WO2010095673A1 - 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル - Google Patents
免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル Download PDFInfo
- Publication number
- WO2010095673A1 WO2010095673A1 PCT/JP2010/052407 JP2010052407W WO2010095673A1 WO 2010095673 A1 WO2010095673 A1 WO 2010095673A1 JP 2010052407 W JP2010052407 W JP 2010052407W WO 2010095673 A1 WO2010095673 A1 WO 2010095673A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- gel
- porous cellulose
- cellulose particles
- polysaccharide
- particles
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/328—Polymers on the carrier being further modified
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
- B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
Definitions
- the present invention relates to the production and use of a packing material for cation exchange chromatography suitable for the separation and purification of chromatographic packing materials, particularly protein preparations such as immunoglobulins that can be used for antibody drugs and biopharmaceuticals for blood products.
- Non-Patent Document 1 Journal of Chromatography A, 679 (1994) 11-22
- an ion-exchange adsorbent comprising a dextran-derived hydrogel in which ion-exchange groups are added to core particles made of polystyrene-silica. It has been reported that the protein adsorption performance is improved by using “S HyperD (trademark)” from Biosepra (France).
- Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2008-528966
- Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-232764
- a ligand using 2-bromoethanesulfone into a gel in which pullulan having a molecular weight of 500,000 is immobilized on porous methacrylate particles. It is described that a matrix for strong cation ion exchange chromatography showing flow rate characteristics was obtained.
- an adsorption capacity of 160 mg / ml of human immunoglobulin has been achieved.
- Non-Patent Document 2 Journal of Chromatography A, 1146 (2007) 202-215 reports the effect of surface modification using dextran on agarose core particles. According to this, by modifying the surface of the core particle using dextran, the diffusibility of the target protein in the carrier is improved, and thus mass transfer of the target is increased.
- SP Sepharose (trademark) XL” is commercially available from GE Healthcare Science.
- Patent Document 3 As an example of a gel matrix for cation exchange chromatography that can be used for antibody drug production, a dextran having a molecular weight of 40 kDa is covalently bonded to a crosslinked agarose gel. It was reported that a gel having an ability to adsorb immunoglobulin (IgG) of 143 mg / ml was obtained by introducing an ion exchange group into the resulting particles using vinyl sulfonic acid.
- IgG immunoglobulin
- a typical silica-based filler as a chromatography filler is excellent in high flow rate.
- the material is unstable under alkaline conditions, it is disadvantageous for general alkali cleaning properties.
- the packing material for chromatography based on polysaccharides has strong alkali resistance. Moreover, the packing material for chromatography based on polysaccharide has a porosity suitable for separation and purification of protein size, and is promising for separation and purification of protein or vaccine preparation.
- Cellulose and agarose which are typical polysaccharides, are more advantageous for increasing the flow rate required for chromatographic packing materials because cellulose has a stronger hydrogen bonding network.
- flow rate characteristics and adsorption characteristics suitable for separation and purification of immunoglobulins for protein preparations, particularly antibody drugs, based on cellulose.
- JP 2008-528966 A Japanese Patent Laid-Open No. 2008-232764 International Publication No. 2007-027139 Pamphlet
- a chromatography filler can be produced by a simpler method by using a polysaccharide having a high intrinsic viscosity.
- the present invention provides a porous cellulose-based gel, a chromatographic filler, a production method thereof, an application, and the like as described below.
- a porous cellulose gel obtained by adding a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g to porous cellulose particles, and drying per unit volume of the porous cellulose gel A porous cellulose gel characterized by having a weight of 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles.
- the porous cellulose particles have a particle size of 30 to 200 ⁇ m and are expressed by Kav when pure water is used as a mobile phase with standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da.
- the porous cellulose gel according to [1] which has a gel distribution coefficient of 0.15 to 0.6.
- [6] A chromatographic packing material obtained by adding a ligand to the porous cellulose gel described in any one of [1] to [5].
- the filler according to [7], wherein the introduced amount of the ligand is 0.13 to 0.30 mmol / ml in terms of ion exchange capacity.
- the filler according to [6], wherein the ligand is a sulfate group.
- the filler according to [9] wherein the introduced amount of the ligand is 5000 to 60000 ppm in terms of sulfur content.
- a porous cellulose gel obtained by adding a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g to porous cellulose particles, and drying per unit volume of the porous cellulose gel A method for producing a chromatographic filler, comprising a step of adding a ligand to a porous cellulose gel having a weight of 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles.
- the porous cellulose particles have a particle diameter of 30 to 200 ⁇ m, and are expressed by Kav when pure water is used as a mobile phase with standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da.
- [18] A method for producing an immunoglobulin preparation, comprising a step of separating and purifying immunoglobulin using the filler according to any one of [6] to [8] and [11] to [13].
- [18a] A method for producing a blood product, comprising the step of separating and purifying the blood product using the filler according to [9] or [10].
- [18b] A method for producing an immunoglobulin preparation, comprising a step of separating and purifying immunoglobulin using the filler according to [9] or [10].
- porous cellulose gel is a separation agent for chromatography, and porous particles formed by adding polysaccharides to porous cellulose particles contain a solvent therein. Or in a swollen state after absorbing a solvent.
- a chromatographic filler having improved flow rate characteristics and adsorption characteristics, and a base material suitably used therefor.
- a ligand can be efficiently introduced by using dextran having a predetermined intrinsic viscosity as a polysaccharide to be added to porous cellulose particles. Can be increased.
- a cation exchange type that can be used for separation and purification of immunoglobulins in the field of antibody medicine by introducing a sufficient amount of a sulfone group as a ligand into the porous cellulose gel of the present invention.
- a chromatographic gel can be provided.
- immunoglobulin adsorption performance can be greatly improved.
- porous cellulose gel of the present invention the packing material for chromatography, the production method and use thereof will be described in detail.
- porous Cellulose Gel First, the porous cellulose gel of the present invention will be described.
- the porous cellulose gel of the present invention is obtained by adding a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g to porous cellulose particles, and the dry weight per unit volume is as described above. It is characterized by 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of porous cellulose particles.
- the porous cellulose gel of the present invention is obtained by adding a predetermined amount of a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity to porous cellulose particles, and cellulose molecules are crosslinked by a crosslinking agent such as epichlorohydrin.
- a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity By modifying the surface of the porous cellulose particles or the inside of the pores with a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity, a high flow rate characteristic is ensured when used as a packing material for chromatography, and a ligand is efficiently introduced. This makes it possible to impart high adsorption characteristics.
- a desired amount of polysaccharide can be added to porous cellulose by a simple method by using a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity.
- the porous cellulose particles used in the present invention preferably have a particle size of 30 to 200 ⁇ m, and particularly preferably have a particle size of 50 to 150 ⁇ m.
- the desired particle size can be adjusted, for example, by classification using a JIS standard sieve.
- a sieve having an aperture of 54 ⁇ m (wire diameter 0.04 mm) and an aperture of 125 ⁇ m (wire diameter 0.088 mm) is suitable for obtaining the particle size of the present invention.
- the average particle size of the porous cellulose particles used in the present invention is preferably 80 to 120 ⁇ m, more preferably 90 to 110 ⁇ m.
- the average particle diameter of the porous cellulose particles can be calculated by actually measuring an arbitrary number of cellulose particle photographs taken using a scanning electron microscope or an optical microscope and obtaining the average. The specific measurement method is as shown in the examples.
- the sphericity (minor axis / major axis) of the porous cellulose particles used in the present invention is not particularly limited, but those having a spherical shape of 0.8 to 1.0 are preferred.
- the porous cellulose particles used in the present invention are porous.
- As an index of sex a commercially available standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da, having a gel distribution coefficient of 0.15 to 0.6 expressed by Kav when pure water is used as a mobile phase. Those are preferred.
- the gel distribution coefficient is more preferably 0.20 to 0.55, and further preferably 0.25 to 0.50.
- the standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da is preferably, for example, standard polyethylene oxide “SE-5” manufactured by Tosoh Corporation.
- the gel distribution coefficient Kav can be obtained from the relationship between the elution volume of the standard substance having a molecular weight and the column volume by the following equation.
- Kav (Ve ⁇ V 0 ) / (Vt ⁇ V 0 ) [In the formula, Ve is a sample holding capacity (ml), Vt is an empty column volume (ml), and V 0 is a dextran T2000 holding capacity (ml). ]
- the method for measuring the gel partition coefficient Kav is described in, for example, L. Fischer Biochemistry Experimental Method 2 “Gel Chromatography” 1st Edition (Tokyo Kagaku Dojin). The specific measurement method is as shown in the examples.
- the gel distribution coefficient Kav of the porous cellulose particles of the present invention can be adjusted, for example, by controlling the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles described in Reference Example 1 described later.
- the gel distribution suitable for the porous cellulose particles of the present invention is preferably adjusted to 4 to 6% (W / W).
- the coefficient Kav can be obtained.
- the gel distribution coefficient Kav of the porous cellulose particles can be controlled, for example, by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles.
- a gel distribution coefficient Kav suitable for the porous cellulose particles of the present invention can be obtained by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions described in Reference Example 1 described later.
- a method combining the control of the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles and the control of the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles may be used.
- the porous cellulose particles used in the present invention may be crosslinked cellulose particles or non-crosslinked cellulose particles, but when a chromatography filler is produced using the porous cellulose gel of the present invention as a base material. Moreover, it is preferable to use crosslinked cellulose particles because higher flow rate characteristics can be obtained.
- Crosslinked cellulose particles can be obtained by crosslinking uncrosslinked cellulose particles. Crosslinking is performed between the free hydroxyl groups of the cellulose molecules that have formed a three-dimensional network structure in each cellulose particle and the functional groups of the crosslinking agent.
- the manufacturing method in particular of a crosslinked cellulose particle is not restrict
- the solvent is not particularly limited as long as it can disperse uncrosslinked cellulose particles, and any of water, an organic solvent such as alcohol, ketone, ether, and aromatic hydrocarbon, or a mixture of water and an organic solvent may be used. Good. Among these solvents, water-soluble solvents are preferable, and water is particularly preferable.
- an inexpensive inorganic salt such as sodium sulfate may coexist in the suspension.
- the crosslinking agent is not particularly limited as long as it is polyfunctional, and a bifunctional one is preferably used in the present invention. Since the crosslinking agent used in the present invention is chemically stable in the bond with cellulose and does not introduce charged groups that can cause undesirable adsorption during the reaction, epichlorohydrin, polyethylene glycol or sorbitol A preferable example is an epoxy compound in which a hydroxyl group is glycidyl etherified. These crosslinking agents can be used alone or in combination of two or more. Among these, in the present invention, it is preferable to use epichlorohydrin in which the bond becomes stronger.
- the crosslinking reaction is preferably performed in the presence of an alkali.
- alkali include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, and alkaline earth such as calcium hydroxide.
- alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide
- alkaline earth such as calcium hydroxide.
- a hydroxide of a similar metal Of these, sodium hydroxide and potassium hydroxide are preferred, and sodium hydroxide is particularly preferred because alkali metal hydroxide has good solubility.
- methods described in Japanese Patent Publication No. 43-10059, Japanese Patent Publication No. 2000-508361 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-39558 can be used as a method for producing crosslinked cellulose particles. it can.
- the water swelling degree of the porous cellulose particles used in the present invention is preferably 5 to 20 ml / g, particularly 6 to 13 ml / g.
- the degree of water swelling of the porous cellulose particles is defined by volume / solid weight (ml / g).
- a gel swollen with water is placed in a graduated cylinder, and vibration is occasionally applied until the volume becomes constant. Then, the volume is measured, then the gel is taken out from the graduated cylinder, the entire amount of the gel is dried and the dry weight of the porous cellulose particles is measured, and the obtained measurement value is used to obtain from the following formula: be able to.
- Water swelling degree (ml / g) gel volume (ml) ⁇ gel dry weight (g)
- the degree of water swelling of the porous cellulose particles of the present invention can be adjusted, for example, by controlling the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles described in Reference Example 1 described later.
- the water swelling suitable for the porous cellulose particles of the present invention is preferably adjusted by adjusting the concentration to 4 to 6% (w / w). You can get a degree.
- the degree of water swelling of the porous cellulose particles can be controlled by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles.
- the degree of water swelling suitable for the porous cellulose particles of the present invention can be obtained by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions described in Reference Example 1 described later.
- a method combining the control of the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles and the control of the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles may be used.
- the polysaccharide added to the porous cellulose particles is one having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g.
- the polysaccharide used in the present invention has the above intrinsic viscosity, a desired amount of polysaccharide can be added to the porous cellulose particles.
- the polysaccharide having the above intrinsic viscosity is used, there is an advantage that the reaction operation is not burdened.
- the range of intrinsic viscosity of the polysaccharide used in the preferred embodiment of the present invention is, for example, 0.21 to 0.90 dL / g, 0.21 to 0.80 dL / g, or 0.21 to 0.70 dL / g. Further, it may be 0.21 to 0.64 dL / g.
- the intrinsic viscosity of the polysaccharide may be adjusted, for example, by selecting a polysaccharide having an appropriate intrinsic viscosity from commercially available products, or may be adjusted by a known method, for example, an appropriate intrinsic viscosity Select microorganisms that produce saccharides, obtain polysaccharides from the microorganisms, change culture conditions for microorganisms that produce polysaccharides, and obtain polysaccharides produced under the culture conditions. Also good.
- the intrinsic viscosity of a polysaccharide is determined according to the viscosity measurement method in the general measurement method listed in the Japanese Pharmacopoeia 14th edition, the first method “capillary viscometer method” of several polymer solutions having different concentrations.
- the viscosity can be determined by measuring the concentration dependence of the viscosity and extrapolating the obtained linear density to zero.
- the weight average molecular weight of the polysaccharide used in the present invention is more preferably 60 kDa or more, and even more preferably 70 kDa or more. Further, the weight average molecular weight of the polysaccharide is more preferably 500 kDa or less, and further preferably 300 kDa or less.
- polysaccharides used in the present invention include no charged groups so as not to cause undesirable non-specific adsorption during the reaction, and can be bound to porous cellulose particles, and thereafter There is no particular limitation as long as it has a reactive functional group (preferably a hydroxyl group) for enabling introduction of a ligand.
- a reactive functional group preferably a hydroxyl group
- examples include agarose, dextran, pullulan, starch, and derivatives thereof. Among these, it is preferable to use dextran, which is water-soluble and advantageous in terms of reaction operability, and can be obtained at low cost.
- the polysaccharide used in another preferred embodiment of the present invention is pullulan.
- the amount of polysaccharide added to the porous cellulose particles is represented by the amount of change in dry weight per unit volume before and after polysaccharide addition. That is, in the present invention, the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel is preferably 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles. This ratio has a suitable range depending on the viscosity of the polysaccharide, but is generally preferably 1.10 times or more, more preferably 1.15 times or more, and particularly preferably 1.20 times or more.
- a ligand can be efficiently introduced when producing the packing material for chromatography using the porous cellulose gel of the present invention, and the adsorption property of the target substance is enhanced. be able to.
- the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel and the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles can be determined as follows. First, 10.0 g of porous cellulose gel is added to a 50 ml stoppered graduated cylinder, and further pure water is added up to the 50 ml line, stoppered and allowed to stand until the volume remains unchanged. When the volume no longer changes, read the gel volume from the graduated cylinder scale. Next, the gel is taken out from the graduated cylinder, the whole amount of the gel is dried, and the weight of the dried gel is measured. Using each measured value, the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel can be determined according to the following formula.
- Dry weight per unit volume (g / ml) Dry weight of gel (g) ⁇ Gel volume (ml)
- the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles can also be determined in the same manner as described above. The specific measurement method is as shown in the examples.
- the dry weight per unit volume of the porous cellulosic gel and the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles for example, select the molecular weight of the polysaccharide used and control the amount added to the porous cellulose particles. Can be adjusted.
- the method for adding the polysaccharide to the porous cellulose particles is not particularly limited as long as the polysaccharide can be bonded to the porous cellulose particles by a chemical covalent bond.
- the polysaccharide may be added to the porous cellulose particles by reacting the porous cellulose particles with a crosslinking agent in a solvent in the presence of an alkali and then reacting the obtained reaction product with the polysaccharide. it can.
- the crosslinking agent used for the reaction is not particularly limited as long as it is bifunctional or polyfunctional, and examples thereof include those similar to those used for crosslinking porous cellulose particles. In particular, epichlorohydrin is preferably used.
- the alkali used for reaction can illustrate the thing similar to what is used for bridge
- the solvent used for the reaction is not particularly limited as long as the porous cellulose particles can be dispersed.
- crosslinking of a porous cellulose particle can be illustrated.
- water is particularly preferable.
- an inorganic salt such as sodium sulfate may coexist in the reaction mixture.
- JP-A-60-77769 As a method for adding a polysaccharide to porous cellulose particles, a method described in JP-A-60-77769 may be used. That is, epichlorohydrin is reacted with crosslinked cellulose particles to introduce an epoxy group, and dextran sulfate or a salt thereof is reacted therewith, whereby dextran can be added to the crosslinked cellulose particles.
- This method has an advantage that unreacted dextran sulfate or a salt thereof can be recovered and reused.
- the porous cellulose gel of the present invention can be obtained by adding a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity to the porous cellulose particles.
- a ligand to the porous cellulose-based gel of the present invention thus obtained, a desired flow rate characteristic can be imparted, and a chromatographic filler excellent in the target substance adsorption characteristic can be obtained.
- the chromatographic packing material of the present invention is obtained by adding a ligand to at least a part of the reactive functional group present in the above-described porous cellulose gel of the present invention.
- the porous cellulose gel of the present invention obtained by adding a predetermined amount of a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity to the porous cellulose particles has excellent flow rate characteristics and can efficiently introduce a ligand.
- the packing material for chromatography of the present invention obtained by adding a ligand to this is excellent in flow rate characteristics and adsorption characteristics.
- the types of ligands include ion exchange groups, hydrophobic groups, affinity groups and the like. Specifically, diethylamino, aminoethyl, carboxymethyl, sulfoneethyl, sulfone, phenyl, phosphate ester group, sulfate ester group, fanylboric acid Group, Protein A, and other reactive functional groups having affinity.
- the packing material for chromatography of the present invention can be easily obtained by adding a ligand to at least a part of the reactive functional group of the porous cellulose gel of the present invention.
- chromatography suitable for the separation and purification of proteins such as lysozyme and immunoglobulin by introducing a sulfone group into at least a part of the reactive functional group (for example, hydroxyl group) of the porous cellulose gel of the present invention.
- a filler can be obtained.
- a chromatographic packing material can be obtained.
- a sulfone group when introduced into the porous cellulose gel of the present invention, it can be carried out as follows.
- Sulfonating agents include haloalkanesulfonic acids such as sodium 3-chloro-2-hydroxypropanesulfonate or sodium 3-bromopropanesulfonate; sulfonic acids having an epoxide such as 1,4-butanesultone or 1,2-epoxyethanesulfonic acid Etc.
- a sulfonic acid having an epoxide such as 1,4-butanesultone or 1,2-epoxyethanesulfonic acid.
- the amount of the sulfonating agent used may be arbitrarily selected depending on the target sulfone group introduction rate and reaction conditions. For example, 0.001 to 1 equivalent of the reactive functional group in the porous cellulose gel It is appropriate to use
- the reaction temperature and reaction time vary depending on the type of the solvent and sulfonating agent, but are usually 0 to 100 ° C., preferably 20 to 85 ° C., preferably 0.5 to 24 hours, more preferably in an inert gas. For 0.5 to 10 hours.
- the reaction mixture may be neutralized by adding an aqueous alkali solution such as an aqueous sodium hydroxide solution. Thereafter, the obtained reaction mixture is filtered or centrifuged to recover the product and washed with water until neutral to obtain the target substance.
- the amount of the sulfone group introduced can be adjusted by changing the amount of the sulfonating agent used, and may be appropriately determined according to the use of the chromatography filler. Specifically, the amount of sulfone group introduced can be increased by increasing the amount of sulfonating agent used.
- JP-A-2001-302702 and JP-A-9-235301 can be referred to for details of the method for introducing a sulfone group.
- the amount of ligand introduced into the chromatographic packing material of the present invention is not particularly limited, but it is preferably 0.13 to 0.30 mmol / ml in terms of ion exchange capacity since desired adsorption characteristics can be obtained. 15 mmol / ml or more is particularly preferable. Moreover, 0.20 mmol / ml or less is especially preferable.
- ion exchange capacity means the molar amount of ligand per volume gel. The specific measurement method is as shown in the examples.
- transducing a sulfate group into the porous cellulose gel of this invention it can carry out as follows.
- the introduction of the sulfate ester group into the porous cellulose gel of the present invention may be carried out by a generally known method disclosed in, for example, US Pat. No. 4,480,091 and JP-A-2006-274245, that is, dimethyl
- a method of allowing chlorosulfonic acid to act on a sulfating agent in a solvent such as formamide or pyridine can be used.
- the amount of sulfating agent used in this case varies depending on the sulfur content of the target particles, but the weight ratio of cellulose gel to sulfating agent (cellulose gel: sulfating agent) is preferably 100: 10 to 100: 100. Is suitably in the range of 100: 10 to 100: 50.
- the reaction varies depending on the type of solvent and sulfating agent, but in an inert gas, at 0 to 100 ° C., preferably 20 to 85 ° C., for 0.5 to 24 hours, preferably 0.5 to 10 hours. Do.
- the introduction amount of the sulfate ester group can be adjusted according to the amount of the sulfating agent charged as described above, and may be appropriately determined according to the use of the chromatography filler. Specifically, the amount of sulfate ester groups introduced can be increased by increasing the weight ratio of the sulfating agent to the cellulose gel.
- the amount of the sulfate ester group introduced into the chromatographic filler of the present invention is not particularly limited, but it is preferably 5000 to 60000 ppm in terms of sulfur content and more preferably 10,000 ppm or more in order to obtain desired adsorption characteristics. Moreover, 50000 ppm or less is particularly preferable.
- the “sulfur content” means the ratio of the sulfur weight to the total dry weight of the porous cellulose gel. The specific measurement method is as shown in the examples.
- the chromatography packing material of the present invention is particularly preferably used for separation and purification of immunoglobulins.
- a desired amount of the sulfone group can be efficiently introduced, so that affinity for immunoglobulin can be imparted.
- the amount of adsorbed immunoglobulin in the chromatographic packing material of the present invention is 110 to 250 mg / ml.
- the “adsorbed amount of immunoglobulin” means the adsorbed amount of immunoglobulin per volume gel measured by the measurement method shown in Examples.
- the chromatography filler according to some embodiments of the present invention in which the ligand is a sulfate group can be suitably used as a chromatography filler instead of a heparin gel.
- the chromatographic packing material of this embodiment can be suitably used for separation and purification of various proteins such as lysozyme.
- the adsorption amount of lysozyme in the chromatographic packing material of this embodiment is 50 to 250 mg / ml.
- an adsorption amount of 100 to 250 mg / ml can be obtained with respect to lysozyme, and a chromatographic packing useful for separation and purification of lysozyme can be provided.
- the “adsorption amount of lysozyme” means the adsorption amount of lysozyme per volume gel measured by the measurement method shown in the examples.
- a highly pure immunoglobulin preparation can be provided by a simple method by separating and purifying the immunoglobulin using the chromatography filler of the present invention.
- a blood product can be provided in a simple manner by separating and purifying the blood product from plasma or the like using the chromatographic filler of some embodiments of the present invention as a chromatographic filler instead of heparin gel. can do.
- the obtained cellulose particles were classified by a sieving operation with a wire mesh sieve having an opening of 54 ⁇ m (wire diameter 0.04 mm) and an opening of 125 ⁇ m (wire diameter 0.088 mm).
- the average particle size of the classified cellulose particles was 100 ⁇ m, and the degree of water swelling was 16.4 ml / g for 6% cellulose particles and 9.6 ml / g for 10% cellulose particles, respectively.
- the Kav measured using pure water as the mobile phase using 1.5 ⁇ 10 5 Da) is as follows. Water swelling degree 11.4ml / g Average particle size 100 ⁇ m Gel partition coefficient Kav 0.38 (SE-15), 0.60 (SE-5)
- the Kav measured using pure water as the mobile phase using 1.5 ⁇ 10 5 Da) is as follows. Water swelling degree 7.1 ml / g Average particle size 100 ⁇ m Gel partition coefficient Kav 0.27 (SE-15), 0.47 (SE-5)
- an epoxy group was introduced into the crosslinked cellulose particles by the following method.
- dextran was added to the epoxidized crosslinked cellulose particles obtained in Reference Example 2A or 2B to obtain a porous cellulose gel, which was further sulfonated to obtain a chromatography filler.
- Example 1 To a 500 ml separable flask, 43 g of pure water and 32.0 g of dextran 70 (name sugar industry, intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight of about 70,000) were added and stirred until dissolved at room temperature. When dissolved, 60 g of the wet gel obtained in Reference Example 2A was added thereto and stirred at 30 ° C. for 1 hour. Next, 6.6 g of 45% (w / w) aqueous sodium hydroxide solution was added to the flask, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 18 hours.
- dextran 70 name sugar industry, intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight of about 70,000
- the reaction mixture was subjected to suction filtration, and the obtained wet gel was washed 5 times with 3 times the amount of pure water. After washing, the wet gel was suction filtered to remove excess water, and stored in a wet gel state.
- the Kav obtained using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as the mobile phase was 0.30.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 50%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.06 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- the resulting gel was suction filtered to remove excess water and stored in a wet gel state. In this way, a wet gel having a sulfone group introduced as a ligand was obtained.
- the ion exchange capacity at this time was 0.17 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 146 mg / ml.
- Example 2 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 24.8 g of dextran 70 was used.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.09 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- 1.28 g of 1,4-butanesultone was used to sulfonate the obtained gel and stored in a wet gel state.
- the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml
- the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 122 mg / ml.
- Example 3 The same as Example 1 except that 17.5 g of high molecular weight dextran EH (namely sugar industry, intrinsic viscosity 0.42 dL / g, weight average molecular weight of about 178,000 to 218,000) was used instead of dextran 70 A wet gel was obtained.
- the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.17.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 28%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.11 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- Example 4 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 33.0 g of polymer dextran EH was used in place of dextran 70.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 5%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.34 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- Example 5 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 10.9 g of dextran T500 (Pharmacosmos, weight average molecular weight 500 kDa, intrinsic viscosity 0.64 dL / g) was used instead of dextran 70.
- the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.21.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 35%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.10 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- Example 2 the gel obtained using 1.29 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
- the ion exchange capacity at this time was 0.14 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 117 mg / ml.
- Example 6 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 17.3 g of dextran T500 was used instead of dextran 70.
- the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.17.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 28%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.22 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- Example 7 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 24.5 g of dextran T500 was used instead of dextran 70.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.34 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- the gel obtained using 1.55 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state. At this time, the ion exchange capacity was 0.17 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 217 mg / ml.
- Example 1 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 33 g of dextran 40 (name sugar industry, intrinsic viscosity 0.17 dL / g, weight average molecular weight of about 40,000) was used instead of dextran 70.
- the Kav obtained by using pure polyethylene oxide (made by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.42.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 70%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.10 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- Example 2 the gel obtained using 1.29 g of 1,4-butane sultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
- the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 101 mg / ml.
- a wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 17.5 g of dextran 70 (name sugar industry, intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight about 70,000) was used.
- the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.43.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 72%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.04 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- the gel obtained using 1.23 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
- the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml
- the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 70 mg / ml.
- ⁇ Comparative Example 3> Wet gel in the same manner as in Example 1 except that 11.0 g of high molecular weight dextran EH (namely sugar industry, intrinsic viscosity 0.42 dL / g, weight average molecular weight about 200,000) was used instead of dextran 70 Got.
- the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.32.
- the ratio of the crosslinked 6% cellulose of Reference Example 1 to Kav was 53%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.05 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- Example 2 the gel obtained using 1.26 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
- the ion exchange capacity at this time was 0.12 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 76 mg / ml.
- ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity, Kav, change in dry weight before and after dextran addition, ion exchange capacity, and average particle size were measured according to the following measurement methods 1-5. Asked.
- the column was connected to the system and equilibrated with a buffer at a flow rate of 1 ml / min until the UV (ultraviolet light absorbance, 280 nm) and electric conductivity of the column effluent were constant. Thereafter, the baseline UV was reduced to zero.
- the antibody solution was allowed to flow from the bypass line, and the flow path to the column was replaced with the antibody solution.
- the line was switched from the bypass line to the column, and the antibody solution was allowed to flow through the column at a flow rate of 1 ml / min.
- the UV of the column effluent was monitored, and the flow of the antibody solution was stopped when the UV of the column effluent reached 10% of the previously measured UV of the antibody solution.
- a pressure gauge was connected in the middle of the liquid feed line to monitor the pressure. The flow rate was increased until the pressure reached 0.3 MPa, and then filling was performed while flowing ultrapure water for 30 minutes. After filling, the pump was stopped and the adapter and reservoir lid were removed. Next, the ultrapure water in the reservoir was pipetted out. The reservoir was removed and the end fitting was connected except for the gel protruding from the column.
- the method for obtaining the gel distribution coefficient Kav of the porous cellulose particles is the same as the method for the porous cellulose gel.
- Kav measuring device System SCL-10APVP (SHIMAZU) Workstation: CLASS-VP (SHIMAZU) RI detector: RID-10A (SHIMAZU) Pump: LC-10AT (SHIMAZU) Autoinjector: SIL-10ADVP (SHIMAZU)
- Kav (Ve ⁇ V 0 ) / (Vt ⁇ V 0 ) [In the formula, Ve is a sample holding capacity (ml), Vt is an empty column volume (ml), and V 0 is a dextran T2000 holding capacity (ml). ]
- Dry weight per unit volume (g / ml) Dry weight of gel (g) ⁇ Gel volume (ml) Similarly, the dry weight (g / ml) per unit volume is determined for the wet gel after the dextran addition reaction, and the change in the dry weight relative to the dry weight per unit volume of the crosslinked cellulose particles is calculated.
- Example 8 Example of 10% cross-linked gel Wet gel in the same manner as in Example 1 except that the cross-linked 10% cellulose particles obtained in Reference Example 2B were used in place of the cross-linked 6% cellulose particles and 54 g of dextran 70 was used. Got. The amount of dextran added at this time was 16.3 mg / ml.
- the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.24.
- the ratio of the crosslinked 10% cellulose obtained in Reference Example 1 (B) to Kav was 51%.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.10 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 10% cellulose particles.
- Example 9 To a 500 ml separable flask, 40 g of pure water and 24 g of pullulan (manufactured by Hayashibara Co., Ltd., cosmetic pullulan, intrinsic viscosity 0.73 dL / g) were added and stirred until dissolved at room temperature. When dissolved, 60 g of the wet gel obtained in Reference Example 2A was added thereto and stirred at 30 ° C. for 1 hour. Next, 6.4 g of 45% (w / w) aqueous sodium hydroxide solution was added to the flask, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 18 hours.
- pullulan manufactured by Hayashibara Co., Ltd., cosmetic pullulan, intrinsic viscosity 0.73 dL / g
- the reaction mixture was subjected to suction filtration, and the obtained wet gel was washed 5 times with 3 times the amount of pure water. After washing, the wet gel was suction filtered to remove excess water, and stored in a wet gel state.
- the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.24 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
- the resulting gel was suction filtered to remove excess water and stored in a wet gel state. In this way, a wet gel having a sulfone group introduced as a ligand was obtained.
- the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 178 mg / ml.
- Example 10-1 Ligand introduction of sulfate ester 300 g of methanol was added to 100 g of wet gel obtained by reacting with polymer dextran EH in the same manner as described in Example 4 and stirred at room temperature for 10 minutes, followed by suction filtration. This operation was repeated 5 times to obtain a methanol-substituted gel. The gel was vacuum dried at 50-60 ° C. until the water content was 2.5% (w / w). In a 500 ml separable flask, 200 g of pyridine was stirred and cooled to 10 ° C. or lower, and 4 g of chlorosulfonic acid was added dropwise under a nitrogen atmosphere.
- the mixture was reacted at 10 ° C. or lower for 1 hour and then heated to 65 ° C. After reaching 65 ° C., 30 g of the dried gel was added and allowed to react for 4 hours with stirring. After completion of the reaction, the mixture was left overnight at 25 ° C., and then neutralized by adding 20% w / w NaOH. The reaction mixture was filtered to recover the gel and washed with pure water until neutral, to obtain a wet gel having sulfate ester groups as ligands.
- Example 10-2 The adsorption amount of lysozyme measured according to the following measurement method 6 of the wet gel of Example 10-1 was 97 mg per 1 ml of gel. Further, the degree of sulfation (sulfur content) of this gel determined according to the following measurement method 7 was 22200 ppm.
- the porous cellulose gel to which dextran of this example is added can also be used as a packing material for chromatography using a sulfate as a ligand, for example. Since the gel of this example is a ligand in which dextran is sulfated, it can also be used as a packing material for chromatography instead of heparin gel.
- Blank values .SO 4 standard solution was a value at the same operation without adding the dried sample (Kanto A 2 ⁇ g / ml solution was used as a standard solution for this measurement method from Anion mixed standard solution IV) manufactured by Kagaku Co., Ltd., and further diluted in stages and analyzed with an ion chromatograph analyzer under the same conditions to prepare a calibration curve. It calculated
- Sulfur content (ppm) (X sample-X blank) x 25 x 2.5 x 0.3333 / 0.05 (sample amount g)
- X sample and X blank are concentrations (ppm) determined from a calibration curve using SO 4 standard solution.
- the chromatographic packing material of the present invention is useful as a packing material for separation and purification of a target substance in various fields because it has excellent flow rate characteristics and adsorption characteristics for the target substance.
- the chromatographic packing material according to a preferred embodiment of the present invention is particularly suitable for the separation and purification of antibody drugs because of its particularly excellent ability to adsorb immunoglobulins.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
例えば、非特許文献1(Journal of Chromatography A,679 (1994) 11-22)では、ポリスチレン-シリカからなるコア粒子にイオン交換基が付加してなる、デキストラン由来のハイドロゲルからなるイオン交換吸着剤(Biosepra社(フランス)より「S HyperD(商標)」として市販されている)を用いることで、タンパク質の吸着性能が向上することが報告されている。
さらに、特許文献2(特開2008-232764号公報)では、多孔性メタクリレート粒子に分子量50万のプルランを固定化したゲルに、2-ブロモエタンスルホンを用いてリガンドを導入することで、良好な流速特性を示す強カチオンイオン交換型クロマトグラフィー用マトリクスが得られたことが記載されている。ここでは、ヒト免疫グロブリンの吸着容量160mg/mlを達成したことが報告されている。
[2]前記多孔性セルロース粒子は、粒子径30~200μmを有し、且つ、重量平均分子量1.5×105Daの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のKavで表されるゲル分配係数0.15~0.6を有するものである、[1]記載の多孔性セルロース系ゲル。
[3]前記多糖類はデキストランである、[1]又は[2]記載の多孔性セルロース系ゲル。
[4]前記多糖類はプルランである、[1]又は[2]記載の多孔性セルロース系ゲル。
[5]前記多孔性セルロース粒子は、水膨潤度5~20ml/gを有する架橋セルロース粒子である、[1]~[4]のいずれか1項に記載の多孔性セルロース系ゲル。
[7]前記リガンドはスルホン基である、[6]記載の充填剤。
[8]前記リガンドの導入量は、イオン交換容量で0.13~0.30mmol/mlである、[7]記載の充填剤。
[9]前記リガンドは硫酸エステル基である、[6]記載の充填剤。
[10]前記リガンドの導入量は、硫黄含量で5000~60000ppmである、[9]記載の充填剤。
[11]免疫グロブリン精製用である、[6]~[8]のいずれか1項に記載の充填剤。
[12]免疫グロブリンの吸着量が150~250mg/mlである、[11]記載の充填剤。
[13]免疫グロブリンの吸着量が190~250mg/mlである、[12]記載の充填剤。
[13a]血液製剤の製造用である、[9]または[10]記載の充填剤。
[13b]免疫グロブリン精製用である、[9]または[10]記載の充填剤。
[15]前記多孔性セルロース粒子は、粒子径30~200μmを有し、且つ、重量平均分子量1.5×105Daの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のKavで表されるゲル分配係数0.15~0.6を有するものである、[14]記載の方法。
[16]前記多糖類がデキストランである、[14]又は[15]記載の方法。
[17]前記多糖類がプルランである、[14]又は[15]記載の方法。
[18a][9]又は[10]記載の充填剤を用いて血液製剤を分離精製する工程を含む、血液製剤の製造方法。
[18b][9]又は[10]記載の充填剤を用いて免疫グロブリンを分離精製する工程を含む、免疫グロブリン製剤の製造方法。
本発明の好ましい態様によれば、多孔性セルロース粒子に付加させる多糖類として所定の極限粘度を有するデキストランを用いることで、リガンドを効率よく導入することができ、簡便な方法で目的物質に対する吸着性能を高めることができる。
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロース系ゲルにリガンドとして十分量のスルホン基を導入することで、抗体医薬分野における免疫グロブリンの分離精製に利用可能な陽イオン交換型クロマトグラフィー用ゲルを提供することができる。本発明の好ましい態様によれば、免疫グロブリンの吸着性能を大幅に向上させることができる。
まず、本発明の多孔性セルロース系ゲルについて説明する。
本発明の多孔性セルロース系ゲルは、多孔性セルロース粒子に、極限粘度0.21~0.90dL/gを有する多糖類が付加してなるものであって、単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.06~1.40倍であることを特徴とする。
Kav=(Ve-V0)/ (Vt-V0)
[式中、Veはサンプルの保持容量(ml)、Vtは空カラム体積(ml)、V0はデキストランT2000保持容量(ml)である。]
本発明の多孔性セルロース粒子のゲル分配係数Kavは、例えば、後述の参考例1に記したセルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御により調整できる。結晶セルロース セオラスPH101(商品名、旭化成ケミカルズ株式会社製)を使用した場合、その濃度を好ましくは4~6%(W/W)に調整することで本発明の多孔性セルロース粒子に好適なゲル分配係数Kavを得ることができる。さらに、多孔性セルロース粒子のゲル分配係数Kavは、例えば、セルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御によっても制御可能である。好ましくは、後述の参考例1に記載の架橋方法・架橋条件に制御することにより本発明の多孔性セルロース粒子に好適なゲル分配係数Kavを得ることができる。当然ながら、セルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御とセルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御とを組み合わせた方法を利用してもかまわない。
溶媒は、未架橋セルロース粒子を分散できるものであれば特に制限されなく、水、アルコールやケトン、エーテル、芳香族炭化水素などの有機溶媒、または水と有機溶媒との混合物のいずれを用いてもよい。これらの溶媒の中でも水溶性溶媒が好ましく、特に水が好ましい。また、架橋反応の効率を上げるために、懸濁液には安価な硫酸ナトリウムなどの無機塩を共存させてもかまわない。
架橋剤は、多官能のものであれば特に制限されず、本発明においては二官能のものが好ましく用いられる。本発明に用いる架橋剤は、セルロースとの結合が化学的に安定であり、反応の際に望ましくない吸着作用を生じうる荷電した基が導入されないことから、エピクロロヒドリン、ポリエチレングリコール又はソルビトールの水酸基をグリシジルエーテル化したエポキシ化合物などが好ましい例として挙げられる。これらの架橋剤は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。これらの中でも、本発明においては、結合がより強固となるエピクロロヒドリンを用いることが好ましい。
水膨潤度(ml/g)= ゲルの容積(ml)÷ ゲルの乾燥重量(g)
本発明の多孔性セルロース粒子の水膨潤度は、例えば、後述の参考例1に記したセルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御により調整できる。結晶セルロース セオラスPH101(商品名、旭化成ケミカルズ株式会社製)を使用した場合、その濃度を好ましくは4~6%(w/w)に調整することで本発明の多孔性セルロース粒子に好適な水膨潤度を得ることができる。さらに、多孔性セルロース粒子の水膨潤度はセルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御によっても制御可能である。好ましくは、後述の参考例1に記載の架橋方法・架橋条件に制御することにより本発明の多孔性セルロース粒子に好適な水膨潤度を得ることができる。当然ながら、セルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御とセルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御とを組み合わせた方法を利用してもかまわない。
多糖類の極限粘度は、例えば、市販のものの中から適当な極限粘度を有する多糖類を選択することにより調整するようにしてもよいし、あるいは、公知の方法、例えば、適当な極限粘度の多糖類を生産する微生物を選択し、その微生物から多糖類を得ること、多糖類を生産する微生物の培養条件を変更し、その培養条件で生成された多糖類を得ることなどにより調整するようにしてもよい。
極限粘度(η)=9×10-4×重量平均分子量(Mw)0.5
まず、多孔性セルロース系ゲル10.0gを50ml栓付メスシリンダーに加え、さらに純水を50mlの線まで加え、栓をして体積が変わらなくなるまで静置する。体積が変わらなくなったらゲルの体積をメスシリンダーの目盛りから読み取る。
次いで、メスシリンダーからゲルを取り出して、ゲルの全量を乾燥させた後、乾燥ゲルの重量を測定する。
各測定値を用いて、下記の式にしたがって、多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量を求めることができる。
単位体積あたりの乾燥重量(g/ml)=ゲルの乾燥重量(g)÷ゲルの体積(ml)
多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量も、上記と同様にして求めることができる。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量及び多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量は、例えば、使用する多糖類の分子量を選択することや多孔性セルロース粒子への付加量を制御することなどで調整できる。
次に、本発明のクロマトグラフィー用充填剤について述べる。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、前述した本発明の多孔性セルロース系ゲル中に存在する反応性官能基の少なくとも一部にリガンドが付加してなるものである。多孔性セルロース粒子に所定の極限粘度を有する多糖類が所定量付加してなる本発明の多孔性セルロース系ゲルは、流速特性が優れている上に、リガンドを効率よく導入することができるため、これにリガンドが付加してなる本発明のクロマトグラフィー用充填剤は流速特性及び吸着特性に優れている。
まず、反応容器にスルホン化剤を準備する。スルホン化剤としては、3-クロロー2ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム又は3-ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムなどのハロアルカンスルホン酸;1,4-ブタンサルトン又は1,2-エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸等が挙げられる。これらの中でも、1,4-ブタンサルトン又は1,2-エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸を用いることが好ましい。スルホン化剤の使用量は、目的とするスルホン基の導入率及び反応条件によって任意に選択すればよく、例えば、多孔性セルロース系ゲル中の反応性官能基に対して、0.001~1当量を用いるのが適当である。
その後、得られた反応混合物を濾過または遠心分離することにより、生成物を回収し、水で中性になるまで洗浄して、目的物質を得ることができる。スルホン基の導入量は、スルホン化剤の使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。具体的には、スルホン化剤の使用量を増やすことによって、スルホン基の導入量を増やすことができる。
スルホン基の導入方法の詳細は、特開2001-302702号公報及び特開平9-235301号公報などを参照することができる。
本発明の多孔性セルロース系ゲルへの硫酸エステル基の導入は、例えば、米国特許第4,480,091号パンフレットや特開2006-274245号公報などに開示の通常知られた方法、即ち、ジメチルホルムアミドやピリジンなどの溶媒中で硫酸化剤にクロロスルホン酸を作用させる方法が利用できる。その際の硫酸化剤の使用量は、目的とする粒子の硫黄含量により異なるが、セルロースゲルと硫酸化剤の重量比(セルロースゲル:硫酸化剤)は、100:10~100:100、好ましくは100:10~100:50の範囲であるのが適当である。反応は、溶媒、硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、0~100℃、好ましくは20~85℃にて、0.5~24時間、好ましくは0.5~10時間行う。
あるいは、本発明のいくつかの態様のクロマトグラフィー用充填剤を、ヘパリンゲル代替のクロマトグラフィー用充填剤として用いて、血漿中などから血液製剤を分離精製することにより、簡便な方法で血液製剤を提供することができる。
尚、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009-37651号(2009年2月20日出願)および特願2009-260183号(2009年11月13日出願)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
架橋セルロース粒子の調製
Journal of Chromatography,195(1980)、221-230、特開昭55-44312号公報に記載された方法にしたがい、下記のようにしてチオシアン酸カルシウム60重量%水溶液に溶解させるセルロース濃度を6%(w/w)又は10%(w/w)とするセルロース粒子を製造した。
(1)100gのチオシアン酸カルシウム60重量%水溶液に6.4gの結晶性セルロース(旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名:セオラスPH101)を加え、110~120℃に加熱して溶解した。
(2)この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート6gを添加し、130~140℃に予め加熱したo-ジクロロベンゼン480ml中に滴下し、200~300rpmにて攪拌分散した。
(3)次いで、上記分散液を40℃以下まで冷却し、メタノール190ml中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
(4)この懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール190mlにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
(5)さらに大量の水で洗浄した後、目的とする球状セルロース粒子を得た。
(6)次いで、球状セルロース粒子をふるいにかけて、所望の粒子サイズ間隔(50~150μm、平均粒子径100μm)にした。
6.4gの結晶性セルロースを10.0gの結晶性セルロースを用いたことを除いて、上記6%球状セルロース粒子の製造と同様にして10%球状セルロース粒子を得た。
分級後のセルロース粒子の平均粒子径は100μmであり、水膨潤度は、それぞれ、6%セルロース粒子で16.4ml/g、10%セルロース粒子で9.6ml/gであった。
(1)上記で得られた6%球状セルロース粒子100g(含水率10.8)を、121gの純水に60gのNa2SO4を溶解した液に加え、撹拌した。混合物の温度を50℃にして2時間撹拌を継続した。
(2)次に、この混合物に45重量%のNaOH水溶液3.3gとNaBH40.5gとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度[NaOH]は0.69%(w/w)であった。
(3)50℃で混合物の撹拌を継続しながら、45重量%のNaOH水溶液48gと、エピクロロヒドリン50gとをそれぞれ25等分した量を、15分置きにおよそ6時間かけて添加した。
(4)添加終了後、この混合物を温度50℃で16時間反応させた。
(5)この混合物を温度40℃以下に冷却した後、酢酸2.6gを加え、中和した。
(6)反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋6%セルロース粒子を得た。
水膨潤度 11.4ml/g
平均粒子径 100μm
ゲル分配係数Kav 0.38(SE-15)、0.60(SE-5)
(1)上記で得られた10%球状セルロース粒子100g(含水率6.3)を、282gの純水に104gのNa2SO4を溶解した液に加え、撹拌した。混合物の温度を50℃にして2時間撹拌を継続した。
(2)次に、この混合物に45重量%のNaOH水溶液5.7gとNaBH40.9gとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度[NaOH]は0.69%w/wであった。
(3)50℃で混合物の撹拌を継続しながら、45重量%のNaOH水溶液83gと、エピクロロヒドリン85gとをそれぞれ25等分した量を、15分置きにおよそ6時間かけて添加した。
(4)添加終了後、この混合物を温度50℃で16時間反応させた。
(5)この混合物を温度40℃以下に冷却した後、酢酸4.0gを加え、中和した。
(6)反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋10%セルロース粒子を得た。
水膨潤度 7.1ml/g
平均粒子径 100μm
ゲル分配係数Kav 0.27(SE-15)、0.47(SE-5)
架橋6%セルロース粒子のエポキシ化
1Lセパラブルフラスコに吸引ろ過した架橋6%セルロース粒子を200g入れた。そこへ純水160mlを入れ、蓋をして該フラスコを30℃の温浴へ浸した。フラスコ内の温度が30℃になったら、水酸化ナトリウム水溶液(水酸化ナトリウム54g、純水133g)とエピクロロヒドリン120gとを加えて、30℃で2時間攪拌した。
2時間後、反応混合物を吸引ろ過し、得られた湿ゲルを3倍量の純水で5回洗浄した。
洗浄後、得られたゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。
架橋10%セルロース粒子のエポキシ化
架橋6%セルロース粒子に代えて架橋10%セルロース粒子を用いたことを除いて、参考例2Aと同様の手順でエポキシ化反応を行った。
500mlセパラブルフラスコに純水43gとデキストラン70(名糖産業、極限粘度0.23dL/g、重量平均分子量約70,000)32.0gを加え、室温で溶解するまで攪拌した。
溶解したらそこへ参考例2Aで得られた湿ゲル60gを加え、30℃で1時間攪拌した。次に、該フラスコに45%(w/w)水酸化ナトリウム水溶液を6.6g加え、そのまま30℃で18時間攪拌した。18時間後反応混合物を吸引ろ過し、得られた湿ゲルを3倍量の純水で5回洗浄した。洗浄後、湿ゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.30であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は50%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.06倍であった。
さらに、50ml栓付三角フラスコへ得られた湿ゲル5gを入れた。そこへ硫酸ナトリウム(和光純薬)5g、水酸化ナトリウム水溶液(水酸化ナトリウム0.98g、純水7.8g)を入れ、50℃のインキュベーターで30分攪拌した。30分後1、4-ブタンサルトン(和光純薬)1.41gを加え、50℃で6時間攪拌した。6時間後反応溶液を吸引ろ過し、得られたゲルを5倍量の純水で5回洗浄した。洗浄後、得られたゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。このようにして、リガンドとしてスルホン基を導入した湿ゲルを得た。この時のイオン交換容量は0.17mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は、146mg/mlであった。
デキストラン70を24.8gで実施したことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.37であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は62%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.09倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.28gを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.13mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は122mg/mlであった。
デキストラン70に代えて高分子デキストランEH(名糖産業、極限粘度0.42dL/g、重量平均分子量約178,000~218,000)17.5gを用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.17であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は28%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.11倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.39gを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.15mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は124mg/mlであった。
デキストラン70に代えて高分子デキストランEH33.0gを用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.03であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は5%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.34倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.57gを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.19mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は241mg/mlであった。
デキストラン70に代えてデキストランT500(Pharmacosmos、重量平均分子量500kDa、極限粘度0.64dL/g)10.9gを用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.21であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は35%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.10倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.29gを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.14mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は117mg/mlであった。
デキストラン70に代えてデキストランT500を17.3g用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.17であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は28%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.22倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.41gを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.14mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は199mg/mlであった。
デキストラン70に代えてデキストランT500を24.5g用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.02であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は3%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.34倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.55gを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.17mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は217mg/mlであった。
デキストラン70に代えてデキストラン40(名糖産業、極限粘度0.17dL/g、重量平均分子量約40,000)33gを用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチテンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.42であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は70%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.10倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1、4-ブタンスルトン1.29gを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.13mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は101mg/mlであった。
デキストラン70(名糖産業、極限粘度0.23dL/g、重量平均分子量約70,000)17.5gを用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.43であった。参考例1(A)で得られた架橋6%セルロースのKavに対する割合は72%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.04倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.23gを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.13mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は70mg/mlであった。
デキストラン70に代えて高分子デキストランEH(名糖産業、極限粘度0.42dL/g、重量平均分子量約200,000)11.0gを用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.32であった。参考例1の架橋6%セルロースのKavに対する割合は53%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.05倍であった。
さらに、実施例1と同様に、1,4-ブタンサルトン1.26gを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.12mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は76mg/mlであった。
γ-グロブリンを用いた動的吸着容量の測定
(1)使用機器及び試薬
LCシステム : BioLogicLP(BIORAD)
バッファー : 酢酸バッファーPH4.3、0.05MNaCl
抗体 : γ―グロブリン、人血清由来(和光純薬)
カラム : ガラスカラム内径5mm、長さ50mm(EYELA)
(2)測定方法
まず抗体をバッファーに溶かし1mg/mlの抗体溶液を作製した。そしてカラムにイオン交換基を付加したゲルを隙間のないよう充填した。次にカラムをシステムに接続しバッファーを用いて、カラム流出液のUV(紫外線吸光度、280nm)と電気伝導度が一定になるまで流速1ml/分で平衡化した。その後、ベースラインのUVをゼロにした。バイパスラインから抗体溶液を流しカラムへの流路を抗体溶液で置換した。次にバイパスラインからカラムへのラインへ切り変え、カラムに抗体溶液を流速1ml/minで流した。カラム流出液のUVをモニターし、カラム流出液のUVが、予め測定しておいた抗体溶液のUVの10%に達した時点で抗体溶液を流すのを止めた。以下の式により10%動的吸着容量を求めた。尚、この分析は20℃の部屋で行った。
{抗体溶液濃度(mg/ml)×抗体溶液を流し始めてから終えるまでの時間(min)×流速(ml/min)-空カラム容量}/カラム体積=10%動的吸着容量(mg/ml)
多孔性セルロースゲルのゲル分配係数Kavの測定
(1)使用機器及び試薬
カラム : エンプティカラム1/4×4.0mm I.D×300mm、
10F(東ソー)
リザーバー : パッカ・3/8(東ソー)
ポンプ : POMP P-500 (Pharmacia)
圧力計 : AP-53A(KEYENCE)
カラムとリザーバーを接続しカラム下部にエンドフィッティングを接続した。Kavを測定するゲルを減圧濾過した湿ゲルの状態で15g計りとり、50mlビーカーへ入れた。そこへ超純水20ml加え軽く攪拌した。粒子またはゲルが溶液に分散した状態でリザーバーの壁を伝わらせるようにカラムへゆっくり加えた。ビーカーへ残ったゲルは少量の超純水ですすぎゆっくりとカラムへ加えた。その後リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加えリザーバーの蓋をした。リザーバー上部へアダプターを接続しポンプで超純水を送液した。送液ラインの途中に圧力計を接続しておき圧力をモニターした。圧力が0.3MPaになるまで流速を上げ、その後30分超純水を流しながら充填した。充填が終わったらポンプを止めアダプターとリザーバーの蓋を外した。次にリザーバーの中の超純水をピペットで吸いだした。リザーバーを外し、カラムからはみ出したゲルを除きエンドフィッティングを接続した。
多孔性セルロース粒子のゲル分配係数Kavの求め方も、上記多孔性セルロースゲルの方法と同様である。
システム : SCL-10APVP(SHIMAZU)
ワークステーション : CLASS-VP(SHIMAZU)
RI検出器 : RID-10A(SHIMAZU)
ポンプ : LC-10AT(SHIMAZU)
オートインジェクター : SIL-10ADVP(SHIMAZU)
1.デキストランT2000(Pharmacia)
2.SE-70(東ソー)分子量5.8×105
3.SE-30(東ソー)分子量3.0×105
4.SE-15(東ソー)分子量1.5×105
5.SE-8(東ソー)分子量1.01×105
6.SE-5(東ソー)分子量4.3×104
7.SE-2(東ソー)分子量2.77×104
8.PEG19000(SCIENTIFIC POLYMER PRODUCTS)分子量19700
9.PEG8650(POLYMER LABORATORIES)分子量8650
10.PEG4120(POLYMER LABORATORIES)分子量4120
Kav=(Ve-V0)/ (Vt-V0)
[式中、Veはサンプルの保持容量(ml)、Vtは空カラム体積(ml)、V0はデキストランT2000保持容量(ml)である。]
Kavプロットの一例を図1に示す。
デキストラン付加前後の乾燥重量変化量の測定
参考例1で得られた架橋セルロース粒子10.0gを50ml栓付メスシリンダーに加え、さらに純水を50mlの線まで加え、栓をして体積が変わらなくなるまで静置する。体積が変わらなくなったらゲルの体積をメスシリンダーの目盛りから読み取る。
次いで、メスシリンダーからゲルを取り出して、ゲルの全量を、80℃のオーブンで16時間乾燥させた後、乾燥ゲルの重量を測定する。得られた測定値から、下記の式にしたがって、架橋セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量を求めることができる。
単位体積あたりの乾燥重量(g/ml)=ゲルの乾燥重量(g)÷ゲルの体積(ml)
デキストラン付加反応後の湿ゲルについても同様にして単位体積あたりの乾燥重量(g/ml)を求め、架橋セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量に対する乾燥重量変化を算出する。
イオン交換容量測定法
ブタンサルトンを付加した湿ゲル1mlをビーカーに秤量し、0.5mol/l塩酸(和光純薬)を加えて3分間攪拌した。その後、吸引濾過により塩酸を取り除き、さらに純水で洗浄した。
洗浄したゲル1mlをビーカーに加え、0.1mol/l水酸化ナトリウム溶液(和光純薬)3mlとフェノールフタレイン溶液1滴を加えた。この溶液に、0.1mol/l塩酸(和光純薬)を溶液の色が透明になるまで加えた。透明になるまで加えた塩酸量をXmlとすると、ゲル1mlあたりのイオン交換容量(IEC)は、次式
(0.1×3/1000-0.1×X/1000)×1000 (mmol/ml)
で求めることができる。
平均粒子径の測定
スライドグラスに湿潤セルロース粒子を取り、光学顕微鏡を用いて倍率100倍で撮影した写真から任意に200粒子の直径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
10%架橋ゲルの実施例
架橋6%セルロース粒子の代わりに参考例2Bで得られた架橋10%セルロース粒子を用い、デキストラン70を54g用いたことを除いて、実施例1と同様にして湿ゲルを得た。この時のデキストラン付加量は16.3mg/mlであった。標準ポリエチレンオキシド(東ソー社製)SE-5(重量平均分子量4.3×104)で純水を移動相に使用して求めたKavは0.24であった。参考例1(B)で得られた架橋10%セルロースのKavに対する割合は51%であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋10%セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.10倍であった。
50ml栓付三角フラスコへ得られた湿ゲル5gを加え、そこへ硫酸ナトリウム(和光純薬)5g、水酸化ナトリウム水溶液(水酸化ナトリウム1.55g、純水15.37g)を入れ50℃のインキュベーターで30分攪拌した。30分後、1、4-ブタンサルトン(和光純薬)4.11gを加え、50℃で6時間攪拌した。6時間後、反応混合物を吸引ろ過し、得られたゲルを5倍量の純水で5回洗浄した。洗浄後のゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は0.28mmol/mlであり、γ―グロブリン10%動的吸着容量は125mg/mlであった。
上記の結果から、10%架橋セルロース粒子を用いても、6%架橋セルロース粒子を用いた場合と同様に免疫グロブリンを効率よく分離精製することができるクロマトグラフィー用充填剤が得られることが実証された。
500mlセパラブルフラスコに純水40gとプルラン(林原社製、化粧品用プルラン、極限粘度0.73dL/g)24gを加え、室温で溶解するまで攪拌した。
溶解したらそこへ参考例2Aで得られた湿ゲル60gを加え、30℃で1時間攪拌した。次に、該フラスコに45%(w/w)水酸化ナトリウム水溶液を6.4g加え、そのまま30℃で18時間攪拌した。18時間後反応混合物を吸引ろ過し、得られた湿ゲルを3倍量の純水で5回洗浄した。洗浄後、湿ゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋6%セルロース粒子の単位体積あたり乾燥重量の1.24倍であった。
硫酸エステルのリガンド導入
実施例4に記載した方法と同様にして高分子デキストランEHと反応させて得た湿ゲル100gに300gのメタノールを加え室温で10分間攪拌した後、吸引ろ過した。この作業を5回繰り返すことによりメタノール置換ゲルを得た。このゲルを水分含量が2.5%(w/w)になるまで50~60℃にて真空乾燥した。500mlセパラブルフラスコにピリジン200gを攪拌しながら10℃以下まで冷却後、窒素雰囲気下、クロロスルホン酸4gを滴下した。滴下終了後、10℃以下で1時間反応させた後、65℃まで加熱した。65℃到達後、前記乾燥させたゲル30gを投入し、攪拌下4時間反応させた。反応終了後、25℃にて一晩放置し、その後、20%w/wNaOHを添加して中和した。反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水で中性になるまで洗浄し、硫酸エステル基をリガンドに持つ湿ゲルを得た。
実施例10-1の湿ゲルの下記測定法6に従って測定したリゾチームの吸着量は、ゲル1mlあたり97mgであった。またこのゲルの下記測定法7に従って求めた硫酸化度(硫黄含量)は22200ppmであった。
リゾチーム吸着量の測定
内径7mmのカラムに上記実施例10-1の湿ゲルを1ml充填し0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH9.5)で50ml/hの流量で0.6時間平衡化した。濃度が5.0mg/mlになるようにリゾチーム(和光純薬社製)に0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH9.5)を加え溶解し、この溶液100mlを前記の充填ゲルに50ml/hの流量で通液し、リゾチームを充填ゲルに吸着させた。さらに、充填ゲルを0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH9.5)で50ml/hの流量で50ml洗浄した。これら、リゾチーム溶液と洗浄液の充填ゲル通過液を全量回収し、250mlにメスアップした。充填ゲルにおけるリゾチーム吸着量は吸着前後の280nmの吸光度より計算されたリゾチームの差し引きによって求めた。具体的には、それぞれのリゾチーム溶液を10倍希釈した溶液の、280nmの吸光度は下記の通りであった。
5.0mg/mlリゾチーム溶液の吸光度 A280=1.250
充填ゲルの通過液+洗浄液の吸光度 A280=0.397
リゾチーム吸着量(mg/ml-gel)=
5.0x100-5.0x(0.397/01.250)x250=103
硫酸化度(硫黄含量)の測定
硫黄含量は、「イオンクロマトグラフィー法」(文献名:改訂5版分析化学便覧p30(社団法人 日本分析化学会編)にしたがい、次に記載の方法によって求めた。60℃で16~20時間真空乾燥したサンプルを乳鉢ですりつぶし、更に、105℃にて2時間乾燥した。この乾燥試料0.05gに2Mの塩酸2.5mlを加え、110℃にて16時間加水分解した。氷冷後、上澄液を1ml採取し、2Mの水酸化ナトリウム水溶液で中和し、25mlにメスアップした。カラムに横河電気社製ICS-A-23を用い、オーブン温度40℃、溶離液に3mM Na2CO3溶液、除去液に15mM 硫酸をそれぞれ1ml/minの流量の条件で使用し、横河電機社製IC7000イオンクロマトアナライザーを用いて分析し、さらに後述の標準溶液から作成した検量線を基にSO4濃度を求めた。ブランク値は乾燥試料を加えずに同様に操作し時の値とした。SO4標準液(関東化学社製 陰イオン混合標準液IV)より2μg/ml液を本測定法の標準溶液とし、更に段階希釈し、同様の条件でイオンクロマトアナライザーにて分析し、検量線を作成した。イオン含量は以下の式により求めた。
硫黄含量(ppm)=(X試料-Xブランク)x25x2.5x0.3333/0.05(試料量 g)
上記式中、X試料、XブランクはSO4標準液による検量線から求めた濃度(ppm)である。
Claims (18)
- 多孔性セルロース粒子に、極限粘度0.21~0.90dL/gを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.06~1.40倍であることを特徴とする多孔性セルロース系ゲル。
- 前記多孔性セルロース粒子は、粒子径30~200μmを有し、且つ、重量平均分子量1.5×105Daの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のKavで表されるゲル分配係数0.15~0.6を有するものである、請求項1記載の多孔性セルロース系ゲル。
- 前記多糖類はデキストランである、請求項1又は2記載の多孔性セルロース系ゲル。
- 前記多糖類はプルランである、請求項1又は2記載の多孔性セルロース系ゲル。
- 前記多孔性セルロース粒子は、水膨潤度5~20ml/gを有する架橋セルロース粒子である、請求項1~4のいずれか1項に記載の多孔性セルロース系ゲル。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の多孔性セルロース系ゲルにリガンドが付加してなる、クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記リガンドはスルホン基である、請求項6記載の充填剤。
- 前記リガンドの導入量は、イオン交換容量で0.13~0.30mmol/mlである、請求項7記載の充填剤。
- 前記リガンドは硫酸エステル基である、請求項6記載の充填剤。
- 前記リガンドの導入量は、硫黄含量で5000~60000ppmである、請求項9記載の充填剤。
- 免疫グロブリン精製用である、請求項6~8のいずれか1項に記載の充填剤。
- 免疫グロブリンの吸着量が150~250mg/mlである、請求項11記載の充填剤。
- 免疫グロブリンの吸着量が190~250mg/mlである、請求項12記載の充填剤。
- 多孔性セルロース粒子に、極限粘度0.21~0.90dL/gを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の1.06~1.40倍である多孔性セルロース系ゲルに、リガンドを付加する工程を含む、クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 前記多孔性セルロース粒子は、粒子径30~200μmを有し、且つ、重量平均分子量1.5×105Daの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のKavで表されるゲル分配係数0.15~0.6を有するものである、請求項14記載の方法。
- 前記多糖類がデキストランである、請求項14又は15記載の方法。
- 前記多糖類がプルランである、請求項14又は15記載の方法。
- 請求項6~8及び11~13のいずれか1項に記載の充填剤を用いて免疫グロブリンを分離精製する工程を含む、免疫グロブリン製剤の製造方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011500639A JP5692059B2 (ja) | 2009-02-20 | 2010-02-18 | 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル |
CN201080008275.XA CN102326075B (zh) | 2009-02-20 | 2010-02-18 | 纤维素类凝胶、填充剂及填充剂的制法、免疫球蛋白制剂的制法 |
US13/201,647 US8912117B2 (en) | 2009-02-20 | 2010-02-18 | Cellulose gel for purification of immunoglobulin |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009037651 | 2009-02-20 | ||
JP2009-037651 | 2009-02-20 | ||
JP2009260183 | 2009-11-13 | ||
JP2009-260183 | 2009-11-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2010095673A1 true WO2010095673A1 (ja) | 2010-08-26 |
Family
ID=42633953
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2010/052407 WO2010095673A1 (ja) | 2009-02-20 | 2010-02-18 | 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8912117B2 (ja) |
JP (1) | JP5692059B2 (ja) |
CN (1) | CN102326075B (ja) |
WO (1) | WO2010095673A1 (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012081616A1 (ja) * | 2010-12-14 | 2012-06-21 | Jsr株式会社 | 高分子粒子の製造方法、及び、高分子粒子 |
JP2012126797A (ja) * | 2010-12-14 | 2012-07-05 | Jsr Corp | 多糖複合粒子の製造方法、及び、多糖複合粒子 |
JP2012126796A (ja) * | 2010-12-14 | 2012-07-05 | Jsr Corp | 架橋高分子粒子の製造方法、及び、架橋高分子粒子 |
JP2013010828A (ja) * | 2011-06-28 | 2013-01-17 | Jsr Corp | セルロースゲル |
WO2014038686A1 (ja) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 株式会社カネカ | 吸着体 |
JPWO2014061411A1 (ja) * | 2012-10-18 | 2016-09-05 | Jnc株式会社 | 抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体および抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体の分離方法 |
JP2017029048A (ja) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | 株式会社Adeka | 蒸しケーキ改良材及び蒸しケーキ生地 |
WO2017069254A1 (ja) * | 2015-10-23 | 2017-04-27 | 富士フイルム株式会社 | アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6409528B2 (ja) * | 2014-11-27 | 2018-10-24 | Jnc株式会社 | アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とを有する多孔性セルロース粒子及びそれを含むクロマトグラフィー担体ならびにb型肝炎ウィルスのウィルス様粒子の精製方法 |
US10034957B2 (en) * | 2015-11-06 | 2018-07-31 | Ethicon Llc | Compacted hemostatic cellulosic aggregates |
CN108948385B (zh) * | 2018-06-15 | 2020-09-22 | 艾美科健(中国)生物医药有限公司 | 一种高吸附量强酸琼脂基层析介质的合成方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60500539A (ja) * | 1983-02-14 | 1985-04-18 | キュノ、インコーポレーテッド | 変性多糖支持体 |
JPH01258739A (ja) * | 1988-04-08 | 1989-10-16 | Kanebo Ltd | アフイニテイー担体 |
JPH03277967A (ja) * | 1990-03-27 | 1991-12-09 | Nissei Kagaku Kogyo Kk | アフィニティクロマトグラフィー用吸着体 |
JP2009506340A (ja) * | 2005-08-31 | 2009-02-12 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | クロマトグラフィーマトリックスの製造 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1221307A (en) * | 1982-12-02 | 1987-05-05 | Nobutaka Tani | Adsorbent and process for preparing the same |
JPS61100262A (ja) * | 1984-10-22 | 1986-05-19 | 鐘淵化学工業株式会社 | 保存安定性の改良された体外循環治療用吸着カラム |
NZ213860A (en) | 1984-10-22 | 1988-03-30 | Kanegafuchi Chemical Ind | Sterilisation of absorbent and column having improved storability including sterilised adsorbent for use in extracorporeal circulation treatment |
JPS61100261A (ja) * | 1984-10-22 | 1986-05-19 | 鐘淵化学工業株式会社 | 吸着体の滅菌方法 |
JPH0626568B2 (ja) * | 1986-03-27 | 1994-04-13 | 鐘淵化学工業株式会社 | 保存安定性の改良された体外循環治療用吸着カラム |
US5258503A (en) * | 1987-09-08 | 1993-11-02 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Autoantibody adsorbent and apparatus for removing autoantibodies using the same |
US5108596A (en) | 1988-04-05 | 1992-04-28 | Kanebo Ltd. | Borous ion-exchanged fine cellulose particles, method for production thereof, and affinity carrier |
US5196527A (en) | 1988-04-05 | 1993-03-23 | Kanebo Ltd. | Porous ion-exchanged fine cellulose particles, method for production thereof, and affinity carrier |
WO1991007427A1 (en) | 1989-11-16 | 1991-05-30 | Nissei Chemical Industry Co., Ltd. | Carrier for column chromatography, process for separating and purifying water-soluble polymeric substance using said carrier, novel pectic acid-cellulose gel and process for preparing the same, and adsorbent for affinity chromatography |
JPH0882303A (ja) * | 1994-09-09 | 1996-03-26 | Kobelco Kenki Eng Kk | 作業アタッチメントの作動制限装置 |
JPH105329A (ja) * | 1996-06-21 | 1998-01-13 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 直接血液灌流に用いる吸着体用担体およびその小粒径化法 |
MY144940A (en) | 2005-01-25 | 2011-11-30 | Avantor Performance Mat Inc | Chromatographic media |
JP5250985B2 (ja) * | 2007-03-19 | 2013-07-31 | 東ソー株式会社 | 充填床用新規充填剤及びその用途 |
US8664152B2 (en) * | 2007-08-31 | 2014-03-04 | Jnc Corporation | Porous cellulose gel, method for producing the same and use thereof |
-
2010
- 2010-02-18 WO PCT/JP2010/052407 patent/WO2010095673A1/ja active Application Filing
- 2010-02-18 JP JP2011500639A patent/JP5692059B2/ja active Active
- 2010-02-18 CN CN201080008275.XA patent/CN102326075B/zh active Active
- 2010-02-18 US US13/201,647 patent/US8912117B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60500539A (ja) * | 1983-02-14 | 1985-04-18 | キュノ、インコーポレーテッド | 変性多糖支持体 |
JPH01258739A (ja) * | 1988-04-08 | 1989-10-16 | Kanebo Ltd | アフイニテイー担体 |
JPH03277967A (ja) * | 1990-03-27 | 1991-12-09 | Nissei Kagaku Kogyo Kk | アフィニティクロマトグラフィー用吸着体 |
JP2009506340A (ja) * | 2005-08-31 | 2009-02-12 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | クロマトグラフィーマトリックスの製造 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MELANI C.STONE ET AL.: "Protein adsorption and transport in agarose and dextran-grafted agarose media for ion exchange chromatography", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 1146, no. 2, 6 April 2007 (2007-04-06), pages 202 - 215 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012081616A1 (ja) * | 2010-12-14 | 2012-06-21 | Jsr株式会社 | 高分子粒子の製造方法、及び、高分子粒子 |
JP2012126797A (ja) * | 2010-12-14 | 2012-07-05 | Jsr Corp | 多糖複合粒子の製造方法、及び、多糖複合粒子 |
JP2012126796A (ja) * | 2010-12-14 | 2012-07-05 | Jsr Corp | 架橋高分子粒子の製造方法、及び、架橋高分子粒子 |
US9352298B2 (en) | 2010-12-14 | 2016-05-31 | Jsr Corporation | Method for producing polymer particles, and polymer particles |
JP2013010828A (ja) * | 2011-06-28 | 2013-01-17 | Jsr Corp | セルロースゲル |
WO2014038686A1 (ja) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 株式会社カネカ | 吸着体 |
JPWO2014061411A1 (ja) * | 2012-10-18 | 2016-09-05 | Jnc株式会社 | 抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体および抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体の分離方法 |
JP2017029048A (ja) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | 株式会社Adeka | 蒸しケーキ改良材及び蒸しケーキ生地 |
WO2017069254A1 (ja) * | 2015-10-23 | 2017-04-27 | 富士フイルム株式会社 | アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 |
JPWO2017069254A1 (ja) * | 2015-10-23 | 2018-07-19 | 富士フイルム株式会社 | アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 |
AU2016340518B2 (en) * | 2015-10-23 | 2019-02-28 | Fujifilm Corporation | Affinity chromatography carrier and biological substance purification method |
US10888841B2 (en) | 2015-10-23 | 2021-01-12 | Fujifilm Corporation | Affinity chromatography carrier and method for purifying biological substance |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102326075B (zh) | 2014-07-30 |
JPWO2010095673A1 (ja) | 2012-08-30 |
CN102326075A (zh) | 2012-01-18 |
JP5692059B2 (ja) | 2015-04-01 |
US20110301330A1 (en) | 2011-12-08 |
US8912117B2 (en) | 2014-12-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5692059B2 (ja) | 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル | |
Alpert et al. | Preparation of a porous microparticulatee anion-exchange chromatography support for proteins | |
JP5643747B2 (ja) | クロマトグラフィー媒体 | |
EP1764152B1 (en) | Asymmetric porous adsorptive bead | |
JP6369467B2 (ja) | 多孔性セルロース粒子の製造方法および多孔性セルロース粒子 | |
JP7497891B2 (ja) | 大孔径アガロース | |
JP5058159B2 (ja) | 分離マトリックスの製造方法 | |
AU2008279841B2 (en) | Separation matrix | |
US8092682B2 (en) | Matrix for separation of polyethers and method of separation | |
JP2565490B2 (ja) | 多孔性ポリサツカライドの架橋方法 | |
JP2005531767A (ja) | 表面改質ベースマトリックス | |
EP3512866B1 (en) | The use of a polymeric mesh for the purification of macromolecules | |
JP5891703B2 (ja) | 多孔質架橋粒子および分離剤の製造方法ならびに分離方法 | |
JP2016006410A (ja) | クロマトグラフィー担体およびそれを用いたタンパク質精製方法 | |
JP5716297B2 (ja) | クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法 | |
JP2016536114A (ja) | 硫酸化水和セルロース膜、それを製造する方法、及びウイルス精製のための吸着膜としての該膜の使用 | |
JP2022184990A (ja) | バイオセパレーションのための複合材料 | |
WO2013187512A1 (ja) | アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法 | |
WO2013180176A1 (ja) | エンドトキシン吸着材 | |
WO2020036151A1 (ja) | 分離材、分離材の製造方法及びカラム | |
KR20160063984A (ko) | 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체 및 b형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 | |
JP6064402B2 (ja) | 抗体単量体の分離用分離剤及び分離方法 | |
JP2017196544A (ja) | 分離材及びカラム | |
JPS6361024B2 (ja) | ||
WO2018181925A1 (ja) | ゲルろ過用分離材及び水溶性高分子物質の精製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 201080008275.X Country of ref document: CN |
|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 10743799 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2011500639 Country of ref document: JP |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 13201647 Country of ref document: US |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 10743799 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |