形螺母。色谱基体可填装在柱内或作为流化床提供。
在一个实施方案中,按照本发明的色谱柱属于称做有限使用色谱柱的那类,在本文中,这是指最宜使用有限次数,如1~10次的装填色谱柱。这类有限使用产品在商业上称为“一次性使用产品”。
在另一个发明点中,本发明涉及一种分离一种或多种目标化合物的方法,它包括让包含目标化合物的液体通过由磺酸乙烯基酯与琼脂糖的羟基反应而制成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)琼脂糖色谱基体以吸附目标化合物;然后通过使色谱基体与洗脱剂接触而回收所述目标化合物。因此,本方法是阳离子交换色谱法。在最优选的实施方案中,色谱基体如上所述。
阳离子交换色谱分析的原理是本领域技术人员所熟知的。优选色谱基体将在吸附和洗脱之间进行洗涤。正如本领域技术人员将认识到,传统的缓冲剂和条件将适用于该工艺。关于色谱法的综述,见,例如,Protein Purification-Principles,High Resolution Method and Applications(J.-C.Janson and L.Rydén,1989 VCH Publishers,Inc.)
上述方法可用于分离,如分离或纯化目标化合物,如生物分子,如蛋白质,例如,单克隆或多克隆抗体;肽,如二肽或低聚肽,肽核酸;病毒;细胞,如细菌细胞;蛋白质感染病毒等。在一个有利实施方案中,目标化合物是蛋白质以及本方法提供基本纯蛋白质。在最有利的实施方案中,目标化合物是免疫球蛋白,如IgG。
或者,该方法也可用来分离阳离子有机分子,如侯选药物。在另一个实施方案中,本方法用来鉴定任何一种上述目标化合物,例如,为诊断目的。在又再一个实施方案中,本方法用于纯化食品和饮料工业产品,如源自乳清、糖和增甜剂溶液、含氨基酸的溶液的各种蛋白质。因此,本方法的产物可以是药物或药物目标,如抗体-基药物或诊断剂;用于治疗的媒介物,如用于基因治疗的质粒或病毒;食品添加剂,如功能化食品;诊断剂等。按照本发明纯化的分子的特定应用是作为供个体化用药的药品。
实验部分
下列实施例仅为说明目的而提供,且无意限制如所附权利要求所定义的本发明。
实施例1:S基与流量/压力性能已提高的琼脂糖的偶联
实施例1a:按照本发明的磺酸乙烯基酯偶联
在本实施例中,起始材料是按US 6,602,990(Berg)所述制成的琼脂糖凝胶颗粒,即流量/压力性能已提高的琼脂糖。
用磺酸乙烯基酯的偶联法:把7ml排出的凝胶放在玻璃过滤器上并用15ml 30%乙烯基磺酸(VSA)(Fluka)水溶液洗涤3次。最后一次洗过后,把凝胶转移到反应器中,加进VSA溶液,到总体积为9ml。然后,加入7ml50%(18M)氢氧化钠储备溶液。搅拌该反应浆料并加热到50℃恒温6h,然后通过从反应溶液过滤出凝胶并用数份水洗涤凝胶而使反应停止。
实施例1b(对比):传统的亚硫酸氧钠偶联
起始材料是如以上实施例1a中定义的琼脂糖凝胶颗粒。
烯丙基化:混合100ml琼脂糖颗粒与12ml50%NaOH水溶液和0.5g NaBH4。在50℃搅拌该混合物1h。加入烯丙基缩水甘油醚(60ml)并在剧烈搅拌下保持该悬浮液在50℃又18h。在连续加入5M AcOH而中和到pH值为7之后,过滤该混合物并依次用0.5L乙醇、1L蒸馏水、200ml 0.2M乙酸和500ml蒸馏水洗涤凝胶。烯丙基含量为0.14mmol/mL。
用亚硫酸氢钠进行SP偶联:在总体积为130mL的上述烯丙基化琼脂糖颗粒在水中的搅拌浆料内,加入28g亚硫酸氢钠并用NaOH控制pH值。在室温下,以连续空气鼓泡通过浆料的方法搅拌该反应混合物18h,然后用蒸馏水洗涤。离子能力(ion capacity)为0.11mmol/mL。
结果
实施例1的结果示于下表1。
实施例2:S基通过增充剂与流量/压力性能已提高的琼脂糖的偶联
实施例2a:按照本发明的磺酸乙烯基酯偶联
起始材料是如以上实施例1a中定义的琼脂糖凝胶颗粒。
环氧基-活化步骤:排出55g琼脂糖凝胶并在温控反应器内与15mL蒸馏水一起搅拌。加入8.5mL50%NaOH和20mg NaBH4,并在搅拌5min后,加入14mL表氯醇。在30℃搅拌该反应浆料2h,然后在玻璃过滤漏斗内用蒸馏水多次洗涤。
葡聚糖偶联步骤:把21g Dextran T40(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)溶于25mL蒸馏水中。加入50g排出的琼脂糖凝胶颗粒,其如实施例1a所述制成并已如上所述经过环氧基-活化,并在30℃搅拌1h。加入2.5mL50%NaOH并在30℃下搅拌该浆料18h,然后在玻璃过滤漏斗内用蒸馏水多次洗涤。
用磺酸乙烯基酯的偶联步骤:如上实施例1a所述使用磺酸乙烯基酯把S基偶联到按照本发明的高交联琼脂糖增充剂上。
实施例2b(对比):传统的亚硫酸氢钠偶联
在该实施例中,对以上实施例1a中所定义的琼脂糖凝胶颗粒进行环氧基-活化并如以上实施例2a所述供给葡聚糖增充剂。
用亚硫酸氢钠的SP偶联:反应如以上实施例1b所述进行。
结果
实施例2的结果示于下表1。
实施例3:葡聚糖增充剂的作用
实施例3a:S基通过增充剂与琼脂糖偶联
商品交联琼脂糖颗粒(SepharoseTM)获自Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden。
环氧基-活化、葡聚糖增充剂的偶联和用磺酸乙烯基酯的S基偶联如以上实施例2a所述进行。
实施例3b:无增充剂时S基与琼脂糖的偶联
起始材料是以上实施例3a中所述的商品琼脂糖。
用磺酸乙烯基酯的S基偶联如以上实施例1a所述进行。
结果
实施例3的结果示于下表2。
实施例4:离子能力和蛋白质结合
按下述方法试验获自以上实施例1~3的产物。结果示于表1(实施例1和2)和表2(实施例3)。
葡聚糖含量测定
对实施例2a、2b和3a中的产物试验葡聚糖含量如下。取出1.0mL葡聚糖改性的凝胶并在配置有加热设备的分析天平上于120℃干燥。用相应的环氧基-活化凝胶作为参比物并用与葡聚糖改性凝胶相同的方法分析。把参比凝胶与葡聚糖偶联凝胶之间的重量差看成是偶联葡聚糖的含量,以mg/mL凝胶为单位表示。
离子能力测定
用滴定法测定氯化物离子交换能力。用0.5M HCl处理凝胶的浆料3min,然后用1mM HCl彻底洗涤。取出1.0mL凝胶样品。把该样品转移至滴定容器并加入5mL水。然后用0.1M NaOH滴定该样品到pH值为7.0。
蛋白质能力测定
穿透能力(breakthrough capacity)在安装到(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)10/100上的HR5/5柱子内测定,溶菌酶的流率为1mL/min,而多克隆免疫球蛋白(IgG)的流率为0.5mL/min,在50mM pH值为4.75的乙酸酯中。测定穿透能力的蛋白质溶液的浓度约为4.0mg/ml。动态蛋白质结合能力以穿透曲线测定,能力是10%最大UV280吸收处的读数。
穿透能力法进行如下:
把吸附缓冲剂泵过色谱体系的旁路位置直至达到稳定基线。进行自动调零并把约10ml蛋白质溶液(经由上环路进入)泵过体系,以获得稳定的100%信号。该步骤的流率与分析期间的相同,即300cm/h(1ml/min)。在穿透能力法中,设定100%信号的20%处所示的吸收。在用吸附缓冲剂达到稳定基线后,再在旁路位置开始前沿分析。该方法始于以10ml吸附缓冲剂(约5个柱体积)通过位于体系内的柱子的柱平衡。然后进行自动调零并在柱内加入蛋白质溶液直至达到20%穿透。
结果
表1
色谱基体 | 葡聚糖含量(mg/mL) | 离子能力(μmol/mL) | 对IgG的能力(mg/mL) | 对溶菌酶的能力(mg/mL) |
实施例1a实施例1b实施例2a实施例2b | 0 | 107 | 23139718 | 547114771 |
01616 | 121120109 |
表2
色谱基体 | 葡聚糖含量(mg/mL) | 离子能力(μmol/mL) | 对IgG的能力(mg/mL) | 对溶菌酶的能力(mg/mL) |
实施例3a实施例3b | 160 | 11397 | 14368 | 131103 |
Claims (21)
1.一种制造色谱基体的方法,包括提供至少一种包含有效羟基的多糖载体;和使所述羟基与磺酸乙烯基酯反应,以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)阳离子交换剂。
2.按照权利要求1的方法,其中所述多糖是交联的。
3.按照权利要求2的方法,其中载体由下列步骤提供:
(a)提供多糖水溶液并取代所述多糖的部分羟基;
(b)凝胶化多糖溶液,以提供载体;和
(c)通过使多糖的羟基反应而交联获自(b)的多糖凝胶。
4.按照权利要求3的方法,其中如(a)中定义的所述取代羟基的方法如下:在多糖溶液中加入至少一种有一个活性部位和一个非活性部位的双官能交联剂,并使这种活性部位与多糖的部分羟基反应;其中,所述加入的交联剂的非活性部位在如(b)中定义的凝胶化后被活化;以及其中,由此活化的部位与多糖凝胶的羟基反应而提供如(c)中定义的交联。
5.按照前述权利要求中任何一项的方法,其中多糖选自琼脂糖和葡聚糖。
6.按照权利要求5的方法,其中多糖是琼脂糖。
7.按照前述权利要求中任何一项的方法,其中与磺酸乙烯基酯反应以生成S-官能化阳离子交换剂的羟基已通过增充剂偶联到载体表面。
8.按照权利要求7的方法,其中增充剂包含至少一种多羟官能聚合物,如葡聚糖。
9.按照前述权利要求中任何一项的方法,其中载体是多孔的。
10.按照权利要求1~9中任何一项的方法,其中载体由基本球状的凝胶颗粒构成。
11.按照权利要求1~9中任何一项的方法,其中载体是膜。
12.由用权利要求1~10中任何一项的方法制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)琼脂糖颗粒构成的色谱基体。
13.一种液相色谱柱,其包含的基体由通过磺酸乙烯基酯与琼脂糖的羟基反应而成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)琼脂糖颗粒组成。
14.一种液相色谱柱,其包含的基体包含由磺酸乙烯基酯与偶联在琼脂糖上的增充剂,如一种或多种多羟基官能聚合物,所提供的羟基反应而成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)琼脂糖颗粒。
15.按照权利要求13或14的色谱柱,它包含如权利要求1~10中任何一项所定义的方法制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)阳离子交换剂。
16.一种分离一种或多种目标化合物的方法,包括使包含目标化合物的液体通过由磺酸乙烯基酯与琼脂糖的羟基反应而成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)琼脂糖色谱基体,以吸附目标化合物;然后通过使色谱基体与洗脱液接触而回收所述的目标化合物。
17.一种分离一种或多种目标化合物的方法,包括使包含目标化合物的液体通过由磺酸乙烯基酯与偶联在琼脂糖上的增充剂所提供的羟基反应而制成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)琼脂糖色谱基体,以吸附目标化合物;然后通过使色谱基体与洗脱液接触而回收所述的目标化合物。
18.按照权利要求16或17的方法,其中色谱基体由基本球状的凝胶颗粒构成。
19.按照权利要求15~18中任何一项的方法,其中至少一种目标化合物是蛋白质。
20.按照权利要求19的方法,其中至少一种目标化合物是免疫球蛋白,优选IgG。
21.如权利要求1~11中任何一项所定义的方法制成的色谱基体在液相色谱技术中的应用。
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