CZ20012428A3

CZ20012428A3 - Způsob separace virových částic

Info

Publication number: CZ20012428A3
Application number: CZ20012428A
Authority: CZ
Inventors: Francis Blanche; Anne Barbot; Béatrice Cameron
Original assignee: Aventis Pharma S. A.
Priority date: 1998-12-31
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2001-11-14
Also published as: US20020037565A1; CN1195057C; CN1332796A; KR20020044106A; PL349074A1; US6537793B2; AU779267B2; BR9916654A; IL143381A; EP1141249A1; NO20013271L; HUP0104794A3; WO2000040702A1; NZ512504A; HUP0104794A2; NO20013271D0; KR100762033B1; US20030170710A1; IL143381A0; AU3049300A

Description

Způsob separace virových částic

Oblast techniky.

Vynález se týká nového způsobu čištěni a kvantifikace virových částic. Konkrétněji se vynález týká způsobu čištěni a kvantifikace adenovirů pomoci iontově-výměnné chromatografie. Vynález také popisuje způsob identifikace různých adenovirových serotypů.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie v současné době prodělává značný rozvoj a od prvních pokusů, provedených v roce 1990, jsou rozpracovány různé klinické studie. Ukázalo se, že mezi metodami běžně používanými pro transfer genů, jsou obzvláště slibnými virovými vektory, přičemž mezi nimi zaujímají klíčovou pozici adenoviry. Rozvoj adenovirových vektorů v genové terapii vyžaduje přístup ke dvěma typům technologií, které jsou v současné době limitující pro přípravu většího množství virových zásob: za prvé bychom měli mít metodu, která je rychlá, vysoce sensitivní a je velmi selektivní pro kvantifikaci virových částic ve vzorku, získaném při konstrukci a amplifikaci zmíněných virů; tento bod je obzvláště důležitý pro optimalizaci metody výroby virových zásob; za druhé potřebujeme způsob čištění, který by byl spolehlivý, reprodukovatelný, jednoduchý a který by mohl být snadno extrapolován do průmyslového měřítka pro přípravu a čištění různých virových částic.

Výroba klinických dávek adenovirů zůstává zdlouhavou procedurou, protože se skládá z mnoha kroků transfekce a amplifikace, jejichž produktivita není optimalizována.

Rekombinantní adenoviry se obvykle vyrábí zavedením virové DNA do enkapsidační linie, načež se buňky po dvou až třech dnech kultivace podrobí mechanické a chemické lýze (kinetika adenovirového cyklu je mezi 24 až 36 hod) . Podle další varianty se v kultivaci pokračuje delší dobu (8 až 12 dní) a viry se sklízí přímo v kapalině po jejich spontánním uvolnění pomocí autolýzy enkapsidačních buněk (WO 98/00524).

Obecně je třeba 2 až 7 amplifikačních cyklů pro výrobu virové zásoby. Hlavní omezení při optimalizaci způsobu výroby virových zásob spočívá ve způsobu titrace virových částic. Skutečně, biologické metody jsou metodami relativně citlivými a přesnými, ovšem jsou obzvláště časově dlouhé při provádění (asi 4 až 15 dní v závislosti na použitém stanovení, tj . transgenová aktivita (tdu) nebo produkce plaku (pfu)). Byly vyvinuty rychlejší analytické metody, ty ovšem nemají dostatečný stupeň přesnosti a citlivosti při provádění titrace virových částic bez dalšího čištění, v lyzátu, surových extraktech nebo kultivačních kapalinách. Proto se následující amplifikační cykly provádějí s multiplicitními infekcemi (MOI), které se zhruba odhadují. Výsledkem je, že aplifikační kroky nejsou příliš reprodukovatelné nebo že jsou někdy dokonce delší a/nebo je jich více, než by bylo nezbytné pro optimalizaci metody. Rychlé a přesné stanovení titrů adenovirových roztoků by tedy umožnilo nastavit multiplicitu infekce pro každý krok tak, aby byla optimalizována celá metoda výroby adenovirových zásob.

Způsob kvantifikace virových částic by měl splňovat několik podmínek. Na prvním místě by měl být dostatečně citlivý, aby dovoloval stanovení virových částic v přípravcích, které jsou ředěné nebo které mají nízký titr (typicky méně než 1 x 10⁶ virových částic v 1 ml (vp/ml) ) , bez toho aby bylo nutné provádět obohacovací kroky. Mělo by • 9 být možné provádět stanovení virových částic přímo v lyzátu nebo v surových preparátech bez potřeby provádět čistící kroky před samotným stanovením. Kromě, toho, tento způsob by měl dovolovat vysokou selektivitu, aby eliminoval možnou interferenci s četnými sloučeninami přítomnými v surovém buněčném lyzátu nebo v extraktech a jejichž poměr se může lišit v závislosti na podmínkách kultivace.

Kvantitativní analytická metoda založená na iontověvýměnné chromatografii již byla v literatuře popsána (Huygue et al., Human Gene Ther. 6: 1403-1416, 1995; P.W. Shabram et al., Human Gene Ther. 8: 453-465, 1997) . Tato metoda, která má detekční limit řádu 1 x 10⁸ vp/ml, je použitelná pro titraci čištěných virových částic. Ovšem, senzitivita této metody se snižuje, jestliže se provádí analýza lyzátu nebo surových buněčných extraktů. U těchto vzorků se odhasuje, že detekční limit je 2 až 5 x 10⁹ vp/ml, a není tedy možné kvantifikovat adenovirové částice ve velmi ředěných a nečištěných preparátech jako jsou lyzáty buněk infikovaných během virových transfekcí a. amplifikací, u nichž je titr adenovirů typicky v řádu 1 x 10⁸ vp/ml až 1 x 10⁹ vp/ml. Kromě toho, tato metoda neumožňuje kvantifikaci adenovirových částic z preparátů získaných v určitých kultivačních médiích bez živočišných proteinů. Tato média obsahují na konci kultivace takové sloučeniny jako jsou cukr, aminokyseliny, vitamín nebo fenolová červeň apod., z nichž některé mohou interferovat s adenovirovými částicemi během kvantifikace virů, což vede ke značnému nadhodnocení titru preparátu. Konečně, chromatografická metoda publikovaná Shabremem et al. Vyžaduje předchozí zpracování vzorku s nukleázou s širokým spektrem aktivity (Benzonase®) za účelem odstranění nukleových kyselin, které interferují při detekci a měření částic.

• ·

Pokud jde o preparativní metody separace adenovirů, chromatografie se používá mnoho let pro čištění adenovirových částic [Haruna, I., Yaosi, H., Kono, R. and Watanabe, I. Virology (1961) 13. 264-267; Klemperer, H.G. and Pereira, H.G. Virology (1959) 9, 536-545; Philipson, L., Virology (1960) 10, 459-465]. Metody popisující čištění rekombinantních adenovirů ve velkém měřítku byly popsány až nedávno (mezinárodní patentové přihlášky WO 96/27677, WO 97/08298, WO 98/00524, WO 98/22588).

Přihláška WO 98/00524 popisuje silnou iontově-výměnnou pryskyřici Source 15Q, která umožňuje získávat v jediném chromatografickém kroku adenovirové preparáty, jejichž čistota je alespoň stejná jako čistota preparátů získaných pomocí ultracentrifugace s gradientem chloridu česného. Tento stupeň čistoty je velmi vysoký a dosahuje standardů vyžadovaných pro klinické studie u lidí (WHO Expert Comittee on Biological Standardization, 49 Report, WHO Technical Report Series, WHO Geneva, in press).

Ovšem, je-li titr preparátu, který má být čištěn, příliš nízký (například v případě adenovirů majících nízkou produktivitu nebo když se má čištění provést s využitím zásob, získaných během ranných amplifikačních kroků), nebo alternativně, když médium pro produkci virů vede k přítomnosti sloučenin eluovaných společně s adenoviry (jako např. v případě média bez telecího séra). Limity účinnosti dosud popsaných chromatografických technik neumožňují kvantifikovat nebo čistit adennnovirové částice v jednom kroku u takovéhoto výchozího materiálu.

Existuje tedy problém nalezení metody titrace virových částic ze surových preparátů, která by byla rychlá, citlivá a vysoce selektivní. Je zde také problém nalezení metody čištění, která by byla spolehlivá, reprodukovatelná a která by umožňovala získat ze zmíněných surových preparátů virové preparáty farmaceutické kvality (s výhodou v jednom kroku).

Bylo shledáno, a právě tohle představuje předmět tohoto vynálezu, že určité chromatografické nosiče vykazují velmi výjimečné vlastnosti při separaci virových částic a obzvláště adenovirů. Tyto vlastnosti dovolují titraci a/nebo čištění virových částic ze surových preparátů bez předchozího zpracování, s velmi vysokou citlivostí a selektivitou. Použití těchto nosičů nečekaně zajišťuje jednoduchou a rychlou analytickou metodu separace a identifikace adenovirů různých serotypů nebo adenovirů modifikovaných na úrovni vlákna nebo hexonu pomocí chromatografie.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob separace virových částic z biologických médií, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden chromatografický krok provedený na nosiči obsahujícím matrici a iontově-výměnné skupiny, přičemž zmíněné skupiny jsou naroubovány na zmíněnou matrici pomocí flexibilního uchycení.

Matrice může být vybrána ze skupiny obsahující agarosu, dextran, akrylamid, oxid křemičitý a poly(styrendivinylbenzen), samotný nebo ve formě směsí. S výhodou matrice obsahuje agarosu, ještě výhodněji jde o 6% zesíťovanou agarosu.

Nosiče obsahující zesíťovaná agarosová ložiska s naroubovanými funkcionalizovanými, flexibilními iontověvýměnnými uchyceními byly vyvinuty pro preparativní a průmyslové chromatografie biomolekul. Tyto nosiče byly konkrétněji navrženy pro zachycení (ukotvení, počáteční krok způsobu čištění) biomolekul ze surových směsí, které byly vyjasněny (tj. zbaveny jejich tuhých složek v suspenzi). Jejich působeni bylo optimalizováno ve smyslu velmi vysoké kapacity připojeni dělené látky, nízkého protitlaku při vysokých lineárních rychlostech eluce, nízké ceny stejně jako vysoké chemické resistence k čistícím činidlům použitým pro regeneraci.

Flexibilní rameno je s výhodou hydrofilní povahy a obsahuje polymer syntetického nebo přírodního původu. Mezi polymery syntetického původu mohou být zmíněny polymery obsahující monomery polyvinylalkoholů, polyakrylamidů, polymethakrylamidů nebo polyvinyletherů.

Mezi polymery přírodního původu mohou být zmíněny polymery polysacharidového původu vybrané ze skupiny obsahující škrob, celulosu, dextran a agarosa.

S výhodou je stupeň polymerizace flexibilního ramena kolem 30 monomerních jednotek, ještě výhodněji je flexibilním ramenem dextran, mající střední molekulovou hmotnost kolem 5000 Da.

S výhodou je flexibilním ramenem funkcionalizována naroubováním skupin schopných interakce s anionickými molekulami. Obecně skupina obsahuje amin, který může být ternární nebo kvartérní. V rámci tohoto vynálezu je obzvláště výhodné použití silných aniontových měničů. Chromatografický nosič, jak bylo naznačeno výše, funkcionalizovaný kvartérními aminy, je tedy s výhodou používán podle tohoto vynálezu.

Pokud jde o nosič, který je preferován pro provádění tohoto vynálezu, můžeme zmínit Q Separose XL (Amersham Pharmacia Biotech). Použití tohoto nosiče je zmíněno v příkladech provedení přihlášky vynálezu WO 98/39467. Čištěné adenoviry jsou modifikovány reakcí s polyethylenglykolem (PEG). Po reakci jsou modifikované adenoviry, nemodifikované adenoviry a PEG jsou separovány průchodem přes kolonu Q Separose® XL. Jde tedy o jednoduchou separaci mezi výchozí materiály a finální produkty chemické reakce. Odbornici v oboru by nemohli předpokládat, že tato kolona může být úspěšně použita pro separaci adenovirů ze složitých biologických médií, obsahujících různé kontaminující částice (DNA z hostitele, RNA, proteiny, lipidy, lipoproteiny, endotoxiny apod.), jako jsou lyzáty enkapsidačních buněk. Stejně tak nevyplývá při čtení tohoto dokumentu, že Q Separose XL může být použita pro preparativní účely, protože je známo, že většina nosiče ztrácí svoji účinnost jakmile se nastříkne větší množství produktů.

Další silné anion-výměnné nosiče, mající podobné charakteristiky., zahrnující složení matrice, distribuci velikosti částic, porositu, chemický původ flexibilního ramene a hustota roubování, mohou být použity pro preparativní nebo analytickou separaci adenovirových částic. S výhodou matrice obsahuje 6% zesilovanou agarosu; která je roubována s flexibilními rameny obsahujícími dextran a jež jsou funkcionalizovány se silnými anion-výměnnými skupinami. Nosič má velikost částic s výhodou kolem 40 až 200 μιη; přičemž termín „kolem použitý při popisu střední velikosti částic znamená, že uvažované hodnoty jsou v rozmezí +/- 20% vzhledem k uvedené hodnotě. S výhodou je tato odchylka +/- 10% a ještě výhodněji je mezi +/- 5% vůči uvedené hodnotě.

V nejpreferovanějším provedení je velikost částic mezi 45 až 165 μιη se středem 90 μιη.

Výhodně má matrice takovou disperzi, že 95% částic má průměr mezi 0,1 až 10-ti násobky středního průměru částic a s výhodou mezi 0,3 až 3-násobkem středního průměru částic.

Q Separose® XL použitá v následujících příkladech, ilustruje (nikoliv vyčerpávajícím způsobem) účinnost nosičů,které mohou být použity v rámci tohoto vynálezu.

Q Separose XL vykazuje distribuci velikosti částic od do 165 μΐΏ, s centrem na 90 μιη. Tato velikost a distribuční charakteristiky činí nosič vhodný pro preparativní chromatografický měnič. Chromatografická teorie a praxe naznačuje, že takovýto nosič má velmi průměrnou účinnost při separaci sloučenin vykazujících podobné chromatografické chování pokud jde iontově-výměnné interakce. Tento nosič tedy generuje málo rozlišené široké chromatografické píky, obzvláště díky velké velikosti a velmi široké distribuci částic, které jej vytváří. Takovéto očekávané chromatografické. chováni je obecně potvrzeno pro biomolekuly jako jsou proteiny, které jsou eluvány ve formě velkých, velmi málo separovaných plků (viz. Data Filé Pharmacia

Biotech No. 18-1123-82). Na druhé straně, zcela neočekávaným způsobem jsou z tohoto typu nosiče eluovány adenovirové částice, a to ve formě velmi symetrických, extrémně úzkých plků. Ve srovnání s proteiny, jako je například albumin, účinnost kolony naplněné Q Separose XL, měřené pomocí výškového ekvivalentu teoretického patra (HETP) nebo jako počet teoretických pater na jednotkovou délku (N/m), je 50 až

100 krát vyšší pro adenoviry (N/m: 35 000) než pro proteiny, jakým je třeba albumin kravského sera (N/m: 600). Viz např.

Příklad 1. Je-li tedy použit tento typ gelu a obzvláště adenovirový chromatografický nesrovnatelná s nosiči obecně a optimalizovaných podmínek, Q Separose® XL gel, dává pík, jehož šířka je doporučovanými pro separaci biomolekul. Mezi doporučovanými nosiči pro separaci biomolekul bychom měli zmínit takové nosiče, jejichž základní • ··· · Q « · ·«· « · • · · · · · V·· ···· «· ·· ·· ·· ··· matrice je typu póly(styren-divinylben^en) (jako třeba pryskyřice Source 15Q a Source 30Q, nebo pryskyřice typu Poros HQ, Poros DE2 nebo Poros D) .

Také bychom měli zmínit nosiče, jejichž základní matrice je methakrylát-ethylenglykol kopolymer, jako např. pryskyřice Toyopearl DEAE, QAE a Super Q, nebo pryskyřice typu Fractogel TMAE, TMAE HiCap, DMAE nebo DEAE, jejichž funkční iontověvýměnné skupiny jsou umístěny na lineárních polymerních řetězcích polyakrylamidového typu, naroubovaných na matrici.

Účinnost nosičů použitých v rámci tohoto vynálezu pro separaci adenovirových částic vede k velmi vysoké citlivosti detekce částic. Jsou-li tyto nosiče použity v analytické chromatografické koloně, neočekávané chromatografické chování virových částic umožňuje kvantifikaci adenovirů s detekčním limitem, který je mnohem nižší než je detekční limit dosud popsaných metod. Tento detekční limit je alespoň desetkrát nižší, což umožňuje dosáhnout detekčního limitu v řádu 1 x 10⁸ vp/ml u preparátů typu surových buněčných lyzátů a detekční limit v řádu 1 x 10⁷ vp/ml u čištěných virových preparátů.

Tento typ nosiče také umožňuje zajištění velmi vysoké selektivity vůči kontaminantům přítomným v analyzovaném vzorku, jako jsou například proteiny a nukleové kyseliny.

Proteiny se nachází ve formě píků, které jsou velmi široké a které jsou eluovány před pikem viru. Nukleové kyseliny jsou eluovány z kolony pomocí koncentrací soli, které jsou významně vyšší než jsou koncentrace nezbytné pro eluování viru. Tato charkateristika, která se velmi liší od charakteristik získaných při dříve popsaných chromatografických metodách (Huygue et al., Human Gene

Ther. 6: 1403-1416,

1995) umožňuje eliminovat interference těchto typů sloučenin s virovým pikem. Konečně, dokonce i když analyzované preparáty obsahuji species, které jsou eluovány společně s virovými částicemi, vysoce specifická forma virového píku umožňuje snadnou identifikaci a snadné provedení kvantifikace.

Nosiče používané podle tohoto vynálezu tedy umožňují identifikovat a kvantifikovat velmi snadno a s vysokou přesností pík adenoviru, pokud je analyzován s využitím přípravků obsahujících velké množství proteinů a nukleových kyselin. Kvantitativní analýza částic stejně jako čištění může být také provedeno s využitím preparátů získaných s širokým spektrem kultivačních virových médií nebo s médii postrádajícími složky živočišného původu, jako např. albumin, ať již hovězího původu, lidského nebo jiného původu (Obrázek

2). Je také důležité všimnout si, že metoda popsaná v tomto vynálezu je použitelná na analýzy vzorků obsahujících nukleové kyseliny bez jejich předchozího zpracování s nukleázou, a to bez ovlivnění citlivosti nebo selektivity metody.

V tomto smyslu je dalším předmětem tohoto vynálezu použití tohoto typu nosiče, a konkrétněji Q Sepharose® XL, pro separaci nebo čištění virových částic, obzvláště adenovirů, z biologických médií. Tato metoda separace může případně zahrnovat předběžný chromatografický krok na jiném nosiči, jako třeba na těch, které byly použity v metodě popsané v přihlášce WO 98/00524, konkrétně pryskyřice Source 15Q. Tento předběžný krok může být v určitých případech výhodný, např. jeli přítomno obzvláště velké množství nečistot v biologickém médiu.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je použití tohoto typu nosiče, a obzvláště Q Sepharose® XL, pro kvantitativní analýzu nebo titraci virových částic, obzvláště adenovirů, z biologických médií.

♦ ·

Biologické médium, z něhož se provádí čištění nebo titrace virů, může být odstředěná kapalina z enkapsidačních buněk produkujících virus nebo lyzát 'enkapsidačních buněk nebo předčištěný roztok zmíněného viru. Je-li preparativní separace nebo čištění virových částic prováděno s pomocí enkapsidačních buněk nebo lyzátu, může být výhodné provádět předběžný ultrafiltrační krok; s výhodou se tento krok provádí tangenciální ultrafiltrací na membráně, mající průpichy mezi 300 a 500 kDa.

Způsob čištění podle tohoto vynálezu umožňuje získávat virové preparáty vysoké kvality pokud jde o čistotu, s velkým výtěžkem částic (řádově od 75 do 80 %) v jednom kroku, s využitím zásoby, která je naředěna a/nebo velmi bohatá pokud jde o nečistoty, za produkčních podmínek, které jsou plně srovnatelné s průmyslovými požadavky a které vyhovují omezením při výrobě terapeutických molekul.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob kvantifikace adenovirů, vyznačující se tím, že se virové částice separují chromatografií na nosiči typu Q Sepharose® XL a kvantita adenovirů se určuje měřením absorbance chromatografických frakcí. Způsob podle tohoto vynálezu dovoluje snazší a přesnější monitorování kinetiky produktů, přímo v homogenním vzorku kapaliny, bez předchozího zpracování, což vede k lepší reprodukovatelnosti a lepší kontrole způsobu výroby zásob virových částic.

Předmět tohoto vynálezu je také použití chromatografického nosiče typu Q

Sepharose®

XL pro identifikaci různých adenovirových serotypů.

Bylo skutečně překvapivě zjištěno, že tento typ nosiče umožňuje separovat a identifikovat, jednoduše a rychle, široké spektrum adenovirů různých serotypů přímo ze vzorku virového produkčního média, a to určením retenčního času a poměru hodnot absorbance při 260 nm a při 280 nm u chromatografického píku.

Pokud jde o použití chromatografických nosičů podle tohoto vynálezu, separace virových částic pro analytické nebo preparativní účely může být provedena použitím solného elučního gradientu na chromatografickou kolonu, alternativně pomocí isokratického módu, to jest při konstantní koncentraci soli.

Pro preparativní účely může být chromatografický nosič použit v konvenčním typu chromatografických kolon nebo v kolonách vhodných pro vysoko-rozlišovací chromatografické systémy, s využitím např. Q Sepharose® XL, nebo alternativně v expandovaných nebo tzv. „fluidizovaných systémech s využitím např. Streamline® Q XL nosiče. Velikost chromatografické kolony je určena jako funkce kvantity viru přítomného ve výchozím materiálu.

Virové preparáty určené k čištění mohou být aplikovány na nosič v pufru, jehož vodivost je taková, aby virus nebyl zadržován na nosiči, zatímco nukleové kyseliny by byly vázány. Výhodně je vodivost nastavena na hodnotu 45 mS/cm. Toto konkrétní provedení umožňuje separovat viry jednoduchou filtrací přes nosič Q Sepharose® XL od nukleových kyselin, získaných z hostitelské buňky a kontaminující virový preparát.

Způsob určování a čištění a charakterizace různých serotypů, popsaný v tomto vynálezu, může být aplikován na různé typy virů a obzvláště adenovirů, ať jsou to již viry divoké nebo rekombinantní viry nesoucí transgen, o nějž máme záj em.

Kromě výše zmíněných .rysů tento vynález také zahrnuje další charakteristiky a výhody, které se vynoří při čtení • · následujících příkladů, jež jsou uvedeny ilustrační formou a nejsou zamýšleny jako limitující.

Legenda k obrázkům

Obrázek 1: Eluční profil čištěného adenoviru a hovězího albuminu na koloně Q Sepharose® XL.

Obrázek 2: Eluční profil supernatantu virové kultury, získané u média bez séra, na koloně Q Sepharose® XL.

Obrázek 3: Eluční profil preparátu čištěného adenoviru (injektováno 2 x 1O¹⁰ vp) na koloně Q Sepharose® XL.

Obrázek 4: Eluční profil preparátu čištěného adenoviru (injektováno 2 x 1O¹⁰ vp) na koloně Q Sepharose® Fast Flow.

Obrázek 5:	Srovnání	elučních profilů	preparátu	čištěného
adenoviru na	koloně	Q Sepharose® XL a	koloně Q	Sepharose®
Fast Flow.
Obrázek 6:	Eluční	profil preparátu	čištěného	adenoviru
(injektováno	2 x 1O¹⁰	vp) na koloně Q Sepharose® HP.

Materiály a metody

1. Adenoviry a výroba replikačně-defektních rekombinantních adenovirů

Adenoviry jsou viry mající lineární dvouvláknovou DNA o velikosti 36 kilobází. Jejich genom obsahuje především obrácené terminální opakování (ITR) na obou koncích, enkapsidační sekvenci (Psi), časné geny a pozdní geny. Hlavni

• · 0 0

000 0 0 • · · • ··0 0 0 časné geny se nachází v oblastech El, E2, E3 a E4 . Mezi nimi jsou obzvláště důležité geny pro virální propagaci obsažené v El. Důležité pozdní geny jsou obsaženy v oblastech LI až L5. Ad5 adenovirový genom byl kompletně sekvencován a je dosažitelný v databázích (viz obzvláště Genebank M73260). Podobně byly sekvencovány části nebo celé další genomy (Ad2, Ad7, Adl2 a pod.).

Pro jejich využití v genové terapii byly připraveny různé adenovirové vektory, zabudovávající se do různých terapeutických genů. V každé z těchto konstrukcí byly adenoviry modifikovány tak, aby nebyly schopné replikace v infikovaných buňkách. Konstrukce popsané v současném stavu techniky jsou adenoviry s vymazanou El oblastí, která je nezbytná pro replikaci virů, do nichž byly inzerovány heterologní DNA sekvence (Levrero et al. , Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50(1986) 161). Kromě toho, aby se zlepšily vlastnosti vektoru, bylo navrženo vytvořit další vymazání nebo modifikace v adenovirovém genomu. Tak např. byla zavedena teplo-citlivá bodová mutace do tsl25 mutantu, čímž byla umožněna inaktivace 72 kDa vázacího proteinu (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). Jiné vektory zahrnují vymazání další oblasti, nezbytné pro virovou replikaci a/nebo propagaci, oblasti E4. E4 oblast je skutečně zapojena do regulace exprese pozdních genů, do stability pozdních jaderných RNA, do extinkce a exprese proteinů hostitelské buňky a do účinnosti replikace virové DNA. Adenovirové vektory, u nichž byly vymazány oblasti El a E4, tedy vykazují transkripční šum pozadí a velmi sníženou expresi virového genu. Takovéto vektory byly popsány např. v přihlášce WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/22378). Kromě toho byly také popsány vektory nesoucí modifikaci v IVa2 genu (WO 96/10088) .

• ·

Rekombinantní adenoviry popsané v literatuře se vyrábí z různých adenovirových serotypů. Skutečně existuji různé adenovirové serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší, ovšem které vykazují srovnatelnou genetickou organizaci. Konkrétněji, rekombinantní adenoviry mohou být lidského nebo živočišného původu. Pokud jde o adenoviry lidského původu, měly by být přednostně zmíněny adenoviry klasifikované ve skupině C, konkrétně adenoviry typu 2 (Ad2), typu 5 (Ad5); adenoviry skupiny B, jako adenoviry typu 7 (Ad7) nebo adenoviry skupiny A, např. adenoviry typu 12 (Adl2). Mezi různými adenoviry živočišného původu můžeme přednostně zmínit adenoviry psího původu a konkrétně všechny adenoviry CAV2 linií (např. Manhattan nebo A26/61 linie (ATCC VR-800)). Další adenoviry živočišného původu jsou citovány obzvláště v přihlášce WO 94/26914, která je v tomto vynálezu zahrnuta jako reference.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu je rekombinantní adenovirus lidský adenovirus skupiny C. Výhodněji je to adenovirus Ad2 nebo Ad5.

Bylo popsáno několik metod generování rekombinantních adenovirů (C. Chartier et al., J. Virol. 70: 4805-4810, 1996; WO 96/25506; J. Crouzet et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997; T-C. He et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998). Tyto metody umožňují konstrukci E. coli plasmidů, nesoucích adenovirový genom o nějž máme zájem; tyto plasmidy se poté natráví restrikčním enzymem, aby se vyříznul adenovirový genom z plasmidů. Adenovirový genom se poté přenese do enkapsidační linie a amplifikuje se.

Rekombinantní adenoviry se obvykle vyrábí zavedením virové DNA do enkapsidační linie, načež se po 2 až 3 dnech buňky podrobí lýze (kinetika adenovirového cyklu je 24 až 36 hodin); podle další varianty se v kultivaci pokračuje 8 až 12 dní a virové částice se spontánně uvolňují do kultivačního média autolýzou ankapsidačních buněk.

Viry použité v rámci následujících příkladů jsou adenoviry obsahující lacZ signální gen E. coli (AV1.0CMW. lacZ) . Tyto viry jsou odvozeny od Ad5 serotypu a vykazuji následující strukturu:

vymazání El oblasti, pokrývající např. nukleotidy 386 (Hinfl bod) až 3446 (Sau3a bod).

kazetu exprese lacZ genu pod kontrolou CMW promotéru, insertovanou na úrovni zmíněného výmazu.

vymazání E3 oblasti.

Konstrukce těchto virů byla popsána v literatuře (WO 94/25073, WO 95/14102, WO 96/25506, J. Crouzet et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997). Je samozřejmé, že ve způsobu podle tohoto vynálezu mohou být použity jakékoliv jiné konstrukce, obzvláště viry nesoucí další heterologní geny a/nebo jiné výmazy (např. E1/E4 nebo E1/E2) .

Techniky fransfekce buněk, amplifikace a titrace adenovirů byly již popsány (F.L. Graham et al., Molecular Biotechnology 3: 207-220, 1995; Crouzet et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997; WO 96/25506).

Tdu technika určování β-galaktosidázové aktivity kódované lacZ genem,obsaženým v AVj.oCMW.lacZ virech se provádí podle popisu v P. Yeh et al (J. Virol. 70: 559-565,

1996).

Produkce AVi.oCMW. lacZ adenovirů

Viry byly sklízeny z kultury produkčních linií konvenčním způsobem, zahrnujícím sérii lyofilizačních cyklů, nebo chemické lýzy v přítomnosti 1% Tween-20 nebo pokračováním kultivace až do autolýzy podle metody pospané ve WO 98/00524.

Kultivační médium se může lišit v závislosti na použitých transkomplementujících liniích nebo podle použitých množství. Tato média mohou být MEM, DMEM a pod., s přídavkem nebo bez přídavku telecího séra a obsahující různé koncentrace anorganických solí, cukru, aminokyselin, vitamínu, herpes nebo fenolové červeně.

El oblast transkomplementujících buněk, jako třeba buněk 293 nebo PER.C6, se transfikuje při 60 až 80% konfluenci v kultivační misce s virovou DNA získanou trávením plasmidu, nesoucího adenovirový genom, o než se zajímáme. Inkubace se provádí 8 až 15 dní, přičemž čas sběru se určuje pomocí mikroskopického pozorování buněk, které se stávají kulatými, lámavějšími a. stále méně přilnavými ke kultivačnímu nosiči. Viry se poté uvolní z jader 3 až 6 následnými lyofilizačními cykly (ethanol-suchý led při -70 °C, vodní lázeň při 37 °C) . Takto získané viry se používají k infekci nových transkomplentujících buněk při dané multiplicitě infekce (MOI), která se může pohybovat mezi 10 až 500 virovými částicemi na buňku, amplifikovaný virus se získává jak bylo popsáno výše inkubováním po dobu 40 až 72 hodin.

Podle další varianty popsané v přihlášce WO 98/00524, se buňky nesbírají 40 až 72 hodin po infikování, ale v inkubace se prodlužuje na 8 až 12 dní za účelem dosažení úplné lýzy buněk bez nutnosti provádět lyofilizační cykly. Virus je poté φ

φ· ·· • · · · • · · • ··· • · ···· ··

	ΦΦ
•	•	«	•	•	• ·
• ·	···	•	•	•
•	•	• Φ	Φ ·	fc	•
• · • Φ	• · ΦΦ	•	•	• ···

spontánně uvolněn do supernatantu, který je poté vyjasněn filtrací na tlustých filtrech snižující se porozity (10 μιη/1,0 μιη/0,8-0,2 μιη) . Vyjasněný supernatant se poté zakoncentruje tangenciální ultrafiltrací na spirální membráně Millipore, mající průpichy 300 kDa. Koncentrační faktor je v řádu 20-ti až 100 násobku. Podle další varianty se vyjasněný supernatant může použít jako takový pro čištění na koloně Sepharose® XL.

Analýza adenovirových preparátů

Analytické techniky používané ke zjišťování kvality získaných virových preparátů (SDS-PAGE, Western kaňková analýza, IE-HPLC na koloně Resource 15Q a pod.) byly již popsány (WO 98/00524).

- Analytické metody používající chromatografický nosič Q Sepharose® XL

Provozní podmínky pro detekci, identifikaci a kvantifikaci adenovirových částic z kultury infikovaných enkapsidačních buněk se získává podle níže uvedeného popisu.

Chromatografická kolona plněná asi 1 ml Q Sepharose® XL (45-165 μπι, Amersham-Pharmacia Biotech) se připravuje v koloně typu HR 5/5 (Amersham-Pharmacia Biotech). Tato kolona je vmontována do HPLC systému Waters 626, vybaveného s UV/VIS detekčním systémem s diod array 996, pracujícím při vlnovém rozsahu 200 - 300 nm. Tato anion-výměnná kolona se používá pro separaci a kvantifikaci virových částic.

Před každou analýzou se kolona nechá přivést do rovnováhy při 30 °C v 20 mM Tris/HCl pufru, pH 7,5 při rychlosti- průtoku 1,5 ml/min. Analyzovaný vzorek, obsahující virové částice, se nastřikne do kolony. K získání maximálního rozlišení by měl být počet injektovaných částic menší nebo roven 2 x 10¹² částic/ml nosiče. Nastříknuty objem nemá významný vliv na separaci species, přinejmenším u objemů menších nebo rovných 50 ml na ml gelu. Po injekci se kolona vymývá s 5 objemy stejného pufru a vázané částice jsou eluovány s lineárním gradientem 0 až 1M NaCl ve 20 mM Tris/HCl pufru, pH 7,5, asi 30 objemy kolony. Po ukončení gradientu se kolona vymyje 2 objemy 0,5 N hydroxidu sodného před tím, než se kolona nechá vyrovnat před další analýzou.

Standardní křivka při 260 nm se konstruuje s přípravkem adenovirových částic čištěném buď v CsCl gradientu nebo chromatografíčky. Tento standardní preparát byl před tím titrován na částice při jejich absorbanci při 260 nm v 0,1% SDS roztoku s využitím konverzního faktorul x 10¹⁰ částic na jednotku absorbance při 260 nm.

Za těchto okolností je adenovir eluován s retenčním časem kolem 18 min a má absorbanční poměr při 2 60 nm ku 280 nm 1,30 +/- 0,02 (viz Obrázek 3). Software „Suitability pro akvizici chromatografického signálu a procesní jednotka Millenium Waters určují po každé analýze automaticky hodnotu N/m (vypočtenou v poloviční výšce) a asymetrii (vypočtenou při 10% výšce) píku. Hodnota N/m adenovirového píku je typicky 35 000 +/- 3000 a asymetrie píku je 1,05 +/- 0,05.

3- Preparativní způsob čištění adenovirů pomocí anion-výměnné chromatografie

Adenovir je čištěn z kultur ankapsidačních buněk 293 nebo PER.C6 (WO 97/00326). Virus je produkován a sklízen v supernatantu po autolýze podle výše uvedeného popisu. Poté je zfiltrován přes 0,45 μιη membránu (HT Tuffryn nebo polysulfon) těsně před čištěním. Pokud není uvedeno jinak protokol čištěni je identický s protokolem použitým pro analytickou separaci virových částic, popsaným výše, ovšem s jiným elučnim gradientem. Eluce se provádí s 0,25 až 1 M NaCl gradientem během 30 objemů kolony. Objem kolony je nastaven na četnost čištěných virů, přičemž se bere v úvahu kapacita 1 x 10¹² částic na 1 ml chromatografického nosiče. Podobně je lineární rychlost eluentu nastavena na 300 cm/h.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Srovnání nosiče typu Q Sepharose® XL s nosičem

typu Q Sepharose® Fast Flow
	Tento příklad ilustruje	specifické	vlastnosti nosičů
typu	Q Sepharose® XL ve srovnání s nosiči	typu Q	Sepharose®
Fast	Flow. Oba nosiče se skládají	z kuliček	identické	základní

struktury (6% zesíťovaná agaroza) mající stejnou distribuci velikosti částic (45 - 165 pm) . Liší se přítomností flexibilních dextranových ramen, nesoucích Q typ výměnných skupin u Q Sepharose® XL, zatímco stejné Q skupiny jsou u Q Sepharose® FF přímo fixovány k agarosové matrici.

Čištěný adenovirový preparát (2 x 10¹⁰ vp) se nastříkne na kolonu Q Sepharose® XL (1 ml nosiče) a je eluován s NaCl gradientem jak bylo definováno v odstavci 2 sekce Materiál a metody. Eluční profil je uveden na Obrázku 3. Za stejných podmínek byla provedena identická analýza s využitím podobné kolony plněné Q Sepharose® FF nosičem. Eluční profil je uveden na Obrázku 4. Srovnání chromatografické účinnosti je uvedeno v následující tabulce.

• ·

Nosič	Účinnost (N/m)	Asymetrie
Q Sepharose® XL	30,000	1.0
Q Sepharose® FF	5,000	1.0

Tabulka 1: Srovnání chromatografické účinnosti nosičů Q Sepharose® XL a Q Sepharose® FF.

Jak je ukázáno na Obrázku 3 a 4, retenční doba virů je v obou případech podobná (t = 18 min pro Q Sepharose® XL a t = 20 min pro Q Sepharose® FF) , ovšem nosič Q Sepharose® XL má mnohem vyšší účinnost než nosič Q Sepharose® FF.

Podobným způsobem byla provedena analýza surového buněčného extraktu obsahujícího 2 x 10⁹ virových částic adenovirů na obou nosičích (Obrázek 5) , která ukázala, že pouze nosič Q Sepharose® XL identifikoval a kvantifikoval virový pík. Na druhé straně, proteiny přítomné v preparátu jsou separovány se stejnou účinností u obou druhů sledovaných nosičů (Obrázek 5).

Tyto výsledky naznačují, že přítomnost flexibilních ramen nesoucích výměnné skupiny, je klíčovou složkou tohoto typu nosiče. Přítomnost těchto flexibilních ramen významně přispívá k výhodnému chromatografickému působení Q Sepharose® XL při separaci adenovirů.

Příklad 2: Srovnání nosiče typu Q Sepharose® XL s nosičem typu Q Sepharose® HP.

Tento příklad ilustruje specifické vlastnosti nosiče typu Q Sepharose® XL ve srovnání s nosičem typu Q Sepharose® HP.

• · • »

Oba nosiče se skládají z kuliček majících identickou základní strukturu (6% zesíťovaná agaróza). Nosič typu Q Sepharose® XL má distribuci velikosti kuliček v rozmezí 45 až 165 pm, se středem na 90 μπι. Velikost částic Q Sepharose® HP je 34 +/- 10 μιη. Velikost částic u nosiče Q Sepharose® HP je menší a mnohem méně disperzní než u nosiče Q Sepharose® XL. Nosič Q Sepharose® HP by tedy měl mít mnohem vyšší chromatografickou účinnost než je účinnost Q Sepharose® XL.

Čištěný adenovirový preparát (2 x 1O¹⁰ vp) se injektuje do kolony Q Sepharose® XL (1 ml nosiče) a byl eluován s NaCl gradientem jak bylo definováno v odstavci 2 sekce Materiály a metody. Eluční profil je uveden na Obrázku 3. Za těch samých podmínek byla provedena identická analýza na stejné koloně naplněné s nosičem Q Sepharose® HP. Eluční profil získaný s nosičem Q Sepharose® HP je uveden na Obrázku 6.

Výsledky uvedené na Obrázku 6 ukazují, že nosič Q Sepharose® HP má podstatně nižší účinnost (N/m, 15 000) než nosič Q Sepharose® XL. Kromě toho, virový pík vykazuje významné chvostování na nosiči Q Sepharose® HP (asymetrie 1,6), zatímco na nosiči Q Sepharose® XL je striktně symetrický.

Nečekaně, bez ohledu na jeho jemnější velikost částic a jeho méně disperzní distribuci velikosti částic, nedosahuje nosič Q Sepharose® HP účinnosti nosiče Q Sepharose® XL při separaci virových částic. Na druhé straně měl tento nosič mnohem lepší účinnost při separaci proteinů, jak je popsáno výrobcem (Amersham-Pharmacia Biotech) a jak bylo potvrzeno za experimentálních podmínek při experimentu separace telecího albuminu (následující tabulka).

Nosič	Adenovirus	Albumin
Účinnost (N/m)	Asymetrie	Účinnost (N/m)
Q Sepharose® XL	30 000	1,0	600
Q Sepharose® HP	15 000	1,6	4000

Tabulka 2: Srovnáni chromatografického působení nosičů Q Sepharose® XL a Q Sepharose® HP.

Tyto výsledky potvrzují, že přítomnost flexibilních ramen nesoucích anion-výměnné skupiny, je klíčovou složkou chromatografického působení tohoto typu nosiče při separaci virových částic. Tyto výsledky také naznačují, že další důležitý parametr, který je třeba vzít v úvahu při výběru nosiče, je velikost částic a obzvláště disperze velikostí.

Příklad 3: Srovnání nosiče typu Q Sepharose® XL s nosiči typu Fractogel® TMAE(S) a Sourcel5Q

Tento příklad ilustruje specifické vlastnosti nosiče typu Q Sepharose® XL ve srovnání s nosiči typu Fractogel® TMAE(S) a Sourcel5Q.

Všechny tři nosiče se skládají z částic různé struktury a složení. Q Sepharose® XL se skládá ze 6% zesíťované agarózy. Fractogel® TMAE je zesíťovanou polymethakrylátovou pryskyřicí a Source 15Q se skládá z částic polystyrendivinylbenzenové pryskyřice. Velikost částic Fractogel® TMAE(S) (20 - 40 μτη) a Source 15Q (15 μη) je významně menší a mnohem méně disperzní než je tomu u Q Sepharose® XL (45 - 165 μη) . Kromě toho, tři nosiče mají silné výměnné skupiny. Ty jsou umístěny na flexibilním ramenu připojeném k matrici v případě nosiče Fractogel® TMAE(S) a Q Sepharose® XL, narozdíl od Source 15Q, kde jsou výměnné skupiny naroubovány přímo na matrici.

Čištěný adenovirový preparát (2 x 1O¹⁰ vp) byl injektovám do kolony Q Sepharose® XL (1 ml nosiče) a byl eluován s NaCl gradientem jak bylo definováno v odstavci 2 sekce Materiály a metody. Eluční profil je uveden na Obrázku 3. Za těch samých podmínek byla provedena identická analýza na stejné koloně naplněné s nosičem Source 15Q a další analýza s kolonou naplněnou nosičem Fractogel® TMAE(S).

Nečekaně, bez ohledu na jemnější velikost částic a jeho méně disperzní distribuci velikosti částic, nedosahuje nosič Fractogel® TMAE(S) účinnosti nosiče Q Sepharose® XL při separaci adenovirů. Na druhé straně měl tento nosič mnohem lepší účinnost při separaci proteinů. Podobně, bez ohledu na jemnější velikost částic a jeho v podstatě monodisperzní distribuci velikosti částic, nedosahuje ani nosič Source 15Q účinnosti nosiče Q Sepharose® XL při separaci adenovirů.

Nosič	Účinnost (N/m)	Asymetrie
Source 15Q	20 000	1,2
Q Sepharose® XL	30 000	1,0
Fractogel® TMAE(S)	20 000	1,5

Tabulka 3: Srovnání chromatografického působeni nosičů Source 15Q, Q Sepharose® XL a Fractogel® TMAE(S).

Tyto výsledky naznačují, že přítomnost flexibilních ramen nesoucích výměnné skupiny není jediným faktorem odpovědným za specifické chromatografické působení nosiče

Q Sepharose® XL při separaci adenovirů. Chemické složení těchto ramen, jejich hustota roubování, druh a porozita matrice, na níž jsou roubována flexibilní ramena - to všechno jsou faktory, které mohou ovlivňovat chromatografické působení nosiče na separaci virových částic.

Přiklad 4: Detekce a kvatifikace částic divokých adenovirů různých serotypů

Tento přiklad ilustruje způsob detekce a identifikace částic divokých adenovirů různých serotypů založený na použití chromatografickém nosiči Q Sepharose® XL.

Různé divoké adenoviry byly produkovány infikací A549 buněk kultivovaných na DMEM mediu a sklízených po trojnásobném lyofilizačním cyklu. Preparát byl poté zfiltrován před analýzou přes membránu Acrodisk (typ HF Tuffryn 0,45 μιη, Gelman Sciences) .

Různé preparáty byly poté analyzovány chromatografií podle protokolu popsaného v odstavci 2 oddílu Materiály a metody. Ovšem v uvedeném příkladu byly analýzy provedeny s kolonou, mající objem lehce vyšší než 1 ml (1,35 ml), což vysvětluje proč je retenční čas adenovirů 5 je vyšší (25,3 min) než je referenční retenční čas (18 min), uvedený v oddílu Materiály a metody.

• ·

ADENOVIRUS	pod-	TITR	Poměr	T_r
(SEROTYP)	skupina	(vp/ml)	(260/280	(min)
18		2.3 x 10⁹	1.18	15.0
3		4.8 x 1O¹⁰	1.35	20.1
7		4.4 x 1O¹⁰	1.33	18.3
11	B	3.8 x 1O¹⁰	1.30	22.7
14		1.1 x 1O¹⁰	1.31	27.0
21		2.7 x 1O¹⁰	1.36	22.8
34		4.7 x 1O¹⁰	1.30	21.5
1		1.2 x 1O¹⁰	1.32	26.9
2	C	2.3 x 1O¹⁰	1.33	26.9
5		6.6 x 1O¹⁰	1.33	25.3
6		6.6 x 1O¹⁰	1.38	22.3
13	D	4.6 x 1O¹⁰	1.55	17.0
20		8.5 x 1O¹⁰	1.32	22.1
4	E	3.9 x 1O¹⁰	1.31	20.1
36		2.9 x 1O¹⁰	1.37	22.4

Tabulka 4: Chromatografické charakteristiky různých adenovirů divokého typu

- <2^

Tento přiklad ukazuje, že různé adenoviry nejen že mají různé retenční doby v závislosti na uvažovaném serotypu, ale mají také různý poměr absorbanci při 260 nm a 280 nm, který je charakteristický pro uvažovaný serotyp. Kombinace těchto dvou kritérií, které mohou být měřeny současně během jedné a té samé chromatografické analýzy, tedy představuje rychlý a spolehlivý prostředek pro identifikaci serotypu adenoviru přítomných v chromatografickém preparátu.

Byla nalezena korelace mezi retenční dobou viru na koloně a charakteristikami vlákna a hexonuadenovirů typu 7, 3, 4, 5 a 2, pro něž byly publikovány sekvence (1998 J. Virol. (1998) 72 str. 7909 and Arch, Virol (1997) 142 str. 1307). Nebyla nalezena žádná korelace ze sekvenčních dat pro hlavu vlákna nebo dokonce z rozdílů v počtu opakujících se β skládaných listů v kmeni vlákna (viz níže uvedenou tabulku). Na druhé straně byla překvapivě nalezena korelace mezi retenční dobou viru a sekvencí hexonu (viz níže uvedenou tabulku). Tato korelace je ve vynikajícím souhlase s celkovým nábojem hexonu při 7 pH; tato korelace ukazuje, že zvýšení náboje hexonu při pH 7 odpovídá zvýšení retenčního času viru na koloně. Lehké rozdíly mohou existovat v závislosti na náboji při pH 7 exponované LI části hexonu, jak naznačují data získaná pro typ viru 3.

• · • ·

• · · σ\ CN ·· ·· • · · · • · · ♦ ««· • · «··« ♦ ·

Hexon	LI hexonu náboj při pH 7	-12.03	-10.03	-12.06	-20.94	-20.02
Hexon pí náboj při pH 7	5.31 -16.83	5.23 -18.66	5.30 -17.55	5.15 -22.57	4.96 -26.73
Q. O identity hexonu	100	93.9	73.9	67.8	67.3
	Počet opakování kmene	kO		12	22	22
	Náboj při pH 7		-2.91		-3.61	-2.80
Fibre	O o identity hlavy	100	52	32	27	33
		18.3	20.1	,20.1	25.3	26.9
Podskupina	ta	co	w	u>	o
Serotyp Adenovirů		CO		LT)	C\1

α ο φ χ:

ο -Ρ Ή +J <υ Ό Ή

Ή C >Ο

C φ

>

φ m

Φ

Η Ή ί>

ω

Φ >υ g

Ή

C >υ c φ +J φ

Μ

Η

Ν

Φ

S

Φ Ο φ ι------1 φ

Μ

Ο

LT) φ

ι—I

Ρ

Λ

Φ

Η

Přiklad 5: Detekce a kvantifikace částic rekombinantních adenovirů během kroků výroby virových zásob

Tento příklad ilustruje použití nosiče typu Q Sepharose® XL pro detekci a kvantifikaci částic rekombinantního adenovirů AVi,₀CMV. lacZ, který je produkován během kroků transfekce a amplifikace s různými ankapsidačnimi buněčnými liniemi (linie 293 nebo PER.C6).

Tato extrémně rychlá metoda analýzy zjišťuje, během několika minut a s využitím kultivačního supernatantu, titr roztoku adenovirů v každém kroku. Tato rychlá a citlivá metoda umožňuje optimalizaci podmínek amplifikace následujícího kroku, který pak může být proveden za definovaných a kontrolovaných MOI podmínek.

Tato metoda analýzy byla testována za účelem ověření produkce rekombinantního adenovirů AVi,oCMV.lacZ během kroků transfekce a amplifikace buněk 293 nebo PER.C6.

Adenovir AVi,₀CMV. lacZ byl produkován po transfekci buněk 293 nebo PER.C6 s plasmidem pXL2822 natráveným s PacI (Crouzet et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997), následované infikováním buněk 293 nebo PER.C6 při definované multiplicitě infekce (MOI). Počáteční transfekce byla provedena s 5 až 10 qg virové DNA získané natrávením plasmidu.

Během lýzy buněk byl virus sklizen tak, že buňky byly podrobeny trojnásobnému lyofilizačnímu cyklu. Preparáty byly poté před analýzou zfiltrovány přes 0,45 μιη membránu Acrodisc (typ HT Tuffryn).

Různé preparáty byly poté · analyzovány pomocí chromatografie podle protokolu popsaném v odstavci 2 oddílu Materiály a metody. Titr roztoku adenovirů se určí podle referenční standardní křivky připravené podle popisu v odstavci 2 oddílu Materiály a metody.

• ♦

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:

Buňky	Virus	Krok	Titr (vp/ml)	Celkové množství (vp)
293	AVi.oCMV. lacZ	Transfekce	3.8 x 10⁸	7.6 x 10⁹
		Amplifikace I MOI 50	3.5 x 1O¹⁰	1.0 x 10¹²
		Amplifikace II MOI 30	4.2 x 1O¹⁰	3.1 x 10¹³
PER.C6	AVí.qCMV. lacZ	Transfekce	2.4 x 10⁸	9.6 x 10⁹
		Amplifikace I MOI 30	2.1 x 1O¹⁰	6.3 x 10¹¹
		Amplifikace II MOI 60	3.2 x 1O¹⁰	1.9 x 10¹³

Tabulka 6:

Detekce a kvantifikace AVi.qCMV. lacZ rekombinantních virových částic získaných během produkce virových zásob ve dvou transkomplementujících liniích (293 nebo PER.C6).

Celkové množství získaných virových částic bylo stanoveno za účelem určení koncentrace infekčních částic (pfu) a částic majících transgenní aktivitu (tdu). Termín pfu („plak tvořící jednotka) odpovídá infekční síle adenovirového roztoku a určuje se infikováním odpovídající buněčné kultury a měřením, obecně po 15 dnech, množství plaku infikovaných buněk. Tato φ · stanoveni jsou založena na biologických metodách a získané hodnoty se mohou lišit v závislosti na použitých podmínkách (J. Virol. (1996) 70 str., 7498). Tvorba plaku v transkomplementujících buňkách skutečně nezbytně nepopisuje infektivitu viru v jiných cílových buňkách (Biotechniques (1997) 22 str., 447). Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce a získané hodnoty jsou v perfektní shodě s daty uvedenými v literatuře (P. Yeh et al. J. Virol. (1996) 70 str. 559) . P. Yeh et al. skutečně popisuje AdRSVpGal viry čištěné pomocí gradientu chloridu česného, mající poměr tdu/pfu od 0,49 do 0,68, což je velmi blízko níže uvedeným výsledkům.

♦ ♦ to m

tdu/pfu	0.45	0.57
vp/tdu	55	43
Titr (tdu/ml)	00 O X	oo o X
vp/pfu	24	26
Titr (pfu/ml)	CN O X l>	CN O V-^ X cd
Titr (vp/ml)	2 o X (N	o o X CN CD
Virus	N o P > s o o > <c	N o -E O O > <
Buňky	293	PER.C6

Μ-I tí C (1) tri ω

C fO

D P p u

Ή

O

Ή τη <ΰ

E o Ή P co 'ÍO >o rO

O -H P co 'CÚ >o

Pí o '•H c >0 Λί α> ρ c

Ή '•Η υ ro ί-ι Ρ

C! (U ο C ο

Ρ

Ν φ

Ε

Ρ <0

Ρ

Ν — > 3

Ό

Ρ

Γιΰ ρ Ρ -Η '—I ί>

Ρ Ρ Ρ oj Ρ Η Φ ·♦ ·· • φ φ ♦ φ φ · φ φφ· • φ ···· ·♦

Přiklad β: Detekce a kvantifikace částic rekombinantních adenovirů během kroků transfekce a amplifikace buněk IGRP2

Tento příklad ilustruje použití nosiče typu Q Sepharose® XL pro detekci a kvantifikaci částic rekombinantního adenovirů AV₃,₀CMV.lacZ, který je produkován během kroků transfekce a amplifikace u buněk IGRP2.

Adenovir AV_3z0CMV. lacZ byl produkován po transfekci IGRP2 enkapsidačních buněk s plasmidem pXL3005 natráveným s PacI (plasmid pXL3005 je odvozen od plasmidu pXL2811 popsaným v (Crouzet et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997) výměnou RVS promotéru za CMV promotér), následované infikováním IGRP2 buněk (WO 96/22378) při definované multiplicitě infekce (MOI). Během lýzy buněk byl virus sklizen tak, že buňky byly podrobeny trojnásobnému lyofilizačnímu cyklu. Preparáty byly poté před analýzou zfiltrovány přes 0,45 μπι membránu Acrodisc (typ HT Tuffryn) .

Různé preparáty byly poté analyzovány chromatografií podle protokolu popsaném v oddílu Materiály a metody. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Virus	Krok	Titr	(vp/ml)	Celkové množství (vp)
AV₃.oCMV.lacZ	transfekce	0.1	x 1O¹⁰	2.0 x 10¹⁰
	amplifikace I, MOI 100	1.54	x 10¹⁰	1.4 x 10¹²
	amplifikace II, MOI 50	1.39	x 10¹⁰	1.0 x 10¹³

Tabulka 8: Detekce a kvantifikace AV3.0CMV. lacZ rekombinantních adenovirových částic získaných během produkce virových zásob.

• ·	00	• 0	• 0	00
0	0	• 0	0	0	•	v	V
	0	t ·	0	0	00 0	0	0
0		···	• 0	0	0 ·	0 0	0
0 000	0	• 00	0 » 00	0 0 0 0	0	0 00

Celkové množství získaných virových částic bylo stanoveno za účelem určení koncentrace částic majících transgenní aktivitu (3,2 x 10⁸ tdu/ml). Velikost poměru vp/tdu 43 je srovnatelná s poměrem vp/tdu 43 a 55, získaných v Příkladu 5 a činí možným korelovat fyzikální měření 1,39 x 1O¹⁰ vp/ml virových částic s biologickým měřením 3,2 x 1O⁸ tdu/ml transdukčni j ednotky.

Příklad 7: Čištění viru chromatografií na pryskyřici Q Sepharose® XL

Výchozím materiálem je buď kultivační lyzát, získaný lyofilizaci enkapsidačních buněk produkujících vir nebo supernatant, získaný po spontánní lýze buněk.

V experimentu popisovaném v tomto příkladu bylo 153 ml autolyzátu kultury PER.C6 buněk infikovaných s virem AVi.oCMV. LacZ, celkem obsahující 4,9 x 10¹² částic, bylo nastříknuto do kolony obsahující 5,8 ml Q Sepharose® XL.

Ekvilibrace kolony a eluce viru byly prováděny při rychlosti toku 300 cm/h s 0,25 až 1 M NaCl gradientem při 30-ti násobku objemu kolony podle popisu analytické separace viru v odstavci 2 oddílu Materiály a metody. Pík viru (7.1 ml) byl sbírán a poté analyzován různými technikami (IE-HPLC, SDSPAGE) podle níže uvedeného popisu.

Sesbírané frakce byly analyzovány pomocí vysoko-rozlišovací kapalinové chromatografie (HPLC) na koloně Resource Q (1 ml) v následujícím chromatografickém systému:

μΐ frakce čištěné chromatografií podle výše uvedeného popisu bylo injektováno do kolony Resource Q15 (1 ml gelu, Pharmacia) ekvilibrované se 100 mM Tris/HCl pufrem při pH 8,0, obsahujícím 0,5 mM MgCl₂, (pufr B). Po promyti s 5 ml pufru B byly adsorbované species eluovány s lineárním gradientem 30 ml NaCl(0 až 1 M) v pufru B při rychlosti toku 1 ml/min.

Eluované částice byly detekovány při 260 nm. Po čisticím kroku na koloně Q Sepharose® XL, sbírané frakce měly čistotu vyšší než 99% virových částic (UV detekce při 260 nm). Výtěžek čištění virových částic je 82%.

Tato HPLC analýza mimo jiné ukazuje, že zbytkový albumin telecího sera v počátečním lyzátu je zcela odstraněn během preparativní chromatografie.

Elektroforetická analýza adenovirové frakce čištěné chromatografií, prováděné na polyakrylamidovém gelu (4-20%)za denaturačních podmínek (SDS). Proteinové pásy jsou poté obarveny v dusičnanu stříbrném. Tato analýza ukázala, že adenovirový preparát, získaný chromatografií, měl úroveň čistoty alespoň stejnou jako přípravky komerčně získané ultracentrifugací a zde není žádný další pás proteinu, který by mohl kontaminovat preparát jinými než adenovirovými proteiny.

Adenovirový preparát získaný chromatografií má poměr absorbancí A₂eo nm/A₂8o nm roven 1,30 +/- 0, 05. Tato hodnota, která je identická s hodnotou získanou u nejlepších preparátů získaných ultracentrifugací, naznačuje, že preparát je zbaven kontaminujících proteinů nebo kontaminujících nukleových kyselin.

Titrace viru skutečně ukazuje přítomnost infekčních virových částic s velmi uspokojivým poměrem vp/pfu (viz níže uvedená tabulka) a čištěné virové částice mají skutečně očekávanou infekční aktivitu.

• ·

Krok	Titr (vp/ml)	Titr (pfu/ml)	vp/pfu	Kumulativní výtěžek v vp (%)
Před	3.2x1ο¹	O.13xlO¹⁰	25	-
čištěním	0
'Chromatografická	56xlO¹⁰	1.6xlO¹⁰	34	81
Frakce
Formulovaný	93xlO¹⁰	3.7xlO¹⁰	25	74
produkt

Tabulka 9: Čištění AVj.oCMV.LacZ adenovirů na nosiči Q Sepharose® XL

Metoda popsaná v tomto přikladu tedy umožňuje čištění adenovirových částic bez ovlivnění jejich infekční schopnosti, a to přímo z lyzátu ankapsidačních buněk a bez žádného předchozího zpracování (např. ultrafiltrace nebo reakce s nukleázou) čištěného materiálu.

Claims

1. Způsob separace virových částic z biologického média, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden chromatografický krok provedený na nosiči zahrnujícím matrici a iontově-výměnné skupiny, přičemž zmíněné skupiny jsou naroubovány na matrici pomocí flexibilního ramene.

2. Způsob separace podle nároku 1, vyznačující se tím, že je matrice vybrána ze skupiny obsahující agarózu, dextran, akrylamid, oxid křemičitý a poly[styrendivinylbenzen], a to samotný nebo ve formě.směsi.

3. Způsob separace podle nároku 2, vyznačující se tím, že matrice obsahuje zesiťovanou agarózu a s výhodou 6% zesíťovanou agarózu.

4. Způsob separace podíe nároku 1, vy.zna č u jící s e tím, že matrice má velikost částic mezi 40 a 200 μιη.

5. Způsob separace podle nároku 4, vyznačující se t i m, že matrice má velikost částic mezi 45 a 165 μιη a má střed na 90 μιη.

6. Způsob separace podle -nároku 4. nebo 5, v y z n a č u j i c i se t í m, že matrice má takovou disperzi, že 95% částic má průměr mezi 0,1 a 10-ti násobky středního poloměru částic a s výhodou mezi 0,3 a 3 násobky středního průměru částic.

7. Způsob separace podle nároku 1, vyznačující se tím, že flexibilní rameno je hydrofilní rameno obsahující polymer syntetického nebo přírodního původu.

8. Způsob separace podle nároku 7, vyznačující se tím, že flexibilním ramenem je polymer syntetického původu, vybraný ze skupiny obsahující polyvinylalkoholy, polyakrylamidy, polymethakrylamidy nebo polyvinylethery.

9. Způsob separace podle nároku 7, vyznačující se tím, že. flexibilním ramenem je polymer přírodního původu polysacharidové povahy, vybraný ze skupiny obsahující škrob, celulosu, dextran a agaróza.

10. Způsob separace podle nároku 8 nebo 9, vyznačgj í c í se t í m, že stupeň polymerizace flexibilního ramena je kolem 30 monomerních jednotek.

11. Způsob separace podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že flexibilním ramenem je dextran mající střední molekulovou hmotnost kolem 5000 Da.

12. Způsob separace podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že iontově-výměnnou skupinou je silná anionvýměnná skupina.

13. Způsob separace podle nároku 12, vyznačuj ící se t 1 m, že silná anion-výměnná skupina je kvartérní amin.

14. Způsob separace podle nároků 7 až 13 nebo podle nároku 5, vyznačující se tím, že se chromatograf ie provádí na nosiči typu Q Sepharose® XL.

15. Způsob separace podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že biologickým médiem je supernatant z enkapsidačních buněk produkujících zmíněný virus.

16. Způsob separace podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že biologickým médiem je lyzát z enkapsidačních buněk produkujících zmíněný virus.

17. Způsob separace podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že biologickým médiem je předčištěný roztok zmíněného viru.

18. s e Způsob tím, separace podle nároku 1, vyznačuj í c i že zahrnuje předběžný ultrafiltrační krok. 19. Způsob separace podle nároku 18, vyzná č u j í c i s e t í m, že ultrafiltrace je tangenciální ultrafiltraci

na membráně mající prahovou velikost 300 až 500 kDa.

20. Použití chromatografického nosiče typu Q Sepharose® XL pro analytickou a/nebo preparativní separaci virových částic.

21. Použití chromatografického nosiče typu Q Sepharose® XL podle nároku 20, vyznačující se tím, že virovými částicemi jsou adenoviry.

22. Použití chromatografického nosiče typu Q Sepharose® XL pro identifikaci různých serotypů adenovirů.

Φ· ·· ·· 9 9 • · · · • • • · · • · · • · ··· • ··* • · • • · • · · • · • · • · • · ···« ·* ·· « Λ ·· ·

23. Použiti chromatografického nosiče typu Q Sepharose® XL pro titraci adenovirů.

24. Způsob kvantifikace adenovirů, vyznačující se tím, že virové částice jsou separovány chromatografií na nosiči typu Q Sepharose® XL a kvantita adenovirů je měřena absorbancí chromatografických frakcí.