CN101218023A - 制备分离基质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备不溶性分离基质的方法，所述方法包括多糖凝胶的盐处理以及随后的所述多糖聚合物的交联。在一个实施方式中，所述方法包括提供可胶凝的天然多糖的水溶液；降低所述多糖溶液的温度至其胶凝点以下；通过向所得多糖中加入至少一种盐进行盐处理；并使经过所述盐处理的多糖交联。所述多糖可制备为例如微粒、膜或块料。

Description

制备分离基质的方法
技术领域
本发明涉及目标分子诸如生物分子的分离和纯化，更具体为涉及色谱基质及其新型制备方法。本发明还包括所述基质在液相色谱中的应用，以及含有所述基质的色谱柱。
背景技术
在生物技术领域的最新发展要求更快速、更精确的技术以回收、纯化分析生物和生化物质，诸如蛋白。色谱是该领域中常规使用的纯化技术。在色谱中，互不相混的两相进行接触。更具体而言，将所述目标分子引入流动相，所述流动相与固定相相接触。当由所述流动相携带通过系统时，所述目标分子将经历一系列所述固定相和流动相之间的相互作用。所述相互作用利用了所述样品中组分的不同物理性质或化学性质。在液相色谱中，液体样品，可选地与合适的缓冲液一起组成所述流动相，所述流动相与称之为分离基质的固定相接触。通常，所述基质包括载体，配体即能与所述目标相互作用的基团与所述载体相连。
分离基质通常基于由无机材料诸如硅石，或者由有机材料诸如合成或天然的聚合物制成的载体。所述合成聚合物，诸如苯乙烯和二乙烯基苯，通常用于表现出一定疏水性的载体，诸如体积排阻色谱、疏水作用色谱(HIC)和反相色谱(RPC)。此外，所述合成聚合物优势较天然聚合物更为优选，这是由于它们能被制造得更坚固和耐压，使得载体能提供更多的优势性流动性质。
数十年来，所述天然聚合物，通常为多糖诸如琼脂糖，已用作分离基质的载体。由于羟基的存在，所述天然聚合物的表面通常是亲水性的，使之基本上与蛋白质没有非特异性相互作用。所述天然聚合物的另一优势在于其无毒性，这在人用内服药物或诊断分子的纯化中尤其重要。琼脂糖可在升高的温度下溶解在水中，并在冷却至一定温度(所述胶凝点)时形成多孔性凝胶。经加热，所述凝胶将在某一温度(熔点)下再次熔化，所述熔点通常明显比所述胶凝点高。所述胶凝涉及所述多糖聚合物的螺旋-螺旋聚集，而有时称之为物理交联。
如上所述，所述天然聚合物不如合成聚合物坚固和耐压，因此已发展方法对其进行改进。例如，通过改变多糖的浓度，所述载体的多孔性可增加，使得目标物质量运输改善并增加在色谱过程中所述目标物与之作用的面积。另一需要考虑的重要因素是所述载体的流动性质，例如在特定分离基质的填充床中。当使所述流动相流过所述床时，反压主要通过所述微粒间缝隙通道进行调节。在低流速下，所述微粒可被视为不可压缩的，则所述反压随流速线性增加，其斜率取决于粒径。当所述流速增加时，所述微粒在流体静压下变形，所述缝隙通道直径的减小以及反压的快速增加。在一定流速下，取决于所述基质的坚固度，所述床将瓦解而所述反压变为无限大。
最常见的改善琼脂糖的坚固度及其流动性质的方法是其化学交联。所述交联发生在可供反应的羟基之间，并通常可由已知的采用环氧氯丙烷的方法实现。
美国专利第4,973,683号(Lindgren)涉及多孔多糖凝胶的交联，更具体地为改进坚固度的方法并同时使多孔多糖凝胶的非特异性相互作用减至最小。所述方法涉及提供琼脂糖凝胶和标识为”单官能”的试剂，所述试剂含有诸如卤素基团或环氧基团等反应性基团和双键。所述试剂通过其反应性基团与所述凝胶相连；随后所述双键活化为环氧化物或者卤代醇，最终与琼脂糖上的羟基反应形成交联。
美国专利第5,135,650号(Hjerten等)涉及高度压缩的色谱固定相微粒，诸如琼脂糖小珠，据称其对于HPLC而言足够坚固，并且没有小孔使之对溶质而言是难以渗透的。更具体而言，所述Hjerten小珠由多孔琼脂糖小珠制成，将所述多孔琼脂糖小珠与有机溶剂相接触使多孔性崩解，此后在已崩解的小孔内的小珠表面发生交联使所述小孔固定为其崩解状态。作为另外一种选择，通过利用接枝在小孔表面的可聚合物质填充所述小孔并进行接枝聚合从而制备所述小珠。该发明宣称的一个优点为单固定相在高压下有效并能用于低压。然而，由于健康和安全的原因，通常避免使用溶剂尤其是在该发明中用到的溶剂。
美国专利第6,602,990号(Berg)涉及制造多孔交联多糖凝胶的方法，其中将双官能交联剂加入到多糖溶液中并使其通过其反应性位点与所述多糖的羟基相连。然而由所述溶液形成多糖凝胶，此后激活所述交联试剂的非活性位点并进行所述凝胶的交联。因此，所述交联剂加入到所述多糖溶液中，这与以上讨论的方法中将其加入多糖凝胶是不同的。所述双官能交联剂包括一个活性位点，即能与多糖的羟基发生反应的位点，诸如卤素和环氧化物，和一个非活性位点，即在所述活性基团进行反应的条件下不发生反应的基团，诸如烯丙基。该发明的双官能交联剂对应于根据上述美国专利第4,973,683号(Lindgren)使用的”单官能试剂”。由所得凝胶构成的微粒已显示出改善的经受高流速和高反压的能力。所述美国专利第6,602,990号的缺点在于需要溴用于所述交联剂的活化。
美国专利第5,998,606号(Grandics)涉及合成色谱基质的方法，其中基质的交联和官能化同时进行。更具体而言，在聚合糖类基质表面上提供的双键在金属催化剂的存在下被活化使所述基质交联并用卤代醇、羧基或磺酸酯等基团使其官能化。通过与活化剂接触在所述基质表面具有所述双键，所述活化剂含有卤素原子或环氧化物和双键。因此，所述美国专利第5,998,606号的活化剂对应于美国专利第4,973,683号的单官能试剂和美国专利第6,602,990号的双官能交联剂。
Qi等(Journal of Functional Polymers，Vol.13，March 2000：“Preparation of Two Types of Immobilized Metal-Chelated ComplexAffinity Membrane Chromatography Media”)描述了如何使用纤维素滤纸作为基质，经过碱处理，环氧化活化，与亚氨基二乙酸二钠偶联并固定Cu2+从而制造巨孔纤维素亲合膜。此外，琼脂糖共价交联到具有类似三明治结构的活化后的膜上。
美国专利申请第2005/0220982号(Moya等)涉及通过以下步骤形成多糖结构诸如小珠、凝胶膜和多孔底物上的多孔涂层等的方法，即形成多糖、一种或多种凝胶抑制剂和溶剂诸如水的室温胶凝抑制溶液，加热所述混合物直至溶液成分溶解，冷却为溶液的所述混合物至大约室温，形成具有所述溶液的三维结构并将所述结构添加至胶凝剂形成多糖凝胶。所述凝胶抑制剂基于例如锌、锂或钠盐。所述多糖涂层据称足够厚使之能在所述多糖层内部发生扩散流。该发明声称的优点是利用通常在高于室温下胶凝的多糖聚合物，通过所述聚合物的受控胶凝在室温下形成所述结构。还声称，在基本上多糖未阻塞小孔的情况下形成了所述表面涂层。然而，所述在室温下的操作要求非常小心的对琼脂糖溶液的操控，这使得整个方法相对耗时。
因此，尽管有可供使用的技术以制备交联多糖分离基质，不同的未来应用也将对所述基质有不同的要求，因此目前仍需求可替代的方法。
发明内容
本发明的一个方面是提供制备多糖分离基质的方法，所述基质表现出适用于大规模处理的流动性质。这可通过制备如所附权利要求所限定的分离基质而实现。
本发明的具体方面是提供制备微粒多糖分离基质的方法，所述方法能进行伴随较小聚结风险的交联。这可通过制备如所附权利要求所限定的分离基质而实现，能在高于传统使用的温度下进行交联。
本发明的具体方面是提供能制备具有改善的坚固度的多孔分离基质而不使孔结构瓦解的方法。这可通过所附权利要求所限定的制备分离基质的方法而实现，所述分离基质的孔径可允许目标分子进入所述小孔。该方面对于在提高的流速下纯化和/或分离相对较小的目标分子诸如蛋白质是有利的。
本发明的其他方面和优点将在以下的详细描述中披露。
定义
术语”微粒”分离基质在此文中指由微粒，例如基本为球形的微粒或较不规则形状的微粒构成的分离基质。”胶凝点”，有时候在此文中称为”胶凝温度”，是指在该温度下溶液聚合物相互物理作用形成固体凝胶。术语”可胶凝的”在此文中指能够形成物理凝胶。术语”天然”多糖指处于未经修饰状态的多糖，即未被取代或者未进行衍生化的多糖。术语分离“基质”在此文中指由多孔或非多孔固体载体构成的材料，配体连接在所述材料上。在色谱领域，所述分离基质有时候指树脂或者介质。术语“配体”在此文中依照其常规含义使用，即能与目标分子相互作用的化学实体，诸如在离子交换法中能与具有相反电荷的目标分子相互作用的带有电荷的基团。Kav是凝胶过滤(体积排阻色谱)参数，定义为(Ve-V0)/(Vt-V0)，其中Ve是测试分子峰的洗脱体积，V0是柱子的空体积，而Vt是总床体积。Kav是所述微粒测试分子能接触的固定相体积分数的衡量尺度。
KavDX是葡聚糖分子的KAV。在实施例中，分别使用分子量为110kD、500kD和1000kD的葡聚糖。
具体实施方式
本发明涉及通过多糖凝胶的盐处理以及随后的所述多糖聚合物的交联制备不溶性分离基质诸如微粒、块料或膜的方法。所述方法可包括先行步骤优选为通过降低所述多糖凝胶溶液的温度由所述溶液提供多糖凝胶。所述凝胶可提供作为膜载体的涂层；作为多糖微粒；或者作为由不同材料制成的微粒上的涂层。所述凝胶有利地为多孔的。
因此，在第一方面，本发明涉及制备分离基质的方法，所述方便包括以下步骤：
(a)提供由已胶凝的天然多糖构成的微粒水悬浮液；
(b)通过加入至少一种盐对所述悬浮微粒进行盐处理；
(c)使经过所述盐处理的微粒交联。
所述多糖可以是任何能形成凝胶的多糖，优选为通过温度的改变，并可选自由琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、壳聚糖、魔芋、胶凝多糖、角叉菜胶、胶质、胶凝糖和海藻酸盐组成的组。本领域技术人员能理解，这些胶凝的多糖微粒有利地由一种多糖构成，但本发明也包括由两种或两种以上的多糖的混合物构成的微粒。在本方法的优选实施方式中，所述多糖是琼脂糖。在具体方法中，微粒核心或载体如上所述被多糖覆盖。所述载体正如在以下膜载体章节中所讨论的。
如上所披露，根据本发明，在步骤(a)中提供的多糖微粒由天然多糖构成，即其聚合物未经过任何修饰或取代诸如衍生化或交联的多糖。因此，本发明将盐添加至未经改变的多糖。
在优选实施方式中，所述多糖微粒基本上是球形微粒(小珠)。在色谱领域，粒径通常给出为由累计体积分布的中值粒径。在本发明中，所述小珠的平均尺寸为其直径为10μm～300μm，优选为30μm～200μm，或者更优选为45μm～165μm，诸如大约45μm。
本领域技术人员按照标准方法诸如反悬浮胶凝(S Hjerten：Biochim Bio-phys Acta 79(2)，393-398(1964)可轻易制得所述多糖小珠。例如，当制备琼脂糖时，在高于其熔点的温度下，通过在水性溶剂诸如水或者其他通常使用的溶剂中溶解和分散琼脂糖得到琼脂糖液滴。所述溶解的琼脂糖在通常使用的有机溶剂诸如甲苯和庚烷中经搅拌而乳化，随后温度降至所述琼脂糖胶凝点以下，合宜为降至室温。在本方法中，如此制造的小珠可有利地用例如乙醇或水清洗除去任何痕量的溶剂，并在水或适宜的水性溶液中悬浮。因此，在优选实施方式中，所述微粒在交联步骤前进行清洗。
正如本领域技术人员所理解，除乳化之外还有其他制备多糖微粒的水性悬浮液的方法。因此，在替代性的实施方式中，可如下获得多糖微粒，即，将由水性介质中的可热胶凝多糖构成组合物喷雾在周围空气中，并使雾化的组合物在空气中胶凝，正如在美国专利第6,248,268号(FMCCorporation)中所披露的，将其以引用的方式在此引入。
在替代性的实施方式中，所述多糖微粒是不规则形状，诸如例如简单地通过制备大块的多糖并将其粉碎为合适的平均粒径而得到。在其他替代性的实施方式中，所述多糖微粒拉长为诸如卵形或纤维状微粒。
在本方法的步骤(b)中添加的盐可以是任何能在选定的温度和盐浓度下提供所需要的坚固度的盐，但其优选为由两种均经评定位于Hofmeister序列的较高端的离子构成。
在一个实施方式中，在步骤(b)中添加的盐的阴离子是硫酸根或磷酸根，优选为硫酸根。在另一实施方式中，所述盐的阳离子选自由Mg；Li；Na；K和NH4组成的组。在优选实施方式中，所述盐的阳离子选自由Mg和Na组成的组。因此，在步骤(b)中添加的盐可以是例如MgSO4或Na2SO4。在优选实施方式中，所述盐是MgSO4。
在步骤(b)中添加的盐可以以水溶液或者固体形式加入。在一个实施方式中，在步骤(b)中添加的盐足以提供在悬浮液中0.5 M～1.3 M的最终浓度。在具体实施方式中，所述在悬浮液中的盐浓度低于1.0M，诸如0.5M～1.0M，并优选为0.5M～0.8M或者0.8M～1.0M。在替代性的实施方式中，所述在悬浮液中的盐浓度在1.0M以上，诸如为1.0M～1.3M，并优选为1.0M～1.2M，例如约1.1M或者1.2M～1.3M。
经本发明人观察，所述盐已加入其中的悬浮液保持在升高的温度下足够长的时间以使所述多糖的性质朝改善流动性质和改善坚固度的方向变化，优选为经过搅拌。盐处理的持续时间可简便地由本领域技术人员确定，并例如为持续至多1个小时，诸如2 0分钟～40分钟，并有利地为约30分钟。因此，所述盐处理时的温度可保持在94℃-98℃之间的任意点，并根据所希望的基质性质进行适应。在一个实施方式中，所述温度为94℃-96℃，诸如94℃～95℃或95℃～96℃，诸如约94℃，约95℃或约96℃。在另一实施方式中，所述温度为96℃～98℃，诸如96℃～97℃，或者97℃～98℃，诸如约97℃或约98℃。
在优选实施方式中，本方法包括在约96℃下进行盐处理，优选为通过添加硫酸盐，诸如Na2SO4或MgSO4。在更优选实施方式中，所述方法包括在所述悬浮液中加入Na2SO4或MgSO4至1.0M以上浓度的盐处理，所述处理在约96℃～97℃下进行。
如上所披露，所述多糖微粒在加入盐之后的步骤中进行交联。在优选实施方式中，在步骤(c)中，所述交联步骤包括添加交联剂。所述交联剂可以是任何合适的已知能聚合多糖的单体或双官能试剂，诸如环氧氯丙烷、二乙烯基砜、二环氧化物、二异氰酸盐等。多糖的交联剂在本领域内已知，参见例如上述讨论的美国专利第4,973,683号和第6,602,990号。本方法的一个优点是其允许在高于通常使用的技术的温度下通过交联制造高坚固度的多糖微粒，这随之降低甚至消除了聚结。不希望局限于任何具体理论，可设想该特征与交联前添加盐相关。
在一个实施方式中，本方法包括后续步骤将色谱配体与所述已交联的多糖基质的羟基相连。将色谱配体连结至不溶性基质，也已知为官能化或有时为衍生化能如下实现，即，可通过连接带有电荷或者可具有电荷的基团以制备离子交换基质；可通过连接表现出生物亲和性的基团以制备亲合基质；通过连接螯合基团以制造固定金属亲合色谱(IMAC)基质；或通过连接疏水基团制造疏水作用色谱(HIC)基质。作为另外一种选择，将称为多重型的基团，即含有超过一个基团诸如离子交换基团和疏水基团的基团，与根据本发明制备的基质相连。在具体实施方式中，所述官能性基团是选自由季铵(Q)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基氨基丁基、磺基丙基(SP)和羧甲基(CM)组成的组的离子交换配体。将官能团连结至不溶性载体诸如分离基质的方法对于本领域技术人员是广泛已知的，并可包括先行步骤进行所述取代基的烯丙基化以及使用标准试剂和条件(参见例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson etal，Greg T.Her-manson，A.Krishna Mallia and Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992.)。在具体实施方式中，在官能化之前，所述交联分离基质可具有延伸剂，也称为灵活臂、触角或绒毛。广泛已知的延伸剂是葡聚糖；参见例如美国专利第6,537,793号，其中详细描述了将延伸剂加入到多糖基质中。
本发明还包括根据本发明进行处理的交联分离基质的灭菌。在另一实施方式中，所述方法涉及用分离基质填充或者简单地装入容器中，并随后对所述容器及其内容物进行灭菌。因此，本发明的具体实施方式包括在所述灭菌前将所述交联分离基质装入色谱柱。可通过加热和/或蒸气处理进行所述灭菌，诸如高压灭菌；辐射；微波；高压；化学试剂；或者任何其他已知的灭菌方法。
本发明的另一方面是如上述进行制备的交联分离基质。在优选实施方式中，本发明的多糖分离基质由基本为球形的多孔微粒构成。在一个实施方式中，所述微粒表现出约0.4，优选为＞0.5的10kDa的葡聚糖的Kav值。在优选实施方式中，所述微粒具有色谱配体。在该实施方式中，所述小孔具有足够的大小使将被分离的目标分子进入，因此改善所述微粒的结合能力。此外，以上描述的分离方法提供了用于大规模处理的充分坚固的基质。该实施方式可用于在以下有关应用方面的章节中例举的任何一种目标分子，但特别有利于相对较小的目标分子，诸如蛋白质。
尽管在上文中讨论微粒形式的分离基质，但正如本领域技术人员所理解，本发明也同样可用于制备其他形式的分离基质。因此，本发明的分离基质可制备为任何其他通常使用的形状，诸如块料；过滤器或膜；芯片；表层；毛细管；纤维等。
在优选实施方式中，制备分离基质的本方法包括制备分离基质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供可胶凝的天然多糖的水溶液；
(ii)降低所述多糖溶液的温度至其胶凝点以下；
(iii)通过向由(ii)所得的多糖中加入至少一种盐进行盐处理；以及
(iv)使所述盐处理的多糖交联。
在一个实施方式中，所述多糖是天然多糖，即其聚合物未经过任何修饰或取代诸如衍生化或交联的多糖。在优选实施方式中，在溶液中添加所述盐至0.5M～1.3M的浓度。在以上所述第一方面的内容中任何一条细节，诸如多糖、盐的性质、温度和盐浓度等可适用于上述制备其他形式的分离基质的方法。
如上所披露，所述多糖可制备为微粒。在一个实施方式中，所述分离基质是膜或过滤器。除上述导致形成本发明的坚固基质的细节之外，所述膜的制备是广泛已知的并可由本领域技术人员轻易地进行。
在替代性的实施方式中，所述分离基质是块料。在该实施方式中，可有利地加入成孔剂以确保所希望的块料产品的多孔性。合适的成孔剂在本领域内已知，例如可以是聚乙二醇。其他关于块料制造的细节在本领域内已知。
本发明的另一方面是含有如上所述的分离基质的色谱柱。所述柱可由任何传统材料制得，诸如生物相容的塑料例如聚丙烯、玻璃或不锈钢。所述柱可以为适用于实验室规模或大规模纯化的尺寸。在具体实施方式中，本发明的柱子配置有螺旋适配器(luer adapter)、管接头和圆顶螺母。
在优选实施方式中，上述步骤(i)也包括提供多孔膜载体并使所述载体与多糖溶液接触。可例如通过将所述膜载体浸入到多糖的热溶液中进行接触，在该情况下优选在冷却步骤(ii)之前将浸透多糖的膜从溶液中取出。所述膜载体可以由任何与所述多糖溶液相容的材料制成，并因此有利地为基本亲水性的。因此，在一个实施方式中，所述膜载体由亲水性聚合物制成，诸如选自由琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、壳聚糖、魔芋、胶凝多糖、角叉菜胶、胶质、胶凝糖、海藻酸盐以及两种或两种以上所述聚合物的混合物组成的组。在本方法的优选实施方式中，所述膜载体由纤维素制成。在最优选实施方式中，所述纤维素膜与琼脂糖溶液相接触得到混合纤维素-琼脂糖膜。在替代性实施方式中，所述膜载体由合成聚合物或陶瓷材料制成，所述合成聚合物或陶瓷材料已经过处理表现出基本亲水的表面，例如通过所述表面的化学改性。因此，在一个实施方式中，所述膜载体表现出亲水表面。
在本方法中使用的膜载体可以是商业销售的膜。作为另外一种选择，可根据本领域内已知的方法进行制备。所述膜载体的平均孔径取决于其预计用途，并可为0.1μm～10μm范围内的任意值，诸如0.2μm～5μm。在具体实施方式中，所述膜提供为盒。在另一实施方式中，所述膜是叠层膜。在具体实施方式中，本发明的膜提供在辊上。如本领域技术人员所理解，所述膜载体的尺寸和形状也取决于其用途。
所述步骤(iii)的盐处理可有利地如下进行，即将所述膜载体浸入到温水盐溶液中一段合适的时间以获得所希望的最终产品的流动性质。在一个实施方式中，盐处理的持续时间为0.5～4小时，诸如1～3小时，例如1小时或2小时。本领域技术人员可利用简单的测试找出对给定的膜载体-多糖组合而言最适合的时间。如以下实施例部分所示，本发明出人意料地显示出通过根据本发明用盐处理覆盖有多糖的膜，所述膜载体在涂布步骤之后实际减小的多孔性能能再生。
随后，所述经盐处理的膜的多糖涂层按照本领域内任何已知的方法进行交联。在一个实施方式中，用于制备膜的方法包括后续步骤将色谱配体连接到所述多糖涂层的羟基上。通过连接配体进行的官能化可如上所述进行。在具体实施方式中，所述交联和官能化基本同时进行。
在另一方面，本发明涉及通过提供多孔膜载体并使所述载体与可胶凝多糖的水溶液接触从而制备膜的方法；其中表现出改进流动性质的多糖涂层由在美国专利第US 6,602,990号(Berg)或SE 0402322-2(Berg等)中描述的方法制得。所述两种方法包括在所述多糖胶凝前通过诸如烯丙基化或者其他所述多糖聚合物的衍生化对其进行改性，这将提高在交联后获得的涂层的坚固性。所述膜载体可以例如是纤维素或者任何其他亲水材料；而所述涂层多糖有利地是琼脂糖。
在优选实施方式中，本方法包括如此获得的交联分离基质的灭菌步骤。可如以上讨论进行灭菌。在具体实施方式中，本发明的膜可制造为一次性使用，也称之为使用后即丢弃的产品。一次性使用在例如所述膜用于吸附污染物，诸如因完全或健康的原因受限进行处理的污染物的情况下是有利的。一次性使用在纯度极其重要，诸如在制药业中的情况下也是有利的。一次性使用产品的另一优点是避免了确认清洁的需要。
在替代性的实施方式中，所述分离基质是块料。在该实施方式中，可有利地加入成孔剂以确保所希望的所述产品的多孔性。合适的成孔剂在本领域内已知，例如为聚乙二醇。其他关于块料制造的细节在本领域内已知。最后，本发明涉及如上述进行制备的分离基质应用于实际上任何种类的目标分子。因此，在本应用的一个实施方式中，生物分子或有机分子从液体中分离、纯化和/或去除。因此，如上所述，该方面是液相色谱方法，并包括将目标分子吸附在所述基质上，以及可选的后续步骤对所述目标进行选择性的脱附，通常称为梯度洗脱。如果需要，在吸附和洗脱之间有一步或多步清洗步骤。作为另外一种选择，本应用用于阻滞目标分子，在此情况下，与其他成分相比，所述目标物在柱子上有选择性地受到阻滞。在该情况下，不再需要洗脱步骤。
在一个实施方式中，所述柱子包含基本为球形的多孔微粒。所述色谱柱可用本发明的分离基质进行致密填充以用于HPLC。作为另外一种选择，本发明的分离基质仅仅填充在所述柱中以在流体床模式中使用，也称为膨胀床吸附(EBA)。在另外一种替代性选择中，本发明的分离基质是在所述柱中聚合的块料。在本发明的优选实施方式中，包含本发明的分离基质的柱子已经过灭菌供一次性使用。如此的一次性使用或者用后即可丢弃的柱子在制药业中尤其有利，有时当无菌性是关键因素，在诊断领域也是有利的。
本发明还包括试剂盒，所述试剂盒包括在分开的隔间中的含有如上所述的分离基质的色谱柱；至少一种缓冲液；以及与目标分子纯化相关的书面说明书。
最后，本发明涉及如上所述制得的分离基质应用于任何种类的目标分子。因此，在本应用的一个实施方式中，生物分子或有机分子从液体中分离、纯化和/或去除。因此，如上所述，该方面是液相色谱方法，并包括将目标分子吸附在所述基质上，以及可选的后续步骤对所述目标进行选择性的脱附，通常称为梯度洗脱。如果需要，在吸附和洗脱之间有一步或多步清洗步骤。作为另外一种选择，本应用用于阻滞目标分子，在此情况下，与其他成分相比，所述目标物在柱子上有选择性地受到阻滞。在该情况下，不再需要洗脱步骤。
在本应用的一个实施方式中，至少为约300cm/h，诸如至少为400，优选为至少500，以及更优选为至少700cm/h的液流施加在由基本上为球形的微粒构成的基质上，其表现出对分子量为110kD的葡聚糖而言至少约0.4的Kav。
如上所披露，所述目标分子可以是任何生物分子，诸如肽、蛋白质诸如受体和单克隆或多克隆抗体、核酸诸如DNA、RNA和寡聚核苷酸诸如质粒、病毒和原核或真核细胞；或者有机分子诸如候选药物等。在一个实施方式中，所述候选药物可用在个人化药物中。根据本发明制备的分离基质也可用于分离在食物饮料业中有用的目标分子，诸如将污染目标分子与功能性食物和/或饮料纯化分离。来自食物行业的已知目标分子是乳清产品，诸如各种乳蛋白。
本发明的最后一个方面是根据本发明制备的分离基质应用作为载体用于培养基中粘附细胞的生长。这些细胞例如是胚胎或成人干细胞。所述基质的另一应用是用于固定酶以制造生物催化剂。
实验部分
本实施例仅提供为描述性目的，而并非如同所附权利要求对本发明进行限制。以下以及在本说明书的其他地方给出的所有参考在此以引用的方式引入。
材料和方法
微粒性质
用于原型Kd评价的葡聚糖
粗葡聚糖     5mg/ml
M＝196300    10mg/ml
M＝123600    10mg/ml
M＝66700     10mg/ml
M＝43500     10mg/ml
M＝4440      10mg/ml
M＝1080      10mg/ml
除在0.25M NaCl中稀释的粗葡聚糖以外，所有葡聚糖用0.2M NaCl溶液稀释。
效率测试
通过注入1％丙酮溶液利用AKTATMexplorer(ID 494)(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)进行效率测试。该测试给出所述柱子填充质量的评价值。经核准的不对称为0.75～1.25，而塔板数＞1000Nm。
选择性
利用装配有A-900自动进样器的AKTATMexplorer(ID 494)进行Kd评估。岛津RI-检测器(RID-10A)与所述AKTATM系统相连以检测葡聚糖样品。采用以下条件：
流速：0.2ml/min
流动相：0.2M NaCl
注射环：100μl
评估
按照本领域内已知的方法对葡聚糖峰进行评估。然后如下计算Kd值作为可利用的孔表面积的度量标准：
Kd＝(Ve-V0)/(Vc-V0-凝胶基质)＝(Ve-V0)/(Vt-V0)
Ve＝洗脱葡聚糖的保留体积(ml)
V0＝空体积(粗葡聚糖保留)(ml)
Vc＝柱体积计算值(床高度(cm)×柱表面积(cm2))(ml)
Vt＝液体总体积(NaCl保留体积)(ml)
实施例1：多糖微粒的一般合成
盐处理：大约1.5g非交联SepharoseTM HP(Amersham Bio-sciences，Uppsala，Sweden)用10倍床体积的去离子清洗以提供7 5％凝胶微粒的水悬浮液。如下对每种原型指明的盐加入到所述悬浮液中。在利用冰浴降温至30℃之前，伴随搅拌使反应混合物在以下对每种原型指定的温度下加热30分钟。在烧结玻璃漏斗上用10倍床体积的水洗涤所述凝胶以除去悬浮液中的盐。
交联：环氧氯丙烷作为交联剂根据Porath(Gel product forseparation，1982，EP 81850244)，采用4倍量的环氧氯丙烷和NaOH进行交联。
官能化：为提供离子交换剂，根据已知方法将季铵基(Q基团)与交联微粒相连。在连接后用0.1M AgNO3对CI-进行滴定以测量官能性Q基团的量。
柱填充：利用去离子水作为填充液体将如上制备的微粒填充在HR 5/20柱(GE Heal thcare，Uppsala，Sweden)中。所述柱子首先在306cm/h的流速下进行填充约15分钟，然后在764cm/h的流速下进行填充约15分钟。通过在以76cm/h的流速下注入25μl的0.4％丙酮后测量峰不对称性对所述柱填充进行测试。在本研究中，具有0.8～1.8的峰不对称的柱子被认为是可以接受的。
实施例2～4：微粒原型
从商业销售的Sepharose基质开始，如上所述用不同的盐、处理次数和持续时间制备原型。结果报告在以下表中。
实施例5～6：比较微粒样品
实施两个比较例，测试在以上实施例2～4中用作原料但未进行所述盐处理步骤的两份SepharoseTM基质。
结果
表1：流速
原型  基础基质   盐处理M(mol/升微粒悬浮液)   最高温度(℃)     粒径(Mal-vern.d50v)(μm)     流速(最大)(ml/min)
实施例2U1262069  SepharoseTM4B   0.35M MgSO4+0.5M Na2SO4   96.8     58     34.5
实施例3U1262073  SepharoseTM6B   1.3M Na2SO4   96.7     76     32.5
实施例4U1262074  SepharoseTM6B   0.5M MgSO4+0.5M Na2SO4   96.9     55     85
U1262066比较例5  SepharoseTM4B   -   -     83     6
U1262067比较例6  SepharoseTM6B   -   -     89     10
表2：效率测试
原型     不对称性     塔板数(Nm)
实施例2，U1262069     1.00     1609
实施例3，U1262073     0.77     2520
实施例4，U1262074     1.26     1489
比较例5，U1262066     0.75     2281
比较例6，U1262067     0.49**     886**
*对于本目的可接受的不对称性
**即使在重复此填充4次以后，仍未能满足在此测试中设定的标准。
表3可利用的孔表面积
原型  基础基质     流速(最大)(ml/min)     粒径(Malvern，d50v)110000)
实施例2U1262069  SepharoseTM4B 34.5 0.67
实施例3U1262073  SepharoseTM6B 32.5 0.59
实施例4U1262074  SepharoseTM6B 85 0.10
U1262066比较例5  SepharoseTM4B 6 0.65
U1262067比较例6  SepharoseTM6B 10 0.46
实施例7～10：膜的盐处理
实施例7：膜在琼脂糖溶液中的浸渍-膜A
通过在95℃下，将0.3g琼脂糖溶解在30mL中3h00制得1％琼脂糖溶液。随后在95℃下，将再生纤维素膜(Sartorius，0.45um，产品号3S18406-047N)浸入所述琼脂糖溶液1h00。然后从所述琼脂糖溶液中取出所述膜并冷却至室温，使得琼脂糖在所述膜结构内胶凝。
实施例8：膜在盐溶液中的处理-膜B
在96℃下，将按照实施例7所描述进行制备的混合膜浸入硫酸铵((NH4)2SO4)(1M溶液)(50mL)达1h00，然后从所述溶液中取出并冷却。所述膜用水充分地冲洗。
实施例9：膜流动性质的测量
将如上所述制备和处理的一片膜放入15mm直径的过滤漏斗中并施加0.7bar的真空。将50mL的水倒入所述漏斗并开始秒表计时。记录所有水通过所述膜的时间。进行三次重复分析试验。
计算以每平方厘米和分钟下的毫升数计的流速。
实施例10：膜流量结果
膜 琼脂糖溶液(％)   盐处理     流速(ml/min/cm2)
对照 - - 21.8
膜A     1   否     2.1
膜B     1   是     18.7

Claims (31)

1.一种制备不溶性分离基质的方法，所述方法包括多糖凝胶的盐处理以及随后的所述多糖聚合物的交联。
2.一种制备分离基质的方法，所述方法包括：
(a)提供由已胶凝的天然多糖构成的微粒水悬浮液；
(b)通过加入至少一种盐对所述悬浮微粒进行盐处理；
(c)使经过所述盐处理的微粒交联。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多糖是琼脂糖。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述悬浮液中添加所述盐至0.5M～1.3M的盐浓度。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(b)加入的盐的阴离子是硫酸根。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述盐的阳离子选自由Mg；Na；K；Li和Cu组成的组。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述盐的阳离子选自由Mg和Na组成的组。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述盐是MgSO4。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行盐处理时的温度为94℃～98℃。
10.如权利要求9所述的方法，其中进行盐处理时的温度为96℃。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)的多糖微粒在有机溶剂中通过乳化进行制备。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微粒在乳化后进行清洗。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，所述交联步骤包括加入交联剂。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括后续步骤将色谱配体连接到所述已胶凝的多糖的羟基上。
15.如前述权利要求中任一项所限定进行制备的交联多糖分离基质。
16.如权利要求15所述的基质，其中所能提供的孔隙容积对应于相对10kD的葡聚糖而言为至少0.5的Kav值。
17.一种色谱柱，所述色谱柱包括权利要求15～16中任一项所限定的分离基质。
18.一种制备分离基质的方法，所述方法包括
(i)提供可胶凝的天然多糖的水溶液；
(ii)降低所述多糖溶液的温度至其胶凝点以下；
(iii)通过向由(ii)所得的多糖中加入至少一种盐进行盐处理；以及
(iv)使经过所述盐处理的多糖交联。
19.如权利要求18所述的方法，其中添加所述盐至0.5M～1.3M的盐浓度。
20.如权利要求18～19中任一项所限定进行制备的交联多糖分离基质。
21.如权利要求19所述的基质，所述基质是膜或块料。
22.一种制备分离基质的方法，所述方法包括
(i)提供多孔膜载体并使所述载体与可胶凝的多糖的水溶液接触；
(ii)降低所述多糖溶液的温度至其胶凝点以下；
(iii)通过向由(ii)所得的多糖中加入至少一种盐进行盐处理；以及
(iv)使所述盐处理的多糖交联。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述膜载体表现为亲水表面。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述膜载体由纤维素制得。
25.如权利要求22～24中任一项所述的方法，其中所述多糖是天然多糖。
26.如权利要求22～25中任一项所述的方法，其中在所述溶液中添加所述盐至0.5M～1.3M的盐浓度。
27.如权利要求22～26中任一项所述的方法，其中在进行盐处理时的温度为94℃～98℃。
28.如权利要求22～27中任一项所述的方法，其包括后续步骤将色谱配体连接到所述已胶凝的多糖涂层的羟基上。
29.如权利要求22～28中任一项所述的方法，其包括对如此获得的交联分离基质进行灭菌的步骤。
30.如前述权利要求中任一项所限定的分离基质在从液体中纯化、分离和/或移除生物分子或者有机分子中的应用。
31.如权利要求30所述的应用，其中施加在所述分离基质上的流动相的流速至少为约300cm/h。
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