JP2009506340A - クロマトグラフィーマトリックスの製造 - Google Patents

Abstract

本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、利用可能なヒドロキシル基を含む多糖担体を用意する段階、及び前記ヒドロキシル基をスルホン酸ビニルと反応させてスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）陽イオン交換体を得る段階を含んでなる方法に関する。担体のヒドロキシル基は、アガロースポリマーのヒドロキシル基であるか、或いは別法としてポリヒドロキシ官能基ポリマーのようなエキステンダー上に提供されるものであり得る。一実施形態では、担体は流れ圧力特性の向上したアガロースからなる。
【選択図】 なし

Description

本発明はクロマトグラフィーマトリックスの製造に関し、さらに具体的には陽イオン交換体の有利な製造方法に関する。本発明はまた、前記マトリックスを含むクロマトグラフィーカラム及び精製プロセスにおけるそれの使用も包含する。

ある化合物を分離すること（例えば、液体又は他の固体物質から夾雑物又は所望分子を分離すること）が要求される例は数多く存在する。いくつかの分野では、帯電した化合物又は帯電可能な化合物を捕獲して分離するために電荷間相互作用が使用される。

洗剤業界では、布地から汚れや塵埃のような化合物を分離するための方法及び洗剤が利用可能である。よく見られる例は洗濯クリーニング業界であり、そこでは洗濯物から汚れを分離するための粉石鹸中に帯電コンディショナー及び洗剤が通常混入されている。かかる帯電コンディショナー（ベネフィット剤としても知られる）は、汚れとコンディショナーとの間の引力の利用により、布地の繊維から汚れを直接に遊離させるため、或いは繊維を改質してクリーニングプロセスを容易にするために使用される。その効力を向上させるため、コンディショナーを別の化学成分上に置換することで除去すべき化合物に対する親和性を高めた形態でコンディショナーを提供することが提唱されている。

国際公開第０３／０４０２７９号は洗濯用途のためのポリマーに関し、さらに具体的には布地の洗濯中に汚れの遊離を促進するために置換多糖構造体を使用することに関する。好適な多糖は、４０を超える重合度、好ましくは５０〜１０００００の範囲内の重合度を有する多糖を包含する。開示された多糖構造体は、エステル結合又はエーテル結合を介して多糖に結合されたアルキル基（例えば、ヒドロキノンアルキル、カルボキシアルキル又はスルホアルキル或いはその塩）で置換されている。平均置換度（即ち、繰返し糖単位上における官能基の平均置換数）は、好ましくは０．１〜３、さらに好ましくは０．１〜１である。国際公開第０３／０４０２７９号に従えば、α−又はβ−結合主鎖（好ましくはβ−１，４−結合主鎖）を有する多糖が使用できる。セルロース系材料は綿繊維に付着することが当技術分野で認められているので、好ましい多糖はセルロースである。

化学及び生物工学分野では、通常、薬物又は薬物候補品のような標的化合物を製造プロセスに由来する汚染化学種から分離する必要がある。例えば、組換え宿主細胞の発現で生産されるタンパク質薬物又は薬物候補品は、例えば宿主細胞及び（場合によっては）細胞破片、他の宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ並びに発酵培地からの残留物（例えば、塩類）から分離する必要がある。現在使用されている生物工学精製方式の多くでは、その融通性及び標的化合物に対する感度の点から、クロマトグラフィーが少なくとも１つの工程として含まれている。クロマトグラフィーという用語は、いずれも２つの互いに混和しない相を接触させるという原理に基づく１群の密接に関連する分離方法を包括する。さらに詳しくは、標的化合物は移動相中に導入され、この移動相を固定相に接触させる。移動相によって系中を運ばれる間に、標的化合物は固定相と移動相との間で一連の相互作用を受ける。かかる相互作用では、試料の成分の物理的又は化学的性質の差が利用される。

クロマトグラフィーにおける固定相は、標的化合物と相互作用し得る官能基であるリガンドを結合した固体担体からなっている。その結果、リガンドは担体に対して対象分子の分離、同定及び／又は精製を行う能力を付与する。液体クロマトグラフィー方法は、通常、化合物を分離するための相互作用原理に応じて名づけられている。例えば、イオン交換クロマトグラフィーは電荷間相互作用に基づいており、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は疎水的相互作用を利用するものであり、アフィニティクロマトグラフィーは特定の生物学的親和性に基づいている。

公知の通り、イオン交換は帯電した標的化合物と反対に帯電したクロマトグラフィーマトリックスとの間の可逆的相互作用に基づいている。溶離は最も普通には塩濃度を高めることで実施されるが、ｐＨを変化させることも等しく可能である。イオン交換体は、負に帯電したクロマトグラフィーマトリックスを用いて正に帯電した標的化合物を吸着させる陽イオン交換体と、正に帯電したクロマトグラフィーマトリックスを用いて負に帯電した標的化合物を吸着させる陰イオン交換体とに分類される。広いｐＨ区間にわたって帯電するイオン交換体に対しては「強」イオン交換体という用語が使用される一方、「弱」イオン交換体は特定のｐＨ値で帯電可能である。常用される強陽イオン交換体の１種は、Ｓ基として知られるスルホン酸リガンドを含んでいる。場合によっては、かかる陽イオン交換体は、官能基及び担体に対するそれのリンカーによって形成される基に従って名づけられる。例えば、Ｓ基がプロピルによって担体に結合されているものをＳＰ陽イオン交換体という。

リガンドを結合した担体の性質は、クロマトグラフィーマトリックスの分離特性にも影響を及ぼす。クロマトグラフィーの所定モードに応じ、実質的に親水性又は疎水性の担体が好ましいことがある。担体に関するその他の考慮事項は、官能化の容易性である。結合リガンドに関して使用される化学作用に応じ、担体を活性化すること（即ち、反応性の高い形態に変換すること）ができる。かかる活性化方法は当技術分野で公知であり、例えば、デキストラン又はアガロースのような親水性担体のヒドロキシル基のアリル化である。共有リガンド結合は、通例、固体支持マトリックス上の反応性官能基（例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、アミノ基など）の使用によって達成される。マトリックスの結合容量を向上させるため、（簡単にリンカーとして知られる）結合アームをリガンドと担体との間に設けることが多い。かかるリンカーはリガンドを担体から物理的に引き離し、それによって担体からの干渉を最小限に抑えながら標的化合物をリガンドと相互作用させる。しかし、クロマトグラフィーマトリックスの合成に際してリンカーを使用することは、マトリックスの表面上の官能基と反応してそれとの共有結合を形成し得る１以上の官能基、及びリガンド上の官能基と反応してそれとの共有結合を形成し得る１以上の官能基を有する官能性試薬の使用を必要とする。

米国特許第５７８９５７８号（Ｍａｓｓｅｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、スルフィド、スルホキシド又はスルホン官能基からなる結合基を介して支持マトリックスに共有結合された、標的化合物を結合し得るリガンドを有する支持マトリックスからなるクロマトグラフィーマトリックスの製造方法に関する。Ｓ基を得るための試薬として重亜硫酸塩が使用される。さらに詳しくは、エチレン性不飽和実在物が付属した担体を得るため、米国特許第５７８９５７８号はアリルグリシジルエーテル、ハロゲン化アリル又はハロゲン化プロパルギル及び塩基の存在下における通常の方法を使用する。具体的には、ハロゲン化物又はグリシジル基がアルカリ性ｐＨでマトリックスのヒドロキシル基と反応する。これらの条件下では、アリル基はマトリックス又は反応溶液中に使用される水に対して限られた反応性を有すると予想される。次いで、エチレン性不飽和基を遊離基条件下でチオール含有リガンドと反応させることでそれの共有結合が達成される。

しかし、上述の米国特許第５７８９５７８号に開示されるようなアリル基の導入及びそれに続くＳ基の結合では、アリル基の一部分が未反応のままで担体上に残留する一方、別の部分は隣接するスルホン酸−スルフィン酸基の導入を招きやすい。加えて、活性化試薬は望まない架橋反応を生じるリスクも伴う。自明のことながら、例えば薬物製造プロセスに追加されるいかなる工程もプロセスのコストを高めるであろう。したがって、いかなるプロセスもできるだけ簡潔にすることは化学処理における一般的目標である。

かくして、当技術分野では、好ましくは上述の欠点の１以上を回避しながら、一層迅速かつ強力に多糖担体の官能化を可能にする改良方法に対する明らかなニーズが存在している。
国際公開第０３／０４０２７９号パンフレット 米国特許第５７８９５７８号明細書 欧州特許第１４６４３９１号明細書 米国特許第５９９８６０６号明細書 米国特許第６８８４３４５号明細書 米国特許出願公開第２００４／００５０７８４号明細書 米国特許第５４５１６６２号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１５０８０５号明細書

一態様では、本発明は陽イオン交換基を含むクロマトグラフィーマトリックスの新規製造方法を提供する。

別の態様では、本発明は、多糖担体に結合されたＳ基を含むクロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、従来の方法より均質な陽イオン交換体を有利に与える方法に関する。

さらに別の態様では、本発明は、従来のマトリックスに比べて増加した容量で１種以上の免疫グロブリンを結合できるクロマトグラフィーマトリックスに関する。

本発明のさらなる細部及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになろう。

定義
本明細書中で「標的化合物」という用語は、水溶液から単離することが望まれる任意の化合物、分子又は他の実在物を意味する。標的化合物は、所望の生成物又は液体生成物の不要夾雑物であり得る。

「多糖」という用語は、本明細書中で使用する場合、天然多糖、合成多糖、多糖誘導体、変性多糖及びこれらの任意の混合物を包含する。

本明細書中で「リガンド」という用語は、標的化合物と相互作用し得る官能基を含む実在物に関するクロマトグラフィーでの通常の意味で使用される。リガンドを構成する基の例には、正に帯電した基又は帯電可能な基（陰イオン交換リガンド）、負に帯電した基又は帯電可能な基（陽イオン交換リガンド）、疎水基、標的化合物に対する特定の生物学的親和性（例えば、抗体に対する抗原の親和性）を有する基（アフィニティリガンド）などがある。

本明細書中で「エキステンダー」という用語は、担体の表面にテザリングされており、したがってリガンドと担体との距離を延長するための機能を果たすポリマーを意味する。かかる「エキステンダー」の主たる機能の１つは、利用可能な表面積を増大させること並びに迅速な表面拡散及び類似の過程のために柔軟なポリマー鎖を提供することにより、表面分子の結合容量及び物質輸送を増加させることである。エキステンダーはまた、例えば、「自在アーム」、「触糸」及び時には「毛羽」としても知られる。当業者には理解される通り、上述したようなリンカーもある程度の延長をもたらすが、通常、リンカーは長いポリマーエキステンダーに比べて少数の原子からなっている。

発明の詳細な説明
このように本発明は、スルホン酸官能化担体の改良された製造方法に関する。さらに詳しくは、第１の態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、利用可能なヒドロキシル基（ＯＨ基）を含む多糖担体を用意する段階、及び前記ヒドロキシル基をスルホン酸ビニルと反応させてスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）陽イオン交換体を得る段階を含んでなる方法に関する。この文脈では、「利用可能な」という用語が反応のために利用可能であることを意味するはもちろんである。一実施形態では、かかる反応で使用されるヒドロキシル基は多糖中に元来存在するヒドロキシル基である。

かくして、本発明は多糖をアリル化する予備活性化段階の必要性を有利に回避する。その結果、本発明によれば、上述したような副反応のリスクが実質的に低減した迅速な、したがって低コストの方法が提供される。かくして、本方法は実質的に均質な生成物を与える。

この文脈では、本明細書中で使用する「スルホン酸ビニル」という用語が、下記の式（Ｉ）で定義されるような非置換スルホン酸ビニル、及び下記の式（II）で定義されるような置換スルホン酸ビニルの両方を包含することはもちろんである。

ＣＨ_２＝ＣＨ−ＳＯ_３ （Ｉ）
ＣＨＲ_１＝ＣＲ_２−ＳＯ_３ （II）
式中、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも一方は、クロマトグラフィーマトリックスに対していかなる望ましくない相互作用も及ぼさない任意適宜の置換基であり得る。

かくして、本方法の一実施形態では、ヒドロキシル基を上記式（Ｉ）で定義されるような非置換スルホン酸ビニルと反応させる。別の実施形態では、ヒドロキシル基を上記式（II）で定義されるようなα−置換又はβ−置換スルホン酸ビニルと反応させる。

好適なスルホン酸ビニルは、Ｃｌａｒｉａｎｔ ＧｍｂＨのような商業的供給源から入手できる。当業者には理解される通り、かかる反応は、求核性のヒドロキシル基がスルホン酸ビニルのβ−炭素を攻撃するマイケル付加である。したがって、一実施形態では、本方法で得られるＳ官能化陽イオン交換体は、担体−リンカー−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓと略述することができる。

公知の通り、マイケル付加では、水酸化物イオン又はアルコキシドイオンが触媒として常用される。反応時間は１０時間以下（例えば、４〜６時間の範囲内）であり得ると共に、温度は２０〜８０℃の範囲内であり得る。本方法では、反応は水のような水性溶媒中で有利に実施される。かくして、一実施形態では、従来の方法に比べて本方法のさらなる利点は、揮発性で有毒な化学薬品を使用する必要性が回避されることである。

有利な実施形態では、担体は架橋多糖からなる。特定の実施形態では、多糖担体は、その剛性を向上させ、したがってその流れ圧力特性を向上させる方法で製造されている。かかる剛性多糖は、時には「ハイフロー」多糖（例えば、ハイフローアガロース）といわれる。かくして、本発明の第１の態様は、上述のようなスルホアルキル官能化クロマトグラフィーマトリックスを与える方法であって、担体がその剛性を向上させる方法で製造された任意のゲル化可能多糖からなるような方法も包含する。かかる方法は下記に一層詳しく記載される。

かくして、本方法では、架橋担体は、
（ａ）水性多糖溶液を用意して前記多糖のヒドロキシル基の一部を置換し、
（ｂ）多糖溶液をゲル化して担体を得、
（ｃ）多糖のヒドロキシル基を反応させることにより、（ｂ）で得られた多糖ゲルを架橋させる
ことで製造できる。

第１の実施形態では、多糖の剛性の向上は、求核攻撃を受けない任意適宜の基（「非反応基」としても知られる）による置換で達成される。非反応基で置換すれば、多糖の安定性が向上し、以後の架橋段階を制御するのが容易になる。一実施形態では、非反応基はエーテル、エステル、アミド及びキサンテートからなる群から選択される。

別の実施形態では、多糖の剛性の向上は、本発明に関連して「反応性」である基による置換で達成される。かかる基は、例えば、求電子基又は求電子基に容易に転化される基（例えば、アリル基、エポキシド、ハロヒドリン及びα，β−不飽和カルボニル）であって、これらはいずれもヒドロキシル基と容易に反応する。

かくして、別の実施形態では、上記の置換は、１つの活性部位及び１つの不活性部位を有する二官能性架橋剤を多糖溶液に添加し、多糖のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させることで達成できる。次に、架橋剤の不活性部位が段階（ｂ）のゲル化後に活性化され、こうして活性化された部位が多糖ゲルのヒドロキシル基と反応することでゲルが架橋する。

その結果、この実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスの製造方法は、
ａ）１つの活性部位及び１つの不活性部位を有する二官能性架橋剤を多糖溶液に添加し、多糖のヒドロキシル基を架橋剤の活性部位と反応させる段階、
ｂ）例えば冷却により、多糖溶液をゲル化して担体を得る段階、
ｃ）架橋剤の不活性部位を活性化する段階、
ｄ）こうして得られた活性化部位を多糖ゲルのヒドロキシル基と反応させてゲルを架橋させる段階、並びに
ｅ）残りのヒドロキシル基をスルホン酸ビニルと反応させてスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）陽イオン交換体を得る段階
を含んでなる。

本方法で使用する二官能性架橋剤は、１つの活性部位及び１つの不活性部位を含んでいる。この文脈では、「活性部位」という用語は多糖のヒドロキシル基と反応し得るすべての基を意味する。かかる基の例は、ハロゲン化物、エポキシド及びメチロール基である。「不活性部位」という用語は、反応部位と同じ条件下では反応しないが、後に活性化されて多糖のヒドロキシル基と反応し得る基をいう。かくして、好適な架橋剤は、アリルグリシジルエーテル及びハロゲン化アリル（例えば、臭化アリル）、Ｎ−メチロールアクリルアミド、塩化ビニルベンジル並びに塩化シンナモイルからなる群から選択される。一実施形態では、二官能性架橋剤はアリルグリシジルエーテル、臭化アリル及びエピクロロヒドリンからなる群から選択される。こうして架橋させたゲルは、当業技術の現状で知られている通常の方法でさらに架橋させることができる。上記方法の段階（ａ）〜（ｄ）に関するさらに詳しい説明は、米国特許第６６０２９９０号（Ｂｅｒｇ）（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）中に見出すことができる。

クロマトグラフィーにおいてできるだけ高い結合容量を得るためには、本方法で使用する担体は、標的化合物を結合するために利用可能なできるだけ大きい表面積を有するべきである。その結果、一実施形態では、担体は多孔質である。これに関連して述べれば、反応のために利用できる基が通常は担体の外面上及び十分なサイズをもった細孔の表面上に存在することはもちろんである。

クロマトグラフィー用担体の表面積を増大させる別の方法又は追加の方法は、担体とリガンドとの間に１種以上のエキステンダーを設けることである。親水性エキステンダーは、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、反復エチレンオキシド（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）及びアミドからなる群から選択される官能基からなり得る。一実施形態では、エキステンダーは多糖のような親水性ポリマーからなる。例示的な多糖エキステンダーは、デンプン、セルロースエーテル（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）のようなセルロース、Ｍｅｓｅｔｅｒｏｉｄ Ｂ−５１２のようなデキストラン、及びアガロースである。

多糖のようなポリヒドロキシ官能性ポリマーは、親水性を有すると共に、テザリング及びリガンド結合の両方のために十分な反応性ヒドロキシル基を供給する点で好ましいエキステンダーである。一実施形態では、エキステンダーは、セルロースエーテル、デキストラン、デンプン及びデンプン誘導体、ヘミセルロース、ペクチン、植物種子ガム（例えば、ローカストビーンガム又はグアーガム）、植物滲出液ガム（例えば、アラビアゴム）、プルラン、スクレログルカン並びにキサンタンからなる群から選択される多糖である。

かくして、一実施形態では、本方法で使用する担体には、エキステンダーを設けるためにデキストランがグラフト化されている。この場合、反応のために利用できるヒドロキシル基は少なくとも部分的にはデキストランに由来している。かくして、一実施形態では、本方法はスルホン酸ビニルとの反応に先立って多糖ゲルにエキステンダーを設ける段階を含んでいる。デキストランは、例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から市販製品として容易に入手でき、公知方法に従って多糖担体に結合できる。デキストランの最も好適な分子量は、担体の細孔径のような他の条件に依存し、１０〜５００キロダルトン（ｋＤａ）（例えば、２０〜７０ｋＤａ）の範囲内にあればよい。有利な実施形態では、デキストランはリューコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｓｄｅｓ）から得られたものであり、約４０ｋＤの分子量を有する。一実施形態では、デキストランは中位の枝分れを示すが、これはグルコース残基の約５％が分岐点であることを意味する。

別の実施形態では、エキステンダーは合成ポリマーからなる。かかる合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）（スクロース−エピクロロヒドリン分子）、ポリビニルエーテル（例えば、ヒドロキシ官能性ポリビニルエーテル）、ポリグリセロール、ヒドロキシ官能性ポリアクリルアミド、ヒドロキシ官能性ポリメタクリレート、ポリグリシドール並びにエトキシル化ポリオールからなる群から選択できる。

当業者には理解される通り、任意のエキステンダーの長さ（サイズ）は、担体に対する結合点の数、エキステンダーの性質、リガンドの構造及びサイズ、並びにエキステンダー１分子当たりのリガンドの数のようないくつかの因子に依存する。本エキステンダーの分子量は、５００Ｄを超え、好ましくは１０００Ｄを超え、最も好ましくは５〜５００ｋＤの範囲内にあればよい。

一実施形態では、エキステンダーは、公知方法に従ってリガンドを結合できる反応基を
有するポリマーである。別の実施形態では、リガンドは担体表面へのテザリングに先立ってエキステンダーに結合されるが、これも当業者には容易に達成される。担体に対するエキステンダーの結合は当業者には容易に実施されるが、例えば、米国特許第６４２８７０７号（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）を参照されたい。

上述の通り、多糖担体は化学反応のために利用できるヒドロキシル基を含んでいる。したがって、担体を用意するに当たっては、多糖はゲルを形成し得る任意の多糖、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ペクチン、キトサン、コンニャク、カラゲナン、ゲラン、アルギン酸塩などであり得る。一実施形態では、多糖担体はデキストラン及びアガロースからなる群から選択される。有利な実施形態では、多糖担体はアガロースである。特定の実施形態では、担体はデキストランエキステンダーを結合したアガロースゲルからなる。別の特定の実施形態では、担体はデキストランエキステンダーを結合したデキストランゲルからなる。

アガロースが、その多孔性によってリガンド結合のために利用できる表面が増大した担体を構成することはクロマトグラフィーの分野で公知である。このように、クロマトグラフィー用担体の選択は、洗剤業界で使用される上述の製品に対して適用される基準とは異なる基準に基づいている。つまり、洗剤業界では帯電基の「担体」として役立つ化学成分が布地材料に対する総合引力を増大させるように選択されるのである。

多糖担体は、当技術分野で公知である任意の常用方法で製造されたものでよい。官能化されていないクロマトグラフィー用担体は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）のように商業的に入手できる。多糖担体は任意適宜の形状、例えば粒子（好ましくは本質的に球状の粒子）、モノリス、膜、フィルター、チップ、毛細管又はその他任意のフォーマットを有し得る。

本方法の一実施形態では、担体は本質的に球状の粒子のようなゲル粒子からなる。かくして、上記方法で（ｂ）は粒子を製造することからなる。これは、例えば有機相中におけるアガロース溶液の懸濁ゲル化により、当業者には容易に達成される。かかる粒子は通常使用される方法によって当業者には容易に製造されるが、例えば、Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４）を参照されたい。特定の実施形態では、粒子の平均直径は約４００μｍ未満、例えば約２００μｍ未満である。かくして、粒子直径の例示的な範囲は１０〜１００μｍ、例えば２０〜８０μｍ（例えば、３０〜５０μｍ又は５０〜７０μｍ）である。

別の実施形態では、多孔質担体は膜からなる。多糖膜は当業者には容易に製造されるが、例えば、Ｓ．Ｔ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｗ．Ｍ．Ｄｅｅｎ：Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．１５３（１９９９）２７１−１７９を参照されたい。

第２の態様では、本発明は上述のようにして製造されるクロマトグラフィーマトリックスに関する。かかるマトリックスは、本発明者らにより、結合容量に関して予想外の性質を示すことが証明された。

第４の態様では、本発明は、スルホン酸ビニルを多糖のヒドロキシル基と反応させることで製造されるスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）多糖担体を含んでなる液体クロマトグラフィー用カラムに関する。一実施形態では、カラムは上述のようにして製造されるスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）陽イオン交換体を含む。

特定の実施形態では、本カラムは上述のようにして製造されるクロマトグラフィーマトリックスを含む。カラムは、生物適合性プラスチック（例えば、ポリプロピレン）、鋼（例えば、ステンレス鋼）又はガラスのような任意の常用材料から作製できる。カラムは、実験室規模又は大規模精製のために適したサイズを有し得る。特定の実施形態では、本発明に係るカラムはルアーアダプター、チューブコネクター及びドーム形ナットを備えている。クロマトグラフィーマトリックスは、カラム内に充填するか、或いは流動層として提供することができる。

一実施形態では、本発明に係るクロマトグラフィーカラムは、「限定使用」クロマトグラフィーカラムとして知られる種類のものである。この文脈では、「限定使用」クロマトグラフィーカラムは、限定された回数（例えば、１〜１０回）の使用のために最も適した充填クロマトグラフィーカラムを意味する。かかる限定使用製品は、商業的には「使い捨て製品」として知られている。

別の態様では、本発明は、１種以上の標的化合物の単離方法であって、標的化合物を含む液体を、スルホン酸ビニルをアガロースのヒドロキシル基と反応させることで製造される多孔質のスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）アガロースクロマトグラフィーマトリックスに通して標的化合物を吸着させる段階、及びクロマトグラフィーマトリックスを溶離剤に接触させることで前記標的化合物を回収する段階を含んでなる方法に関する。このように、本方法は陽イオン交換クロマトグラフィーの方法である。最も好ましい実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは上述のようなものである。

陽イオン交換クロマトグラフィーの原理は、当業者には公知である。好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスは吸着と溶離との間で洗浄される。当業者には理解される通り、本方法では通常の緩衝液及び条件が有用である。クロマトグラフィー方法に関する総説としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌ．Ｒｙｄｅｎ，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。

上記の方法は、タンパク質（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体）のような生体分子、ジペプチド又はオリゴペプチドのようなペプチド、ペプチド核酸、ウイルス、細菌細胞のような細胞、プリオンなどの標的化合物の単離（例えば、分離又は精製）のために使用できる。有利な実施形態では、標的化合物はタンパク質であり、本方法は実質的に純粋なタンパク質を与える。最も有利な実施形態では、標的化合物はＩｇＧのような免疫グロブリンである。

別法として、本方法は薬物候補品のようなカチオン性有機分子を単離するために使用される。別の実施形態では、本方法は上述の標的化合物のいずれか１種を同定するため（例えば、診断目的のため）に使用される。さらに別の実施形態では、本方法は、食品及び飲料業界用の生成物（例えば、ホエーに由来する各種タンパク質、糖及び甘味料溶液、アミノ酸含有溶液）を精製するために使用される。かくして、本方法の生成物は、薬物又は薬物標的（例えば、抗体系薬物又は診断薬）、治療で使用するためのベクター（例えば、遺伝子治療で使用するためのプラスミド又はウイルス）、食品サプリメント（例えば、機能化食品）、診断薬などであり得る。本発明に従って精製される分子の具体的な用途は、個人化医薬品用の薬物としてのものである。

実験の部
以下の実施例はもっぱら例示目的のために示すものであり、特許請求の範囲で定義される本発明を限定するものではない。

実施例１：流れ圧力特性の向上したアガロースに対するＳ基の結合
例１ａ：本発明に係るスルホン酸ビニル結合
本例では、出発原料は、米国特許第６６０２９９０号（Ｂｅｒｇ）に記載されたようにして製造したアガロースゲル粒子（即ち、向上した流れ圧力特性を有するアガロース）であった。

スルホン酸ビニルを用いる結合手順：７ｍＬの水切り済みゲルをガラスフィルター上に置き、１５ｍＬの３０％ビニルスルホン酸（ＶＳＡ）（Ｆｌｕｋａ）水溶液で３回洗った。最後の洗浄後、ゲルを反応器に移し、ＶＳＡ溶液を添加して全量を９ｍＬにした。その後、７ｍＬの５０％（１８Ｍ）水酸化ナトリウム原液を添加した。反応スラリーを撹拌し、５０℃に６時間加熱した後、反応溶液からゲルを濾別し、ゲルを数回水洗することで反応を停止した。

例１ｂ（比較例）：通常の重亜硫酸ナトリウム結合
出発原料は、上記例１ａに定義したようなアガロースゲル粒子であった。

アリル化：１００ｍｌのアガロース粒子を１２ｍＬの５０％ＮａＯＨ水溶液及び０．５ｇのＮａＢＨ_４と混合した。混合物を５０℃で１時間撹拌した。アリルグリシジルエーテル（６０ｍｌ）を添加し、懸濁液を激しく撹拌しながら５０℃にさらに１８時間放置した。５Ｍ ＡｃＯＨの逐次添加によってｐＨ７に達するまで中和した後、混合物を濾過し、ゲルを順次に０．５Ｌのエタノール、１Ｌの蒸留水、２００ｍｌの０．２Ｍ酢酸及び５００ｍｌの蒸留水で洗った。アリル含有量は０．１４ｍｍｏｌ／ｍＬであった。

重亜硫酸ナトリウムを用いるＳＰ結合：上記のアリル化アガロース粒子の撹拌水性スラリー（全量１３０ｍＬ）に、２８ｇの重亜硫酸ナトリウムを添加し、ｐＨをＮａＯＨで調節した。スラリー中に空気を連続的に吹き込みながら、反応混合物を室温で１８時間撹拌し、蒸留水で洗った。イオン容量は０．１１ｍｍｏｌ／ｍＬであった。

結果
実施例１の結果を下記表１に示す。

実施例２：流れ圧力特性の向上したアガロースに対する、エキステンダーを介したＳ基の結合
例２ａ：本発明に係るスルホン酸ビニル結合
出発原料は、上記例１ａに定義したようなアガロースゲル粒子であった。

エポキシ活性化手順：５５ｇのアガロースゲルを水切りし、温度調節反応器内で１５ｍＬの蒸留水と共に撹拌した。８．５ｍＬの５０％ＮａＯＨ及び２０ｍｇのＮａＢＨ_４を添加し、５分間の撹拌後、１４ｍＬのエピクロロヒドリンを添加した。反応スラリーを３０℃で２時間撹拌した後、ガラスフィルター漏斗内において蒸留水で数回洗った。

デキストラン結合手順：２１ｇのデキストランＴ４０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を２５ｍＬの蒸留水に溶解した。例１ａに記載したようにして製造されかつ上述のようにしてエポキシ活性化された５０ｇの水切り済みアガロースゲル粒子を添加し、３０℃で１時間撹拌した。２．５ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加し、スラリーを３０℃で１８時間撹拌した後、ガラスフィルター漏斗内において蒸留水で数回洗った。

スルホン酸ビニルを用いる結合手順：上記例１ａに記載したようにしてスルホン酸ビニルを使用することで、本発明に係る高度架橋アガロースのエキステンダーにＳ基を結合した。

例２ｂ（比較例）：通常の重亜硫酸ナトリウム結合
本例では、上記例１ａに定義したようなアガロースゲル粒子をエポキシ活性化し、上記例２ａに記載したようにしてデキストランエキステンダーを設けた。

重亜硫酸ナトリウムを用いるＳＰ結合：上記例１ｂに記載したようにして反応を実施した。

結果
実施例２の結果を下記表１に示す。

実施例３：デキストランエキステンダーの効果
例３ａ：エキステンダーを介したアガロースに対するＳ基の結合
市販の架橋アガロース粒子（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ウプサラ、スウェーデン）から入手した。

上記例２ａに記載したようにして、エポキシ活性化、デキストランエキステンダーの結合、及びスルホン酸ビニルを用いるＳ基の結合を実施した。

例３ｂ：エキステンダーを用いないアガロースに対するＳ基の結合
出発原料は、上記例３ａに記載したような市販のアガロースであった。

上記例１ａに記載したようにして、スルホン酸ビニルを用いるＳ基の結合を実施した。

結果
実施例３の結果を下記表２に示す。

実施例４：イオン容量及びタンパク質結合
上記実施例１〜３で得られた生成物を下記のようにして試験した。結果を表１（実施例１及び２）及び表２（実施例３）に示す。

デキストラン含有量の測定
例２ａ、２ｂ及び３ａの生成物のデキストラン含有量を以下のようにして試験した。１．０ｍＬのデキストラン変性ゲルを採取し、加熱装置を備えた化学てんびん上において１２０℃で乾燥した。対応するエポキシ活性化ゲルを基準品として使用し、デキストラン変性ゲルと同様にして分析した。基準ゲルとデキストラン結合ゲルとの重量差を結合デキストランの量と見なし、ｍｇ／ｍＬゲルで表した。

イオン容量の測定
塩化物イオン交換容量を滴定によって測定した。ゲルのスラリーを０．５Ｍ ＨＣｌで３分間処理し、次いで１ｍＭ ＨＣｌで十分に洗った。１．０ｍｌゲルの試料を採取した。試料を滴定容器に移し、５ｍＬの水を添加した。次いで、試料を０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．０まで滴定した。

タンパク質容量の測定
漏出点容量は、ＡＫＴＡ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）１０／１００に取り付けたＨＲ５／５カラムにおいて、５０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．７５）中のリゾチームについては１ｍＬ／分、ポリクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ）については０．５ｍＬ／分の流量で測定する。漏出点容量測定用のタンパク質溶液は約４．０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。動的タンパク質結合容量を漏出曲線として測定し、最大ＵＶ_２８０吸光度の１０％の位置で容量を読み取った。

漏出点容量方法は下記のようにして実施される。

安定な基線に達するまで、クロマトグラフィー装置のバイパス位置を通して吸着緩衝液をポンプ送入する。オートゼロを実施し、（スーパーループを介して適用される）タンパク質溶液約１０ｍｌを装置内にポンプ送入することで安定な１００％信号を得る。この段階についての流量は、分析時と同じ（即ち、３００ｃｍ／時（１ｍｌ／分））である。漏出点容量方法では、１００％信号の２０％の位置に認められる吸光度を設定する。吸着緩衝液を用いて安定な基線に達した後、やはりバイパス位置において前端分析を開始する。この方法では、まず最初に、装置内に配置したカラムを通して１０ｍｌ（約５カラム容積）の吸着緩衝液を流すことでカラムの平衡化を行う。その後、オートゼロを実施し、２０％漏出点に達するまでタンパク質溶液をカラムに適用する。

結果

Claims (21)

1. クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、利用可能なヒドロキシル基を含む１種以上の多糖担体を用意する段階、及び前記ヒドロキシル基をスルホン酸ビニルと反応させてスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）陽イオン交換体を得る段階を含んでなる方法。
2. 前記多糖が架橋している、請求項１記載の方法。
3. 前記担体が
   （ａ）水性多糖溶液を用意して前記多糖のヒドロキシル基の一部を置換し、
   （ｂ）多糖溶液をゲル化して担体を得、
   （ｃ）多糖のヒドロキシル基を反応させることにより、（ｂ）で得られた多糖ゲルを架橋させる
   ことで得られる、請求項２記載の方法。
4. （ａ）で定義されるヒドロキシル基の前記置換が、１つの活性部位及び１つの不活性部位を有する１種以上の二官能性架橋剤を多糖溶液に添加し、かかる活性部位を多糖のヒドロキシル基の一部と反応させることで達成され、前記添加架橋剤の不活性部位が（ｂ）で定義されるゲル化の後に活性化され、こうして活性化された部位が多糖ゲルのヒドロキシル基と反応することで（ｃ）で定義される架橋が達成される、請求項３記載の方法。
5. 多糖がアガロース及びデキストランからなる群から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. 多糖がアガロースである、請求項５記載の方法。
7. スルホン酸ビニルと反応させてＳ−官能化陽イオン交換体を得るヒドロキシル基が、エキステンダーを介して担体に結合されている、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
8. エキステンダーがデキストランのような１種以上のポリヒドロキシル官能性ポリマーからなる、請求項７記載の方法。
9. 担体が多孔質である、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
10. 担体が本質的に球状のゲル粒子からなる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
11. 担体が膜である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
12. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法で製造される、スルホン酸官能化（Ｓ−官能化）アガロース粒子からなるクロマトグラフィーマトリックス。
13. スルホン酸ビニルをアガロースのヒドロキシル基と反応させることで製造される多孔質のスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）アガロース粒子からなるマトリックスを含んでなる液体クロマトグラフィー用カラム。
14. スルホン酸ビニルをアガロースに結合されたエキステンダー（例えば、１種以上のポリヒドロキシ官能性ポリマー）上に提供されるヒドロキシル基と反応させることで製造される多孔質のスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）アガロース粒子からなるマトリックスを含んでなる液体クロマトグラフィー用カラム。
15. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法で製造されるスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）陽イオン交換体を含む、請求項１３又は請求項１４記載のカラム。
16. １種以上の標的化合物の単離方法であって、標的化合物を含む液体を、スルホン酸ビニルをアガロースのヒドロキシル基と反応させることで製造される多孔質のスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）アガロースクロマトグラフィーマトリックスに通して標的化合物を吸着させる段階、及びクロマトグラフィーマトリックスを溶離剤に接触させることで前記標的化合物を回収する段階を含んでなる方法。
17. １種以上の標的化合物の単離方法であって、標的化合物を含む液体を、スルホン酸ビニルをアガロースに結合されたエキステンダー上に提供されるヒドロキシル基と反応させることで製造される多孔質のスルホン酸官能化（Ｓ−官能化）アガロースクロマトグラフィーマトリックスに通して標的化合物を吸着させる段階、及びクロマトグラフィーマトリックスを溶離剤に接触させることで前記標的化合物を回収する段階を含んでなる方法。
18. クロマトグラフィーマトリックスが本質的に球状のゲル粒子からなる、請求項１６又は請求項１７記載の方法。
19. １種以上の標的化合物がタンパク質である、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
20. １種以上の標的化合物が免疫グロブリン（好ましくはＩｇＧ）である、請求項１９記載の方法。
21. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法で製造されるクロマトグラフィーマトリックスの、液体クロマトグラフィーにおける使用。